자유롭게 움직이는 쥐의 자발적 보행 및 이동 분석을 위한 저비용 마커리스 DeepLabCut 기반 워크플로우

요약

우리는 DeepLabCut을 사용하여 자유롭게 움직이는 쥐의 자발적인 보행과 이동을 정량화하는 저비용 마커 없는 워크플로우를 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 카메라 비디오 획득, 해부학적 랜드마크의 무마커 추적, 시공간적 운동 매개변수 추출을 통합하여 전문 장비 없이도 비침습적이고 접근 가능한 운동 행동 분석 프레임워크를 제공합니다.

초록

보행은 협응력, 근력, 균형, 감각운동 통합의 변화를 반영하여 다양한 질병과 상태에서 운동 변화를 감지하는 데 널리 사용되는 기능적 바이오마커입니다. 하지만 동물 모델에서 보행을 분석하는 전통적인 방법은 종종 고가의 장비, 복잡한 장비, 또는 자연 행동을 변화시킬 수 있는 침습적 절차를 필요로 합니다. 여기서는 자유롭게 움직이는 쥐의 보행과 자발적 이동을 정량적으로 분석하기 위한 오픈소스 자세 추정 소프트웨어인 DeepLabCut을 기반으로 한 저비용, 마커 없는 워크플로우를 소개합니다. 이 방법은 물리적 마커나 특수 하드웨어 없이 단일 카메라 비디오 획득, 해부학적 랜드마크의 무표지 추적, 시공간 운동 매개변수 추출에 의존합니다. 프로토콜의 적용 가능성을 입증하기 위해, 알츠하이머병의 삼중 형질전환 마우스 모델(3xTg-AD)에서 대표적인 적용 예시로 구현되었습니다. 이 접근법은 자유로운 움직임을 유지하고 다루는 스트레스를 최소화하여 운동 행동을 비침습적으로 평가할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 표준 행동 테스트 환경과 호환됩니다. 전반적으로 이 방법은 전임상 연구에서 보행 및 이동의 정량적 분석을 위한 접근성 있고 비침습적인 틀을 제공합니다.

서론

보행은 운동, 감각, 인지 시스템의 실시간 상호작용에서 발생하는 복잡한 운동 과정으로, 안정적이고 적응^{적인 움직임을} 생성하기 위해 감각 피드백, 자세 조절, 운동 계획, 근육 활성화의 조정된 처리가 필요합니다. 이러한 통합적 특성 때문에 보행 변화는 임상 실무와 실험 연구 모두에서 신경학적 장애의 기능적 지표로 점점 더 인식되고 있습니다. 인간과 동물 모델에서 보행 분석은 이동성, 낙상 위험, 허약함, 기능 능력의 변화를 감지할 수 있게 하며, 여러 상태에서 질병 진행과 개입 효과에 대한 바이오마커로 제안되었습니다 ^2,3,4.

기초 연구, 특히 쥐 모델에서 자발적 보행과 운동 활동 평가는 운동 표현형을 특성화하고 생리적 교란과 치료 개입의 영향을 평가하는 데 널리 사용되는 전략입니다. 운동 매개변수의 객관적 정량화는 육안만으로는 신뢰성 있게 포착할 수 없는 미묘한 운동 변화를 감지할 수 있게 하여, 특히 초기 또는 경미한 표현형을 표적으로 하는 전임상 연구에서 제한이 있습니다⁵. 이러한 맥락에서 보행 분석은 운동 행동의 변화를 조사하고 신경학적 및 신경퇴행성 질환과 같은 다양한 실험 조건과 관련된 기능적 변화를 규명하는 데 유용한 도구로 부상했습니다^.

마우스 모델에서 운동 행동과 보행 분석은 전통적으로 공간적·시간적 운동 변수를 정량화하기 위해 설계된 전문 기술 플랫폼에 의존해 왔습니다. 조명 보행로, 계측 플랫폼, 상업용 모션 트래킹 소프트웨어와 같은 시스템이 일반적으로 사용됩니다; 하지만 비용이 많이 드는 하드웨어와 전용 인프라에 의존하기 때문에 많은 실험실의 접근성이 크게 제한됩니다 ^7,8,9,10. 경제적 고려를 넘어, 이러한 접근법들은 추가적인 실험적 제약을 도입합니다. 몇몇 시스템은 동물이 좁은 복도나 조명이 강한 차선을 통과하도록 요구하며, 이는 자발적 행동을 줄이는 강제 운동 패턴을 부여하는 반면, 다른 시스템은 물리적 마커, 페인트 스팟, 또는 팔다리에 부착된 접착 태그에 의존합니다. 이러한 개입은 스트레스를 유발하고 보행 역학을 변화시키며, 운동 결과의 생리학적 해석을 혼동시킬 수 있습니다 11,12,13,14. 이러한 한계는 침습적 절차나 고가의 인프라에 의존하지 않고 자연스럽고 자유롭게 움직이는 환경에서 보행을 포착할 수 있는 방법론의 필요성을 강조합니다.

