분할 브로콜리 RNA 리포터를 이용한 시험관 내 RNA 클러스터에서 분자 간 RNA 염기쌍의 시각화 및 정량화

Summary

이 프로토콜은 분할된 브로콜리 RNA 리포터를 이용한 시각적 분석으로 시험 관 내 RNA 클러스터 내 분자 간 염기쌍을 검출하고 정량하는 방법을 설명합니다.

Abstract

다가 분자 간 RNA–RNA 상호작용에 의해 촉진되는 RNA 클러스터링은 단백질이 없어도 시험관 내에서 발생할 수 있습니다. 화학 탐침과 계산 시뮬레이션을 통해 이러한 상호작용을 예측하는 데 사용되었지만, RNA 클러스터 내 분자 간 염기쌍을 직접 평가하는 방법은 여전히 제한적입니다. 본 연구는 관심 있는 형광 표지된 RNA에 접합된 분할된 브로콜리 RNA 리포터를 기반으로 한 시각적 검사를 제시합니다. 이 분석법은 RNA 클러스터 내 분자 간 염기쌍을 검출하고 정량화할 수 있게 합니다. 분할된 브로콜리 시스템은 상보적인 리포터 서열을 포함하며, 이들이 이합체되어 브로콜리 RNA 압박체를 형성합니다. 이중합체화된 RNA 구조는 결합 시 녹색 형광을 방출하는 형광체인 DFHBI-1T와 결합합니다. RNA 클러스터링 시 녹색 형광의 출현은 관심 있는 RNA 간의 상보적 보고자 서열에 의해 매개되는 염기쌍을 보고합니다. DFHBI-1T 형광 측정은 시험 관 내 RNA 클러스터링 조건이 이 보고자 서열들 간의 분자 간 염기쌍에 어떤 영향을 미치는지 정량적으로 평가할 수 있게 합니다.

Introduction

시험관 내에서 전사된 RNA는 염과 분자 크러딩 시약 ^1,2,3,4,5를 첨가하면 가시적인 클러스터로 자가조립될 수 있습니다. 특히, 이러한 RNA 클러스터는 단백질을 포함한 다른 세포 구성 요소가 없어도 형성될 수 있어, 특정 조건에서 분자 간 RNA–RNA 상호작용만으로도 시험관 내 RNA 응축을 촉진하기에 충분함을 나타냅니다.

다양한 분자 간 RNA–RNA 상호작용 유형 중에서, 분자 간 염기대 대조는 응축 분야 1,2,4,6,7,8,9,10에서 상당한 주목을 받고 있습니다. 이러한 상호작용은 전사체 간 노출된 상보적 서열("우편번호")에 의해 유도될 수 있으며, 필라멘트 곰팡이 Ashbya gossypii²에서 BNI1과 SPA2 mRNA의 공동 군집화나 Drosophila melanogaster 에서 오스카 mRNA의 올리고머화 등이 입증됩니다 ^6,7. 또는 RNA 2차 구조의 재형성을 통해 분자 간 염기쌍을 촉진할 수 있으며, 이는 구조적으로 내재된 상보적 서열을 노출시킵니다. 이 기전은 실리코⁹의 반복 RNA와 시험관^내 구아니딘 리보스위치에서 관찰되었습니다. 노출된 상보적 서열과 RNA 구조 재모델링은 화학적 탐침^11,12 또는 시뮬레이션 접근법 ^4,9,13,14를 사용하여 측정할 수 있습니다. 그러나 시험관 내 RNA 클러스터링 분석에서 분자 간 염기쌍을 직접 시각화하는 방법은 여전히 제한적입니다.

염기쌍 가교체 15,16,17과 겔 전기영동 ^4,6,7을 이용한 RNA 풀다운 분석법은 시험관 내 분자 간 RNA 염기쌍을 연구하는 데 흔히 사용됩니다. 하지만 이러한 방법들은 클러스터 내와 외부 염기쌍을 구분할 공간적 해상도가 부족합니다. 더불어, 후속 분석을 위해 RNA 클러스터를 분리하는 것은 클러스터의 안정성을 유지하면서 이후 분석과의 버퍼 호환성을 보장해야 하므로 기술적으로 어렵습니다.

관심 있는 형광 표지된 RNA와 결합한 분할 브로콜리 RNA 리포터¹⁸ 을 기반으로 한 시각적 분석법이 이전에 시험 관⁴에서 RNA 응축 과정에서 분자 간 염기쌍을 직접 검출하는 데 사용된 바 있습니다. 이 맥락에서 분할 브로콜리 시스템은 정의된 시험관 클러스터링 조건 하에서 보고자 간 또는 이를 운반하는 RNA 간의 분자 간 상호작용 가능성을 보고합니다. 따라서 이 분석법은 서열 맥락과 환경 요인이 RNA 클러스터 유사 환경에서 분자 간 염기대 대립 경향에 어떤 영향을 미치는지 탐구합니다.

분할된 브로콜리 시스템은 상 하 두 개의 상보적인 RNA 서열로 구성되며, 이들이 이합체되어 브로콜리 RNA 압형성체를 재구성합니다(그림 1A–C)¹⁸. 이합체 시, 압타머는 형광체 DFHBI-1T와 결합하여 녹색 형광을 나타냅니다(그림 1A–C)¹⁸. 이 시스템을 사용하면, RNA 클러스터 내 보고자 상보 서열 간의 분자 간 염기대결 정도가 RNA 접힘에 의존하는 것으로 밝혀졌습니다. 다양한 실험 조건에서 DFHBI-1T 형광과 RNA 농도의 비율을 비교함으로써, 시험 관 내 조건이 RNA 클러스터 내 보고자 매개 분자 염기쌍에 미치는 영향을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

이 분석법은 RNA 클러스터 내 분자 간 염기 쌍을 연구하기 위한 RNA 풀다운 및 겔 전기영동 접근법을 보완합니다. 그러나 견고한 신호 검출은 분자 클로딩 시약이 필요할 수 있으며, 브로콜리 상하 RNA의 이합체 및 접힘 효율에 의해 감도가 제한됩니다.

