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방법 논문

초파리 용해액에서 세포 없는 시험관 내 mRNA 번역

384 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70844

⸱

2026년 6월 12일

 ,  ,  ,  , 
1mRNA and Cancer Laboratory, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología (INCan; National Institute of Cancer), 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Escuela de Ingeniería y Ciencias, Tecnologico de Monterrey

이 논문에서

요약

여기서는 해상 추출액을 준비하고 초파리 배아를 이용한 시험관 내 번역 방법에 대해 자세히 설명합니다.

초록

세포 자유 mRNA in vitro 번역은 진핵생물 전반에 걸친 유전자 발현 중 단백질 합성 과정을 이해하는 데 중요한 역할을 해왔습니다. 시험 관 내 번역을 위한 다양한 시스템에서 용해액의 개발은 번역 기계의 대부분 구성 요소의 역할을 연구하고 단백질 합성 과정의 여러 단계를 해부하는 데 중요한 역할을 해왔습니다. Drosophila melanogaster 용해체를 이용해 번역 및 번역 조절의 다양한 측면이 연구되었습니다. 이 논문은 합성 mRNA 주형 제조, 대규모 생체 파리 배양, 초파리 배아에서 번역 적합 용해체 제조, 그리고 세포 없는 시험관 내 번역 반응 수행에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 멜라노가스터, 비릴리스, 가짜스큐라, 그림샤위, 하이데이 등 초파리 속의 모든 종에 적합합니다. 이 프로토콜을 다른 번역 시스템과 비교하고, 제한점, 중요한 단계, 문제 해결 방법에 대해 논의합니다. 프로토콜의 성과 재현성을 평가하기 위해 대표성 결과가 포함되어 있습니다. 마지막으로, 생명공학과 연구 분야에서의 잠재적 응용 분야에 대해 논의합니다.

서론

100년 넘게 초파리는 번역 조절과 번역 기계 1,2,3,4를 포함한 많은 생물학적 현상과 분자를 연구하는 강력하고 유전적으로 다루기 쉬운 모델 생물임이 입증되었습니다. 초파리 세포 없는 시험관 내 번역은 생체 내에서 관찰된 많은 사건을 재현할 수 있어 단백질 합성 연구에 강력한 도구가 되었습니다. 따라서 초파리는 번역 및 번역 조절을 수행하는 새로운 기능과 분자를 발견하기에 이상적인 시스템이다. 초기 연구들은 파리 관련 절지동물 Artemia salina5와 이후 Drosophila hydei6에서 시험관 내 번역 능력 있는 시스템을 확립했습니다.

이후 외인성 mRNA에 반응하는 용해액이 Drosophila melanogaster에서 개발되었습니다. 초파리 시험관 내 번역에 관한 대부분의 연구는 다양한 연령대의 배아에서 수행되었으나, 번역 반응 버퍼의 일부 변형은 여러 연구 그룹에서 사용되었습니다. 비교를 위해 연구된 다양한 현상과 번역 반응 조건은 표 1에 나열되어 있습니다. 배아 외에도, 초파리 난자 10,22,23,24,25,26과 배양된 슈나이더 또는 Kc 세포 용해액 을 이용한 자유 시험관 번역 프로토콜도 개발되었습니다. 시험관 내 번역에 필요한 구성 요소와 서로 다른 종의 용해물 간 비교는 참고문헌33,34에 설명되어 있습니다.

mRNA 번역 과정은 진핵생물 전반에서 보존되지만, 분류군 간 유의미한 차이는 주로 번역 시작 단계에서 발견되며, 이 단계에서 다양한 분자가 분류군 또는 종 특이적 방식으로 번역을 억제하거나 촉진합니다35,36. 이 프로토콜은 계통발생적으로 먼 메타동물의 용해액(밀이나 토끼의 상업용 용해액을 포함해서)을 사용할 수 없는 곤충의 발달 과정 전반에 걸쳐 mRNA 번역을 연구하는 데 매우 적합합니다. 실제로 이 프로토콜은 난자분해액을 사용할 때는 불가능한 배아 발생 중 발생하는 번역 사건을 재현할 수 있습니다. 현재까지 배아, 난자, 배양 세포 초파리 시스템 간의 비교는 이루어지지 않았습니다. 시험관 내에서 합성된 단백질에 번역 후 변형을 추가하는 것은 현재 상태에서 이 프로토콜의 한계입니다. 더불어, 이 방법은 박테리아에서 재조합 단백질을 생산하는 방법에 비해 준비량의 단백질을 얻지 못합니다.

