이 연구는 성체 제브라피시에서 정밀하고 비침습적이며 체질량 기반 경구 약물 전달을 가능하게 하는 젤라틴 기반 급식 방식을 제시합니다. 이 프로토콜은 신뢰할 수 있는 피드 수용과 원리 증명으로서 MK-801의 성공적인 전달을 입증하여 예상한 행동 효과를 가져왔습니다.
이 논문에서
요약
초록
물고기에서 약물 전달의 일반적인 방법(예: 비커 투여, 복강내 주사, 구강 관개)은 시간이 많이 걸리고, 부정확하며/또는 낭비가 많습니다. 이러한 방법들은 동물에게도 스트레스를 주기 때문에, 반복적이거나 장기적인 약물 투여와 행동 실험에는 적합하지 않으며, 이는 취급 관련 혼란 변수에 민감한 경우가 많아 생의학 연구에서 어류 모델의 활용도를 제한합니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 젤라틴 기반 급여법이 개발되어 최소한의 교란 없이 빠르고 정확한 약물 투여를 가능하게 했습니다. 이 방법은 젤라틴, 브라인 새우 추출물, 스피룰리나, 그리고 선택한 약물로 구성된 개별 맞춤형 사료 조각을 준비하는 것입니다. 젤라틴의 열 유연성 특성 덕분에 단일 균질한 제제를 액화시키고, 개별 체중에 따라 정확한 분량을 나누어 맞춤형 모젤로 재고화할 수 있습니다. 원리 증명으로, NMDA 수용체 길항제 MK-801(4 mg kg⁻1)이 새로운 수조 테스트 전에 성체 제브라피시에게 투여되었고, 이로 인해 불안 유사 행동 감소와 일치하는 행동 효과가 나타났습니다. 이 접근법은 행동 약리학에 매우 적합하며 다른 수생 모델 생물에도 쉽게 적용할 수 있습니다.
서론
제브라피시(Danio rerio)는 생의학 연구에서 발달, 생리학, 행동학, 약리학 1,2,3을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 그러나 제브라피시의 약리학적 연구, 특히 성체 동물에서의 유용성은 정밀하고 최소한의 교란을 일으키는 약물 전달 방법의 가용성에 의해 제한됩니다.
비커 투여, 복막 내 주사, 경구 관개 투여와 같은 제브라피시에 일반적으로 사용되는 약물 투여 기법은 각각 상당한 단점을 가지고 있습니다. 비커 투여를 통한 전신 침시 노출은 약물 흡수에 제한적인 통제를 제공하고, 상당한 화합물 폐기물을 발생시키며, 흡수율과 화합물 안정성 차이로 인한 변동성을 초래합니다 5,6,7. 주사 기반 접근법과 경구 가비지는 더 정확한 투여를 가능하게 하지만 마취, 구속, 반복적인 접촉이 필요하며, 이는 스트레스 반응을 유발하고 부상이나 저산소증 위험을 증가시켜 행동 및 생리적 측정을 혼란시킬 수 있습니다 8,9,10. 이러한 한계는 반복적이거나 장기간 약물 투여가 필요한 실험에서 특히 문제적입니다.
이러한 문제를 해결하기 위해 젤라틴 기반 급여 방식이 개발되어 제브라피시11에게 빠르고 정밀하며 비침습적인 약물 전달이 가능했습니다. 이 방법은 약리학적 화합물을 젤라틴, 브라인 쉬림프 추출물, 스피룰리나로 구성한 작고 개별적으로 맞춤화된 사료 조각에 포함시킬 수 있게 합니다. 사료 기반 약물 전달은 윤리적 동물 연구에서 3R(대체, 감소, 정제) 원칙에 부합하는 비침습적 대안입니다. 이전 연구들은 성체 제브라피시12, 13, 14에서 사료 기반 약물 전달의 실현 가능성을 입증했으나, 기존 접근법은 개체별 체중 차이를 고려하지 않는 이질적인 먹이 매트릭스나 고정된 사료량에 의존하고 있습니다. 여기서 설명하는 방법은 무게 기반 선량 보정을 가능하게 하여 이러한 한계를 해결합니다.