Protocol

이 프로토콜은 이 분석을 구현하는 단계별 방법을 제공하며 그 응용에 대해 설명합니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 시험관 내 RNA 전사를 위한 DNA 주형 준비

1. 각 DNA 템플릿의 5′ 말단에 분리된 브로콜리 압정체 서열을 포함한 T7 프로모터 서열을 추가하여 시험관 내 RNA 전사를 수행합니다. 분할된 브로콜리 자작체 서열(상단 과 하단)을 단독으로 사용하거나, 관심 있는 추가 RNA 서열이 있든 없든 T7 프로모터 하류 어디든 삽입할 수 있습니다.
   참고: T7 프로모터, 분할 브로콜리 리포터, DNA 주형 증폭에 사용되는 프라이머의 서열은 표 1에 나열되어 있습니다.
   참고: T7 RNA 중합효소는 +1 위치의 "G"로 전사를 시작하는 것을 강하게 선호합니다. +2와 +3 위치에 바로 하류에 추가적인 G가 존재하면 전사 수율¹⁹가 증가할 수 있습니다. 그러나 하류 서열이 G로 시작하면, 예를 들어 두 G로 시작하는 상하 구성물처럼 전사는 서로 다른 위치에서 시작될 수^있다. 그 결과, 전사체는 5′ 끝에 1, 2, 또는 3개의 G를 포함할 수 있으며(예: GATCC, GGATCC, GGGATCC), 이는 설계된 구성체에서 염기쌍 해석에 영향을 줄 수 있습니다.
2. 상업적으로 합성된 유전자 블록, 플라스미드 또는 DNA 조각을 PCR의 템플릿으로 사용하세요. 원래 템플릿에 T7 프로모터가 없다면, 5′ T7 프로모터 오버행이 있는 순방향 프라이머와 적절한 역프라이머를 함께 사용하세요.
3. 200 μL PCR 튜브에 10 μM 순방향 및 역방향 프라이머 각각 2.5 μL, 20 ng DNA 주형, 25 μL 2× 고충도 마스터 믹스, 뉴클레아제 무첨가 물이 포함된 200 μL PCR 튜브에서 50 μL PCR 반응을 준비합니다. 피펫팅을 위아래로 돌려 2,000 × g에서 원심분리기를 2초간 충분히 섞으세요.
4. 다음 프로그램을 사용하여 열 사이클러에서 PCR 반응을 돌리세요: 98 °C에서 30초(1 사이클); 98 °C에서 10초, 최적화 어닐링 온도는 30초, 72 °C에서 30초 동안 킬로베이스당 30초(35 사이클); 72 °C에서 2분(1 사이클).
   참고: Tm 계산기와 같은 온라인 도구를 사용하여 최적화된 어닐링 온도를 결정하세요. PCR 제품은 완성 후 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
5. 2 μL PCR 산물을 8 μL 무뉴클레아제 물과 2 μL 6× 로딩 염료와 혼합합니다. 혼합물을 1% 아가로스 겔에 적재하여 전기영동을 진행합니다.
   참고: PCR 산물은 단일 밴드로 나타나야 합니다. 여러 밴드가 관찰되면 올바른 밴드를 절제하고 젤 추출 키트로 정제한 후 진행하세요.
6. DNA 정제 키트를 사용해 PCR 산물 또는 젤 추출 DNA를 정제한 후, 20–30 μL 무뉴클레아제 물에 1.5mL 마이크로 원심분리관에 세척합니다.
7. 미세부적 분광광도계를 사용해 DNA 농도와 순도를 측정합니다. A260/A280이 대략 1.8이고 A260/A230이 2.0보다 높도록 하세요.
   참고: A260/A230이 2.0 이하일 경우 추가 정화 단계를 수행합니다.
8. DNA 주형은 −20 °C에서 보관하다가 사용하세요.

2. 시험관 내 RNA 전사 반응 준비

1. 작업 표면, 튜브 거치대, 피펫을 RNase 오염 제거 용액으로 닦으세요. RNase가 없는 필터링된 팁을 사용하세요.
2. T7 전사 키트와 함께 제공되는 해동 반응 완충액과 뉴클레오타이드 용액(ATP, CTP, GTP, UTP), UTP, UTP, UTP, 그리고 UTP-Cy5를 얼음 위에 보관했습니다. 사용 전에 모든 튜브를 2,000 g× 원심분리기로 2초간 돌려주세요.
   참고: UTP-Cy5를 빛으로부터 보호하세요.
3. DNA 템플릿(T7 프로모터 제외)에서 티민 염기의 수를 계산하고, 20 μL 전사 반응에 필요한 UTP와 UTP-Cy5의 부피를 결정합니다. RNA 종 간에 일관된 표지 밀도를 유지하세요.
   참고: 예를 들어, 100개의 우라실 염기를 포함한 RNA를 약 3개의 Cy5 표지된 요라실과 함께 표지하려면, 1 mM UTP-Cy5 4.5 μL 및 75 mM UTP 1.9 μL 추가합니다.
4. ATP, CTP, GTP 각각 2 μL, 키트에 포함된 UTP 부피와 UTP-Cy5, 2 μL 10× 반응 완충액, 2 μL 효소 혼합물, 200 ng DNA 템플릿, 그리고 뉴클레아제 무첨가 물을 결합하여 20 μL 전사 반응을 준비합니다. 피펫팅을 위아래로 움직이며 충분히 섞고, 2,000 × g 에서 원심분리기를 2초 동안 하세요.
5. 반응을 37°C에서 6시간 동안 배양합니다.
6. 키트에 제공된 1 μL DNase를 추가합니다. 피펫을 위아래로 움직이고 2,000 × g 에서 원심분리기로 2초간 충분히 섞으세요.
7. 37 °C에서 추가로 15분 배양하세요.
8. 반응(~20 μL)을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 키트에 제공된 115 μL 무핵효소 물과 15 μL 암모늄 아세테이트 차단액을 추가하세요. 피펫팅을 위아래로 휘저으며 2,000 × g 에서 원심분리기를 2초간 충분히 섞으세요.
   참고: 2.9–3.7단계 대신 상업용 RNA 정제 키트를 사용할 수 있습니다.
9. 150 μL 페놀/클로로포름을 넣고 부드럽게 섞으세요.
   주의: 페놀/클로로포름은 화학 연기 후드에서 다루세요.
10. 원심분리기 16,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 돌립니다.
11. 상부 수상을 새 튜브로 옮기세요.
    참고: 간기를 방해하지 마세요; 하층은 염료가 섞여 있지 않아 파란색으로 보일 수 있습니다.
12. 같은 양의 클로로포름을 넣고 충분히 섞으세요.
    주의: 화학 훈제 후드에서 클로로포름을 다루세요.
13. 원심분리기 16,000 × g에서 4 °C에서 2분간 사용.
14. 2.11–2.13 단계를 반복합니다.
15. 수층(~100–150 μL)을 새로운 튜브로 옮깁니다. 900 μL 이소프로판올을 추가하고 충분히 섞습니다.
16. 세 개의 같은 부피로 각각 다른 튜브에 나누어 보관하세요.
    참고: 각 알리코트는 여러 RNA 클러스터링 반응을 일으킬 수 있습니다.
17. 하룻밤 또는 최대 한 달간 −20°C에서 보관하세요.