여기서는 대규모 초 파리 케이지를 일상적으로 키우는 절차, 합성 mRNA 주형을 준비하는 방법, 배아에서 번역 적합 용해액을 제조하는 방법, 그리고 세포 없는 시험관 내 번역 분석을 수행하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 재료표 는 프로토콜 전반에 걸쳐 필요한 시약을 보여줍니다.

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프로토콜

1) 시험관 내 전사를 위한 템플릿 플라스미드 구성

  1. 5' 비번역 영역(UTR), 리포터 시스트론, 3' UTR, 그리고 T7, T3 또는 SP6 RNA 중합효소 프로모터 하류에 위치한 폴리(A) 꼬리를 포함하는 플라스미드를 선택합니다. 전사 전에 각 구조체가 플라스미드 선형화를 위해 poly(A) 꼬리 바로 하류에 고유한 제한 부위를 포함하도록 하세요(그림 1).
    참고: 제한효소 부위는 인식 부위가 전사 서열 밖에 있거나 선형화된 DNA가 A로 끝날 수 있는 위치로 신중히 선택해야 합니다. 게다가 제한효소는 템플릿의 3피트 끝에 무딘 부분이나 5피트 돌출부를 남겨야 합니다. 3' 돌출부는 이상한 전사 생성물을 초래할 수 있습니다. 3피트 돌출부가 있는 효소를 사용할 경우, 사용 전에 조각을 무뎌야 합니다.
  2. 모든 구성체를 시험 관 내 전사 템플릿으로 사용하기 전에 시퀀싱을 통해 검증하세요.
    참고: 이 워크플로우에는 poly(A)71 꼬리를 가진 Firefly 루시퍼레이제(FLuc) 리포터 구조체가 사용되었습니다. FLuc 구성체는 pLUC-카세트12에서 파생되었습니다. 벡터 및 키트 정보는 재료표에 기재되어 있습니다.

2) 캡 및 폴리아데닐화 mRNA의 시험관 내 전사

  1. 폴리(A) 꼬리 하류의 고유한 제한 부위(여기서는 KpnI)를 사용하여 각 플라스미드 구성체를 선형화합니다.
  2. 1% 아가로스 겔 전기영동으로 선형화된 DNA를 100V 1시간 동안 분리합니다.
  3. DNA를 겔 추출하여 동일한 아가로스 겔 전기영동으로 그 완전성과 적절한 선형화를 점검합니다.
    참고: 선형성된 DNA를 젤 정제할 필요는 없습니다—DNA가 완전히 절단된 경우, 컬럼 정제나 페놀 추출/ETOH 침전만으로도 충분합니다.
  4. 제조사의 지침에 따라 시험 관 내 전사 키트를 사용해 정제된 선형 DNA를 전사하세요. 전사 반응에 5' 캡 유사체를 포함시켜 RNA를 안정화하고 번역을 자극합니다.
    참고: m7G(5′)ppp(5′)G RNA와 같은 기능적 캡 유사체는 전사체 안정화 및 번역 자극을 지원합니다. G(5′)ppp(5′)A와 같은 비기능적 캡 유사체는 전사체 안정화를 지원하지만 번역 자극은 지원하지 않습니다. 이 번역 억제제는 비시스트로닉 전사체를 번역할 때 사용되어 두 번째 시스트론7의 번역을 유도하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 존재를 검사합니다. poly(A) 꼬리의 의존성을 검사하기 위해, 전사 전에 템플릿 플라스미드에서 이를 삭제할 수 있습니다.
  5. 제조사의 지침에 따라 전사 후 DNA 주형을 제거하기 위해 RNase-free DNase로 모든 전사 반응을 처리하세요. 모든 시험관 내 전사 키트는 RNase 없는 DNase를 제공합니다.
  6. 제조사의 지침에 따라 염화리튬 침전 또는 컬럼 기반 RNA 정화로 전사본을 정제하세요.
    참고: 모든 시험관 내 전사 키트는 염화리튬 시약을 제공합니다.
  7. 정제된 전사체를 분광법으로 정량하고, 100V 1시간 동안 1%-아가로스 겔 전기영동으로 mRNA 무결성을 평가합니다.
  8. mRNA를 분리하여 -70°C에서 보관하다가 사용하세요.

