Caenorhabditis elegans 생식계통에서 동형접합 노크인 라인을 얻기 위한 CRISPR/Cas9 미세 주입 워크플로우.
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방법 논문
카에노르랍디티스 엘레간스에서 생식계 특이 유전자의 CRISPR/Cas9 매개 내인성 형광 태깅
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Caenorhabditis elegans(C. elegans) 생식계에서의 단백질 위치 지정은 배우자 발생 중 유전자 기능 해석에 핵심적이지만, 기존의 형질전환 유전자 접근법은 종종 가변적인 발현을 낳고 생식세포에서는 침묵시킬 수 있습니다. 여기서는 내인성 유전자좌에 형광 태그를 삽입하는 실용적인 CRISPR/Cas9 워크플로우를 설명하여, 천연 조절 하에 단백질 분포를 보고하는 안정적인 노크인 대립유전자를 생성할 수 있게 합니다. 프로토콜은 표적 단백질에 적합한 태깅 전략 선택, 성숙한 성체 양성체에 생선 미세주입을 통한 CRISPR 시약을 전달하는 과정의 주요 단계를 다루며, 주입된 동물을 선별을 위해 회수하는 과정입니다. 녹인 후보자는 PCR 기반 유전자형 분석을 통해 두 세대에 걸쳐 확인되어 동형접합 벌레를 분리하고 편집된 대립유전자를 검증합니다. 마지막으로, 생식계 형광을 검증하고 생체 내 세포 내 아세포 위치를 평가하기 위해 공초점 현미경을 사용합니다. 이 워크플로우는 재현 가능하고 생식세포 강화 유전자에 널리 적용할 수 있도록 설계되어, 발생 및 세포생물학적 분석을 위한 동형접합 태그 균주를 쉽게 확립할 수 있는 경로를 제공합니다.
서론
Caenorhabditis elegans (C. elegans)는 짧은 생활사, 투명한 몸체, 높은 유전적 접근성 덕분에 생식 발달과 배우자 발생을 연구하는 잘 확립된 모델입니다. C. elegans 는 주로 자가수정 자웅동체로 존재하며, 생식선은 먼저 정자 생성을 거친 후 난자 생성으로 전환됩니다. 이 생식 방식은 균주 유지를 단순화하고 동형접합 계통2를 쉽게 얻을 수 있게 합니다. 최근 공간 전사체학은 생식선에서 풍부해진 유전자 목록을 크게 확장했으며, C. elegans3에서 생식계 전반에 걸쳐 뚜렷한 성별 특이적 발현 패턴을 밝혀냈습니다. 최근에는 단세포 RNA 시퀀싱이 생식세포 발달 경로를 재구성하고 정자 생성을 관여하는 유전자 조절 네트워크 추론을 가능하게했습니다. 이 데이터셋들은 풍부한 후보 목록을 생성하지만, 기능적 해석은 종종 생체 내에서 단백질 행동을 관찰해야 합니다—특히 해당 단백질이 언제 어디서 위치하는지, 그리고 생식계 발달 과정에서 그 패턴이 어떻게 변하는지 정의하는 것입니다.
C. elegans의 기존 형질전환은 종종 플라스미드 DNA의 생식선 미세주입에 의존하며, 이는 다복 복제된 염색체 외 배열을 쉽게 생성합니다5. 그러나 생식계통에서는 이러한 배열이 종종 강하게 침묵하는데, 이는 반복 DNA의 발현을 제한함으로써 생식계 기능을 보존하고 세대에 걸친 유전 정보의 안정성을 유지하는 데 도움을 주는 메커니즘으로 여겨집니다. 그 결과, 체세포 조직에서 쉽게 발현되는 형질전환유전자 발현 구조가 생식계 내에서 약하거나 일관성이 없을 수 있습니다. 발현이 감지되더라도 복제수 효과와 설계된 조절 요소들은 단백질의 용량과 시기를 변화시켜 원래의 위치와 동역학에 대한 결론을 혼란시킬 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 미세입자 폭격과 Mos1 매개 단일 복제 삽입(MosSCI)이 널리 사용되어 저/단일 복제 통합 형질전환 라인 8,9,10을 생성합니다. 이러한 방법들은 생식계통에서 발현을 개선할 수 있지만, 비용, 처리량, 그리고 내인성 조절 재현 능력 면에서는 차이가 있습니다. CRISPR/Cas9 게놈 편집은 상동 지향 수리를 통해 내인성 유전자 좌위에 형광 태그를 삽입하여 단백질 위치 위치와 동역학을 보고하는 안정적인 노크인 대립유전자를 생성하는 보다 직접적인 경로를 제공합니다.