제한 없는 이동 중 보행을 평가하면 속도, 궤적, 자세를 인위적으로 조절하는 외부 제약을 피하고 보다 자연스러운 운동 패턴을 관찰할 수 있습니다. 이 접근법은 최소한의 제약이 제한된 조건에서 운동 행동을 특성화하는 데 도움을 줍니다. DeepLabCut은 합성곱 신경망을 사용해 물리적 마커 없이도 사용자 정의 해부학적 랜드마크를 추적하는 오픈소스 딥러닝 기반 자세 추정 프레임워크입니다. 표준 비디오 녹화에서 해부학적 점 추적을 가능하게 함으로써, DeepLabCut은 운동학적 매개변수를 추출하면서 비용과 실험 복잡도를 크게 줄여줍니다 15,16,17,18. 중요한 점은, 마커 없는 추적이 실험 간섭을 최소화하여 자발적 행동 연구에 적합하다는 점입니다. 이 단일 카메라 마커 없는 접근법은 자유롭게 움직이는 조건에서 자발적 운동 활동과 2차원 보행 관련 특징을 접근성 있고 비침습적으로 정량화해야 하는 연구에 가장 적합합니다. 하지만 지면 반력, 족저 압력, 관절각, 또는 완전한 3차원 사지 운동학과 같은 직접적인 생체역학적 변수가 필요할 때는 계측된 보행 플랫폼이나 3차원 모션 캡처 시스템이 필요합니다.

이 글의 목적은 DeepLabCut 기반의 저비용 마커 없는 워크플로우를 제시하여 자유롭게 움직이는 쥐의 보행 및 자발적 이동을 비침습적으로 정량화하는 것입니다. 단일 카메라 비디오 수집, 해부학적 랜드마크 추적, 시공간 운동 매개변수 추출을 특수 하드웨어나 침습적 조작이 필요 없는 접근 가능한 워크플로우 내에 통합합니다. 이 프로토콜은 워크플로우의 방법론적 구현과 대표적 결과에 중점을 둡니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 NIH 실험동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었으며, 멕시코 국립자치대학교 신경생물학 연구소 생명윤리 위원회의 프로토콜 번호 117에 따라 승인되었습니다.

1. 맥락 연구

1. 연구에 필요한 실험 조건에서 쥐를 사용하세요. 이 프로토콜 논문에서는 APPSwe와 tauP301L 형질전환유전자를 PS1M146V knock-in 배경에 포함시키고, 비형질전환 마우스를 대조군으로 삼중 형질전환 마우스 모델(3xTg-AD)을 워크플로우 구현의 대표적 예로 사용합니다.
2. 연구 시작 전에 모든 동물의 유전자형 검사를 하세요.
3. 쥐에게 12시간 12분의 밝고 어두운 주기, 22 °C ± 2 °C, 상대 습도 60% ± 5%로 구성된 통제된 조건 하에 수의사의 감독 하에 쥐에게 자유롭게 음식과 물을 공급하세요.
4. 60분간의 익숙화 후 빛 단계에서 각 동물당 단일 야외 야외 세션을 사용하여 자발적인 탐색 행동을 유지하고 반복적인 경기장 노출로 인한 활동 감소를 피합니다.
   참고: 이 프로토콜 문서에서는 생물학적 비교를 지원하기 위해서가 아니라 작업 흐름과 방법으로 생성된 이동 및 보행 출력 유형을 보여주기 위해 대표적인 녹음을 제시합니다.

2. 재료

1. 자발적 이동 및 보행의 기록 및 분석을 위한 재료 및 장비 표에 기재된 재료와 장비. 실험 장치의 전체 조립은 그림 1을 참조하세요.