이 프로토콜은 성체 제브라피시에서 젤라틴 기반 사료 준비 및 투여에 대한 상세하고 단계별 설명을 제공합니다. 이 방법은 새로운 수조 실험이라는 행동 분석법을 통해 시연되었지만, 제브라피시 생물학의 다른 영역에도 널리 적용 가능하며 다른 수생 모델 생물에도 적용할 수 있을 것으로 기대됩니다. 이 프로토콜은 특히 정밀하고 반복적이며 장기적인 약리학적 조작이 필요한 연구에서 제브라피시에서 효율적이고 재현 가능하며 저스트레스 약물 전달을 원하는 연구자들에게 실용적인 해결책을 제공합니다.
프로토콜
이 연구에는 성체 수컷과 암컷 AB와 TL 제브라피시(4–12개월)가 사용되었습니다. 모든 동물은 웨인 주립대학교에서 사육되고 사육되었습니다. 모든 절차는 웨인 주립대학교 지침에 따라 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 어류는 표준 조건 아래 고밀도 선반(온도 27.5 ± 0.5 °C, 수질 전도도 500 μS ± 10 μS, pH 7.5 ± 0.2)에서 14시간 10분의 밝은/어둠 주기(08:00 시에 조명 켜짐)를 사용했습니다. 물고기는 하루 두 번 먹이를 주었으며, 아침에는 건식 사료, 오후에는 갓 부화한 염수새우를 먹였습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 어류 무게 측정 및 사료 부피 계산
- 100mL 유리 비커에 약 50mL의 시스템물을 채우고 디지털 저울에 올려놓으세요. 저울을 줄이세요.
- 집 어항에서 미세한 그물을 사용해 한 마리의 물고기를 부드럽게 그물로 채취하세요. 그물을 마른 종이 타월에 잠시 대어 과도한 물을 제거하세요.
- 물선을 조심스럽게 비커에 옮기면서 물이 비늘에 흘러가지 않도록 하세요.
- 무게를 기록하고 이 측정된 무게를 사용해 각 물고기의 체중당 1% 부피(V/BW)를 기준으로 필요한 사료량을 계산합니다.
2. 소금새우 추출물 제조
- 염수새우 가루를 증류수에 최종 농도인 250 mg/mL로 현탁합니다. 실온에서 1시간 동안 저어줍니다. 현탁액을 12,500 × g에서 실온에서 10분간 원심분리하고 상원액을 유지합니다.
- 원심분리를 한 번 더 반복한 후 상원액을 다시 수집합니다.
- 염수새우 추출물을 −20°C에서 최대 6개월간 보관하세요.
3. 젤라틴 기반 사료 제조
- 준비 전에 브라인 새우 추출물을 해동하고, 원하는 젤라틴 사료 양에 필요한 젤라틴(12% w/v), 스피룰리나(4% w/v), 그리고 해당되는 경우 필요한 약리학적 화합물의 목표 질량을 계산합니다.
- 스피룰리나와 젤라틴 가루(돼지 유래; 300g≈ 블룸을 각각 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 각 튜브의 실제 질량을 기록합니다. 측정된 질량이 최종 목표 부피의 목표 질량 이상인지 확인하세요.
- 스피룰리나 함유 튜브에 적절한 양의 브라인슈리프 추출물, 약물 화합물, 물을 첨가하여 최종 4% w/v 스피룰리나와 80 mg/mL 브라인 슈림프 추출물의 농도를 달성합니다.
- 균질화하기 위해 완전히 소용돌이를 사용하세요. 이전 단계에서 필요한 혼합물의 부피를 젤라틴 함유관으로 옮기면 최종 젤라틴 농도는 12% w/v가 됩니다.
- 튜브를 미리 데워진 45 °C 가열 블록 위에 5분간 올려놓고, 젤라틴이 완전히 녹을 때까지 간헐적으로 소용돌이치게 합니다. 용해가 불완전할 경우, 균질화를 돕기 위해 멸균된 나무나 금속 교반봉을 사용해 부드럽게 저어줍니다.
