장 자율신경의 선택적 절단을 위한 쥐 모델

요약

이 프로토콜은 상장간막동맥을 일관된 해부학적 랜드마크로 사용하여 쥐에서 장을 지배하는 교감신경 및 부교감신경의 정밀하고 선택적 절단을 가능하게 하여, 장 생리학과 질병의 자율신경 조절을 연구할 수 있는 집중적이고 재현 가능한 모델을 제공하는 것을 목표로 합니다.

초록

자율신경은 교감신경과 부교감신경으로 구성되며, 이들은 다양한 생리적 기능을 조절하기 위해 주로 길항적으로 작용합니다. 자율신경 신경이 장 생리학 및 병리학에서 어떤 역할을 하는지에 대한 관심이 높아지면서, 장 지향 교감신경 및 부교감신경 입력을 정밀하게 조작할 수 있는 실험 모델에 대한 필요성이 증가하고 있습니다. 여기서는 장을 지배하는 교감신경 및 부교감신경을 선택적으로 절단하는 수술 프로토콜을 제시합니다. 상장간막동맥(SMA)을 재현 가능한 해부학적 랜드마크로 사용하여 장 자율신경다발을 신뢰성 있게 식별하고 이후 표적 절단을 가능하게 합니다. 신경절 절제술이나 횡격막하 미노절술과 같은 광범위한 탈신경 접근법과 달리, 이 접근법은 장 지향 자율신경 다발의 해부학적으로 국소화된 절단을 달성하여 장 외부 간섭을 줄이는 데 도움을 줄 수 있습니다. 손상은 조절 가능하며 일반적으로 출혈이 최소화되어 시술 일관성과 수술 후 회복을 지원합니다. 수술에는 적절한 미세수술 교육이 필요하지만, 프로토콜은 적응 가능하여 사용자가 특정 실험 목표에 맞게 핵심 매개변수를 조정할 수 있습니다. 중요하게도, 이 모델은 생리적 및 질병적 조건 모두에서 교감신경과 부교감신경이 장 기능 조절에 어떤 역할을 하는지 연구할 수 있는 실용적인 기반을 제공한다. 이 글은 새로운 사용자가 연구에 이를 도입할 수 있도록 절차를 자세히 설명하는 것을 목표로 합니다.

서론

위장관은 자율신경계(ANS)의 지속적인 통제 하에 있으며, 교감신경 및 부교감신경 경로가 운동성, 분비, 상피 장벽 기능, 면역 항상성 등 장 생리학의 기본 측면을 조정합니다 ^1,2. 대장에서는 외부 교감신경 입력이 여러 세포 구획에 걸쳐 영역 의존적 효과를 발휘할 수 있어, 광범위한 ANS 교란이 부위 특이적 장 표현형을 가릴 수 있음을 강조합니다¹. 반대로, 미주신경 신호와 하류 콜린성 기전에 의해 고전적으로 매개되는 부교감 회로는 장내 면역 균형 유지와 점막 반응 형성에 필수적인 역할을 점점 더 인정받고 있으며, 해부학적 정밀도로 교감신경과 부교감신경 기여를 분리하는 실험 전략을 더욱 촉진합니다².

생리적 조절을 넘어, 자율신경 활동은 대장암(CRC)을 포함한 장질환 생물학의 중요한 조절 요인으로 부상하고 있습니다. 최근 CRC 연구는 β2-아드레날린 신호와 NGF 발현 암 관련 섬유아세포가 신경-기질 상호작용을 강화하고 종양 진행을 촉진하는 양방향 교감신경-중간엽 프로그램을 입증하여, 교감신경 회로가 CRC 병인기전과 기능적으로 결합될 수 있음을 직접적으로 입증합니다^. 동시에 콜린성 신호전달은 정형전소 마우스 모델에서 무스카린 수용체 3의 약리학적 억제와 콜린성 신호 전달을 면역 체크포인트 발현 및 기타 악성 특징과 연결하는 것으로 나타나 CRC 성장 및 종양 관련 면역 특징과 연관되어 있습니다 ^4,5. 중요한 점은, 자율신경이 장 질환에 미치는 영향이 심리적 스트레스나 장내 미생물군과 같은 다른 조절 요인과도 수렴할 수 있다는 것입니다. 장신경계는 스트레스 신호를 장 염증에 전달할 수^{있으며, 미}생물 신호는 장-뇌 회로를 작동시켜 장-외부 교감신경 뉴런을 조율하여 신경 조절이 면역 및 미생물 생태와 교차하는 다요인 구조를 지원합니다 ^6,7.