여기서는 C . elegans 에서 CRISPR/Cas9 매개 내인성 형광 태깅의 실용적인 워크플로우를 설명하며, 보고된 생식계통 풍부 발현 패턴을 기반으로 선정된 유전자에 적용합니다. 프로토콜은 표적 선택, 기증자 템플릿 및 RNA 설계, 생식선 미세주입, 그리고 후속 스크리닝을 통해 동형접합 녹인 라인을 분리하고, 유전자형 분석을 통한 검증을 안내합니다. 이 접근법은 발달 단계에 걸친 생식계통 발현 유전자에 폭넓게 적용 가능하며, 단백질 위치 분석과 생체 내 역학의 정량적 분석을 가능하게 합니다. 이 워크플로우는 생식계주에서 발현된 유전자를 태깅하고, 천연 조절 제어 하에 단백질 위치 및 역학을 분석하는 데 실용적인 전략을 제공합니다.
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프로토콜
Caenorhabditis elegans를 포함한 모든 실험은 베이징사범대학교의 실험실 생물 관리 및 사용에 관한 기관 지침에 따라 수행되었습니다.
그림 1: C. elegans에서 CRISPR/Cas9 매개 내인성 형광 태깅 개요. 내인성 형광 녹인 생성 및 검증의 주요 단계를 보여주는 도식 워크플로우. 설계 및 구성 단계에서 생식계 강화 표적 유전자와 삽입 부위가 선택되고, pDD162는 Cas9의 CRISPR/Cas9 플라스미드로 사용되어 RNA 발현을 안내하며, pPD95.75는 형광 태그(예: GFP)와 좌우 상동암이 서브클론되는 기증자 골격으로 사용됩니다. 미세 주입 단계에서는 CRISPR/Cas9 주입 혼합물(gRNA/Cas9 플라스미드, 기증자 템플릿, 공동 주입 마커 포함)이 젊은 성체 자웅동체의 생식샘에 전달된 후 씨앗 판에서 회복됩니다. 검증 단계에서는 마커 양성 자손이 선별되어 PCR 기반 노크인 이벤트의 확인과 DNA 시퀀싱을 통한 확인을 포함한 후속 유전자 타입 분석을 수행하고, 성공적인 노크인 라인은 형광 현미경으로 검사하여 태식선 발현과 태그된 단백질의 세포 내 위치 상태를 평가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
1. 생식세포 강화 표적 유전자 선택
- 공개 데이터베이스와 출판된 문헌을 사용하여 생식선 또는 생식세포에서 우세한 발현을 가진 후보 유전자를 식별합니다.
- 단백질 특징에 따라 적절한 태깅 부위를 선택하세요. 선택된 아이소폼과 태그 삽입 위치를 기록하여 후속 가이드 RNA 및 기증자 템플릿 설계를 수행합니다(그림 1).
2. 가이드 RNA 및 기증자 템플릿 설계
- 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 상류에서 20 nt 가이드 RNA(gRNA) 서열을 확인한다. NGG), Cas9 인식에 필요한 시퀀스를 작성하고, 이를 의도된 태그 삽입 지점에 최대한 가깝게 위치시킵니다.
- C . elegans 유전체를 선택한 온라인 설계 도구(예: IDT CRISPR 설계 도구)를 사용하여 후보 gRNA를 평가합니다. 예측 가능한 온타겟 절단 효율이 강하고 고위험 예측 오프타겟 부위가 없는 가이드를 선택하세요.