3. 시험관 내에서 전사된 RNA의 정제

1. RNA 샘플을 16,000 × g 의 4 °C에서 15분간 원심분리합니다.
2. RNA 펠릿을 방해하지 않고 조심스럽게 이소프로판올을 제거하세요.
3. 뉴클레아제가 없는 물에 70% 에탄올 1mL를 첨가합니다.
4. 원심분리기 16,000 g × 4°C에서 2분간 진행.
5. 에탄올을 제거하고 3.3–3.4단계를 반복합니다.
6. 최종 에탄올 세척 시 1000 μL 피펫을 사용해 대부분의 에탄올을 제거합니다. 2,000 × g 에서 벤치 위 미니 원심분리기에서 2초간 원심분리하고, 남은 에탄올은 20 μL 피펫으로 제거합니다.
7. RNA 펠릿을 실온(RT)에서 1–2분간 자연 건조시킵니다.
8. RNA 펠릿을 20 μL 무핵효소 물에 재현탁합니다. 샘플은 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호하세요.
9. 마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정합니다. A260/A280이 대략 2.0이고 A260/A230이 2.0보다 높도록 하세요.

4. 시험관 내 RNA 클러스터링 반응 준비

참고: 이 프로토콜에서는 이전 연구 ^2,4,5를 바탕으로, RNA 클러스터링의 유도에는 스페르민과 PEG 8000이 필요합니다. 구체적으로, 100 mM 스페르민 테트라하이드로클로라이드 스톡 용액을 뉴클레아스 무첨가수에서 조제하여 여러 개의 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 분리하여 −20 °C에서 저장하였습니다.

1. 100 mM 정액 튜브와 50% PEG 8000을 얼음 위에 녹입니다.
   참고: 개장 후에는 50% PEG 8000을 열화 가능성이 있으므로 2개월 이상 사용하지 않는 것이 좋습니다.
2. 신선하게 만든 10× RNA 재접기 버퍼 500 μL 준비를 위해 50 μL 2M KCl, 50 μL 1M MgCl₂, 50 μL 1M Tris(pH 7.0), 그리고 350 μL 무뉴클레아제 물을 혼합합니다. 피펫팅으로 위아래로 잘 섞으세요. 벤치 위 미니 원심분리기에서 2초간 2,000g × 원심분리기.
   참고: 재접기 버퍼는 RNA 클러스터링 실험 당일에 준비해야 합니다.
   참고: 4.3-4.4 단계는 실험 조건에 따라 다르며 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 이 연구에서 사용된 RNA 클러스터링의 두 가지 예시는 아래에 설명되어 있습니다. 공폴딩 조건은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 RNA²로 어닐링하는 데 사용된 방법을 변형한 것입니다. 이 방법에서는 RNA를 염 완충제에 혼합하고 함께 가열하여 상보적 서열을 가진 RNA 간의 분자 간 염기대결을 촉진합니다. 반면, 별도의 접기 조건에서는 각 RNA가 혼합 전에 개별적으로 접힌다. 이 조건은 RNA가 상호작용하기 전에 접히는 세포 시나리오를 근사하기 위한 것입니다.
3. 공동 접기
   참고: 이 조건은 상단 과 하단 서열을 포함하는 RNA 간의 분자 간 염기대결을 촉진합니다. RNA 클러스터링 조건 하에서 보고자 주도 분자 간 염기쌍을 긍정적으로 대조군으로 수행합니다.
   1. 200 μL PCR 튜브에 상부 또는 하부 서열을 가진 시험관 내 전사 RNA 각각 16 pmol, 재접기 RNA 완충제 1×0 μL 2 μL, 그리고 무뉴클레아제 물을 최종 14 μL로 결합합니다. 피펫팅으로 완전히 혼합합니다. 2,000g × 원심분리기를 벤치 위 미니 원심분리기에서 2초간 사용했습니다.
      참고: 16 pmol에 해당하는 RNA 질량을 계산하기 위해.
   2. RNA 샘플을 90 °C에서 2분간 가열합니다.
   3. 즉시 샘플을 RT로 옮기고 빛으로부터 보호하세요. 반응을 RT에서 1시간 동안 배양하세요.
4. 분리 접기
   1. RNA 샘플을 90°C에서 2분간 가열한 후 즉시 얼음에 최소 15분간 보관하세요.
   2. 200 μL PCR 튜브에 상부 또는 하부 서열을 운반하는 시험관 내 전사 RNA 16 pmol, 10× 재접기 RNA 완충액 1 μL, 그리고 누클레아제 무첨가 물을 최종 7 μL 용량으로 결합합니다.
      참고: 16 pmol에 해당하는 RNA 질량을 계산하기 위해.
   3. 빛으로부터 보호하여 RT에서 30분간 배양하세요.
   4. 상단과 하단 서열을 포함한 RNA 샘플을 하나의 PCR 튜브에 결합합니다. 피펫팅으로 위아래로 잘 섞으세요. 2,000g × 원심분리기를 벤치 위 미니 원심분리기에서 2초간 사용했습니다. RT에서 30분간 부양하세요.
5. 100 mM 정자민과 50% PEG 8000을 1:2(v/v) 프리믹스 6 μL 추가하세요. 피펫팅으로 위아래로 잘 섞으세요. 벤치탑 미니 원심분리기에서 2,000 g × 원심분리기 2초를 사용하세요.
   참고: 50% PEG 8000은 점도가 매우 높습니다. 피펫은 천천히 조심스럽게 사용하세요.
6. 반응에 1 mM DFHBI-1T 2 μL를 추가합니다. 피펫팅으로 위아래로 잘 섞으세요. 벤치탑 미니 원심분리기에서 2,000 g × 원심분리기 2초를 사용하세요. 반응은 노란빛이 도는 녹색으로 보여야 합니다.
   참고: 1 mg DFHBI-1T (MW: 320.21) 동성 염료로 20 mM DFHBI-1T 스톡 용액을 제조하기 위해 분자생물학 등급 무수 DMSO 156 μL를 첨가합니다. 여러 개의 마이크로 원심분리관에 소량씩 담아 -20 °C에서 보관합니다. 염료를 위한 반복적인 냉동-해동 과정을 피하세요. 20 mM 육수를 뉴클레아제가 없는 물에 희석하여 얼음 위에 보관하여 신선하게 희석한 1 mM DFHBI-1T 작동 용액을 준비합니다.
7. 반응을 유리 챔버 커버글라스에 넣습니다.
8. 증발을 최소화하기 위해 덮개를 덮고 어두운 상태에서 4시간 동안 RT 상태로 부양하세요.