3. 자발적 이동의 습관화 및 기록

1. 동물 준비 및 습관 화
   1. 실험 최소 60분 전에 쥐를 보호실에서 행동 검사실로 조심스럽게 옮겨 환경적 습관화를 돕습니다.
   2. 행동 검사실을 20°C–22°C의 일정한 온도, 표준화된 조명 강도(경기장 수준에서 측정한 120–150럭스), 지속적인 백색소음 등 통제된 환경 조건 하에서 유지하여 외부 청각 자극을 최소화합니다.
   3. 습관 훈련 기간 동안에는 추가 자극이나 자극 없이 동물을 집 우리에 가두세요. 스트레스로 인한 행동 변동을 최소화하기 위해 기관 동물 복지 지침에 따라 동물을 다루세요.
   4. 깨끗한 장갑을 끼고 천천히, 의도적인 움직임으로 동물을 다루세요. 동물을 꼬리 밑부분으로 부드럽게 들어 올리고 반대 손으로 몸을 받쳐 놓은 후 개방된 들판 경기장에 놓으세요.
      참고: 중요한 단계: 일관성 없는 취급이나 충분한 적응 시간은 불안 관련 행동을 증가시키고 운동 매개변수에 변동성을 초래할 수 있습니다. 모든 동물과 세션에서 동일한 습관 화분 절차를 반드시 확인하세요.
2. 야외 경기장 및 카메라 준비
   1. 각 녹음 세션 전에 70%(v/v) 에탄올로 아크릴 개방 필드 경기장을 철저히 청소하여 잔여 냄새와 이전 향기 단서를 제거하세요. 사용 전에 표면이 완전히 마를 때까지 기다려 주세요.
   2. 70% 에탄올을 환기가 잘 되는 곳에서 다루고, 열이나 점화원에서 멀리 떨어뜨리며, 경기장이 완전히 건조될 때까지 기다려 주세요.
   3. 개방 필드 경기장을 나무 플랫폼 위에 안전하게 설치하여 구조물이 안정적이고 진동이 없도록 하세요.
   4. 투명한 아크릴 벽과 무광 바닥을 점검하여 먼지, 습기, 반사 잔여물이 없는지 확인해 영상 추적에 방해가 될 수 있습니다.
   5. 경기장 양쪽에 외부 측면 백색광등을 경기장 평면에 대해 대략 30–45° 각도로 배치하여 녹화 구역 전체에 균일한 조명을 제공하고 그림자, 반사, 과도한 밝기를 최소화하세요. 각 세션 전에 램프 배치를 조정하고, 경기장 레벨의 조명이 목표 범위인 120-150 럭스 내에 유지되는지 확인하세요.
   6. 카메라를 경기장 아래쪽 하단 시점으로 위치시키고, 경기장 평면에서 약 80cm 정도 고정된 거리를 확보하여 녹화 구역의 완전한 시야를 확보하세요. 이 최적 거리는 특정 카메라의 렌즈 조리개와 시야각(FOV)에 따라 조절해야 완전한 아레나 커버리지를 유지할 수 있다는 점에 유의하세요.
   7. 카메라를 컴퓨터 시스템에 연결하고 동물을 소개하기 전에 영상 촬영 소프트웨어를 실행하세요.
   8. 카메라 초점과 시야각을 조정하여 경기장 전체 표면이 보이고 선명하게 보일 수 있도록 하세요.
   9. 공간 보정을 위한 참조 이미지를 획득하기 위해 알려진 치수를 가진 체커보드 그리드 또는 보정 패턴을 경기장 평면에 배치합니다.
      참고: 중요한 단계: 정확한 카메라 정렬, 고정된 카메라 거리, 일관된 조명은 신뢰할 수 있는 무마커 자세 추정에 필수적입니다. 기하학적 또는 조명 조건의 편차는 추적 정확도를 떨어뜨리고 세션 간 데이터 비교 가능성을 저해할 수 있습니다.
      참고: 외부 지지 구조에는 스테인리스 스틸을 포함한 대체 재료가 사용될 수 있으며, 단, 설치 상태가 안정적이고 기록 정렬이 유지되어야 합니다.
      참고: 녹화 장비가 안정적이고 외부 시각적 간섭이 최소화되어야 할 경우 외부 시각 입력을 추가로 제어하고 싶을 때, 불투명 경기장이나 대체 벽 재료도 사용할 수 있습니다.
      참고: 이 프로토콜에서 사용된 경기장 크기는 자유롭게 움직이는 쥐를 기록하는 데 사용되는 구성과 일치합니다. 이 치수들은 완전한 동물 시야, 공간 보정, 일관된 획득 조건이 유지되는 한 설치된 설치류와 채택된 개방 필드 프로토콜에 따라 조정할 수 있습니다.
3. 자발적 운동 행동 기록
   1. 쥐를 경기장에 넣기 전에, 영상 프레임에 동물 식별자를 잠시 표시하여 녹화와 해당 실험 세션 간의 직접적인 시각적 연관성을 확보하세요.
   2. 쥐를 개방된 필드 중앙에 놓기 전에 동영상 녹화를 시작하여 세션 초반의 탐색 행동을 포착하세요.
   3. 쥐를 조심스럽게 개방된 들판 중앙에 놓으세요.
   4. 시각, 청각, 촉각적 방해 없이 3분 동안 자발적인 이동을 연속으로 기록하세요. 현재 프로토콜에서는 마우스당 한 번의 녹화 세션만 수행되었습니다.
   5. 컴퓨터 화면의 실시간 영상 피드를 모니터링하여 끊김 없이 녹화되고 동물의 움직임이 제대로 포착되었는지 확인하세요.
   6. 세션 간 카메라 정렬과 조명 균일성을 주기적으로 점검하여 동물 간 일관된 녹화 조건을 보장합니다.
   7. 녹화 시간이 끝나면 영상 촬영을 중단하고 위에서 설명한 동일한 취급 절차로 동물을 조심스럽게 경기장 밖으로 옮기세요.
   8. 동물을 다시 집 우리로 돌려보내고 휴식을 취한 후 추가 절차를 진행하세요.
      참고: 기록 중 동물의 위치를 바꾸지 마세요. 외부 간섭이 자발적인 보행 패턴을 변화시키고 하류 분석에 영향을 줄 수 있습니다.
4. 정리, 데이터 저장, 세션 완료
   1. 각 세션 후 70%(v/v) 에탄올로 개생 구역을 다시 청소하고, 완전히 말릴 때까지 기다려 다음 동물을 들여보세요.
   2. 다음 동물을 도입하기 전에 경기장 표면에 에탄올이나 악취가 남지 않도록 하세요.
   3. 각 녹화 직후 동물 식별자, 세션 날짜와 시간, 실험 조건, 운영자 이름을 즉시 문서화하세요.
   4. 추가 동물 실험이 있을 경우, 동일한 환경 및 실험 조건에서 3.1.1단계부터 절차를 반복합니다.
   5. 각 비디오 파일을 표준화된 명명 규칙(예: AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4)을 사용하여 전용 폴더에 저장하세요.
   6. 실험이 끝나면 세션마다 조명 설정의 드리프트를 방지하기 위해 카메라 시스템과 조명 장비를 종료하세요.
      참고: 본 프로토콜에서는 70% 에탄올이 사용되었으나, 이 절차에서 흔히 사용되는 소독제이기 때문에, 다음 녹화 전 경기장이 완전히 건조하고 잔여 냄새가 없을 경우 점진적인 표면 열화를 방지하기 위해 아크릴 호환 소독제도 사용할 수 있습니다.
      참고: 가능할 경우, 여러 장소를 준비하여 세션 간 즉각적인 전환을 가능하게 하고, 실험이 동물 간 지속적인 진행을 촉진할 수 있습니다.
      실험 장치의 재료와 조립물은 그림 1 을 참조하는데, 여기에는 목재 플랫폼(그림 1A), 아크릴 경기장(그림 1B), 측면 조명 시스템(그림 1C), 하단 카메라 위치(그림 1D), 그리고 완전한 실험 장비(그림 1E)가 포함됩니다.

