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연구 논문

SPRY2와 miR-590-5p 발현 조절이 인간 골관절염 모델 연골세포에서 자가포식에 미치는 영향

108 조회수

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DOI:

10.3791/70883

⸱

2026년 7월 31일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

IL-1β 유도 C28/I2 연골세포 모델에서 염증 스트레스는 miR-590-5p를 증가시키고 SPRY2 발현을 감소시켰습니다. 이 축을 조절하면 Beclin-1, LC3-II, Bcl-2의 발현이 변화하여, 골관절염에서 자가포식 관련 반응과 연골세포 생존에 영향을 줄 수 있는 miR-590-5p/SPRY2 조절 경로가 있을 것으로 추정됩니다.

초록

골관절염(OA)은 연골이 점진적으로 파괴되고 연골 항상성 상실이 특징인 흔한 퇴행성 관절 질환입니다. 오토포식 조절 이상이 골관절염 발병에 기여하지만, 연골세포에서 자가포식 관련 반응을 조절하는 분자 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 본 연구는 IL-1β 유도 C28/I2 인간 연골세포를 이용해 염증성 골관절염 미세환경에서 miR-590-5p/SPRY2 조절축의 역할을 조사하였습니다. 시험 관 내 OA 모델은 IL-1β로 C28/I2 세포를 처리하여 확립되었습니다. miR-590-5p와 SPRY2의 발현은 정량적 PCR과 웨스턴 블로팅을 통해 평가하였다. 기능 증가 및 기능 상실 접근법을 사용하여 SPRY2와 miR-590-5p가 자가포식 관련 표지자인 Beclin-1과 LC3-II에 미치는 영향을 평가했으며, 생존 관련 단백질인 Bcl-2도 함께 평가하였다. 생물정보학적 분석 및 구조 실험을 통해 miR-590-5p와 SPRY2 간의 조절 관계를 조사하였다. IL-1β 처리는 miR-590-5p 발현을 유의미하게 증가시키면서 SPRY2 mRNA와 단백질 농도(P < 0.05)를 감소시켰습니다. SPRY2 과발현은 Beclin-1과 LC3-II 발현을 현저하게 감소시켜 각각 약 65%와 77% 감소시켰습니다(P < 0.05). 반면, miR-590-5p는 베클린-1, LC3-II, Bcl-2 과발현을 증가시킨 반면, miR-590-5p 억제는 이러한 효과를 되돌리고 SPRY2 발현을 회복시켰습니다. 기능 분석 결과 SPRY2가 miR-590-5p의 추행 조절 타깃으로 지지되었습니다. 이 발견들은 miR-590-5p/SPRY2 축이 염증성 상태에서 자가포식 관련 마커 발현과 연골세포 생존의 중요한 조절자임을 확인하며, 골관절염 치료 표적으로서의 잠재적 관련성을 시사합니다.

서론

전 세계적으로 가장 흔한 관절염 형태인 골관절염(OA)은 통증, 이동성 장애, 신체 장애의 주요 원인으로, 의료 시스템과 사회에 상당한 부담을 안겨줍니다. 병리학적으로 OA는 관절 연골의 점진적 퇴행, 활막 염증, 연골하 골1의 병리적 재형성이 특징입니다. 역학 추정에 따르면 전 세계적으로 약 3억 3백만 명이 골관절염에 영향을 받고 있으며, 인구 고령화와 비만율 증가에 따라 이 숫자는 증가할 것으로 예상됩니다2. 중국에서는 증상성 무릎 골관절염의 유병률이 약 8.1%로 추정되며, 여성과 농촌 인구에서 유병률이 불균형적으로 높게 나타납니다3. 높은 유병률에도 불구하고, 현재 치료 옵션은 주로 비스테로이드성 소염제(NSAIDs)를 통한 증상 관리와진행성 질환에 대한 외과적 개입에 한정되어 있습니다. 질병 조절 골관절염 약물(DMOADs)이 없는 것은 연골세포 항상성과 생존을 조절하는 분자 기전에 대한 불완전한 이해를 반영한다.