이러한 수렴하는 증거들은 생리학적·병리학적 환경 모두에서 인과적 추론을 뒷받침할 수 있도록 장에 따른 자율신경 효과를 충분한 해부학적 정밀도로 분리할 수 있는 실험적 접근법의 필요성을 강조합니다. 회로 지도 작성과 신경조절의 빠른 진전에도 불구하고, 많은 일반적으로 사용되는 중재법은 장기 특이성에 한계가 있습니다. 전신 약물 조작, 화학적 교감신경 절제술, 횡격막 미주절개술은 광범위한 자율신경 출력에 영향을 미쳐 장을 넘어 면역 및 대사의 기준점을 변화시켜 대장 특이적 신경 입력에 대한 인과적 귀속을 복잡하게 만들 수 있습니다⁸. 예를 들어, 미주신경 회로는 염증성 사이토카^{인 생성을} 억제할 수 있으며, 미주신경 자극은 췌장 내분비 기능과 β 세포 역학을 조절할 수 있어, 상류나 비선택적 개입이 장 외 효과를 유발해 장 표현형 해석을 혼동할 수 있음을 보여준다¹⁰. 이러한 한계는 생리학 및 병리학에서 결장 제한 자율신경 기전을 분리하려는 연구에 특히 중요합니다. 따라서 이 방법의 전반적인 목표는 쥐에서 장 지향성 교감신경 및 부교감신경 섬유를 해부학적으로 유도하고 선택적으로 절단할 수 있게 하여, 목표 외 충격을 줄이면서 장 자율신경 조절을 검증하는 실용적인 모델을 제공하는 것입니다.

요약하자면, 이 프로토콜은 다른 복부 장기의 자율신경 신경 교란을 최소화하면서 더 정밀한 마우스 장 자율신경 탈신경 접근법을 보고하여, 장외 장기 영향으로 인한 잠재적 편향을 줄여 해석 가능성을 높입니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 수도 의과대학 베이징 우호병원 기관동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(번호 24-2026). 이 연구에는 성체 야생형 수컷 C57BL/6J 쥐(8–10주, 20–30g)가 사용되었습니다. 시약 및 장비에 대한 자세한 정보는 재료표에 제공되어 있습니다.

포함 기준: 생물학적 변이를 최소화하기 위해 동일한 품종, 성별, 연령대의 쥐를 실험에 포함시켰습니다. 적응 기간 동안 정상적인 활동, 미용 행동, 음식과 물 섭취, 대변 배출을 보인 건강한 동물만 포함되었습니다. 또한, 쥐들은 수술 전 최소 7일 동안 동물 시설에 적응시켰습니다.

제외 기준: 수술 중 통제되지 않은 출혈이나 주요 혈관 손상, 장 천공, 생존에 적합하지 않은 중대한 조직 손상이 있는 경우에는 쥐를 제외하였다. 마취에서 회복하지 못한 동물, 즉 수술 후 2시간 이내에 보행 가능해지지 않는 동물도 제외되었습니다. 추가 제외 기준에는 지속적인 상처 열림, 심한 감염, 48시간 이내 또는 72시간 내 20% 이상의 체중 감소와 같은 수술 후 합병증이 포함되었습니다. 사후 조직학적 평가로 확인된 신경 가지의 외과적 오식별이 있는 쥐도 연구에서 제외되었습니다.