그림 1: 야외 경기장에서의 이동 비디오 녹화를 위한 실험 장치. (A) 경기장 지지 구조; (B) 플랫폼에 설치된 아크릴 야외 경기장; (C) 균일한 조명을 보장하기 위한 측면 조명; (D) 아래에서 움직임을 기록하기 위한 카메라 위치; (E) 완전한 설치. 흰색 화살촉은 그림 1C 의 광원과 그림 1D의 카메라 방향을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. 비디오 처리 및 운동학적 분석

1. 영상 준비 및 품질 관리
   1. .에서 원본 비디오를 획득하세요. MOV 포맷을 설정하여 일정한 프레임 속도와 해상도 파라미터를 유지하면서 DeepLabCut과 호환되도록 .avi 형식으로 변환할 수 있습니다.
   2. B원본 비디오 파일을 획득 직후 분석 컴퓨터의 전용 폴더에 즉시 저장하고, 표준화된 명명 규칙(예: AnimalID_Session_Date)을 적용하세요.
   3. 녹화가 완전하고 중단, 프레임 손실, 손상 없이 녹화되었는지 확인하기 위해 각 영상을 전체적으로 검토하세요. 획득 오류가 있는 영상은 분석에서 제외해야 합니다.
   4. 원본 포맷이 DeepLabCut과 호환되지 않으면 비디오를 MP4(H.264) 또는 압축되지 않은 AVI 형식으로 변환하세요.
   5. 선택적으로, 세션 시작과 종료(예: 동물을 실험 현장에서 도입하거나 제거할 때)에 비실험적 간격을 제거하기 위해 영상 자료의 시간 다듬기를 수행할 수 있습니다.
   6. 해상도와 프레임 속도가 녹화 시 사용된 획득 매개변수와 일치하는지 확인하고, 모든 세션에서 일관성을 유지해야 합니다.
   7. 비디오 프레임 내에서 경기장 전체 표면이 보이는지, 이동 중에 신체 부위가 지속적으로 가려지지 않는지 확인하세요.
   8. 모든 검증 및 처리된 영상을 DeepLabCut 분석을 위한 지정된 프로젝트 디렉토리에 묶어두세요.
      참고: 중요한 단계: 프레임 속도가 불안정하거나, 경기장 시야가 부분적이거나, 모션 블러가 트래킹 정확도를 직접적으로 떨어뜨립니다. 품질 기준을 충족하지 못하는 동영상은 모델 훈련이나 추론에 포함되어서는 안 됩니다.
2. 프로젝트 생성 및 구성
   1. 프로젝트에 사용할 비디오 라이브러리를 지정하라. 분석용으로 의도된 동일한 영상이나 네트워크 교육용으로 대표적인 하위 집합을 사용한다.
   2. Python 환경을 실행하고 DeepLabCut 패키지를 가져오세요.
   3. 다음 명령어를 사용하여 새로운 DeepLabCut 프로젝트를 생성합니다:
   4. deeplabcut.create_new_project('프로젝트명', '저자', '비디오패스').
   5. config.yaml 파일에서 관심 있는 해부학적 랜드마크(신체 부위)를 정의하여 명확하고 해부학적으로 일관된 정의를 확보하세요.
   6. 신체 부위 정의는 실험 질문에 최적화되어야 하며, 모든 동물과 세션에서 동일하게 유지되어야 합니다.
3. 프레임 추출 및 신체 부위 라벨링
   1. config.yaml 파일에서 영상 길이와 공간 배치에 따라 start, stop, numframes2extract, cropping_parameters를 지정하세요.
   2. 대표 프레임을 다음과 같이 추출합니다: deeplabcut.extract_frames(config_path, '자동', 'kmeans'/'균일').
   3. 추출한 프레임을 검토하여 신체 자세, 방향, 사지 위치, 보행 단계 범위 등 기록 전반에 걸쳐 변화가 포함되었는지 확인하세요. 특정 자세, 사지 구성, 또는 운동 단계가 과소대표된다면, 이러한 조건을 더 잘 표현할 수 있도록 추가 프레임을 추출합니다.
   4. 특정 보행 주기 단계가 필요할 때는 deeplabcut.extract_frames(config_path, '수동')을 사용하여 수동으로 프레임을 추출합니다.
   5. 그래픽 라벨링 인터페이스를 deeplabcut.label_frames(config_path)로 실행하세요.