관절 연골의 구조적·기능적 완전성은 상주 연골에 의존하며, 연골은 동화작용과 이화대가지 활동의 균형을 통해 세포외기질(ECM) 교체를 유지합니다. 골관절증 진행 과정에서 연골세포는 비정상적인 기계적 스트레스와 염증성 매개체, 특히 인터루킨-1β(IL-1β)과 종양 괴사 인자 α(TNF-α)에 노출되어 기질 합성에서 기질 분해로 전환하는6. IL-1β은 기질 금속단백효소(MMP)와 응집효소의 생성을 자극하면서 타입 II 콜라겐과 프로테오글리칸의 합성을 억제함으로써 연골 파괴에 기여합니다7. 또한 IL-1β은 산화 스트레스와 미토콘드리아 기능 장애를 유발하여 연골세포 세포자멸사와 노화를 유발합니다8. 따라서 염증성 상태에서 연골 세포 생존을 조절하는 세포 내 신호 전달 경로를 규명하는 것이 OA 연구의 우선순위로 남아 있습니다.

자가포식은 손상된 소기관과 단백질 집합체를 제거하고 재활용함으로써 세포 항상성을 유지하는 진화적으로 보존된 리소좀 분해 경로입니다. 기저 자가포식은 세포 생존과 에너지 균형에 필수적입니다; 그러나 오토포지 조절 이상은 질병 진행에 기여할 수 있습니다. 골관절염에서 자가포식은 일반적으로 연골세포가 세포 스트레스에 적응하고 세포자살사에 저항하도록 돕는 보호 반응으로 간주됩니다. 이전 연구들은 골관절염 진행 과정에서 특히 말기 질환에서 자가포식 활동이 감소하여 세포 질 조절 저하와 연골 세포 손실 증가를 초래한다고 제안했습니다11. 여러 단백질이 자가포식 관련 활성의 지표로 흔히 사용됩니다. 베클린-1은 자가포식체 시작에 참여하며, 미세소관 관련 단백질 1 경쇄 3(LC3-I에서 LC3-II)의 전환은 자가포식체 형성의 표지자로 널리 사용된다. 반면, B세포 림프종 2(Bcl-2)는 베클린-1 의존성 자가포식을 억제하는 동시에 항세포자멸사 효과도 발휘합니다13. 그럼에도 불구하고, 자가포식 관련 표지자의 해석은 주의가 필요하며, LC3-II와 베클린-1의 정적 측정만으로는 증가된 자가포식체 형성과 손상된 리소좀 분해를 독립적으로 구별할 수 없습니다. 이러한 한계에도 불구하고, 자가포식 관련 경로의 조절은 OA에 대한 유망한 치료 전략으로 남아 있습니다.

마이크로RNA(miRNA)는 표적 메신저 RNA의 3′-비번역 영역(3′-UTR) 내 상보 서열에 결합하여 전사 후 유전자 발현을 조절하는 짧은 비암호화 RNA로, mRNA 분해 또는 번역 억제를 일으킵니다14. 이상한 miRNA 발현은 염증, 세포자멸사, ECM 재형성에 영향을 미쳐 OA 발병과 관련이 있다고 밝혀졌습니다15. 이들 분자 중에서 miR-590-5p는 골 대사 및 기타 병리학적 과정에서 조절 역할로 주목받고 있습니다. 이전 연구들은 miR-590-5p가 중간엽 줄기세포에서 골형성 분화를 촉진하고 지방 생성을 억제한다는 것을 보여주었다16. 암 모델에서 miR-590-5p는 맥락 의존적 기능을 나타내며, 종양 억제 조절자로서17. 더불어, miR-590 계열 구성원을 포함한 변형된 마이크로RNA 발현 프로필이 OA18 기간 중 관절 조직의 병리학적 재형성에 연관되어 있음이 밝혀졌습니다. 그러나 줄기세포나 암 모델에서 얻은 증거는 성숙한 관절 연골세포로 직접 적용할 수 없습니다. 따라서 염증성 골관절염 미세환경 내에서 연골세포 반응 조절에 미치는 miR-590-5p의 역할은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다.

