산성 유도 Het-1A 세포 모델 구축 및 miR-107/FGFRL1 축의 기능 분석

요약

여기서는 Het-1A 세포를 이용해 HCl 유발 역류 식도염 세포 모델을 구축하고, 분자 및 세포 분석을 통해 miR-107/FGFRL1 축을 조사하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

광범위한 증거는 마이크로RNA(miRNA)가 위장관 병태생리학적 과정에서 핵심적인 역할을 한다는 것을 시사합니다. 그러나 역류 식도염(RE)에서의 구체적인 기전은 아직 잘 알려져 있지 않습니다. 여기서는 산에 의해 유도된 RE 모델을 확립하고 분자 및 세포 분석을 이용해 miR-107/FGFRL1 축을 조사하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 R E(n=94) 환자와 건강한 대조군(n=94)으로부터 혈청 채취를 포함한 임상 샘플 분석을 수행했으며, 이후 RT-qPCR을 통한 정량적 검출을 수행하였습니다. 시험관 내에서 Het-1A 세포를 염산에 노출시켜 산에 의한 손상 모델이 확립되었습니다. 또한 MTT 세포 생존력 검사와 이중 루시퍼라제 리포터 검사법을 사용하여 세포의 기능 검증이 수행되었습니다. 대표적인 결과는 miR-107이 RE 환자의 혈청과 산성 처리된 Het-1A 세포에서 하향 조절되었음을 보여준다. miR-107은 FGFRL1을 직접 표적으로 하여 Het-1A 세포 생존력과 염증 수준에 염산이 유도한 변화를 매개했으며, FGFRL1 표적화를 통해 세포 생존력과 염증 변화와 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 RE에서 miR-107/FGFRL1 매개 기전을 조사할 수 있게 합니다. 이 접근법은 재현 물질의 분자 메커니즘을 연구할 수 있는 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다.

서론

식도역염(RE)은 위산과 위 내용물이 반복적으로 식도로 역류하여 염증, 침식 또는 심지어 궤양이 생기는 소화 질환으로, 이 중증도는 역류 물질의 성격, 역류 빈도, 식도 점막의 저항과 관련이 있습니다 ^1,2. 위식도 역류 질환(GERD)의 매우 흔한 유형으로서, RE는 발생률이 꾸준히 증가하며 전 세계적으로 영향이 점차 확대되고 있습니다^. RE의 비특이적 임상 증상은 종종 오진이나 과소진단으로 이어집니다. 더불어, 질병의 재발 경과는 종종 더 심각한 위장 합병증으로 진행되어 영향을 받은 사람들에게 상당한 생리적·사회경제적 부담을 안겨줍니다⁴. RE의 표준 임상 관리는 일반적으로 약물치료(예: 양성자 펌프 억제제), 최소 침습 내시경 시술^{또는 외과적} 치료로 ^{이루어집니다.} 그러나 치료 효과는 약물 관련 부작용과 시술적 이환율에 의해 제한되는 경우가 많습니다. RE의 분자 발병 기전에 대한 불완전한 이해를 고려할 때, 그 기전을 밝히는 것은 새로운 치료 표적을 밝혀내고, RE는 보다 효과적이고 환자 특이적 치료 전략 개발에 도움을 줄 수 있습니다. 이 프로토콜은 분자 및 세포 분석을 통해 miR-107/FGFRL1 축의 조절 역할을 규제하는 시험관 내 RE 모델을 확립하는 것을 목표로 합니다.

마이크로RNA(miRNA)는 서열 특이적 결합을 통해 mRNA 번역을 조절하는 능력을 통해 수많은 인간 질병의 병인에 관여하는 것으로 광범위하게 문서화되어 왔습니다⁷. 예를 들어, miR-3682-3p는 FHL1 발현을 조절하여 Wnt/β-카테닌 경로에 영향을 주어 식^{도암 8}의 진행을 촉진합니다. miR-21-5p와 miR-223-3p는 호산구 식도염(EOE)의 경과에 영향을 미쳐 하류 표적 유전자의 발현을 매개^합니다. miR-107은 인간의 10번 염색체에 암호화된 miRNA로, 다양한 종양 생성 과정(^{10, 11, 12})에서의 함의로 인해 상당한 연구의 주목을 받고 있습니다. 현재 증거는 miR-107이 위암과 식^도암에서 핫스팟 매개체임을 시사^{하지만, 비}종양성 소화기 질환에서의 병태생리적 기능과 조절 기전은 철저히 조사되어야 합니다. 그러나 re에서 miR-107 기능을 연구하기 위한 적절한 시험관 내 모델과 통합 분석 접근법은 여전히 제한적입니다.