3) 대규모 초파리 배양의 정기 유지

  1. 참고 문헌인 Drosophila melanogaster 야생형 균주 Oregon-R을 사용하세요.
  2. 검증된 참고 자료 센터 레시피에 따라 파리 사료를 준비하세요.
    참고: 저자들은 블루밍턴 초파리 주식 센터 레시피37을 식품 조리 참고로 사용했습니다. 이 레시피에 대한 자세한 내용은 표 2, 37에 나와 있습니다. 그림 2는 배아 채취부터 루시퍼라제 활성 정량화까지의 전체 작업 흐름을 보여줍니다.
  3. 길이 약 1m, 지름 50cm의 입방체 또는 원통형 아크릴 케이지를 설치합니다.
  4. 케이지 상단에 지름 약 30cm 크기의 구멍을 만들고 메시로 밀봉하세요(그림 3).
  5. 젖은 종이를 망 위에 올려 파리에게 물을 공급하고, 젖은 종이는 매일 교체하세요(그림 3).
  6. 케이지 앞부분은 열려 있고 천으로 덮어 케이지 내부에 접근할 수 있게 하세요. 플라스틱 플라이 케이지 뒷면에 아크릴을 완전히 밀봉해 놓으세요.
  7. 배아 채취 전에 파리 개체수를 증폭시키고, 새장 안에 ~1,000마리의 어린 파리를 넣으세요. 파리 우리를 22–25°C로 유지하세요.
    참고: 동일한 크기와 플라이 밀도를 가진 여러 개의 파리 케이지를 동시에 유지할 수 있습니다. 파리는 약 15일간 알을 낳으며 20일째 되면 죽기 시작합니다.
  8. 매일 파리에게 200 μL 아세트산 또는 식초가 들어간 재수화된 베이커스 이스트 한 숟가락을 얹어 먹이세요.
  9. 차세대 파리를 확립하기 위해 0–12시간 배아 여러 판을 수집하세요. 배아를 22cm × 17cm 깊이× 10cm 플라스틱 상자에 3cm 깊이의 파리 먹이를 넣습니다. 상자에 메쉬로 막힌 구멍이 있어 공기 순환을 돕고 유충이 탈출하지 못하도록 하세요(그림 4). 음식 위에 건조 활성 효모를 넣고 배아가 25°C에서 자라도록 하세요.
  10. 3일 후에는 5cm 높이의 접힌 종이를 상자에 넣어 3령 유충이 올라가 번데기가 될 수 있도록 합니다.
  11. 10일 후에는 갓 부화한 성체 파리가 든 상자를 우리에 넣습니다. 파리들이 상자 밖으로 나와 우리 안에서 2일 동안 짝짓기를 하도록 하세요.
  12. 용해물 준비를 위해 특정 연령대의 배아를 얻으려면, 케이지를 조심스럽게 열고 정해진 산란 기간 동안 아가르즙 플레이트를 케이지 안에 넣어야 합니다.
  13. 접시를 치우고 체를 쌓아 달걀을 모으세요.
    참고: 0세에서 12세 배아 용해체의 경우, 오전 8시에 케이지에 두 개의 한천즙 접시를 넣고 오후 8시에 제거하여 배아 채취를 하세요.
    1. 성충파리가 부화한 후 3일째에서 10일째 사이에 해체 준비를 위해 배아를 수집하세요.
    2. 동시에 2일째에서 4일째에 배아를 채취하고, 위에서 설명한 것처럼 식품 상자에 새로운 세대의 파리를 세웁니다.