1. 수술 전 준비

1. 모든 수술 기구를 멸균하세요.
2. 통증 민감화를 방지하기 위해 수술 30분 전에 모든 쥐에게 예방적 진통제를 투여하세요. 멜록시캄(5 mg/kg 체중)을 피하 주사 로 투여합니다.
3. 온열 패드를 37°C로 예열한 후 수술 플랫폼 아래에 놓으세요.
4. 수술 부위(마취 유도실 포함)에 75% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 꼼꼼히 닦으세요. 유도실 바닥에 충분한 종이 타월을 깔아두세요.
5. 마취 유도실과 튜빙을 점검하여 누수가 없는지 확인하세요. 이소플루란을 채우고 충분한 공급을 확보하세요. 1L/min 산소에 3%–3.5% 이소플루란을 투여하여 마취를 유도합니다. 마우스를 지속적으로 모니터링하세요; 수술용 평면에 도달하는 데 보통 1–2분 이내에 도달합니다.
6. 쥐를 네 팔다리를 완전히 펴고 누운 자세로 눕히고, 저자극성 테이프로 고정하세요. 코 콘을 맞추고 고정하세요. 유지 관리를 위해 이소플루란을 1.5%에서 2.5%로 줄이세요. 발가락 압박 반응 없음과 규칙적인 호흡(분당 55–65회 호흡)을 통해 마취 깊이를 평가합니다.
   참고: 장기간 미세수술 시술 중에는 초기 수술 평면 이후의 마취 깊이를 지속적으로 모니터링합니다. 5–10분마다 페달 철수 반사와 호흡 수를 평가하는 것 외에도, 호흡 패턴(예: 규칙성 및 심도)과 시각 관찰 또는 흉벽 접촉 을 통해 심박수를 모니터링합니다. 점막 색깔(발이나 입술에서 측정)도 정기적으로 확인하여 충분한 산소 공급을 확인합니다. 마우스가 호흡 증가(분당 >80호흡), 자발적 움직임, 발달 반사 재발 등 경량 마취 징후가 나타나면, 적절한 수술면이 회복될 때까지 이소플루란 농도를 0.25%에서 0.5% 단위로 점진적으로 증가시킵니다. 반대로 호흡이 얕거나 불규칙해지거나 심박수가 급격히 떨어지면 이소플루란 수치가 0.25%에서 0.5% 감소하여 안정적인 심폐 기능이 회복됩니다. 이 동적 조정은 시술 내내 마우스가 적절한 마취 깊이를 유지하면서 심폐 억제를 최소화하도록 보장합니다.
7. 마취 하에서 각막 건조와 손상을 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르세요.
8. 복부 털을 치골 결합 부위부터 늑골 가장자리 아래 부위까지 전기 면도기를 사용해 면도합니다. 그 다음, 수술용 플랫폼을 입체현미경 아래에서 옮깁니다.
9. 수술 부위를 포비돈-요오드 면봉을 중심에서 말초까지 바깥쪽, 동심원 방향으로 소독하며, 상골 아래에서 치골 결합부까지, 그리고 양쪽 옆구리까지 외측으로 덮습니다. 이 작업을 3번 반복하세요. 그 후 같은 방식으로 70% 에탄올로 닦으세요. 밭에 흩어진 털이 없는지 확인하세요.
10. 수술용 마스크와 일회용 모자를 착용하고, 멸균 수술복을 입고, 멸균 장갑을 착용하세요.
11. 쥐를 멸균된 창구형 커튼으로 덮어주세요. 창문을 약 2× 3cm로 조절하고 복부 중앙선과 정렬하여 수술 부위를 완전히 노출시킵니다. 커튼의 네 모서리를 고정하세요.

2. 복강 절개 및 노출

1. 멸균 겸자를 사용해 치골 결합 바로 옆 피부 주름을 부드럽게 들어 올립니다. 멸균된 날카로운 끝 가위로 끝부분에 작은 초기 절개(~0.3cm)를 내고, 그 후 피부 절개를 중앙선을 따라 두개골 방향으로 1.5–2.0cm 확장합니다.
   참고: 날카로운 가위 끝을 초기 입구에 삽입한 후, 끝을 위로 기울이고 피부 밑면을 따라 통제된 '푸시컷' 동작을 하여 너무 깊게 자르거나 복부 근육이나 내장을 손상시키지 않도록 하세요. 겸자와 가위를 사용해 느슨한 피하 결합 조직을 복벽 근육에서 둔하게 해부하세요. 피부 절개 부위보다 약간 더 넓게 해부하여 이후 노출을 원활하게 하세요.
2. 상골 돌기에서 약 0.5cm 후방에 멸균된 미세 겸자 끝을 조심스럽게 백선에 넣고 작은 조직 텐트를 들어 올립니다.
3. 멸균되고 날카로운 가위를 사용해 들어 올린 부위에 2–3mm 크기의 작은 구멍을 만듭니다. 이 시점에서 매끄러운 복막과/또는 그 아래 장기들(예: 간엽)이 보여야 합니다.
4. 멸균된 둔끝 가위 한 쪽을 복강에 삽입하여 복벽과 밀착하게 유지하세요. 직접 시각화 하에서, 절개를 두개골 방향으로 향해 절개를 확장하여 전체 길이가 피부 절개 지점과 일치할 때까지 진행합니다.
   참고: 가위 끝을 위로 각도 맞추고, 장의 고리나 혈관이 가위 아래에 없도록 직접 시야를 마주할 때만 진행하세요.

