지속적인 생리학적 기계적 스트레스 하에서 생세포 영상을 위한 범용 압력 부하 장치

Summary

여기서 설명하는 압력 부하 장치는 배양된 세포의 타임랩스 광학 영상을 가능하게 하며, 표준 세포 배양 접시와 역현미경과 호환됩니다. 이 장치를 사용하여 종양 정수압 미세환경이 칼슘 신호 전달을 증진한다는 것이 확인되어, 종양 미세환경에서의 기계적 신호 전달을 연구할 수 있는 실현 가능한 플랫폼을 제공합니다.

Abstract

이 프로토콜은 지속적인 정수압 자극 중 부착 세포를 실시간으로 현미경으로 관찰할 수 있는 정압압 부하 장치를 설명하며, 3.5cm 상업용 세포 배양 접시와 호환됩니다. 이 장치는 알루미늄 베이스로 제작된 밀폐 배양실, 광학 투명 폴리(메틸 메타크릴레이트) 덮개, 덮개에 통합된 가스 입구/배출구, 그리고 밀폐된 관찰창으로 구성되어 있습니다. 조절된 가스원에 연결함으로써 장치는 안정적인 정수압(0–200 kPa, 조절 가능)을 유지하면서 연속적인 위상 차이 또는 형광 이미징을 가능하게 합니다. 이 압력 부하 장치를 사용하면 형태, 증식, 이동과 같은 세포 표현형과 행동에 대한 압력 유도 용량 의존적 효과를 기록할 수 있습니다. 더불어, 형광 신호는 실시간으로 기록할 수도 있습니다. 여기서는 유방암 MDA-MB-231 세포와 자궁경부암 HeLa 세포에서 압력 유발 Ca^2⁺ 신호 이질성과 역학을 타임랩스 영상을 이용한 역형광현미경을 통해 관찰 및 정량화하였습니다. 이 플랫폼은 기계적 부하와 라이브 셀 영상을 통합하여 기존 종말 시스템의 한계를 극복하며, 기계생물학 연구를 위한 범용 도구를 제공합니다.

Introduction

수많은 세포, 조직, 장기는 생^리학의 일부로서 지속적이거나 간헐적인 압축력을 경험합니다. 예를 들어, 폐포 세포는 호흡 중 순환적 압력을 받^{고, 방}광 상피세포는 소변 저류 중 기계적 부하를 견디는 반면,^3. 고형 종양과 같은 병리학적 맥락에서 암세포는 공간적 밀폐와 높은 간질^{액 압력에서} 비롯된 압축력에 지속적으로 노출됩니다. 마찬가지로, 반월상 변성 및 폐섬유증과 같은 다른 질환에서도 반월상 반월판 세포⁵ 와 폐포 상피 세포⁶ 도 장력과 기질 강성 기초 압력에 의한 지속적인 기계적 스트레스를 받습니다.

기계적 압력이 세포 표현형과 행동을 강력한 조절제로 한다는 증거가 점점 늘어나고 있습니다 ^7,8. 비악성 세포에서는 압박 스트레스가 치주 줄기세포의 증식을 촉진하고 침습적 돌출부를 통해 쇄골 융합을 유도합니다⁹. 반대로 암 모델에서 압축은 janus 효과를 보인다: 흑색종 세포의 증식과 이동을 억제하는 동시에 화학저항성을 촉진하는 전사체 재프로그래밍을 활성화한다^10,11. 더 나아가, 고삼투압에 의한 부피 압축은 세포 내 과밀을 유발하고, 액체-액체 상 분리(LLPS)를 통해 단백질 농도와 이온 강도의 재분배를 자극하여 세포 행동과 운명을 근본적으로 변화시킬 수 있습니다. 이러한 물리적 교란은 활성화된 Wnt/β-카테닌 신호를 통해 장 내 오가노이드의 확장을 촉진하고 장 줄기세포의 자기 갱신을 증가시킵니다¹². 또한 세포핵에서는 부피 변화에 의해 유도된 LLPS가 전사 시작, 신장, 종료의 조정을 통해 유전자 전사 조절에 관여합니다^13,14.