OA에서 miR-590-5p의 잠재적 하위 메커니즘을 조사하기 위해, 실리코 내 표적 예측 분석이 수행되었으며, Sprouty2(SPRY2)를 추정되는 하류 표적으로 확인하였습니다. SPRY2는 Sprouty 단백질 계열에 속하며, 이 단백질은 수용체 티로신 키나제 신호를 음성으로 조절하고 RAS/MAPK/ERK 경로의 활성화를 억제합니다. MAPK 신호전달이 연골세포 분화, 염증 반응, 자가포식에 영향을 미치기 때문에, SPRY2는 OA 병태생리학에서 중요한 조절 노드일 수 있습니다20. 이전 연구들은 SPRY2가 류마티스 관절염 모델에서 염증 반응을 억제할 수 있음을 보여주며(21), 상피계에서 세포자멸사(apoptosis) 관련 조절에 참여할 수 있으며(22), 허혈성 손상 모델에서 자가포식 관련 반응과 연관되어 있음을 보여준다(23). 이러한 관찰은 SPRY2가 세포자멸사와 자가포식의 조절에 관여함을 시사하지만, 관절 연골 세포에서의 역할은 아직 제대로 규명되지 않았습니다. 따라서 miR-590-5p와 SPRY2가 염증성 스트레스 하에서 연골세포 생존에 영향을 미치는 조절 축을 형성한다고 가설화되었다.

이러한 관찰을 바탕으로 miR-590-5p가 연골세포에서 SPRY2 발현을 조절함으로써 자가포식 관련 반응을 조절한다는 제안이 제기되었습니다. miR-590-5p와 SPRY2는 각각 다른 생물학적 맥락에서 개별적으로 연구되었으나, OA 연골 세포에서의 기능적 관계는 아직 밝혀지지 않았습니다. 본 연구에서는 C28/I2 인간 연골세포에서 IL-1β 유도 OA 모델을 사용하여 miR-590-5p와 SPRY2의 발현 패턴을 조사하고 Beclin-1, LC3-II, Bcl-2의 발현에 미치는 영향을 평가하였습니다. miR-590-5p/SPRY2 조절 축을 조사함으로써, 본 연구는 연골세포 생존의 근본 후생유전학적 기전에 대한 통찰을 제공하고 OA의 잠재적 치료 표적을 규명합니다.

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프로토콜

이 연구는 상업적으로 이용 가능한 인간 연골세포 세포주 C28/I2만을 사용하여 수행되었습니다. 이 연구에는 인간 참가자, 인간 조직 샘플, 환자 유래 물질, 또는 살아있는 동물이 참여하지 않았습니다. 따라서 기관 및 국가 지침에 따라 기관 심사 위원회(IRB)와 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인이 필요하지 않았습니다. 프로토콜에 사용되는 도구, 화학물질, 키트 및 시약은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 세포 배양 및 OA 모델 구축

인간 연골세포주 C28/I2(자세한 내용은 재료표에 제공됨)는 상업 공급자로부터 획득했습니다. 실험적 재현성을 보장하기 위해 세포는 단거리 연속 반복(STR) 프로파일링을 통해 인증되었고, 마이코플라즈마 오염이 없음을 확인하기 위해 정기적으로 검사되었습니다. 3번과 8번 통로 사이의 세포가 모든 실험에 사용되었습니다. 세포는 DMEM에서 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(모든 배양 시약은 재료표에 상세 설명 있음)을 37°C의 가습 대기, 5%CO2 함유 환경에서 유지했습니다.