- gRNA 서열을 CRISPR 발현 플라스미드 골격 내 U6 프로모터와 gRNA 스캐폴드 사이 영역에 클론합니다.
참고: gRNA 서열을 오버행으로 포함하는 프라이머를 설계하세요. PCR 증폭을 수행한 후 상동 재조합 기반 조립(homologous rejoint based assembly)을 수행하는데, 이는 제한효소 소화를 제거하고 발현 벡터15에 직접 단일 클로닝을 가능하게 하는 연결 독립 클로닝 방법입니다. - Sanger 시퀀싱으로 올바른 삽입을 확인하세요.
- 형광 태그를 이용해 기증 플라스미드를 구성하는데, 그 양옆에는 표적 유전자좌에서 유래한 약 1,000 bp 좌측 상동 팔이 있습니다.
참고: 단백질나제 K 소화를 이용해 N2 게놈 DNA에서 벌레 용해액으로 제조한 상동성 팔을 증폭하세요. 15–20 bp 염료를 설계하면 선형 벡터 및 형광 태그와 겹칩니다. 상동 암을 조립하고 상동 재결합 을 통해 단일 반응으로 골격에 태그를 넣습니다. N-말단 태깅의 경우 ATG 시작 코돈 바로 뒤, C-말단 태깅의 경우 정지 코돈 바로 앞에 형광 태그를 삽입하세요. 단백질의 적절한 접힘과 기능을 유지하기 위해 표적 유전자와 형광 태그 사이에 링커 서열을 포함시켜야 합니다. 링커를 사용해 융합 파트너 간의 입체 간결을 줄이고, 링커와 태그가 부호화 시퀀스와 함께 프레임에 삽입되도록 하세요. 알려진 또는 예측된 기능 도메인, 신호 펩타이드, 또는 막관통 영역을 손상시키지 않도록 삽입 부위를 신중히 선택하세요(보충 파일 1). - 공여자 상동 주형 서열에 침묵치환을 도입하여 단백질 서열을 변경하지 않고 PAM 또는 가이드 결합 서열을 방해하고, 통합 후 Cas9가 재절단되는 것을 방지합니다.
참고: 상동 암 증폭에 사용되는 프라이머에 동의어 점 돌연변이를 포함시키며, PAM 영역 내 코돈을 표적으로 삼으세요. - Sanger 시퀀싱을 통해 상동암과 태그 접합부 모두에서 공인 서열 무결성을 확인한다.
참고: 검증된 플라스미드는 단기 저장은 −20 °C, 장기 저장은 −80 °C에 보관하세요.
3. 주사 혼합물 준비
- CRISPR 발현 플라스미드, 공인 플라스미드(pPD95.75를 기반으로 구성됨), 그리고 공동 주입 마커를 멸균된 ddH₂O에 결합하여 표 1에 명시된 농도에서 최종 부피 10 μL로 주입 혼합물을 조립합니다.
참고: 마커 가독성, 후보 회복률, 주사 후 생존율의 균형을 맞추기 위해 농도를 경험적으로 최적화하세요. - 주입 혼합물을 10,000 × g에서 10–20분간 원심분리하여 입자 물질을 펠릿으로 만들고 미세주입 모세관 막힘을 방지합니다.
| 구성 요소 | 기능 | 작동 농도 (ng/μL) |
| pDD162 | CRISPR/Cas9 플라스미드 (Cas9 및 gRNA 발현) | 50-100 |
| 기증자 플라스미드 (pPD95.75 골격) | HDR 기증자 템플릿이 형광 태그를 탑재하고 양옆에 ~1 kb 상동 암이 둘러싸여 있습니다 | 50-100 |
| pRF4 | 공동 주입 마커 (롤러 표현형) | 50-100 |
| pPD122.11 | 공동 주입 마커(GFP 발현) | 5-10 |
| 멸균 DDH2O | 최종 권으로 가져갑니다 | – |
표 1: 주입 혼합물 조성 및 플라스미드 기능. 주입 혼합물에는 CRISPR 발현 플라스미드, 기증 플라스미드, pRF4, pPD122.11이 지정된 농도로 포함되어 있으며, 총 용량은 10 μL입니다.