5. 영상 촬영 준비

1. 적절한 레이저와 대물렌즈가 장착된 구조화 조명 또는 공초점 현미경을 사용해 3차원 이미지를 획득하세요.
   참고: 초점이 맞지 않는 빛을 최소화하기 위해 공초점 현미경이 필요합니다.
2. 각 관심 영역(ROI)을 각 z-평면에서 먼저 Cy5 채널로 촬영하고, 그 후 GFP 채널을 사용해 동일한 ROI를 촬영하도록 현미경을 설정하세요.
3. 모든 채널에 노출 시간을 500ms로 설정하세요. GFP는 레이저 출력을 80%, Cy5는 40%로 설정하세요.
4. 반응 방울 밖의 커버슬립 영역을 150nm의 z-단계 크기를 사용해 영상에 넣어보세요.

6. 분자 간 염기쌍의 정량화

1. 이미지 분석 소프트웨어로 이미지를 가져오기²¹. GFP(DFHBI-1T)와 Cy5(RNA) 채널을 식별합니다.
2. RNA 클러스터 내에서 5 × 5픽셀 ROI를 그리고, 동일한 z-평면에서 두 채널의 통합 밀도를 측정합니다. 각 이미지에서 서로 다른 RNA 클러스터에서 5–8개의 ROI를 선택하세요.
   참고: 카메라 세팅에 따라 ROI 크기를 조정하되, 실험 전반에 걸쳐 일관성을 유지하세요.
3. 배경 측정을 위해 반응 방울 외부의 5–8 ROI를 선택하고 두 채널의 평균 통합 밀도를 계산합니다.
4. 각 ROI에 대해 다음을 사용하여 정규화된 DFHBI-1T 강도를 계산합니다:
   

7. 일반적인 문제 및 문제 해결

1. 원심분리 후 RNA 펠릿이 관찰되지 않는다면, RNA 분해, 전사 시간 부족, 비활성 중합효소, 잔류 염, 또는 낮은 RNA 농도를 고려할 수 있습니다. RNase 없는 시약을 사용하고, 전사 시간을 연장하며, 신선한 효소를 사용하고, 템플릿을 정제하세요.
2. Cy5 표지된 RNA 클러스터가 관찰되지 않는다면, RNA 분해나 PEG 8000 또는 UTP-Cy5 분해를 고려할 수 있습니다. 신선한 시약과 RNase가 없는 조건을 사용하세요.
3. 만약 공동 접기 조건에서 DFHBI-1T 신호가 관찰되지 않는다면, 염료 품질 저하, 브로콜리 구조 형성 부족, 또는 전사체가 절단된 상태를 고려할 수 있습니다. 신선한 염료를 사용하고, 적절한 완충 조성을 확인하며, 겔 분석을 통해 전사체 크기를 확인하세요.
4. 형광 신호가 탈색되면 레이저 출력과 노출 시간을 줄이고, 영상 단계를 최소화하며, 배양 중 샘플을 빛으로부터 보호하세요.

Results

이 시연 실험에서는 상단과 하단 RNA 리포터가 단독으로 염기쌍을 형성하고 브로콜리 구조를 형성하는 능력이 이전에 설명된 시험관 내 RNA 클러스터링 프로토콜⁴를 사용해 처음 평가되었습니다. 상하 염기쌍을 통해 두 개의 브로콜리 팔이 생성되며, 각각 하나의 DFHBI-1T 분자를 삽입할 수 있습니다(그림 1A–C)^18,22.

스페르민과 PEG 8000과 RNA 클러스터링이 유도되면, 두 RNA는 각각 또는 함께 클러스터를 형성했습니다(그림 1D–Eii). 상단 또는 하단 RNA를 분리하여 조사했을 때, RNA 클러스터 내 DFHBI-1T 형광은 열 변성 및 재접기 전에 두 RNA가 결합된 공동 접기 상태보다 현저히 낮았습니다(그림 1F). 공폴딩 조건에서 DFHBI-1T(0.1 mM)와 상단 (0.8 μM)과 하단 (0.8 μM)의 몰 비율은 125:1:1로 추정되었다. 이는 잠재적 브로콜리 구조의 최대 수에 비해 DFHBI-1T가 약 62.5배 초과된 것과 같습니다.