시험관 내 골관절염(OA) 모델을 확립하기 위해, C28/I2 세포에 재조합 인간 IL-1β를 자극하였습니다. 확립된 문헌 6,7, 과도한 즉각적 세포독성 없이 강한 이화 상태를 유도하기 위한 예비 용량-반응 최적화 실험을 바탕으로, 세포들은 24시간 동안 20 ng/mL IL-1β로 처리되었습니다.

2. 실험적 그룹화 및 형질전환

기전적 경로를 명확히 하기 위해, 연구는 최소 세 개의 독립적인 생물학적 복제체를 가진 세 가지 주요 실험 모듈로 나뉘었습니다:

  1. SPRY2 기능 증가/손실:
    세포는 대조군, OA 모델, OA + 빈 벡터(NC), OA + SPRY2 과발현 플라스미드(OE-SPRY2), 그리고 해당 소규모 간섭 RNA 그룹(si-NC 및 세 가지 특정 si-SPRY2 구성체: si-695, si-800, si-896)에 배정되어 간섭 효율을 스크리닝하였습니다.
  2. miR-590-5p 변조:
    세포는 대조군, OA 모델, OA + 모방 NC, OA + miR-590-5p 모방군, OA + 억제제 NC, OA + miR-590-5p 억제군으로 나누었습니다.
  3. miR-590-5p/SPRY2 조절 관계의 기능적 검증:
    miR-590-5p와 SPRY2 간의 제안된 조절 관계를 추가로 평가하기 위해, 세포들은 miR-590-5p 모방 및 억제제 조건을 적용하여 miR-590-5p 변조가 OA 모델에서 SPRY2 발현을 변화시키는지 확인하였다.
    형질전환을 위해 C28/I2 세포는 6웰 플레이트에 2×10 5 셀/웰에 시딩되었습니다. 70%–80% 합류율에 도달하면, 제조사 프로토콜에 따라 상업용 지질 기반 형질염변 시약을 사용하여 연골 세포24에서 소량 RNA 전달 절차를 확립하였습니다. 간단히 말해, 플라스미드(OE-SPRY2 및 NC; 2 μg/well)와 올리고뉴클레오타이드(miR-590-5p 모방/억제제 및 siRNA; 50 nM)를 환원 혈청 배지에 희석하였다. 지질-DNA/RNA 복합체는 상온에서 15분간 배양한 후 혈청 없는 DMEM 내 세포에 점적으로 첨가되었습니다. 형질전환 6시간 후, 배양지는 10% FBS를 포함한 완전한 DMEM으로 교체되었고, 세포는 RNA와 단백질 추출 전 추가로 48시간 배양되었다.

3. qPCR 검출

총 RNA와 miRNA는 제조사 프로토콜에 따라 전용 miRNA 추출 키트를 사용해 분리되었습니다. RNA 순도와 농도는 UV-Vis 분광광도계를 사용해 평가했으며, 후속 분석에는 A260/A280 비율이 1.8–2.0인 샘플을 사용했습니다. 상업용 역전사 시약을 사용해 cDNA 합성을 수행했습니다. qPCR 사이클링 절차는 다음과 같았습니다: 95 °C에서 10분; 95 °C에서 10초, 58 °C에서 30초, 72 °C에서 30초를 40주기 동안 진행; 이어서 프라이머 특이성과 프라이머 이머 부재를 확인하기 위한 용융 곡선 분석이 진행되었습니다. β-액틴과 U6는 각각 mRNA와 miRNA의 내부 대조군 역할을 했습니다. 상대 유전자 발현은 2-ΔΔCt 방법25를 사용하여 계산되었습니다. Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p, 참조 유전자를 포함한 모든 프라이머 서열은 표 1에 나열되어 있습니다.