4. 주사 바늘을 장전하고 준비한다
- 생식선 주입에 적합한 날카로운 끝을 가진 길게 테이퍼를 만드는 바늘 풀러를 사용해 유리 모세혈관을 마이크로주입 바늘로 당깁니다.
참고: 풀러 매개변수는 경험적으로 최적화하세요. 예시 시작 매개변수: 열 = 540, 당김 = 20, 속도 = 100.
주의: 뽑힌 바늘은 천공 부상을 방지하기 위해 조심히 다루세요. 바늘을 다룰 때는 겸자를 사용하고, 사용한 바늘은 샤프 용기에 버리세요. - 미세모세관 피펫을 가열해 두 조각으로 나누어 로딩 도구를 만드세요.
참고: 상업용 적재 팁을 대체로 사용할 수 있습니다. - 단축된 미세모세관 피펫의 넓은 끝에 고무 흡입기 전구를 부착하세요.
- 약 1 μL 정도의 정액 주입 혼합액을 로더에 흡입합니다.
참고: 정확한 부피는 매우 중요하지 않습니다. 용액이 바늘 끝을 채우도록 하세요. - 로더를 주입 바늘의 뒷부분에 삽입하고 주사 혼합물을 부드럽게 분배합니다.
- 적재된 바늘을 10분간 수평으로 놓아 용액이 끝 쪽으로 가라앉도록 하고 연속된 컬럼을 확인합니다.
- 주입 현미경에 바늘을 장착하고 밝은 시야 광학으로 팁을 초점에 맞추세요.
- 바늘 끝을 덮개 슬립 가장자리에 살짝 닿아 할로카본 오일에 적셔서 유량을 테스트하세요.
참고: 주입 압력(30–80 psi)을 조절하여 1초16초 이내에 생식선 직경과 거의 같은 기포를 생성하세요.
5. 주사할 벌레 준비
참고: 앞서 설명한 선충 성장 배지(NGM) 플레이트와 M9 완충제를 준비하세요. 대 장균 OP50(이하 OP50)을 시딩한 판에 벌레를 보관하고, N2 배경에서 주사를 시행하세요.
- 건강한 배지에서 L4 양성체를 선별하여 20°C에서 10시간 배양하여 잘 발달한 생식계통을 가진 젊은 성체를 얻습니다.
- 박테리아 잔류를 줄이기 위해 씨앗이 없는 판에 벌레를 옮기세요.
- 유리 슬라이드에 마른 2% 아가로스 패드를 준비하고 할로카본 오일 한 방울을 발라주세요.
- 속눈썹 고르기를 이용해 지렁이를 아가로스 패드에 옮기세요.
- 벌레를 움직이지 못하게 하고 생식선을 주사할 방향을 잡아라.
주의: 건조를 방지하기 위해 20–30분 이내에 주사를 완료하세요.
6. 생식샘 미세주사 시행
그림 2: 젊은 성체 C. eleganshermaphrodites에서 미세주입을 위한 원위 생선 융합체의 위치 확인. (A) 장착된 젊은 성체 자웅동체의 저배율 밝시야 이미지. 양쪽 생식선 팔이 모두 보입니다; 주입 부위는 대표적인 예로 한 팔(화살표)에 표시되어 있습니다. 박스 영역은 패널 B에서 고배율로 표시된 영역을 표시합니다. (B) 패널 A의 박스 영역에 해당하는 원위 생식샘의 고배율 DIC 뷰. 화살표는 주사 혼합물이 전달되는 원위 생식샘 융합체 내 주입 위치를 나타냅니다. 스케일 바: 100 μm(A) 및 20 μm (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
- 움직이지 못한 벌레를 찾아 저배율 대물렌즈로 생식선을 식별하세요.