4) 0세에서 12세 사이의 초 파리 배아에서 번역 용해체 준비

참고: 이 프로토콜에는 미세코클 뉴클레아제 치료가 포함되지 않습니다. 이 단계는 뉴클레아제 비활성화가 불완전할 경우 외부 리포터 mRNA의 분해를 방지하기 위해 생략되었습니다. 각 실험에서는 무mRNA 대조군을 사용하여 배경 번역을 모니터링해야 합니다.
참고: 이 방법은 이전에 설명한프로토콜 7,12,14,15,16,17,22에서 파생되었습니다.

  1. 표 2에 설명된 배아 용해 완충제를 준비하여 -20 °C에서 1 mL 알리코트 단위로 보관합니다.
    참고: 각 알리코트는 즉시 사용할 수 있도록 최대 2배까지 해동하세요.
  2. 체로 배아를 채취하세요.
    참고: 표준 프로토콜은 0–12세 배아를 사용하지만, 다른 배아 나이도 용해액 준비에 적합할 수 있습니다.
  3. 배아는 수돗물로 충분히 세척한 후 0.9% NaCl + 0.03% Triton X-100이 포함된 배아 완충제로 세척합니다.
    참고: 배아는 처리 전 최대 24시간까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  4. 데코리오네이트 배아를 50% 배아 완충제와 50% 하우스 미백제(차아염소산나트륨[NaOCl] 4–6%, 수산화나트륨[NaOH] 0.02–0.1%)에 5분간 투여합니다.
    주의: 표백제를 다룰 때는 장갑과 투명 플라스틱 고글을 착용하세요.
  5. 수돗물로 충분히 세척하세요. 배아를 종이로 말리고 무게를 재세요.
  6. 포장된 배아를 얼음 위에 있는 유리 조직 분쇄기로 옮깁니다. 배아 1g당 1mL의 배아 용해 버퍼를 추가합니다. 얼음 위에 20번의 스트로크로 배아를 균질화하세요.
  7. 균질액을 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 원심분리기 15,900 × g , 4 °C에서 20분간 진행.
  8. 얼음 위에서 50 μL 알리코트 단위로 간기를 회수하세요. 알리코트를 액체 질소에 얼려 -80 °C에서 보관하세요.
    참고: 간기는 상상과 하상 사이에 흐린 액체 용액입니다. 상상은 점도가 높고 불투명한 흰색 지질층입니다. 하단 상은 고체 펠릿입니다.
    주의: 인접한 상에서 중간 단계 용액을 오염시키지 않도록 주의하세요.
    주의: 액체 질소를 다룰 때는 장갑과 투명 플라스틱 고글을 착용하세요.

5) 시험관 내 번역 반응

  1. 96웰 플레이트 또는 PCR 열사이클러 위의 개별 0.2 mL PCR 튜브에서 번역 반응을 설정합니다. 각 번역 반응은 최종 17 μL 용량으로 준비하며, 여기에는 5 μL 배아 용해액과 표 2에 설명된 나머지 반응 성분도 포함됩니다.
    참고: 배아 용해액은 전체 반응 부피의 30% 비율을 차지합니다.
  2. 재조합 단백질이 번역 반응에 추가되면, 20 mM.M.H.H(HEPES-KOH pH 7.4)에 대해 단백질을 이분해합니다. 샘플 부피와 단백질 크기에 따라 투석 카세트 용량과 분자량 컷오프를 선택하세요.
    참고: 재조합 단백질의 첨가는 개시 인자를 이용한 번역 억제자나 용량 의존적 분석법 연구와 관련이 있습니다. 번역 반응에 사용되는 재조합 단백질에 PBS를 첨가하는 것은 피하세요. 단백질 샘플 또는 번역 반응에서 글리세롤을 5% 이하로 유지하세요. 가능하다면 반응에 글리세롤을 추가하는 것을 피하세요.
  3. mRNA를 변성시키기 위해 65°C에서 2분간 가열한 후, 시험 관 내 번역 반응 전에 얼음 위에서 2분간 빠르게 냉각합니다.
  4. 각 mRNA를 3배로 번역합니다. 반응 설정은 다음과 같습니다: 반응 칵테일 2.7 μL (표 2) + 배아 용해액 5 μL + mRNA(30 ng) + 최종 부피 H2O에서 17 μL 사이. 기본 마스터 믹스로서, 표 2의 한 반응에 대해 반응 칵테일을 따라 수행할 반응 수에 따라 조정합니다. 반응을 25°C에서 60분간 배양합니다.
    참고: ATP와 GTP는 여기서 설명된 표준 반응에 별도로 추가되지 않습니다. 저희 경우, 추가 ATP/GTP를 보충했지만 FLuc 출력은 개선되지 않았고 번역도 감소했습니다. 따라서 반응은 표 2 에 설명된 에너지 재생 시스템으로 추가 뉴클레오타이드 보충 없이 수행됩니다.
  5. 열사이클러를 4°C에서 5분, 25°C에서 60분, 마지막 4°C에서 10분으로 프로그래밍합니다.
  6. 반응을 멈추려면 20 μL 냉각 1× 수동 용해 버퍼를 추가합니다. 반응 부위를 얼음에 10분 더 보관하세요.
  7. 샘플을 -20 °C에 보관하거나 루시퍼레이스 정량 검사를 진행하세요.
    참고: 프로토콜은 여기서 일시정지할 수 있습니다.