상단과 하단에서만 관찰된 낮지만 0이 아닌 DFHBI-1T 신호는 각 보고자가 개^{별적으로 발}현되었을 때 DFHBI-1T 형광이 최소하다는 이전 보고와 일치합니다. DFHBI-1T는 RNA가 없을 때 매우 낮지만 검출 가능한 배경 형광을 보였습니다(그림 1F). 이 결과들은 DFHBI-1T가 시험관 내 RNA 클러스터링 분석과 호환되며, 공동 접힘이 상단과 하단 RNA 간의 분자 간 염기대결을 촉진함을 보여줍니다.

RNA 강도로 정규화한 후, 공주접힘 조건에서 정규화된 DFHBI-1T 형광 강도는 1.03에 도달하여, 상단과 하단 단독 값보다 훨씬 높은 수치(각각 0.054와 0.023)였습니다(그림 1D, 그림 1Ei, 그림 1F). 클러스터링되기 전에 따로 접힌 상단과 하단 RNA를 혼합해 형성된 RNA 클러스터를 조사했습니다(그림 1D, 그림 1Eii, 그림 1F). 이 별도의 접힘 조건에서 정규화된 DFHBI-1T 신호는 0.031로, 음성 대조군(상단 또는 하단 단독)에서 관찰된 기준선 수준과 유사했습니다(그림 1F). 이 결과들은 공동 접힘이 상단과 하단 RNA 간의 분자 간 염기쌍을 촉진하는 반면, 분리된 접힘은 이러한 상호작용을 제한한다는 것을 나타냅니다.

상단과 하단 서열은 다음으로 Drosophila melanogaster shutdown(shu)의 3′ 비번역 영역(UTR), 생식 과립 mRNA ^4,23,24와 그 대응 물질인 shu^anti에 삽입되었습니다. 이전 연구에서 이 RNA가 주로 초파리 멜라노가스터에서 단량체로 존재하며, 높은 몰 농도에서도 이합체화되지 않는 RNA 겔 분석법 ^4,24 때문에 선택되었습니다. 또한 슈-탑과 슈-바텀은 RNA^{겔에서 동}조이머를 형성하지 않아 탑과 다운 간 분자 간 상호작용과 슈에서 파생된 측면 서열의 영향을 보다 직접적으로 평가할 수 있습니다.
슈탑, 슈 하텀, 슈^안티탑, 슈 ^안티-보텀의 DNA 템플릿은 표 2에 나열되어 있습니다. 상단과 하단 서열은 shu 또는 shu^항 3′ UTR의 중앙에 삽입되어, 상호작용을 촉진하고 상호작용 영역이 일반적으로 전사체 내에 내재된 생리적 RNA–RNA 상호작용을 더 잘 모방하기 위해 구조적 재형성이 필요^했다.

RNA 클러스터링을 유도했을 때, 슈-탑, 슈-바텀, 슈^안티-탑, 슈 ^안티바텀은 각각 위쪽과 하단만큼이나 최소한의 DFHBI-1T 형광을 보였다(그림 2A 및 2B). 일관되게, 슈탑과 슈 하트의 공동 폴딩, 또는 슈^안티탑과 슈^안티바텀의 공동 폴딩은 별도의 폴딩보다 더 높은 DFHBI-1T 신호를 생성했다(그림 2Ci와 Cii). RNA 강도와 음성 대조군(각 RNA만의 평균 정규화된 DFHBI-1T 신호로 정의됨)으로 정규화된 후, 슈-탑과 슈-하단의 공동 접힘 시 정규화된 DFHBI-1T 형광이 5.63배 증가했습니다(그림 2Di 및 2Dii). 반면, 개별 접힘은 1.04배 증가에 그쳤으며, 이는 슈탑과 슈바텀 각각에서 관찰된 기준선 수준과 비슷한 수준이었다. 공접힘 및 분리 접힘 조건에서 슈 ^안티탑과 슈 ^안티바텀 패턴에서도 유사한 경향이 관찰되었다(그림 2Di 및 2Dii). 이 결과들은 분리 접힘이 슈-탑과 슈-바텀 또는 슈^반-탑과 슈 ^반-하단 간의 분자 간 염기쌍을 촉진하지 않으며, 공동 접힘은 삽입된 리포터 서열 때문에 이러한 상호작용을 강화한다는 것을 시사합니다.

슈와 슈^안티가 염기쌍을 사용하는지 테스트하기 위해 슈탑과 슈 ^안티바텀, 슈안^티탑을 슈바텀과 혼합했습니다. 두 조합 모두 공접힘 및 분리 접힘 조건에서 슈탑과 슈 하트-바텀 또는 슈^안티탑과 슈^안티바텀 상태보다 더 높은 DFHBI-1T 형광을 보였습니다(그림 2Ci 및 2Cii). 정규화 후, 슈-탑과 슈^안티바텀, 슈 ^안티-탑과 슈 바텀의 공동 접힘은 DFHBI-1T 형광이 각각 61.86배와 82.60배 증가했습니다(그림 2Di와 2Dii). 반면, 개별 접힘은 각각 2.69배와 4.94배 증가에 그쳤습니다(그림 2Di와 2Dii). 공폴딩 조건보다는 상당히 낮았지만, 이 값들은 슈탑과 슈 하트나 슈 ^안티탑과 슈 ^안티바텀 상태(각각 1.04와 1.16)보다 높았습니다.

이 결과들을 종합하면, 추가 상보적 서열을 가진 리포터는 해당 서열이 없는 리포터보다 염기쌍을 형성할 수 있는 능력이 더 높음을 나타냅니다. 이 효과는 공복합 조건 하에서 더욱 강화되며, 분자 간 상호작용을 촉진합니다.