3. 상장간막동맥 및 신경 절단의 확인

1. 멸균 테이프를 사용해 복막 벽을 부드럽게 옆으로 젖혀 복막 공간을 노출시킵니다.
2. 장이 밖으로 나오도록 면봉으로 복벽에 적당한 압력을 가하세요. 소장, 결장, 맹장을 부드럽게 쥐의 왼쪽으로 옮기세요.
   참고: 노출된 장을 무균 면사대나 거즈로 덮어 조직 건조와 열 손실을 방지하기 위해 따뜻한(≈37 °C) 멸균 식염수로 적셔야 합니다.
3. 오른손을 사용해 멸균되고 촉촉한 면봉(또는 무딘 팁 마이크로 핀셋)으로 위, 십이지장, 결장을 왼쪽 상부 사분 면으로 부 드럽게 위치시킵니다. 이 단계에서 척추 앞쪽에 위치한 복부 대동맥이 명확히 보여야 하며, 때때로 소량의 복막후지방으로 부분적으로 덮여 있습니다.
4. 왼쪽 신장정맥과 셀리악병 줄기를 확인하세요. 상장간막동맥(SMA)은 복부 대동맥 전벽에서 단일 동맥 가지로 시작되며, 일반적으로 셀리악 몸통까지 후미 쪽 방향 ~2~4mm이며 좌신정맥 수준 또는 그 위쪽에 위치합니다.
   참고: 왼쪽 신정맥은 복부 대동맥의 앞쪽을 수평으로 가로로 흐르다가 하대정맥으로 흘러가는 어둡고 두꺼운 정맥입니다. 셀리악 줄기는 보통 복부 대동맥의 앞벽에서 처음 뻗은 주요 동맥 가지로, 좌신정맥 바로 위(두개쪽)에 위치하며, 간동맥, 비장동맥, 좌측 위동맥으로 삼각되는 경우가 많습니다. 반면, SMA는 간/비장 가지가 없는 단일 줄기입니다. 이 병은 장막의 뿌리로 들어가 공주부, 회장, 근위 결장에 영양을 공급합니다; 장간막까지 경로를 추적하면 정확한 식별을 확인하는 데 도움이 됩니다.
5. SMA와 평행하게 뻗어 있는 우유빛 줄기 같은 다발을 목표 신경 섬유로 식별하세요. SMA 위에 위치한 신경다발은 부교감 섬유에 해당하며, SMA 아래에 위치한 다발은 교감 섬유에 해당합니다(그림 1A).
6. 마이크로 겸자와 마이크로 가위를 사용해 SMA 주변의 지방과 림프 조직을 매우 부드럽게 분리하여 신경 섬유를 완전히 노출시킵니다. 교감신경 또는 부교감신경 다발을 미세한 겸자로 부드럽게 들어 SMA에서 분리한 후 빠르고 조심스럽게 절단합니다(그림 1).
   참고: 해리 시에는 겸자와 가위 끝을 동맥 측벽 쪽으로 향하게 유지하고, 기구를 수직으로 더 깊은 면으로 향하지 않도록 주의하세요. 만약 심한 출혈(예: SMA 또는 복부 대동맥에서 발생하여 멸균 면봉으로 압력을 가해도 30초 내에 조절할 수 없는 출혈)이 발생하면 즉시 시술을 중단합니다. 동물은 마취 상태에서 인도적으로 안락사되며, 이후 모든 분석에서 제외됩니다. 이 종점은 불필요한 고통을 방지하기 위해 IACUC가 승인한 인도적 종결에 따라 미리 정의되어 있습니다. 일반적인 수술 중 합병증에 대한 추가 문제 해결 지침은 보충 파일 1에 제공됩니다.