이러한 압력에 의해 유발된 생물학적 효과를 정량적으로 조사하기 위해서는 명확하고 균일한 압축 자극을 적용할 수 있는 실험 시스템이 필수적입니다. 시험 관 내에서 배양된 세포는 수용성 배지로 둘러싸여 있을 때, 정수압은 이러한 압축력을 가하는 주요하고 생리학적으로 중요한 수단으로 작용하며, 이는 세포 기계전^도(세포 기계전도) 연구에 널리 채택되었습니다. 정수압은 골유도 인자 보충 없이도 알칼리성 인산효소 활성을 높이고 인간 지방유래 중간엽 줄기세포의 골형성을 가속화할 수 있습니다¹⁶. 비알코올성 지방간 질환에서는 정수압과 같은 기계적 힘이 심한 섬유화 없이도 문맥 고혈압에 기여할 수 있어 조직 다양성에 대한 역할을 강조합니다¹⁷. 정수압이 병태생리학적 조절에서 중요한 역할을 하지만, 정수압의 기전적 연구는 중요한 한계에 직면해 있습니다: 기존의 압력 챔버는 자극 중 살아있는 세포를 실시간으로 관찰할 수 없습니다. 대부분의 실험 시스템은 종단 분석만 허용하며, 압전 1 기계활성화, Ca²⁺ 플럭스 이질성, 세포골격 재조직과 같은 기계적 전달 사건의 공간적·시간적 역학을 가립니다. 이 격차는 정수압이 종양이나 기타 조직에서 표현형 다양성을 어떻게 결정하는지에 대한 이해를 제한했습니다.

이 기술적 격차를 해소하기 위해, 광학 영상을 통해 정밀하게 제어된 정수압에 대한 세포 반응을 실시간으로 관찰할 수 있는 새로운 실험 플랫폼이 개발되었습니다. 이 시스템은 세 가지 핵심 기능을 통합합니다: (1) 조절 가능한 가스-압력 제어기를 통해 0–100 kPa 범위 내에서 지속 정수압을 적용함 (압력 게이지는 0–200 kPa 범위이며, 생리학적 매개변수에 따라 압력을 선택할 수 있음). 예를 들어, 다양한 세포 유형의 보고된 압축 스트레스를 기준으로 하면: 인간 골수 기질 세포 8-16 kPa¹⁸, 혈관 평활근육 세포 12–24 kPa¹⁹, 인간 유선 상피세포 0–15 kPa²⁰.); (2) 정수압 적용 시 높은 시간 해상도를 가진 연속 라이브 셀 이미징; 그리고 (3) 장기간 실험 동안 생리학적 배양 조건을 유지하는 것. 이 접근법은 기계적 자극에 반응하여 발생하는 Piezo1 채널 모집 및 활성화, 칼슘 신호파, 세포골격 재형성 등 동적 과정을 직접 시각화할 수 있게 합니다. 또한 이 장치는 대부분의 상업용 배양 접시와 역현미경과 호환되어 실험실에서 매우 편리하게 사용할 수 있습니다. 이러한 세포 내 생화학적 사건을 실시간으로 모니터링할 수 있는 능력은 세포가 정수압을 감지하고 적응하는 방식에 대해 전례 없는 통찰을 제공합니다. 기계적 전달 사건의 시간적 순서를 포착함으로써, 힘의 초기 감지, 하위 신호 전달, 표현형 변화를 포함하여, 이 플랫폼은 생리적·병리학적 맥락에서 정수압이 세포 행동에 미치는 근본 메커니즘을 조사하는 강력한 도구를 제공합니다.