그림 1: 시험관 내 RNA 클러스터에서 상부 및 하부 RNA의 예측된 2차 구조 및 분자 간 염기쌍의 정량화. (A–B) RNAfold²⁵에 의해 예측된 대로 상단(A)과 하단(B)의 2차 구조가 개별적으로 접힌 예시. 따로 접으면 위아래가 브로콜리 동생성체를 재구성하지 못하며, DFHBI-1T(회색 별)는 최소한의 형광을 발생시킵니다. (C) RNAcofold²⁵에 의해 예측된 염기쌍 상단 및 하단 RNA의 2차 구조 예. 두 RNA 간의 분자 간 염기쌍이 두 개의 브로콜리 팔을 재^구성하여 DFHBI-1T 결합을 가능하게 하고 강한 녹색 형광(녹색 별)을 생성합니다. (D) DFHBI-1T 단독(염료 단독 대조) 및 위아래 RNA가 DFHBI-1T(녹색) 존재 하에 형성된 시험관 내 RNA 클러스터(마젠타) 이미지. (Ei, ii) 위쪽과 하쪽 RNA가 공동 접힘(i)과 별도의 접힘(ii) 조건 하에 형성된 시험관 내 RNA 클러스터(마젠타) 패널 D와 E의 경우, RNA는 Cy5로 표지되어 평균 약 3분의 1의 RNA가 단일 Cy5 표지된 우라실을 포함하고 나머지 3분의 2는 표지되지 않은 상태입니다. 이미지는 150 nm 스텝 크기로 획득된 27개의 슬라이스의 평균 Z-투영을 나타내며, 모든 조건에서 동일한 노출과 레이저 출력을 각 채널에 사용합니다. DFHBI-1T 형광은 조건에 따라 동일한 강도 범위로 정규화되었습니다. 스케일 바: 2 μm. (F) DFHBI-1T 강도는 Cy5 형광으로 측정된 RNA 풍부도와 정규화되었습니다. 데이터는 SEM 평균± 제시됩니다. 양측 t-검정(**** 대 공동 접힘)의 P-값은 다음과 같습니다: 1.0 × 10⁻²²(염료 전용), 2.3 × 10⁻²²(상단), 4.9 × 10⁻²³(하단), 7.0 × 10⁻³(별도 접힘). 염료 전용 조건은 n = 30개 영역, 나머지 모든 조건은 30–31개의 RNA 클러스터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 슈 및 ^{슈 항} 전달 상하부 리포터의 분자 간 염기쌍 대표 이미지 및 정량화. (A) DFHBI-1T 단독(염료 단독 대조) 및 DFHBI-1T 존재 하에 슈탑, 슈 안티탑, 슈 ^안티탑, 슈 ^안티바텀 RNA가 형성한 시험관 내 RNA 클러스터(마젠타) 이미지(녹색). RNA는 Cy5로 표지되어 시험관 내 전사 과정에서 평균 3개의 UTP-Cy5 요라실이 포함되었습니다. 이미지는 150 nm 스텝 크기로 획득된 27개의 슬라이스의 평균 Z-투영을 나타내며, 모든 조건에서 동일한 노출과 레이저 출력을 각 채널에 사용합니다. DFHBI-1T 형광은 조건에 따라 동일한 강도 범위로 정규화되었습니다. 스케일 바: 2 μm. (B) DFHBI-1T 강도는 Cy5 형광으로 측정된 RNA 풍부도와 정규화되었습니다. 데이터는 SEM. n.s.± 평균으로 제시되며, 유의성은 아닙니다. 양측 t-검정(염료 단독 vs. P-value) P-값: 3.1 × 10^⁻3 (**; 슈탑), 1.7 × 10⁻¹ (신력; 슈 바텀), 2.9 × 10⁻³⁵ (***; 슈^안티탑), 그리고 2.2 × 10⁻² (; 슈^안티-바텀). n = 염료 전용 조건은 30개 영역, 나머지 모든 조건은 30–32개의 RNA 클러스터입니다. (Ci, ii) DFHBI-1T(녹색)가 존재하면서도 (i) 및 별도 접힘 하에 shu-top과 shu-bottom, shu-top과 shu^anti-bottom, shu-top과 shu-bottom, shu anti-top과 shu-bottom을 혼합하여 형성된 시험관 내 RNA 클러스터(마젠타) 이미지( ii) 조건. 이미지는 150 nm 스텝 크기로 획득된 27개의 슬라이스의 평균 Z-투영을 나타내며, 모든 조건에서 동일한 노출과 레이저 출력을 각 채널에 사용합니다. 저범위에서는 DFHBI-1T 형광이 그림 1D–Eii 및 그림 2A와 동일한 강도 범위로 정규화되었습니다. 높은 범위에서는 DFHBI-1T 형광이 패널 Ci와 Cii 패널의 모든 조건에서 더 높지만 일관된 강도 범위로 정규화되었습니다. 스케일 바: 2 μm. (Di, ii) DFHBI-1T 강도는 먼저 RNA 강도로 정규화되었고, 이후 각 RNA만의 평균 정규화된 DFHBI-1T 신호로 정의된 음성 대조군으로 정의되었습니다. 데이터는 SEM. n.s.± 평균으로 제시되며, 유의성은 아닙니다. (i) 양측 꼬리 T 검정(**** 대 슈탑 + 슈바텀) P값: 1.1 × 10⁻³¹ (슈^안티-탑 + ^{슈 안티}-바텀), 1.1 × 10⁻²² (슈-탑 + ^{슈 앤티}-바텀), 4.3 × 10⁻²⁷ (슈^안티-탑 + 슈-바텀). (ii) 양측 t-검정의 P-값(shu-top + shu-bottom): 2.2 × 10⁻¹ (n.s.; 슈^안티-탑 + 슈^앤티-바텀), 1.9 × 10⁻⁹ (; 슈탑 + 슈^안티바텀), 그리고 1.3 × 10⁻¹⁵ (; 슈^안티탑 + 슈 바텀). n = 29–32개의 RNA 클러스터가 모든 조건에 대해 존재합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

이름	연속 (5′-3′)
T7 프로모터	타타크악 박타그
상단	가트가크트카트트크트크 카갓캣캣카아가가악 GGTCGGGTCCAGATGATGGGGAT
바닥	GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCACATACTCTGAT GATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGC TCCATCATCC
탑-T7 포워드	타타크악 박타그 가트가트카
상단-리버스	ATCCGCATCATCTGGACCC
바텀-T7 포워드	타타크악 박타그G GATCCGCATCATCTGTCGA
하부 리버스	GGATGATGGAGCCCACACT
전면 프라이머는 T7 프로모터 서열 오버행(굵은 표기)을 포함하며, 그 다음으로 RNA의 5′ 말단을 표적으로 하는 서열이 있습니다.