- 완전히 균질화된 혼합물(튜브당 최대 100 μL)을 라벨이 붙은 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 분할 추출합니다.
- 완전히 굳어지고 급여 시 다루기 편리하게 하기 위해 −20 °C에 하룻밤 보관하세요.
4. 개별 사료 모자의 형성
- 알리투어한 젤라틴 혼합물을 45°C에서 완전히 액체화될 때까지 재가열한 후 급여합니다.
- 액화된 젤라틴 혼합물을 완전히 소용돌이로 돌리세요.
- 물고기 체중의 1%에 해당하는 부피를 파라핀 필름 시트에 피펫팅하여 개별 조각을 만듭니다(그림 1).
참고: 취급과 보관을 용이하게 하기 위해, 부피를 분배하기 전에 페트리 접시 안에 파라핀 필름 한 장을 넣으세요. 이렇게 하면 파라핀이 평평하게 유지되고, 준비된 조각을 저장할 때 −20°C로 옮기기가 더 쉬워집니다. - 재응고를 위해 −20°C에 최소 20분간 두세요.
- 먹이를 줄 때까지 얼음 위에 보관하세요.
5. 젤라틴 사료 투여
- 물고기를 하우징 랙에서 행동실로 옮기고 1시간 동안 적응시키세요.
- 먹이 주기 전 2–5분 동안 투명 장벽을 사용해 수조 내 각 물고기를 일시적으로 격리하세요.
- 겸자를 사용해 각 물고기 몸무게의 1%에 해당하는 개별 젤라틴 먹이를 각 고립된 물고기 앞 수면에 놓습니다.
- 각 물고기를 관찰하여 5분 이내에 사료 전체를 소비하는지 확인하세요.
- 물고기가 사료를 먹은 후에는 장벽을 제거하고 물고기를 집 어항으로 돌려보내거나 실험적인 절차를 진행하세요.
참고: 사료 준비 및 목표 및 실제 투여량 계산을 설명한 작업 예제는 보충 파일 1에 제공되며, 예시 값도 표 1에 제시되어 있습니다.
결과
젤라틴 사료의 맛도
사료의 맛을 평가하기 위해, 성체 AB와 TL 얼룩말피시는 아침 먹이 대신 5일 연속 젤라틴 기반 사료를 제공했다(그림 2). 모든 TL 어류는 첫 노출 시 5분 이내에 사료를 섭취했으나, AB 어류는 반복 노출이 필요했으며, 16마리 중 15마리는 적응 후 4일 연속 사료를 꾸준히 섭취했습니다(그림 2A). 사료 섭취 시간을 3자 ANOVA(성별 × 일× 줄여 분석한 결과, 긴장(F₁,₁₂₅ = 19.4, P < 0.0001)과 일(F₄,₁₂₅ = 5.80, P < 0.001)의 주요 영향은 없었으나, 성별의 주요 영향은 없었다(F₁,₁₂₅ = 0.24, P = 0.63). 균주와 일(F₄,₁₂₅ = 3.35, P = 0.012) 및 균주, 일, 성별 간에는 유의미한 상호작용이 관찰되었습니다(F₄,₁₂₅ = 2.55, P = 0.04). TL 어류 양성 모두 첫 노출(4–20초)부터 빠르게 먹이를 섭취한 반면, AB 어류는 초기 섭취 시간이 더 길었고(7–144초), 며칠이 지나면서 감소했다(그림 2B). 4일차와 5일째에는 AB 수컷 한 마리를 제외한 모든 물고기가 10초 이내에 사료를 먹었습니다. 약 95%의 어류가 적응 후 2–3일 후 30초 이내에 젤라틴 사료를 섭취하며, 이는 이전에 보고된15,16입니다.