   6. 그림 2에 표시된 모든 미리 정의된 해부학적 랜드마크를 라벨링하세요. 여기에는 획득 시 대표적인 비디오 프레임(그림 2A), 원본 프레임에 겹쳐진 자동 신체 지점 감지(그림 2B), 그리고 분석에 사용되는 정의된 신체 랜드마크 및 경기장 기준점의 도식적 표현(그림 2C)이 포함됩니다. 일관된 해부학적 기준을 따르세요(예: 코: 주둥이 앞쪽 끝; 꼬리 밑부분: 척추와 꼬리 사이의 접합부)
   7. 네 개의 팔다리 모두 일관되게 표시하세요. 각 랜드마크는 땅과 닿을 때 발바닥 패드 위에 발 중앙에 위치시키세요.
   8. deeplabcut.check_labels(config_path)로 라벨을 저장하고 검사하며, 필요하다면 부정확한 주석을 수정하세요.
   9. 가능하다면, 두 번째 훈련된 평가자에게 프레임 일부를 라벨링해 평가자 간 일관성을 평가하도록 요청하세요.
      참고: 중요한 단계: 일관성 없거나 해부학적으로 부정확한 라벨링은 후속 추적 오류의 주요 원인입니다. 모든 프레임에서 랜드마크 정의를 엄격히 준수해야 합니다.
4. 신경망 훈련
   1. 포즈 추정 모델을 200 에포흐 동안 훈련시키고, 최종 평균 훈련 오차(RMSE)는 3.27 픽셀, 평균 테스트 오차는 3.59 픽셀로, 이는 앞서 설명한 획득 조건에서 안정적인 추적 성능에 해당합니다.
   2. 다음 deeplabcut.create_training_dataset(config_path)를 사용하여 훈련 및 평가 데이터셋을 생성하세요.
   3. config.yaml에서 Training Fraction 매개변수를 조정하여 학습에 사용되는 이미지의 비율을 정의하세요.
   4. GPU 사용 가능 여부는 nvidia-smi를 실행해 확인하세요.
   5. 네트워크 학습 시작 방법은 다음과 같습니다: deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, epochs=200).
   6. 훈련 손실을 모니터링하고, 손실 값이 안정되고 추가 개선이 관찰되지 않으면 훈련을 중단하세요.
   7. 훈련이 중단되면 마지막으로 저장된 체크포인트부터 재개하세요.
   8. deeplabcut.evaluate_network(config_path)를 사용하여 학습된 모델을 평가하고 평균 픽셀 오차를 기록합니다.
   9. 오류가 실험 설정에서 허용 가능한 임계값을 초과하면 추가 라벨링 프레임을 추가하거나 주석을 다듬고 훈련을 반복하세요.
      참고: 허용 가능한 픽셀 오류 임계값은 카메라 해상도와 경기장 크기에 따라 달라질 수 있으나, 실험 간에 일관성을 유지해야 합니다.
5. 비디오 분석 및 보행 정량화
   1. 가능성이 0.3 미만인 점을 누락된 것으로 간주합니다.
   2. 선형 보간은 간격이 ≤ 프레임 연속일 때만 빠진 점을 보간합니다; 분석에서 더 긴 격차는 제외합니다.
   3. 몸 중심 속도 임계값을 10 cm/s로 정의하는 운동 동작을 정의합니다.
   4. 이 임계값 이하의 움직임과 3프레임 미만의 일시적 이벤트는 제외합니다.
   5. 실험 영상에 대해 다음과 같은 deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=참)을 사용하여 추론을 실행하세요.
   6. deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path])를 사용하여 라벨이 붙은 동영상을 생성하여 추적 품질을 시각적으로 확인하세요(그림 2).
   7. config.yaml에서 pcutoff 파라미터를 0.6으로 설정하여 추적 시각화 및 평가 시 신뢰도 임계값을 적용하세요.
   8. 출력 CSV 파일을 재료 표에 나열된 통계 컴퓨팅 환경으로 가져오고, 해당 분석 패키지 및 행동 정량화를 위한 보조 자료 1 에 제공된 맞춤형 스크립트도 함께 포함합니다.
   9. 프레임 인덱스를 원본 비디오 샘플링 속도를 사용해 시간으로 변환하세요.
   10. 알려진 경기장 치수와 추적된 경기장 모서리 랜드마크를 이용해 픽셀 좌표를 물리적 단위로 변환하여 공간 차원을 보정합니다.
   11. 미터법 추출 전에 추적된 좌표에 대해 품질 관리를 수행하세요.
   12. 가능도 값이 0.3 미만인 점들을 누락된 것으로 간주하고, 적절할 경우 선형 보간으로 대체합니다.