위산 역류는 RE¹⁵에서 식도 점막 손상의 주요 병원성 인자로 널리 알려져 있습니다. 최근 연구들은 RE의 병원성 기전이 위액에 의한 직접적인 점막 손상이 아니라, 식도 상피세포에서 화학물질 분비를 자극하여 염증성 매개 조직 손상의 연쇄 반응을 시작하는 것이라고 제안합니다¹⁶. 이 과정의 분자 기전을 조사하기 위해, 우리는 Het-1A 세포를 염산으로 처리하여 산 역류로 인한 상피 손상의 주요 병리학적 특징을 재현하는 시험관 내 산 손상 모델을 구축하였습니다. 이 접근법은 시험관 내에서 산에 의한 상피 손상을 모방할 수 있는 통제되고 재현 가능한 시스템을 제공합니다. 우리는 miR-107이 RE 관련 염증과 세포자멸사에서 조절 역할과 진단 잠재력을 체계적으로 탐구하였습니다. 이 프로토콜은 식도 상피세포에서 miRNA 매개 염증 및 세포자멸사 경로 조절을 연구할 수 있게 합니다. 기존의 생체 내 동물 모델 및 1차 세포 배양과 비교할 때, HCl 유도 Het-1A 모델과 miR-107 기능 분석법을 결합한 모델은 탁월한 안정성, 조절 가능성, 재현성을 제공하여 산성 유발 상피 손상, miRNA 매개 전사 후 조절, 식도 세포의 염증 반응 연구에 특히 적합합니다¹⁷. 이 방법은 산성 유발 상피 손상의 분자 기전과 miRNA 매개 조절 연구에 특히 적합합니다. 환자에 대한 임상 분석과 결합할 때, 이 접근법은 임상 데이터와 결합하여 RE 분야의 기전적 연구를 지원할 수 있습니다.

프로토콜

1. 환자 모집

1. 헬싱키 선언에 따라 연구를 수행하라.
2. 칭다오 교주 중앙병원 윤리위원회(승인번호: 2023033-01)로부터 연구 프로토콜 승인을 받으세요.
3. 연구 시작 전에 모든 참가자가 서명된 사전 동의서를 제공하도록 하십시오.
4. 칭다오 교통 중앙병원에서 역류성 식도염(RE) 환자 94명을 식별하여 등록합니다.
5. 대조군으로 건강한 자원봉사자 94명을 포함시켰습니다.
6. 모든 RE 환자를 위내시경 검사로 진단하여 식도 점막 병변과 침식을 확인하세요. 환자들을 로스앤젤레스 분류 기준에 따라 분류합니다.¹⁸.
7. 3개월 이상 지속된 소화계 불편감이 있고, 상부 위장관 수술 병력이 없으며, 이 연구에 서명한 동의서를 제공한 RE 환자를 포함하였습니다.
8. 배럿 식도, 식도 정맥류, 식도 협착증, 심부 궤양 또는 위내시경 검사를 통한 악성 종양 병변 환자는 제외합니다.

2. 혈청 샘플 수집

1. 최소 8시간 밤 단식 후 오전 8시에서 10시 사이에 각 참가자로부터 5mL의 공복 정맥혈을 채취하세요.
2. 수집된 혈액을 4°C 3000 g × 15분간 원심분리합니다.
3. 원심분리 후 상청액을 조심스럽게 채취하세요.
4. 분리된 혈청은 -80 °C에서 냉동고에 보관하여 다음 측정을 기다리세요.
   참고: 샘플은 장기 보관을 위해 −80 °C에서 보관할 수 있으며, 나중에 처리될 수 있습니다

3. 세포 배양

1. 상업용 세포 은행에서 인간 식도 편평 세포주 Het-1A를 구매하세요. 세포를 37°C 수조에서 1–2분 이내에 빠르게 녹입니다.
2. Het-1A 세포를 소생시키고 RPMI-1640 배양지에 10% 태아 소 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충하여 배양합니다.
3. 인큐베이터 매개변수를 37°C, 5% CO₂로 설정하여 세포 배양 유지를 위해 사용하세요.
4. 배지를 2일마다 교체하고, 80–90% 합류율에서 0.25% 트립신-EDTA를 사용해 세포를 통과시킵니다.