- 마이크로매니퓰레이터 조작을 사용해 바늘을 위치시키세요.
- 웜을 바늘에 대해 20–40° 각도로 정렬하세요.
- 더 높은 배율로 원위 생식계에 집중하세요.
- 벌레를 바늘 쪽으로 밀어 넣고 끝을 생식선 융합체 안에 위치시킵니다(그림 2).
- 용액을 주입하고 눈에 띄는 생식선 부종으로 분만을 확인하세요.
참고: 주입 압력(30–80 psi), 보상 압력(0.1–0.5 psi), 주입 시간(0.1–0.3초)을 최적화하세요.
주의: 과도한 압력이나 부피는 벌레 파열을 일으킬 수 있습니다. - 바늘을 빼고 다음 주사를 위해 위치를 재조정하세요.
참고: 생존 극대화를 위해 단측 주사를 시행하거나, 편집 효율을 높이기 위해 양측 주사를 시행하세요. - M9 버퍼를 추가해 벌레를 방출하고 각 벌레를 개별 회수 플레이트로 옮기세요.
- 20–25마리의 벌레에 주사를 반복하세요.
참고: 바늘이 막히거나 손상되면 교체하세요. - 주사 벌레를 20°C에서 2–3일간 인큐베이팅하여 회복을 돕습니다.
7. F1 후보자들을 심사하여 노크 인-포지션 라인을 식별한다
- F1 자손을 선별하여 공동 주입 마커를 검사하고 마커 양성 동물을 선택합니다.
참고: 조직 특이도와 스펙트럼 특성을 가진 대체 형광 공동 주입 마커의 예시는 보충표 1에 제공되어 있습니다.
참고: 더 높은 신뢰도를 위해 두 마커를 모두 발현한 동물을 선택하세요. 높은 마커 빈도를 가진 번식('잭팟 번식')을 우선시하세요. - 각 F1 벌레를 개별 플레이트에 옮기고 1–2일간 알을 낳게 하세요.
- 각 F1 벌레를 단백질효소 K 버퍼에 용해하여 PCR 템플릿을 준비합니다.
참고: 즉시 처리하지 않으면 용해액을 −80 °C에서 보관하세요. - 상동암 외부에 유전체 프라이머 하나와 내부 태그 프라이머 하나를 사용해 접합 PCR을 수행합니다.
참고: PCR 양성 F1 동물의 해당 판을 보관하십시오.
8. F2 자손을 선별하여 동형접합 노크인 라인을 분리하고 통합 확인
- PCR 양성 F1 라인에서 F2 자손을 개별 판에 분리합니다.
- F2 벌레가 자손과 성충을 생산하여 유전자형 분석에 활용하도록 허용하세요.
참고: 필요 시 용해액은 −20 °C에 저장하세요. - 상동암 양옆에 프라이머를 배치하여 산물 크기에 따라 야생형 및 노크인 대립유전자를 구별하는 PCR을 수행합니다.
- 두 삽입 접합부에서 Sanger 시퀀싱으로 올바른 통합을 확인하세요.
- 형광 현미경을 이용해 생식세포 형광 발현과 위치 확인.
- 확인된 동형접합 계통을 확장하고 재고를 유지하세요.
참고: 크라이옵저저브는 장기 보관을 위한 검증된 라인을 보유하고 있습니다.
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결과
프로토콜에 따라 젊은 성체 자웅동체는 CRISPR/Cas9 플라스미드(pDD162), 약 1 kb 상동 암(pPD95.75)으로 둘러싸인 GFP 노크인 태그를 암호화하는 플라스미드 공여체와 공동 주입 마커(pRF4 및 pPD122.11)를 생식선 마이크로주입했습니다. 생식줄 강화 표적 유전자를 대표적인 예로 사용하여 안정적이고 동형접합 노크인 대립유전자를 생성했으며, 이 대립유전자는 천연 조절 제어 하에서 단백질 위치를 보고합니다.