4. 복강 폐쇄

1. 복부 내 거즈/면 패드를 모두 제거하세요. 복강 내 활성 출혈 여부를 꼼꼼히 검사하며, 특히 SMA 박리장, 신경 절단 부위, 복벽 절개 부위에 주의를 기울이세요.
2. 복강에 소량의 따뜻한 멸균 생리식염수(0.5–1.0 mL)를 부드럽게 세척한 후, 멸균 건조 면봉으로 과도한 체액을 조심스럽게 제거하세요.
3. 기구를 사용해 거즈/면을 세어 복강 내에 이물질이 남아 있지 않은지 확인하세요.
4. 6-0 흡수성 봉합사를 사용해 절개 한쪽 끝에서 시작해 연속 러닝 스티치로 복막과 근육층을 봉합합니다. 각 물림은 양쪽 복막과 복벽 근육을 포함해야 합니다.
   참고: 상처 가장자리를 겸자로 들어 올리고 각 실밥을 직접 시각화하여 기저의 장이나 대막을 걸리지 않도록 하세요. 필요하다면 적신 면봉을 사용해 장을 절개 부위에서 부드럽게 밀어내세요.
5. 5-0 실크 브레이드 비흡수성 봉합사로 피부를 중단 봉합하세요. 봉합사는 ~2mm 간격으로 놓고, 중간 정도의 장력으로 매듭을 묶으면서 허혈을 방지하기 위해 피부 가장자리를 근접하되 목을 잡지 마세요.
   참고: 상처 부착이 부실하면 절개 탈장이 발생할 수 있습니다. 근육층이 단단히 밀착되어 있고, 피부 가장자리가 잘 정렬되어 있는지 확인하세요.
6. 포비돈-요오딘 면봉으로 닫힌 피부 절개 부위를 다시 부드럽게 세척하세요.
7. 쥐(귀나 꼬리)에 수술 날짜를 표시하세요.
8. 노즈 콘을 제거하고 쥐를 깨끗하고 부드러운 회수 케이지로 옮기고, 37°C 워밍 패드(싱글 하우징) 위에 놓입니다. 흡인 위험을 줄이기 위해 동물을 측면 누운 상태로 유지하세요.
   참고: 저체온증을 방지하기 위해 온열 패드가 37 °C에서 안정적으로 유지되는지 확인하세요. 필요 시 부피 보강을 위해 1mL의 따뜻한 멸균 생리식염수를 피하에 투여합니다.
9. 쥐가 완전히 의식을 되찾고 독립적으로 엎드린 자세를 유지할 수 있을 때까지 지속적으로 관찰하세요.
   참고: 수술 후 진통은 멜록시캄(5 mg/kg, 피하 투여, 수술 후 최대 48시간마다 24시간마다 한 번)으로 계속되었으며, 지속적인 통증이나 고통 징후가 관찰될 경우 추가 수의 평가를 받았습니다.

5. 수술 후 모니터링 지표

참고: 수술 후 모니터링은 처음 72시간 동안 하루 두 번, 이후 연구 기간 동안 매일 진행되었습니다. 평가된 매개변수는 다음과 같습니다:

1. 전반적인 외모, 손질, 털 상태, 자세, 활동 수준 등을 모니터링하세요.
2. 매일 체중을 측정하세요; 수술 전 체중의 48시간 이내에 15% 이상의 체중 감량 또는 72시간 동안 20% 이상의 손실을 인도적 종점으로 정의합니다.
3. 수술 부위를 감염, 열공, 분비물 등의 징후를 점검하세요.
4. 자발적인 움직임, 만질 때 하는 반응, 그리고 고통의 징후(예: 발성, 안절부절 못함) 등 행동을 모니터링하세요.
5. 수의사가 진통을 시켰음에도 지속적인 통증이나 고통의 징후를 보이는 동물을 평가하고, 필요하다면 안락사시키십시오.