6) 합성된 루시페라제의 정량

  1. FLuc 활성을 정량화하기 전에 반응을 20분간 실온에 두세요.
  2. 각 번역 반응 10 μL과 루시퍼레이스 기질 50 μL(사용 최소 2시간 전)을 실온에 가져가세요.
  3. 번역 반응에 루시퍼라제 기질을 추가합니다. 자동 또는 수동 광도계를 사용하여 상대 광도 단위를 기록할 수 있습니다. 루미노미터를 1초 간격으로 10개의 측정값을 측정하도록 프로그래밍하세요.

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결과

우리는 0–12세 배아를 사용하여 6가지 독립적인 해해 제제(즉, 생물학적 반복) 간 효율 변동성을 분석하기 위해 번역 반응을 수행했습니다. 각 막대는 기술적인 삼중형을 나타냅니다(그림 5). 유사한 번역 효율이 관찰되었으나 약간의 변동이 있었습니다. 또한 서로 다른 연령대의 배아 간 번역 효율성도 비교했습니다. 따라서 우리는 0–2세, 0–12세, 0–18세 배아의 용해액을 생물학적 반복, 즉 독립적인 용해체를 사용하여 검사했습니다(그림 6). 우리는 0–2시간 배아의 해해액이 가장 낮은 FLuc 활성을 보인 반면, 0–18세 배아의 용해액은 가장 높은 FLuc 활성을 보였다. 마지막으로, 0–18시간 된 초파리 배아 분해액의 번역 효율을 다른 종과 비교하였습니다. 우리는 토끼 망상혈구와 밀 배아에서 상업용 용해물을 시험했습니다(

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토론

세포 자유 시험관 번역을 위한 초파리 용해액은 재현 가능한 결과를 낼 수 있습니다. 다양한 연령과 완충 조성의 변이가 있는 배아를 단백질 합성과 그 메커니즘의 다양한 기본 현상을 연구하는 데 사용되어 왔습니다(표 1). 여기서는 모든 연령대의 배아가 정밀하고 정량적인 방식으로 연구를 수행할 수 있는 표준 방법을 설명했습니다(표 1). 이 프로토콜은 돌연변이 파리의 대규모 배양이 확립될 때 특정 단백질이나 유전자형의 기능을 연구하는 데 잠재적으로 유용하다. 더불어, 이 방법은 초파리 속의 모든 종에 적용할 수 있으며, 비교 및 진화 연구를 위해 다른 파리 속이나 곤충 속과 표준화할 수 있습니다. 이는 특히 많은 곤충의 유전체가 현재 이용 가능하다는 점에서 중요합니다.