표 1: T7 전사를 위한 DNA 주형 증폭에 사용된 T7 프로모터, 분할된 브로콜리 리포터, 프라이머 서열. 나열된 프라이머들은 상부 및 하부 RNA의 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성하는 데 사용되었으며, 이는 이후 본 연구에서 기술된 RNA 클러스터링 분석에 사용되었습니다.

이름	연속 (5′-3′)
슈탑	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTATTATTATTTACTACCAAAAAGGATGATGGAG ACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGAGGGGGGGGTCCAGATGGGGAG TAAAAAACATACCAAACATGAATTTAGTTCCAATTCTAGTAGTCAAGTTCTAGGAAGCAGTATCATTT AGTTATTATTTCGATATATCAACATGAATGTAAGCCCACGAATGTTAACGTTTTTTTGT TATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTTTTAAAAACCAATAAAAGTAATGCGGCACTACAT
슈 바텀	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTATTTCATTTACCAAAAAGATTCCGCATCATCATC TGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTATGTGTGGGTCAACCCACATCTGATG ATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCCAAAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTAGAGAGCAGTATATCATTAGTTATTTCGATTAGTAGCAACATGAATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTTTTTTTTTAGAGCAACGTAGTAAGTTGTTAA 아카카타아트그카그카크타캇
슈안티탑	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTATTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTAA ATAACAAAAAACGTTAACATTCGTGTGTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATAAC TAATGATACTGCTCTCTTAGAACTTGGAACTAAATTACCTTCATGTGTGTGTGTTTTTGGA TGATGGAGACGGTCGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGAGGGGGGGGGGGGTCCAGATGAT GCGGATTTTTTGAGTAAGATATGAAATGAATGAATGGGGGGTTTTTAGTAAGC
슈안티 바텀	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTATTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTA AATAACAAAAAACGTTAACATTCGTGTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAATTACCTTCATGTTTTTTTGTGTGTATTTTTTTT GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTGCCATGTGTATGTGGGTCAAC CCACATACTCTGATGATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCTTTTTTTGAGTAA GATATGAATATGAAATACTGGGGGGCTTTTTAGTAAGC
슈-탑 또는 슈-바텀-T7 포워드	타타크악 박타그GGCTTACTAAGAAGCCCCAGT
슈탑 아니면 슈 바텀-뒷면	ATGTAGCTGCCGTGTGCATTAC
슈안티탑 또는 슈안티바텀-T7 포워드	타타크악 박타그GGATGTAGCTGCCGTGTGTCATTA
슈안티탑 아니면 슈안티-바텀-뒷면	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTA
전면 프라이머는 T7 프로모터 서열 오버행(굵은 표기)을 포함하며, 그 다음으로 RNA의 5′ 말단을 표적으로 하는 서열이 있습니다. T7 프로모터와 슈탑 및 슈 바텀 또는 슈안티탑과 슈 안티바텀 사이에 한두 개의 추가 G가 포함되었습니다. 이는 +2와 +3 위치에 G가 있으면 전사 수율이 크게 증가할 수 있기 때문입니다19. 그러나 이러한 추가 G는 설계된 구성체에서 염기쌍 해석에 영향을 미칠 수 있습니다. 1.1단계의 노트를 참고하세요.

표 2: T7 전사를 위한 DNA 주형을 증폭하는 데 사용된 슈탑, 슈하트, 슈 ^안티탑, 슈 ^안티바텀, 프라이머 서열. 나열된 프라이머들은 상부와 하부 리포터를 가진 shu 및 ^{shu 항}RNA의 시험관 내 전사용 DNA 주형을 생성하는 데 사용되었으며, 이 주체들은 본 연구에서 기술된 RNA 클러스터링 분석에 사용되었습니다.

Discussion

본 연구에서는 분할된 브로콜리 압타머 시스템¹⁸을 시험관 내 RNA 클러스터링 조건에서 분자 간 염기쌍의 직접 시각화 및 정량에 맞게 적용하였습니다. 이 접근법은 다양한 시험관 내 조건에서 분자 간 염기쌍 평가를 가능하게 하며, 염기쌍 가교세포 15,16,17과 겔 전기영동 ^4,6,7을 이용한 RNA 풀다운 실험과 같은 하위 생화학적 분석법을 보완합니다. 이러한 생화학적 방법들은 RNA 클러스터 내와 외부 염기쌍을 구분할 공간적 해상도가 부족하지만, 이 방법은 클러스터 내 상호작용을 직접 공간적으로 시각화할 수 있게 합니다. 구체적으로, 정의된 RNA 클러스터링 조건 하에서 상단과 하단 RNA 또는 이 리포터를 가진 RNA 간의 염기쌍을 모니터링할 수 있게 합니다. 또한, 가교결합이나 RNA 추출 없이 리포터 RNA 간 염기쌍을 실시간으로 정량적으로 읽어내어 샘플 손실과 버퍼 부적합성을 최소화합니다.

형광 현미경을 사용하여 분할된 브로콜리 압착체 서열 간의 분자 간 염기쌍을 DFHBI-1T 신호를 통해 정량적으로 측정하여, 시험 관 내 RNA 클러스터링 프로토콜과의 적합성을 입증하였습니다. 분자 간 염기쌍의 범위는 RNA 접힘 조건에 따라 달라졌으며, 이는 공폴딩 및 분리된 접힘 조건에서 관찰되었습니다(그림 1F 및 그림 2Di–2Dii). 이 결과는 RNA 접힘 조건이 분자 간 RNA 상호작용에 중요한 영향을 미치며, 실험 결과를 해석할 때 신중히 고려해야 함을 시사합니다.