결과

SMA를 일관된 해부학적 이정표로 삼으면, 장 자율신경 다발은 혈관과 평행하게 뻗은 얇고 진주빛 흰색 구조로 식별할 수 있습니다. SMA에 대한 해부학적 위치에 따라, 상다발은 추정되는 부교감신경다발로, 하다발은 추정되는 교감신경다발로 지정되었다(그림 1A, D). 수술 중 긍정적인 결과는 표적 다발이 명확하게 시각화되고 완전히 중단되었으며, 잔류 섬유가 절단면을 잇지 않을 때 달성됩니다. 절단 부위에서 가끔 관찰되는 우유빛 또는 흰색 액체는 성공적인 신경 절단의 확증으로 간주되지 않았는데, 이는 주변 림프관 또는 결합 조직의 손상으로 인해 유사한 외관이 발생할 수 있기 때문입니다. 따라서 성공적인 탈신경 효과는 해부학적 관찰과 후속 검증을 결합하여 평가되었습니다(그림 1B, C, E). 수술 중 최적이...

토론

마우스 SMA는 셀리악 몸통 아래쪽 복부 대동맥의 전방벽에서 발생하며, 장을 포함한 주요 복부 내장으로 동맥 유입을^{제공합니다.} SMA 앞쪽에는 결장과 그 장간막이 있으며, 뒤쪽에는 왼쪽 신정맥과 복부 대동맥과 밀접한 관련이 있습니다; 상장간막정맥은 보통 오른쪽을 따라 흐릅니다. 쥐에서 SMA는 매우 섬세하며 중요한 장기와 주요 혈관으로 둘러싸여 있습니다. 중요한 점은, 미세한 교감신경과 부교감신경 섬유가 SMA에 단단히 붙어 있으며 그 옆을 따라 운행된다는 것입니다. 따라서 교감신경 또는 부교감신경 줄기의 절단은 높은 정밀도가 필요합니다.

이 과정에서 두 가지 주요 과제가 발생합니다. 첫 번째는 SMA와 함께 이동하는 교감 및 부교감 섬유의 수술 중 신뢰성 있는 확인입니다. 둘째, 신경이 혈관벽과 밀접하게 맞닿아 있기 때문에 신경 절단이 SMA 손상과 출혈을 쉽게 초래할 수 있...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5-0 실크 꼰 비흡수성 봉합사	Ethicon	W500
6-0 PGA 봉합사	Jinhuan	CR631
마취 유도 챔버	RWD Life Science	V100
동물 마취 기계	RWD Life Science	R500IP
항콜린 아세틸전달효소 항체	Abcam	ab181023
인공 눈물 윤활제 안과용 연고	Akorn	59399-162-35
C57BL/6J 마우스	상하이 모델 유기체 센터 기술	SM-001
콜레라 독소 서브 유닛 B(CTB), Alexa FluorTM 555 컨쥬게이트	Thermo Scientific	C34776
복합 현미경	Yuyan 기기	512
DAPI 및 Hoechst 핵산 염색	Invitrogen	D3571
패스트 그린	Thermo Scientific	F7252
세밀한 지혈 포셉	진중 수술 기기	JCG020
저자극성 수술 테이프	3M Blenderm	70200419342
아이소플루란	RWD Life Science	R510-22-10
마이크로 포셉(곡선)	진중 수술 기기	WCC200
마이크로 포셉(직선)	진중 수술 기기	WCC190
마이크로 바늘 홀더	진중 수술 기기	WBA050
마이크로 가위	진중 수술 기기	Y3F010
마이크로 주사기	Hamilton	7632-01
안과 가위(뾰족한 끝단)	진중 수술 기기	JC2303
안과 가위(둥근 끝단)	진중 수술 기기	JC2303
포비돈-요오드 면봉	윈너 메디컬	206
조직 및 세포 고정제 (4% 파라포르말데하이드, PFA)	MedChemExpress	HY-DY3003
조직 OCT-냉동 매체	Sakura	C2077
티로신 하이드록실라제 (E2L6M) 토끼 단일클론 항체	Cell Signaling Technology	58844S

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