젤라틴 사료를 이용한 MK-801의 행동 효과
젤라틴 기반 약물 전달의 효과를 입증하기 위해, N-메틸-D-아스파르트산 수용체(NMDAR) 길항제인 MK-801을 젤라틴 사료로 투여하였습니다. 새로운 탱크 탐사 중 바닥 거리는 행동 측정으로 측정되었습니다. MK-801은 성체 제브라피시17에서 이동 및 불안과 유사한 또는 포식자 회피 행동을 변화시키는 것으로 알려져 있습니다. 성체 AB 제브라피시는 약물 없이 젤라틴 조각을 이틀 연속으로 받아 익숙함과 안정적인 섭취를 보장함으로써 먹이 절차에 적응시켰습니다. 셋째 날, 처리군에 배정된 물고기들은 젤라틴 사료에 MK-801(4 mg kg⁻1) 단일 투여를 받았습니다. 대조군은 동일한 젤라틴 조각을 포함한 물질(물)만 받았습니다. 새로운 수조 테스트에서 행동 평가 30분 전에 먹이를 투여했습니다.
불안과 유사한 또는 포식자 회피 행동은 바닥으로부터의 거리로 측정되었으며, 2 × 2 ANOVA(성× 약물)를 사용해 MK-801의 유의미한 주효과를 확인했다(그림 3)(F₁,₆₉ = 24.5, P < 0.001). 약물 처리를 받은 물고기는 수조 상단 근처에 더 많은 시간을 머무르는데, 이는 일반적으로 불안과 유사한 행동이나 포식자 회피 행동이 감소한 것으로 해석됩니다. 성별(F1,69=2.52, P=0.12)이나 성 상호작용에 의한 약물(F1,69=1.0, P=0.32)의 주요 효과는 없었다. FDR 보정 쌍방향 t검정은 MK-801이 여성(P = 0.0076)과 남성(P = 0.023) 모두에서 바닥 거리를 증가시킨다는 것을 확인했다.
이 결과들을 종합해 젤라틴 기반 사료가 약리학적 화합물의 효과적인 경구 전달을 가능하게 하며, 새로운 탱크 테스트에서 약물 유발 행동 변화를 유도한다는 것을 보여줍니다.
그림 1: 젤라틴 사료 준비. 젤라틴 급료는 체중의 1%에 해당하는 개별 맞춤 조각으로 파라핀 필름에 피펫팅되어 −20 °C에서 굳혔습니다. 이 수치는 Ochocki 등11에서 수정된 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 2: 성체 제브라피시의 젤라틴 기반 사료 섭취량. (A) AB 및 TL 어류 중 투여 후 5분 이내에 사료를 섭취한 성별 비율. (B) AB와 TL 물고기의 성별별 섭취 시간. 사료를 섭취하지 않은 물고기는 먹기 시간 분석에서 제외되었습니다. 데이터는 s.e.m.± 평균 값으로 표시됩니다; n = 품종과 성별당 8마리. 이 수치는 Ochocki 등11에서 수정된 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 3: NMDA 수용체 길항제 투여의 행동 효과. MK-801(4 mg/kg)은 성체 AB 제브라피시 남녀를 대상으로 새로운 수조 검사 30분 전에 투여되었습니다. 수조 바닥과의 거리는 불안과 유사한 행동/포식자 회피 행동의 척도로 사용되었습니다. 데이터는 중앙값(중심선), 사분위 간 범위(박스), ±1.5× 사분위 범위(수염)를 보여주는 박스 앤 위스커 플롯으로 제시됩니다. *P < 0.05, 거짓 발견률 보정 쌍별 t-검정에 기반합니다. 표본 크기: 여성 차량, n = 20; 여성형 MK-801, n = 19; 남성 차량, n = 19; 남성 MK-801, n = 15. 젤라틴 사료를 섭취하지 않은 동물 5마리가 분석에서 제외되었습니다. 이 수치는 Ochocki 등11에서 수정된 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
| 구성 요소 | 가축 농도 | 표적 집중 | 목표 질량/부피 | 실제 질량/부피 |
| 젤라틴 | - | 12% (부정) | 60mg | 62mg |
| 스피룰리나 | - | 4% (무대) | 20mg | 25mg |
| 브라인 새우 추출물 | 250 mg/mL | 80 mg/mL | 160 μL | 200 μL |
| 약물 | 10 mg/mL | 0.4 mg/μL (1% BW에서 4 mg/kg) | 20 μL | 25 μL |
| 물 | - | - | 320 μL | 400 μL |
| 액체 공급 총 부피 | - | - | 500 μL | 625 μL |
| T OTAL 완성 사료 부피 | - | - | 500 μL | 516.7 μL |
표 1: 젤라틴 사료 준비 예시. 1% 체중에서 4 mg/kg 약물 전달을 위해 젤라틴 기반 사료를 준비하는 데 사용된 재고 농도, 표적, 그리고 가상의 실제 질량 또는 부피.