4. 세포 유도

1. Het-1A 세포를 6웰 플레이트에 접종하고, 세포 밀도를 2×10^{5 세포·}웰^-1 로 조절하여 2 mL 완전 배양액에 넣습니다.
2. 농축 염산(HCl)을 인산염 완충식염수(PBS)와 희석하고 pH를 4.0으로 조절합니다.
   주의: 염산은 부식성이 있고 자극적입니다. 적절한 개인 보호 장비(안전 고글, 장갑, 실험복 포함)를 사용하여 염산을 다루고, 화학 훈기 후드에서 작업하세요
3. 각 웰에 준비된 HCl 용액 2mL를 추가하여 세포를 유도합니다.
4. HCl 용액을 버리고 각 시점마다 검사 전에 미리 예열된 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
5. 0, 10, 20, 30분에 MTT 분석법을 사용해 세포 생존력을 측정합니다.

5. 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)

1. 페놀-클로로포름 시약을 사용해 Het-1A 세포에서 총 RNA를 추출합니다.
2. NanoDrop 분광광도계를 사용해 RNA 순도와 농도를 평가하며, A260/A280 비율이 1.8에서 2.0 사이임을 확인합니다.
3. 역전사 증폭 시스템을 역전사 키트를 사용하여 구성합니다.
4. PCR 기계에서 37°C에서 역전사를 15분, 85°C에서 5초간 수행한 후 4°C에서 유지합니다.
5. 역전사를 통해 고리형 DNA(cDNA)를 생성합니다.
6. SYBR Green PCR 마스터 믹스를 사용하여 20μL 반응 부피에서 RT-qPCR 반응을 수행합니다.
7. PCR 사이클 조건을 다음과 같이 설정합니다: 초기 변성은 95°C에서 10분간 진행하고, 이어서 95°C에서 15초, 60°C에서 1분간 40회 변성합니다.
8. miR-107과 FGFRL1의 내부 대조군으로 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(GAPDH)와 소규모 핵 RNA(U6)를 사용하세요.
9. 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 데이터를 계산합니다.
10. RT-qPCR을 통해 염증 인자(IL-6, IL-8)와 세포자사멸 관련 조절 분자(Fas, p53)의 mRNA 함량을 정량합니다.

6. 세포 형질전환

1. Het-1A 세포를 6웰 플레이트에서 2×10^{5 셀·} 웰-1의 밀도로 정적으로 배양하여 로그 성장 단계에 도달합니다.
2. 상업 공급업체로부터 합성 올리고뉴클레오타이드(miR-107 mimic/ov-FGFRL1; 50 nM), 하향 조정 플라스미드(miR-107 억제제; 100 nM), 그리고 이에 대응하는 음성 대조 조각을 확보합니다.
3. 위 조각들을 리포펙타민 시약으로 48시간 동안 세포에 형질전환합니다.

7. 세포 생존 가능성

1. Het-1A 세포를 100 μL 매^{체에 5}×10 밀도의 96웰 플레이트에 씨앗 후 하룻밤 배양합니다.
2. 메틸 티아졸릴 테트라졸륨(MTT) 용액(20 μL, 5 mg·^mL-1, 최종 농도 0.5 mg·^mL-1)을 Het-1A 세포에 첨가하고 37 °C에서 4시간 배큐합니다.
3. 디메틸설폭사이드(DMSO, 150 μL)를 추가하고 혼합물을 10분간 소용돌이로 돌립니다.
4. 마이크로플레이트 리더기로 각 웰의 흡광도(490 nm)를 측정합니다.
5. 그룹당 3개의 복제 우물을 설정하고 독립적으로 3번 반복하세요.

8. ELISA 분석법

1. 제조사의 표준 작업 절차에 따라 ELISA 키트를 사용하여 셀 내 IL-6 및 IL-8을 검출하세요.
2. 이 과정을 독립적으로 세 번 반복합니다.

9. 표적 예측 및 루시퍼레이스 활성 분석

1. miRDB 및 ENCORI 데이터베이스를 사용하여 miR-107의 잠재적 표적을 예측합니다. 겹치는 표적을 식별하고 상보적 결합 부위를 검증합니다.
2. miR-107과 FGFRL1 사이의 상보적 결합 부위를 규명합니다.
3. 복제하여 miR-107 결합 부위를 포함하는 야생형 FGFRL1 3'UTR(wt-FGFRL1)를 얻었습니다. 특이적 결합 부위 돌연변이체(mut-FGFRL1)를 생성합니다.
4. Het-1A 세포를 wt/mut-FGFRL1 및 miR-107과 모방/억제제(또는 NC 대조군)와 공동 형질전환합니다.
5. 이중 루시퍼레이스 리포터 분석 시스템을 사용하여 루시퍼레이스 활성을 측정합니다.