Protocol

1. 재료

1. 장치 사양 ( 그림 1 참조)
   1. 아래에 명시된 사양에 따라 구성 요소를 준비하세요:
      베이스: 알루미늄 (Ø 56 mm, 높이 15 mm), 중앙 창문 Ø 40 mm.
      커버: PMMA (Ø 56 mm), 6개의 × M3 나사구멍, 루어 락 가스 포트, 실리콘 가스켓 (내경 25mm, 외경 32mm, 두께 0.8mm)
      압력 조절기: (0–200 kPa 범위)
2. 세포와 시약
   1. 이 연구에서는 MDA-MB-231과 HeLa 세포를 사용합니다. L-15 배지, RPMI 1640 배지, 신생아 송아지 혈청(NCS), 1% 항생제-항균류 용액, 그리고 칼슘 영상 프로브를 사용하여 세포 배양과 Ca²⁺ 표지합니다.

2. 장치 준비

1. 제조
   1. 맞춤형 디자인은 이 연구의 핵심 요소입니다. 규격에 따라 알루미늄 베이스와 PMMA 커버를 정밀 가공합니다( 그림 1 및 보조 그림 1 참조).
   2. 실리콘 가스켓을 잘라서 필요한 크기로 가공하세요.
      참고: PMMA 재료의 광학 투과율은 표준 투과광 영상에 충분합니다. 모든 성분은 멸균 가능하며 이후 세포 배양 실험에 적합했습니다. 이 챔버의 제조 공차에 특별한 요구사항은 부과되지 않았으며(본 연구에서는 ±.1 mm의 공차가 채택되었습니다).
2. 불임 수술
   1. 베이스(알루미늄)를 멸균하려면 121°C에서 20분간 오토클레이브하세요.
   2. 커버를 멸균하려면(PMMA), 75% 에탄올로 닦은 후 30분간 UV 소독하세요.
   3. 실리콘 가스켓을 121°C에서 20분간 오토클레이빙하여 멸균하세요.

3. 세포 처리

1. 세포 배양
   1. 35mm 접시 내 씨앗 세포는 30%–70% 합류율로 구성되어 있습니다. 세포를 RPMI-1640 또는 L15 배양지(10% NCS 보충)에서_CO2 인큐베이터에서 37°C, 5% CO₂에서 24시간 배양합니다.
   2. 세포 통과 시에는 0.25% 트립신으로 세포를 해리시키고 완전한 배지로 소화를 종료합니다. 세포가 70%에서 80% 합류할 때 재씨딩에 사용하세요.
2. Ca²⁺ 염색
   1. 배지를 제거한 후, 생물안전 캐비닛에서 미리 데워진 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)으로 세포를 두 번 세척하세요.
   2. 세포 간 Ca²⁺ 를 5 μM 칼슘 이미징 프로브로 혈청 무첨가 배지에 염색합니다. 세포를 37°C에서 빛이 잘 보호된 환경에서 20분간 배양합니다.
   3. 염료를 제거하고, 세포를 HBSS로 세 번 세척한 후, 세럼이 없는 배지에서 30분간 에스터 제거를 하세요.

4. 장치 조립 (그림 2)

1. 배양 접시를 압력 챔버의 중앙 창문으로 옮긴 후 배양 배지를 제거합니다.
2. 멸균된 가스켓을 배양 접시에 넣으세요.
3. 덮개를 접시 개스킷 스택 위에 맞추세요.
4. 나사를 대각선으로 조이면서 먼저 손으로 조여 저항이 느껴질 때까지 조이고, 그 후 토크 제어 드라이버로 1.5번 더 돌립니다.
5. 실리콘 가스 튜브를 루어락 포트에 연결하고, 혼합된 가스를 장치에 주입해 누출 여부를 확인하세요.
6. 실리콘 가스 튜브를 분리하고 5mL 멸균 주사기를 사용해 루어 락 포트를 통해 세포 배양 접시에 신선한 배지를 주입합니다.