보조 파일 1: 여러 마리의 어류를 위한 젤라틴 기반 사료 준비 예시. 약물 함유 사료의 조제와 개별 체중에 따른 개별 용량 계산을 시연하는 작업 예제입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
토론
여기서 제시된 젤라틴 기반 급식 방법은 제브라피시에서 일반적으로 사용되는 약물 전달 방식의 주요 한계를 극복하여, 최소한의 취급으로 개별화된 체중 기반 용량을 가능하게 합니다. 이로 인해 실험의 정밀도와 재현성이 향상됩니다. 젤라틴의 열적 유연성 덕분에 단일 균질한 제물을 액화하여 정확한 분량을 내고, 개별화된 조각으로 재고화하여 개체별 크기 변동을 고려하면서도 균일한 약물 분포를 보장한다. 또한, 젤라틴 공급을 통한 경구 투여는 주사 기반 방법과 관련된 스트레스와 잠재적 손상을 피하며, 이는 3Rs 프레임워크4에 따른 중요한 개선입니다.
이 접근법의 장점은 정확한 실행에 달려 있습니다. 성공적인 실행에는 여러 절차적 요소가 매우 중요합니다. 개별 체중의 정확한 측정이 필수적인데, 성체 제브라피시는 나이, 성별, 혈통 일치 그룹 내에서도 상당한 크기 이질성을 보일 수 있으며, 개체 간 체중 차이가 거의 세 배에 달하기 때문입니다11, 18, 19. 젤라틴 매트릭스 내에서 화합물의 철저한 균질화도 공급 부분 전반에 걸쳐 일관된 투여를 보장하는 데 똑같이 중요합니다. 마지막으로, 약물 투여 전에 젤라틴 사료에 적응시키는 것은 먹이 거부를 줄여줍니다; 정확한 투여를 위해 사료 섭취 시 시각적으로 확인하는 것이 권장됩니다.
그러나 적절한 실행이 이루어지더라도, 사료 기반 약물 전달에는 실질적인 도전 과제가 존재합니다. 한 가지 잠재적 문제는 사료 조각을 부적절하게 배치하면 물에 넣은 후 사료가 빠르게 분해될 수 있다는 점입니다. 이는 일반적으로 준비 중 온도 조절 및 혼합 부족, 장시간 가열, 또는 반복되는 동결-해동 사이클 때문에 발생합니다. 이를 방지하기 위해 젤라틴이 완전히 녹도록 적절한 가열/혼합을 통해 보장해야 하며, 준비된 재고는 한 번만 해동한 후 신속히 사용하는 일회용 용량으로 분할 교환되어야 합니다. 민감한 준비 과정의 경우, 실험 전에 적절한 세팅을 확인하여 물을 담은 비커에 추가하여 추가하는 추가 사료 조각을 준비하는 것이 권장됩니다. 사료 맛을 감소시키는 화합물의 경우, 조개 주스12˒13 이나 상업용 어류 유인체20과 같은 유인제를 도입함으로써 수용성을 높일 수 있습니다. 본 연구에서는 염수새우 추출물을 사용하여 맛을 개선했으며 효과가 입증되었습니다. 또는 여러 차례 소량 투여하면 원하는 누적 노출을 달성하면서 섭취량을 개선할 수 있습니다. 이러한 실용적 고려사항 외에도, 사료 기반 전달은 본질적인 약동학적 한계를 가지고 있습니다. 모든 경구 전달 방법과 마찬가지로, 위장 흡수는 주사 기반 접근법에 비해 생체이용률을 지연시키거나 감소시킬 수 있으며, 사료 매트릭스 내 화합물 안정성도 다양할 수 있습니다.