   13. 시각적 검사 중 이상치 경로를 식별하고 필요 시 수정하거나 제외하세요.
   14. 신체 중심 변위와 뒷다리 움직임을 기반으로 동기화된 운동학 기준을 사용하여 보행 구간을 정의합니다.
   15. 몸을 들이기, 돌리기, 그루밍과 같은 비운동 행동은 제외하세요.
   16. 실험 조건과 동물 모델에 따라 정의 임계값을 수동으로 보정하고 정제하여 분석할 수 있도록 견고하고 연속적인 운동 구간만을 유지합니다.
   17. 필터링된 연속 운동 구간을 사용하여 추적된 랜드마크 간의 기하학적 및 시간적 관계로부터 도출된 보행 지표를 계산합니다(표 1). 여기에는 보폭 길이, 보폭, 케이던스, 보폭, 스탠스 시간, 스윙 시간, 동측 진폭, 그리고 사지별 변위 측정값이 포함되었습니다.
   18. 동일한 추적 데이터를 사용하여 전체 녹음에서 개방 필드 지표를 추출합니다(표 1). 여기에는 총 이동 거리, 평균 속도, 이동 시간, 이동 시간 비율, 걷기 경기 횟수 및 지속 시간, 중앙, 주변, 코너 구역에서 누적 이동 거리가 포함되었습니다.
   19. 모든 출력을 구조화된 마스터 파일로 컴파일하여 하위 통계 분석에 활용합니다.
   20. 재료표에 나열된 계산 환경과 위 에서 설명한 플롯 스크립트를 사용하여 시각적 표현(예: 궤적, 열지도, 시간 기반 변위, 보행 패턴, 사지 간 조정 플롯)을 생성합니다.
   21. 보조 영상 1과 보조 영상 2에서는 분석 워크플로우 해석을 용이하게 하기 위해 점 신뢰도, 보행 충돌 감지, 탐색적 영역 분류, 사지 간 협응의 대표적인 동기화 시각화가 제공됩니다.
6. 품질 관리 및 데이터 백업
   1. 무작위로 라벨이 붙은 영상 일부를 시각적으로 살펴보며 프레임과 세션 전반에 걸쳐 해부학적 일관성을 확인하세요.
   2. 예측된 랜드마크 위치를 주석이 달린 라벨과 비교하여 모델의 안정성과 일반화를 검증합니다.
   3. config.yaml, 원본 라벨, 학습된 네트워크 가중치, 출력 파일 등 프로젝트의 전체 복사본을 저장하세요.
   4. 워크플로우에서 사용되는 소프트웨어 버전(DeepLabCut, Python, PyTorch, CUDA, 통계 컴퓨팅 환경 포함), GPU 사양 및 분석 날짜를 문서화하세요.
   5. evaluation-results.csv에서 평균적인 오류와 처리 시간을 요약 보고서를 생성하세요.
   6. 전체 프로젝트를 로컬 아카이브와 기관 서버 또는 안전한 클라우드 저장소에 백업하세요.
7. 계산 환경 및 재현성 자원
   1. 원본 비디오 녹화를 .에서 캡처하세요. 1080 × 1920 픽셀, 약 60 FPS의 해상도로 MOV 포맷을 제공합니다.
   2. 영상을 .avi 형식으로 전처리하고 트랜스코딩하세요.
   3. 변환 단계에서 관심 영역을 자르고, 720 × 720 픽셀의 정사각형 해상도로 크기를 조정하며, 프레임 속도를 일정한 60 FPS로 표준화하여 이후 운동학 분석 시 정확한 시간 정량화를 보장합니다.
   4. DeepLabCut 버전 3.0.0rc13을 사용하여 Python 3.12.12, PyTorch 2.5.1, CUDA 11.8로 구성된 환경에서 마커리스 추적 워크플로우를 구현하세요.
   5. 포즈 추정 모델을 200 에포크에 대해 훈련시키고, 최종 평균 훈련 오차(RMSE)는 3.27 픽셀, 평균 테스트 오차는 3.59 픽셀을 얻습니다.
   6. 통계 컴퓨팅 환경과 보 충 자료 1 에 제공된 맞춤형 스크립트를 사용하여 보행 및 개방 현장 정량화를 수행하라.
   7. 걷는 동작을 식별할 때 몸 중심 속도 임계값을 10cm/s로 사용하세요. 운동 시기 사이에 최대 3프레임의 간격을 채우고, 3프레임보다 짧은 일시적인 움직임은 제외하여 연속적인 보행 구간을 유지하여 분석할 수 있습니다.
   8. 관련 config.yaml 설정, 대표성 분석 스크립트, 예시 비디오 및 추적 파일, 모델 가중치를 보조 자료 1에 제공하세요.
   9. 추가 구현 세부사항, 모델 평가 지표, 하드웨어 사양, 사례별 분석 매개변수를 보조 자료 1에 포함하세요.
      참고: 각 실험에서 사용하는 획득 조건에 따라 이 매개변수들을 조정하세요.