프라이머 명칭 전방 프라이머 (5′-3′)역프라이머 (5′-3′)
U6ATTGGAACGATAGAGAGAGATTGGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5pGCGTAAGGCACGCGGTGAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-액틴TGGCCCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAAGATTGGAAGGTAACACCATAAACAAG
Bcl-2TGGGATTCCTGTGGGATTGACTCAGTCTACTCTCTCTGTGTGATGTGTG
베클린-1TCCCGTGTGGAATGAGGAGAGTAAGGAACAAGTCGGTatctctg
LC3-II카카아트카크트그트GAGCTGTAAGCGCCTTCTAA

표 1: 정량적 PCR(qPCR) 분석에 사용되는 프라이머 서열. qPCR을 이용한 표적 전사체 증폭 및 정량에 사용되는 순방향 및 역방향 프라이머 서열, 내부 참조 대조군.

별도의 명시가 없는 한, 데이터는 평균 표준편차(SD)± 표현됩니다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA를 사용한 후 S-N-K 사후 검정을 통해 산출되었습니다. 기호는 다음을 나타냅니다: *P < 0.05 대 컨트롤; #P < 0.05 vs. 지시된 모델 또는 음성 대조군; 그리고 P< OA+억제제-NC 대 0.05.

4. 서부 얼룩 검출

세포는 확립된 단백질 추출 및 면역블롯 절차를 거친 후 프로테아제 및 인산효소 억제제 조합을 보조한 RIPA 버퍼를 사용하여 채취 및 용해하였습니다. 세포 이물질을 제거하기 위해 14,000 × g 에서 4°C에서 15분간 원심분리한 후, 상청액을 수집하고 BCA 단백질 분석 키트를 사용해 단백질 농도를 정량화했습니다. 동일한 양의 단백질 용해액(30 μg)을 변성시키고, SDS-PAG로 1.5시간 동안 분해한 후 300 mA에서 PVDF 막에 1.5시간26분간 옮겼습니다. 막은 0.1% Tween 20(TBST) 함유 5% 무지방 건조 우유를 Tris 완충 식염수에 넣어 상온에서 1시간 차단한 후, 4°C에서 16시간 동안 특정 1차 항체(예: anti-SPRY2, 1:1000 희석)를 사용하여 16시간 적립시켰습니다. TBST에서 세 차례 세척한 후, 막을 적절한 HRP 결합 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 인큐베이팅했습니다. 단백질 밴드는 ECL 검출 시스템을 사용해 시각화하고 ImageJ 소프트웨어를 사용해 정량화하였습니다.

5. 통계 분석

데이터는 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 모든 실험은 최소 세 개의 독립적인 생물학적 복제(n ≥ 3)를 사용하여 수행되었으며, 정량적 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시되었습니다. 모수 검정 이전에 데이터 정규성은 Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 평가되었고, 분산의 균질성을 평가하였습니다. 다수 그룹 간 통계적 유의성은 분산 일방향 분석(ANOVA)을 사용한 후 Student-Newman-Keuls(S-N-K) 사후 검정을 통해 다중 비교를 수행하였습니다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

시험관 내 연골 세포 염증 모델 확립

골관절염 병리의 분자 기전을 조사하기 위해, IL-1β로 자극된 C28/I2 인간 연골 세포를 이용한 시험관 내 염증 모델이 구축되었습니다. 이 모델의 타당성은 히알린 연골 세포외기질의 주요 구성 요소이자 건강한 연골세포의 특징인 콜라겐 II 알파 1 사슬(Col-II)의 발현을 평가함으로써 확인되었습니다. 정량적 분석 결과, IL-1β 노출은 대조군에 비해 Col-II mRNA 발현이 통계적으로 유의미하게 감소한 것으로 나타났습니다. 이러한 표현형 변화는 골관절염 미세환경과 유사한 이화화 상태로 초기 전환을 나타내며, 이후 기전적 연구의 기초 모델을 제공합니다(그림 1).