적응에도 불구하고, 소수의 동물은 젤라틴 사료를 섭취하지 않을 수 있으며, 예상 약물 용량을 받지 못할 수 있으므로 분석에서 제외해야 합니다. 거부율은 일반적으로 2.4%에서 6.4% 사이이며, 따라서 주요 방법론적 장애물이 되지 않습니다. 사료 섭취량도 품종에 따라 다를 수 있습니다. 이 균주 효과는 유전적 배경이 식품20에 접근하는 잠복에 영향을 미칠 수 있다는 이전 보고서와 일치합니다. 이러한 요소들은 실험 설계 시 고려해야 합니다. 사료 준수를 균주 식별과 함께 보고하는 것이 투명성과 재현성을 높이는 것이 권장됩니다.
본 연구의 또 다른 중요한 한계는 프로토콜이 성체 제브라피시에서만 개발되고 검증되었으며, 따라서 유충 단계로 직접 적용할 수 없다는 점입니다. 이 방법은 개별 체량 기반 용량 투여와 개별 젤라틴 모자를 섭취하는 데 의존합니다. 이는 성충에서는 가능하지만, 유충은 작은 간극 크기, 현탁 기반의 먹이 행동, 신뢰할 수 있는 개별 체중 측정의 어려움 때문에 실용적이지 않습니다. 따라서 유충 적용을 위한 적응은 상당한 수정이 필요하다. 이러한 변형에는 미세한 입자의 개발과 대체 전달 전략이 포함될 수 있습니다.
이전에 설명한 사료 기반 방법과 비교할 때, 이 방법은 더 우수한 투여 정확도와 사용 편의성을 제공합니다. 상업용 젤라틴 사료는 이질적인 물질의 나눠 분량을 요구하여용량 정밀도를 제한하는 반면, 다른 방법들은 모든 동물에게 균일한 양을 투여하고 동일한 체중을 가정합니다14,21. 개별화된 투여를 가능하게 함으로써, 여기서 설명하는 젤라틴 기반 급식 방법은 과다 또는 과다 투여를 방지하고 실험적 통제를 개선합니다; 이로 인해 성체 제브라피시의 약물 투여는 일반적으로 체중에 따라 용량이 결정되는 설치류의 모범 사례와 일치합니다. 이 방법은 스트레스를 최소화할 수 있어 정밀하고 반복적인 약리학적 조작이 필요한 연구에도 적합합니다. 여기에는 행동 신경과학, 신경약리학, 노화 연구 분야가 포함됩니다. 또한 마취제와 상호작용하거나 수성 환경에서 안정성이 낮은 화합물에도 유리합니다. 성체 제브라피시에서 입증되었지만, 이 방법은 다른 수생 모델 생물에도 쉽게 적용할 수 있습니다. 전반적으로 이 기술은 투여 정밀도, 동물 복지, 방법론적 유연성을 향상시켜 생의학 연구에서 어류 모델의 활용도를 확장합니다.
공개 사항
이 프로토콜은 이전에 Journal of Experimental Biology에 발표된 연구를 기반으로 합니다. Ochocki AJ, Kenney JW, 202311. 본 글은 재현성을 위한 상세하고 확장된 방법론적 지침을 제공합니다.
감사의 글
이 연구는 국립보건원(R35GM142566)의 지원을 받아 J.W.K.가 지원했습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| (+) MK-801 hydrogen maleate powder | SIGMA-ALDRICH | M107-5MG | |
| 돼지 피 젤라틴 분말 | SIGMA-ALDRICH | G1890-100G | 겔 강도 ~300 g Bloom, Type A, 생물 반응제 |
| 미크로 세밀 말린 송풍 새우 | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/mikro-fine-dried-brine-shrimp-16-ounce | 미세 < 400 미크론 |
| 스피루리나 분말 | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/spirulina-powder-spirulina-powder-2-oz | 99% 순수 청록색 조류 |
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