10. 통계 분석

1. GraphPad Prism을 사용하여 ROC 분석을 수행하려면 식식 데이터를 입력하고 ROC 곡선 함수를 선택한 후 결과를 내보내세요.
2. 학생 t-검정(두 그룹)이나 일방향 분산 분석(ANOVA; 다그룹 기준)으로 그룹 간 차이를 평가한 후 Tukey의 사후 검정을 수행합니다.
3. p < 0.05를 통계적으로 유의미하다고 생각하세요.
4. 원본 데이터의 상세 정보는 보충 표 1에 요약되어 있습니다.

결과

환자 모집 및 기초 특성 이 결과는 RE 환자에서 miR-107의 발현 및 진단 성능을 설명합니다. 표 1은 건강한 대조군과 RE 환자의 일반적인 특성을 기록합니다. 결과는 성별, 연령, 기저 병력 측면에서 두 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이가 없음을 보여주며(p > 0.05), 비교 가능성을 나타냅니다.

혈청 miR-107 발현 및 진단 성능

혈청 miR-107 수치는 RE 그룹에서 대조군에 비해 유의하게 낮았다(그림 1A). ROC 곡선 분석 결과, miR-107이 RE 환자와 건강한 대조군을 구분한다는 것이 입증되었습니다(AUC = 0.895; 그림 1B

토론

RE는 위식도 역류로 인해 발생하는 식도 점막의 염증성 질환으로, 다양한 증상을 동반하여 삶의 질에 영향을 줄 수 있고 심각한 합병증 발생 위험을 동반합니다¹⁹. 정상적인 생리적 조건에서 위는 고유한 방어 기제 덕분에 위산과 담즙으로부터 보호받습니다. 반면, 견고한 점액 장벽이 부족한 식도는 이러한 물질에 의해 손상에 더 취약합니다²⁰. 따라서 우리는 RE의 병리학적 기전을 탐구하여 비침습적 표지자의 발현을 통해 RE의 발생 여부를 평가하고자 합니다. 이 프로토콜은 연구소에서 RE를 재현 가능하게 모델링하고 miRNA 매개 조절 기전을 분석하는 방법을 제공합니다. 성공적인 구현을 위한 핵심 단계는 염산 농도와 노출 시간의 정밀한 제어, 일관된 세포 배양 조건 유지, 그리고 형질전환 효율의 검증입니다. 일반적인 도전 과제로는 산 처리 후 세포 생존력의 변동성과 일관성 없는 형질전환 결과...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아메리칸 타입 문화 컬렉션	매너서스, 미국		상업용 셀 뱅크
디메틸 설폭사이드	시그마, 독일	D4540
이중 루시퍼라제 리포터 분석 키트	프롬메가, 미국	E1910	이중 루시퍼레이스 리포터 분석 시스템
패스트스타트 유니버설 SYBR 그린 마스터 키트	로슈, 독일	4913850	SYBR 그린 PCR 마스터 믹스
태아 소 혈청	깁코, 뉴욕, 미국	10100147C
제네파마 컴퍼니	중국 상하이
염화수소	시그마-올드리치, 미주리, 미국	1099730001
IL-6 ELISA 키트	R& D 시스템즈, 미국	D6050	ELISA 키트
IL-8 ELISA 키트	R& D 시스템즈, 미국	D8000C	ELISA 키트
인큐베이터	포르마 사이언티픽, MA, 미국	311 S/N29035
리포펙타민 3000	인비트로젠, 미국	L3000015	리포펙타민 시약
메틸 티아졸릴 테트라졸륨	시그마, 독일	M5655
마이크로플레이트 리더	바이오텍, 버몬트, 미국	ELx808
나노드롭 분광광도계	미국 매사추세츠주 서모	ND-1000
페니실린/스트렙토마이신	깁코, 뉴욕, 미국	15070063
PrimeScript RT 키트	타카라, 일본	DRR047A	역전사 키트
트리졸	미국 매사추세츠주 서모	10296010	페놀-클로로포름 시약
초저온 냉동고와 nbsp;	중국 칭다오 하이얼	DW-86W100