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토론

이전 연구들은 miRNA가 시작, 소포 신장, 성숙 등 여러 단계에서 자가포식을 조절한다는 것을 보여주었다27. miRNA가 OA 병인기전에서 관여하는 점이 점점 더 입증되고 있으며, 특히 염증, 세포자멸사, 세포외기질 재형성, 자가포식 관련 경로에 미치는 영향이 그렇습니다. miR-590-5p는 세포 항상성 및 암 관련 과정과 연관되어 있습니다 28,29,30. 골격 및 연골 관련 맥락에서 miR-590-5p는 인간 중간엽 줄기세포의 연골성 분화를 촉진하는 것으로 보고되었으며, OA 연골 모델에서는 FGF18,24를 표적으로 하여 증식, 세포자멸사, 염증 ...

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공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

저자들은 광시 중의대학 루이캉 병원 노인의학과에 이 연구를 위한 실험 시설과 기술 지원을 제공해 준 데 감사를 표합니다. 저자들은 또한 데이터 수집과 분석에 도움을 준 실험실 직원과 동료들께도 감사를 표합니다. 이 연구는 광시 중의생과대학 자연과학 연구 프로젝트(연구비 번호 2022MS039; LncRNA-GAS5는 쥐 무릎 골격증 연골 세포에서 자가포식을 억제하기 위해 SPRY2 발현을 매개합니다: 화유 쿠시 처방의 기전 연구 및 조기 개입 효과) 및 중국 국가자연과학기금(지역재단)(연구비 번호 82160912; Skp2 유비퀴틴화 분해, FoxO1 무릎 골관절염 연골세포 자가포식 억제, 화유 쿠시 처방의 조기 개입 효과에 관한 기전 논의.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Anti-β-actin 항체Proteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938Western blot 분석을 위한 내부 로딩 컨트롤
Anti-SPRY2 항체Proteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324SPRY2 단백질 발현 검출
BCA 단백질 분석 키트Thermo Fisher Scientific23225전체 단백질 농도 결정
C28/I2 인간 연골세포 세포주PunocelCP-H107골관절염 연구를 위한 인체 연골세포 모델
Complete DMEMKeyGen BiotecKGM12800S일반적인 세포 배양을 위한 기본 배지
CWBIO 초순수 miRNA 추출 키트CWBIOCW0627S전체 RNA 및 miRNA 분리
ECL 검출 시스템Thermo Fisher Scientific32106단백질 밴드의 화학 발광 시각화
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco1891605세포 배양 성장 보충제
GraphPad Prism 버전 9.0GraphPad SoftwareN/A통계 분석 및 그래프 생성
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01mRNA를 cDNA로의 역전사
ImageJ 소프트웨어National Institutes of HealthN/AWestern blot 밴드 강도 정량화
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015플라스미드 및 올리고뉴클레오티드의 형질주입
miR-590-5p 모방체, 억제제, 및 NCRiboBio맞춤형 합성miR-590-5p 발현 조절
miRNA 1st 스트랜드 cDNA 합성 키트VazymeMR101-02miRNA를 cDNA로의 역전사
Opti-MEM 배지Gibco31985-062형질주입 복합체 준비
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140122세포 배양에서 세균 오염 방지
단백질분해효소 및 인산분해효소 억제제 콕테일MedChemExpressHY-K0010추출 중 단백질 보호
PVDF 멤브레인Millipore SigmaISEQ00010면역 블로팅을 위한 단백질 전달 멤브레인
재조합 인간 IL-1βMedChemExpressHY-P78459OA-유사 염증 조건 유도
RIPA 완충액BeyotimeP0013B세포 용해 및 단백질 추출
si-SPRY2 구성물 및 si-NCGenePharma맞춤형 합성SPRY2 발현 감소
SPRY2 과발현 플라스미드 (OE) 및 빈 벡터 (NC)GeneChem맞춤형 구성SPRY2 과발현 효과 평가
UV-VIS 분광광도계 (NanoDrop 2000)Thermo Fisher ScientificND-2000RNA 농도 및 순도 측정
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참고문헌

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