5. 압력 부하 및 영상

1. 실리콘 가스켓의 루어 락 포트에서 디지털 압력 게이지와 가스 탱크에 내부 직경 4mm의 실리콘 가스 튜빙을 연결하세요.
2. 조립된 장치를 현미경 스테이지에 장착하세요.
3. 압력을 조정하세요.
   1. 게이지를 사용하여 0–200 kPa 범위의 안정성을 검증합니다.
      참고: 헬라 세포 배양에는 질소 75%, 산소 20%, 이산화탄소 5%가 포함된 혼합 가스가 사용됩니다. MDA-MB-231 세포 배양에는 질소 80%, 산소 20%를 포함한 혼합 가스가 사용됩니다. 압력 부하 실험에 사용되는 가스 종류는 셀 종류, 배질 종류 또는 특정 실험 요구사항에 따라 교체할 수 있습니다. 어떤 부품도 모델별로 특화되지 않으며, 압력 감지 모듈과 그 유입 튜빙의 치수는 필요에 따라 선택할 수 있습니다.
4. 디지털 압력 조절기를 통해 목표 압력(예: 100 kPa)을 설정하세요.
5. 목표 압력에 도달하면 영상 촬영을 시작하세요.
6. 영상
   1. 스테이지를 조정하고, 영상 영역을 확인하며, 세포가 초점이 맞는지 확인하세요.
   2. 20× 대물렌즈가 장착된 역형광 현미경을 사용하여 염색된 세포의 형광 이미지를 획득하며, 다음 매개변수를 적용합니다: 400ms 노출 시간, 5초 타임랩스 간격, 총 영상 지속 시간 10분(FITC 필터: Ex/Em = 490/525 nm, 컷오프 = 515 nm).
   3. 시스템의 정상 작동을 확인하고 기준선 신호 데이터를 얻기 위해 10분간 비압력 상태에서 영상을 찍습니다.
   4. 가스 밸브를 부하 압력으로 연 후, 셀이 초점이 맞도록 단계 높이를 재조정한 후 동적 칼슘 신호 촬영을 시작하세요.
   5. 배양 접시의 하단 두께와 대물렌즈의 작동 거리를 기준으로 대물렌즈를 선택하세요. 과도한 광표백과 광손상을 피하면서 칼슘 신호 진동을 모니터링할 수 있도록 노출 시간을 선택하세요.
   6. 다른 동적 신호를 관찰할 때는 프로브 유형과 실험 요구사항에 따라 매개변수를 조정하세요.

6. 문제 해결

1. 문제 해결 조언은 표 1 을 참고하세요.

7. 통계 분석

1. 모든 데이터를 표준편차(SD)± 평균으로 제시하세요. GraphPad Prism 소프트웨어(미국)는 쌍이 없는 학생 t-검정을 통해 두 그룹 간 결과를 비교하는 데 사용되었습니다. **p < 0.01, ***p < 0.001, 또는 ****p < 0.0001일 때 차이를 통계적으로 유의미하다고 간주하라.

Results

이 정수압 부하 장치의 실시간 영상 기능을 검증하기 위해, 정수압 가하 후 종양 세포 내 칼슘 신호의 역학을 관찰하였습니다. 합류한 MDA-MB-231, HeLa, A549 세포를 35mm 배양 접시에 시딩하여 이후 사용하였습니다. 칼슘 영상 프로브로 염색한 후, 혈청이 없는 배양 세포는 40 kPa의 정수압에 노출되었습니다. 10분간 정수압 부하를 가한 후 암세포 내 총 칼슘 수치가 증가했습니다(그림 3A, B 및 보조 그림 2A, B). 칼슘 진동을 유도하기 위해 혈청 무첨가 배지에 10% NCS를 첨가했습니다. 40 kPa의 정수압이 진동 세포 비율이 더 높은 MDA-MB-231과 HeLa 세포의 칼슘 진동을 증가시킨다는 것이 입증되었습니다(그림 3C, 비디오 1