그림 2: 비디오 녹화에서 마커 없는 신체 점 추적 및 보행 분석을 위한 대표적인 워크플로우. (A) 획득 중 개방된 필드 경기장 내에서 자유롭게 움직이는 쥐의 대표적인 비디오 프레임. (B) 자세 추정 후 원본 비디오 프레임에 자동 신체 점 감지 예시를 덧씌워 분석에 사용된 해부학적 랜드마크를 보여줍니다. (C) 보행 재구성, 공간 보정 및 정량적 운동 분석에 사용되는 정의된 신체 랜드마크와 경기장 기준점의 도식적 표현. 랜드마크 및 경기장 기준점: 주둥이, 목, 바디 센터, 바디 센터 왼쪽(bcl), 바디 센터 라이트(bcr), 왼쪽 엉덩이(hipl), 오른쪽 엉덩이(hipr), 꼬리 밑부분, 꼬리 중앙, 꼬리 끝(lfp), 왼쪽 뒷발(lhp), 오른쪽 앞발(rfp), 오른쪽 뒷발(RHP), 오른쪽 뒷발(RHP), 왼쪽 상단(TL), 오른쪽 상단(TR), 왼쪽 하단(BL), 오른쪽 하단(BR). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

추적 및 분석 워크플로우 적용 후, 자동 처리는 정의된 신체 중심 랜드마크를 이용해 자발적 개방 이동을 재구성하고 후속 분석에 적합한 정량적 출력을 생성했습니다. 대표적인 궤적 플롯은 프로토콜이 자유 탐사 중 경기장 전반의 공간 이동, 시간 점유, 속도 역학을 어떻게 포착하는지를 보여줍니다. 이 섹션에 표시된 개방 필드 변수들은 전체 녹음에서 계산되었으며, 프로토콜이 생성하는 운동 및 보행 출력 유형을 보여주기 위해 대표적인 녹음도 포함되어 있습니다.