두 차례의 주사 세션에서 30마리의 P0 자웅동체가 주입되었고, 20마리의 F1 동물을 유전자형 분석하여 두 개의 접합-PCR 양성 계통이 확인되었고, 이후 동형접합 노크인 웜을 분리하기 위해 선별되었습니다. F1 동물을 먼저 단일 분석하여 F2 플레이트를 만들고, 해당 F1 성체는 유전자형 분석을 위해 용해되었습니다. 노크인 양성 선은 선택된 상동성 팔 외부에 유전체 프라이머 하나와 GFP...
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토론
이 워크플로우는 내인성 유전자좌에 형광 태그를 삽입하여 단백질 위치 위치를 보고하는 안정적이고 동형접합 노크인 라인을 생성하도록 설계되었으며, 이는 천연 조절조절 5,6,7,8,9,10 하에 있습니다. 실제로는 단일 결과보다는 순차적인 검증 사슬로 판단하는 것이 가장 좋습니다: F1 PCR 스크리닝으로 노크인 후보를 확인하고, F2 유전자형 PCR을 통한 동형접합 확인, DNA 시퀀싱으로 편집된 대립유전자 확인, 그리고 공초점 현미경으로 생식세포 형광을 시각화하는 것입니다. 이 단계별 전략은 내생성 태깅이 성공적으로 달...
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공개 사항
저자들은 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국가중점연구개발 프로그램(2023YFA1801100 to L.M.), 중국 자연과학기금(32400698 P.W., 32270774 L.M.)의 지원금으로 지원받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아가르 | Beijing Lablead Biotech Co., Ltd. | QZ02 | NGM 아가르 플레이트를 준비하는 구성 요소 |
| 아가로스 | NOVON | ZZ14011 | 2% 아가로스 패드 준비 |
| Caenorhabditis elegans 균주 N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | 주입 배경 균주 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5425 | 주입 혼합물 정화 |
| 콜레스테롤 | Beijing Chemical Reagents Company | 57-88-5 | NGM 아가르 플레이트를 준비하는 구성 요소 |
| Co-injection marker plasmid rol-6 (su1006) (pRF4) | Guangshuo Ou Lab | 후보를 농축하기 위한 롤러 마커 | |
| 공동현미경 | ZEISS | LSM880 + Airyscan | GFP 발현/국소화 검증 |
| 이칼륨 수소인산염 (K2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7758-11-4 | NGM 아가르 플레이트를 준비하는 구성 요소 |
| 이나트륨 수소인산염 (Na2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7558-79-4 | M9 완충액 준비 구성 요소 |
| DNA 래더 | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF288-01 | 아가로스 겔에 대한 크기 참조 |
| 도너 플라스미드 백본 (pPD95.75) | Addgene | 1494 | HDR 도너 구성을 위한 백본 |
| 전기영동 시스템 | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | 112-0630 | 접합부 검사 및 염색체 유형 분석을 위해 아가로스 겔에 PCR 증폭 산물 분리 |
| Escherichia coli OP50 균주 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | 벌레의 먹이 공급원 | |
| 형광 co-injection marker plasmid (pPD122.11) | Fire Lab | 후보를 농축하기 위한 GFP co-marker | |
| 형광 스테레오 현미경 | SOPTOP | SZX12-HT | 형광 co-injection 마커를 가진 살아있는 벌레 검사 |
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| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | 주입 중 건조 방지 |
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| 황산 마그네슘 (MgSO4) | Sinapharm | CAS: 7487-88-9 | NGM 아가르 플레이트 및 M9 완충액 준비 구성 요소 |
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| 칼륨 이수소 인산염 (KH2PO4) | Sinapharm | CAS: 7778-77-0 | NGM 아가르 플레이트 및 M9 완충액 준비 구성 요소 |
| 염화나트륨 (NaCl) | Sinapharm | CAS: 7647-14-5 | NGM 아가르 플레이트 및 M9 완충액 준비 구성 요소 |
| 스테레오 현미경 | Motic | K400L | 아가로스 패드에 벌레 선택 및 장착 및 주입 후 복구 단계 수행 |
참고문헌
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