여기서 설명한 방법은 몇 가지 ...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

N.B-Á와 G.H.는 멕시코 국립암연구소(Instituto Nacional de Cancerología, INCan)의 내부 자금 지원 프로그램을 받았습니다. D.E.V.는 2022년 과학, 인도, 기술 및 혁신 비서국(SECIHTI) 프로그램 "México para la Formación y Consolidación de las y los Investigadores por México"의 박사 후 연구원입니다. 파리를 제공해 준 파니스 미시를리스와 베티 오소리오(CINVESTAV, 멕시코)에게 감사드립니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알루미늄 호일 시트ReynoldsN/A표준 가정용 알루미늄 호일; 동등한 상업용 브랜드 허용.
아미노산 혼합물PromegaL4461N/A
애플 사이다 식초HeinzN/A상업용 사과 사이다 식초(5% 산도); 동등한 브랜드 허용.
사과 또는 포도 주스JumexN/A상업용 포도 주스; 또는 동등한 상업용 브랜드.
박테리올로지컬 아가Merck/Sigma-Aldrich9002-18-0N/A
붕산(H3BO3)Merck/Sigma-AldrichB6768BioReagent, 분자생물학 등급, ≥99.5%, 분말; TBE 버퍼 준비에 사용.
캡: 역방향 캡(ARCA): 3'-O-Me-m7G(5'')ppp(5'')G RNA 캡 구조BioLabsS1411SN/A
캡: m7G(5'')ppp(5'')G RNA 캡 구조 아날로그New England BiolabsS1404SN/A
캡: 비기능성 캡 아날로그 G(5'')ppp(5'')ANew England BiolabsS1406N/A
원심분리기 튜브(15mL)Corning430053N/A
완전한, EDTA-프리 단백질분해효소 억제제 칵테일Roche11836170001N/A
토끼 근육의 크레아틴 포스포키나제Merck/Sigma-AldrichC-3755N/A
크레아틴 인산, 디나트륨 염Merck1120A47950N/A
탈수 베이커 효모Fleischmann'sN/A상업용 활성 건조 효모; 동등한 브랜드 허용.
디에틸 피로카르보네이트Merck/Sigma-AldrichD575897%(NNR)
DNA 클린 & 콘센트레이터-5Zymo ResearchD4004N/A
Drosophila melanogaster 야생형 주 오레곤-RBloomington Drosophila Stock Center, 미국 인디애나https://bdsc.indiana.edu/index.html ; Drosophila melanogaster의 돌연변이 주와 기타 Drosophila 종의 야생형 참조 주, 예를 들어 virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei 등은 이 Stock Center에서도 제공됩니다.
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)Merck/Sigma-AldrichE9884ACS 시약, 99.4-100.6%, 분말; TBE 버퍼 준비에 사용.
HEPESSigmaSLBH4583V99.5%(titration)
과산화수소(H2O2)EquateN/A상업용(~2.5-3.5% 과산화수소 용액; 동등한 브랜드 허용.
인 비트로 전사 mMessage mMachine T7, T3, 또는 SP6 키트Thermo Fisher ScientificAM1344 및 AM1348N/A
KOAc, 또한 KCH3COO라고도 함Merck/Sigma-Aldrich여러N/A
Lb 브로스(lennox)Merck/Sigma-AldrichL30221kg
루시퍼라제 분석 시스템PromegaE1501N/A
MAXIscript T7, T3, 또는 SP6 인 비트로 전사 키트InvitrogenAM1316 및 AM1312N/A
Mg(OAc)2, 또한 Mg(CH3COO)2라고도 함Merck/Sigma-Aldrich여러N/A
NaCl(나트륨 염화물)J.T BakerB17W53ACS 시약
올리고뉴클레오티드어떤 회사N/A시퀀스 특이적.
Pasive lysis 5X 버퍼PromegaE1941N/A
파이펫 팁AxygenT-200-Y200 마이크로리터 노란색 팁.
파이펫 팁AxygenT-1000-B1ml 파란색 팁.
파이펫 팁AxygenT-3000.5-10 마이크로리터 투명 팁.
프로피온산Merck/Sigma-Aldrich79-09-04ACS 시약 등급, ≥99.5%, 액체.
PYREX® 5 mL 유리 페스틀 조직 그라인더PYREX®7724-5N/A
QIAprep spin 플라스미드 미니프레퍼 키트Qiagen27106N/A
QIAquick 젤 추출 키트Qiagen28704N/A
토끼 소

참고문헌

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