대표적인 비-Tg 기록에서는 재구성된 신체 중심 궤적이 경기장 전체에 걸쳐 연속적으로 이동하는 모습을 보여주며(그림 3A), 시간 밀도와 속도 코딩 시각화는 탐험 중 장기간 점유 영역과 움직임 속도 변동 영역을 강조합니다(그림 3B). 대표적인 3xTg-AD 녹음은 공간적으로 더 제한된 궤적과 축소된 경기장 커버리지(

토론

본 연구는 표준 비디오 획득과 DeepLabCut 기반 자세 추정을 이용해 자유롭게 움직이는 쥐의 자발적 이동과 보행을 접근 가능한 워크플로우 내에서 분석하는 저비용, 마커 없는 접근법을 제시합니다. 이 워크플로우는 자연스러운 운동 동작을 보존하고 실험 간섭을 줄이면서 동영상 녹화에서 운동 및 보행 관련 변수를 추출할 수 있게 합니다. 이런 의미에서 프로토콜은 운동 행동의 전임상 연구에 실용적이고 접근 가능한 대안을 제공합니다.

이 프로토콜은 알츠하이머병의 형질전환 마우스 모델에서 워크플로우의 대표적 응용으로 입증되었습니다. 생성된 출력은 이 접근법을 통해 얻을 수 있는 운동 및 보행 변수 유형(^{19, 20, 21,}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
70% 에탄올	일반	N/A	세션 사이 경기장 청소
조정 가능한 백색광 램프	일반	N/A	일정한 조명 유지(100–150 lx)
검은색 커튼/광택 제어	일반	N/A	외부 광선/반사 감소
체커보드 그리드 템플릿	일반	N/A	공간 보정 참조 이미지
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	오픈소스	N/A	포즈 추정 소프트웨어
디지털 비디오 카메라(HD, 16:9; ≥60 fps)	일반	N/A	세션 간 고정 설정
Nvidia GPU 워크스테이션	사용자 정의 빌드	N/A	모델 학습/추론을 위한 하드웨어
럭스 미터	일반	N/A	경기장 수준의 조명 확인
PyTorch	Pytorch 재단	N/A	DeepLabCut이 필요한 프레임워크
투명 아크릴 오픈필드 경기장(42 × 42 × 42 cm)	맞춤형 / 자체 제작	N/A	오픈필드 경기장
경기장 아래 카메라 마운트(90° 뷰)	맞춤형 / 자체 제작	N/A	하단 레코딩을 위한 안정된 마운트
CUDA	Nvidia Corporation	N/A	GPU 가속 병렬 처리
R 프로그래밍 언어	R 재단	N/A	데이터 분석을 위한 프로그래밍 언어