Discussion

이 프로토콜은 조정 가능한 정수압 하에서 기계전도(mechanotransduction) 역학을 실시간으로 관찰할 수 있는 보편적으로 적응 가능한 압력 부하 장치를 보여주었습니다. 광학 투명 PMMA 커버와 정밀 가공된 알루미늄 베이스를 통합함으로써, 시스템은 종단 분석만 수행할 수 있는 기존 챔버의 중요한 한계를 극복합니다. 이 압력 부하 장치는 표준 역현미경과 함께 작동하여 타임랩스 이미징을 통해 동적 정보를 제공할 수 있습니다. 표준 35mm 배양 접시와의 호환성과 간단한 조립 공정 덕분에 널리 보급될 수 있습니다.

이 장치를 이용한 기계적 압력에 대한 칼슘 신호 전달 역학의 실시간 관찰은 기계적 힘과 종양 병리생물학 간의 분자 연관성을 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 기계적 압력은 종양 미세환경 내 고체 스트레스의 핵심 요소이며, 악성 진행의 중요한 조절 요인으로 점점 더 인식되고 있습니다. 예를 들어, 고...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
항생제-항균제(100회)	서모 피셔 사이언티픽, 미국	15140122	전체 배지 내 농도 1%
오토클레이브	파나소닉, 일본	MLS-3751-PC	알루미늄 베이스와 실리콘 가스켓 소독을 위해
바이오세이프티 캐비닛	서모 피셔 사이언티픽, 미국	1300 시리즈 A2 클래스 II, 타입 A2 생물학적 안전 캐비닛	세포 취급을 위한 멸균 환경을 제공합니다
Cal-520 AM, 세포 영구 칼슘 지표	AAT 바이오퀘스트, 미국	21131	살아있는 세포 내 칼슘 이온 농도의 동적 검출을 위해
세포 배양 접시 (35mm)	바이오필, 중국	TCD010035	세포 시딩에 사용되는 표준 35mm 접시
챔버 베이스 (알루미늄)	취안이, 중국	/	맞춤 디자인과 Oslash; 56mm, 높이 15mm, 중앙 창문 및 슬래시; 40mm
챔버 커버 (PMMA)	취안이, 그리고 nbsp; 중국	/	맞춤 디자인과 Oslash; 56mm, 6&배 포함; M3 나사 구멍, 루어 락 가스 포트
CO2 인큐베이터	서모 피셔 사이언티픽, 미국	헤라셀 3111	배양 조건은 37도 유지; C는 5% CO2
HBSS (행크스 밸런스 소금 용액)	비오타임, 중국	C0219	염색 전후의 세포 세척
헬라 세포주	세포 자원 센터, 기초 의학 연구소, CAMS/PUMC, 중국	CRM-CCL-2	인간 자궁경부암 세포
역형광 현미경	니콘, 일본	이클립스 Ti2	형광 영상을 위해
라이보비츠의 L-15 미디엄	서모 피셔 사이언티픽, 미국	41300039	MDA-MB-231 세포 배양을 위한
MDA-MB-231 세포주	세포 자원 센터, 기초 의학 연구소, CAMS/PUMC, 중국	CRM-HTB-26	인간 유방암 세포
신생아 송아지 혈청 (NCS)	서모 피셔 사이언티픽, 미국	16010142	완전 배지 내 농도 10%
압력 조절기	홍룬, 중국	DP20	범위: 0-200 kPa
RPMI 1640 미디엄	서모 피셔 사이언티픽, 미국	31800022	MDA-MB-231 세포 배양을 위한
멸균 주사기 (5 mL)	KDL, 중국	1101010198	루어 락 포트를 통해 매질이나 시약을 주입할 때
트립신 (0.25%)	서모 피셔 사이언티픽, 미국	2520056	통과를 위한 부착 세포 해리를 위해