이 분석법은 또한 상부와 하단 리포터를 둘러싼 서열이 분자 간 염기쌍을 증진하는지 평가하는 플랫폼을 제공하며, 이는 shu를 이용해 입증되었습니다. DFHBI-1T 형광은 슈탑과 슈^안티바텀, 슈 안티탑과 슈 안티바텀 함께일 때보다 슈탑과 슈 안티 바텀 또는 슈 ^안티탑과 슈^안티바텀 사이에서 더 높았으며, 이는 슈와 슈^안티가 관련된 분자 간 상호작용을 나타냅니다 브로콜리 신호를 더욱 강화합니다. 이러한 관찰은 위쪽과 하쪽 리포터의 공동 접힘만으로 얻은 DFHBI-1T 형광 신호만으로는 분석의 상한선을 대표하지 않음을 시사합니다.

이 실험에서 측정된 DFHBI-1T 형광은 1.04배 증가(별도의 접힘 하에 슈-탑 과 슈-하단 )에서 82.60배 증가(공동 접기 조건 하의 슈^안티-탑 과 슈 하단 )까지 광범위한 동적 범위를 보였다. 이 동적 범위 덕분에 이 리포터를 가진 RNA 간 분자 간 RNA 상호작용의 차이를 검출할 수 있습니다.

이 프로토콜의 여러 단계는 RNA 클러스터 내 분열된 브로콜리 상단 과 하단 RNA 간의 분자 간 RNA 염기대결을 성공적으로 검출하는 데 매우 중요합니다. 신선한 PEG 8000 알리코트를 사용해 RNA 클러스터링을 안정적으로 유도해야 하며, 시약 불안정성으로 인해 반복되는 동결-해동 사이클을 최소화해야 합니다. DFHBI-1T는 형광 특성을 보존하기 위해 −20 °C에서 분리되어 보관해야 합니다. 시험 관 내 전사 산물은 클러스터링 전에 변성 RNA 겔에서 분석하여 올바른 전사체 크기를 확인해야 합니다. 또한, RNA 방울은 영상 촬영 전 상온에서 장기간 배양되므로 RNase가 없는 환경, 즉 깨끗한 작업 환경과 영상 챔버를 유지하는 것이 필수적입니다.

이 분석법의 한계 중 하나는 DFHBI-1T가 상단과 하단 서열에 의해 매개되는 분자 간 염기쌍을 특별히 보고한다는 점입니다. 서로 다른 RNA 영역에서 발생하는 다른 분자 간 염기대 대립 사건은 검출되지 않습니다. 또한, 위쪽과 하쪽 가닥 사이의 염기쌍으로 형성되는 브로콜리 구조는 열역학^{적으로 안정적}이며, 초파리 생아 과립 mRNA 클러스터에서 관찰되는 것처럼 산란된 표면 노출 염기와 같은 약하거나 일시적인 상호작용을 완전히 반영하지 못할 수^{있습니다.}

더불어, 분자 간 RNA–RNA 상호작용은 무분별하고 비특이적일 수 있으며, 상단과 하단 리포터를 둘러싼 서열이 DFHBI-1T 형광에 영향을 줄 수 있습니다. 이 측면 영역은 리포터 서열과 직접 상호작용하여 브로콜리 형성을 억제하거나 RNA 구조를 변화시켜 리포터를 운반하는 RNA 간 상호작용에 영향을 미칩니다. 따라서 이 분석법은 RNA 구조, 상하염기쌍, 측면 서열들 간의 상호작용, 그리고 측면 서열과 리포터 간의 상호작용이 복합적으로 작용한 결과를 반영합니다.

이 분석은 향후 조사의 기회를 제공합니다. 예를 들어, 리포터 옆에 있는 RNA 서열을 변경하거나, RNA 헬리케이스 또는 샤페론을 도입하거나, 염분 조건을 변형하는 것이 RNA 클러스터 내 분자 간 염기대결에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 효과는 공폴딩 조건과 별도의 접힘 조건에서 DFHBI-1T 신호를 측정함으로써 평가할 수 있습니다. 유사한 RNA aptamer가 세포, 박테리아, 효모 26,27,28,29,30에서 사용된 점을 고려할 때, 이 접근법은 셀룰로 시스템이나 모델 생물에서 mRNA 클러스터 내 분자 간 염기대 대립을 연구하는 데 확장될 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M MgCl2	밀리포어 시그마	M1028	10× RNA 재접기 버퍼.
2M KCl	서모 피셔 사이언티픽	AM9640G	10× RNA 재접기 버퍼.
PEG 8000 50%	NEB	M0204S	T4 RNA 리가아제 키트의 구성 성분; RNA 클러스터링을 유도하는 분자 클로딩 시약으로 사용됨.
절대 에탄올, 200 프루프	서모 피셔 사이언티픽	T038181000CS	RNA 워시 버퍼 준비에 사용됩니다.
산성 페놀:클로로포름, pH 4.5 (IAA 기준, 125:24:1)	서모 피셔 사이언티픽	AM9722	RNA 정제에 사용됩니다.
아미노알릴-UTP-Cy5	예나 생명과학	NU-821-CY5	시험관 내 전사 과정에서 RNA 표지에 사용됩니다.
챔버드 커버글라스	써모피셔 사이언티브	155409PK	RNA 클러스터링 반응을 위한 영상 챔버.
클로로포름	서모 피셔 사이언티픽	C298-500	RNA 정제에 사용됩니다.
DFHBI-1T	루체르나	410	브로콜리 RNA 압정체 검출을 위한 형광체로 사용됨.
DMSO	서모 피셔 사이언티픽	D12345	무수; 분자생물학 등급; DFHBI-1T 준비에 사용됨.
DNA 클린 & 집중기 키트	자이모	D4014	T7 전사 전 DNA 산물 정화에 사용됩니다.
DNA 젤 추출 키트	NEB	T1020L	젤 추출에 사용되었습니다.
건조 목욕	벤치마크 사이언티픽	BSH1001	마이크로 원심분리관에서 RNA 샘플을 가열하는 데 사용됨.
피지/이미지 J	NIH(국립보건원)	해당 없음	오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어; 형광 강도 정량화와 ROI 분석에 사용됩니다.
젤 전기영동 시스템;	써모피셔 사이언티브	B2-BP	DNA 겔 전기영동 실행에 사용됩니다.
젤 로딩 염료, 보라색 (6회 이상)	NEB	B7024S	DNA 겔 전기영동의 로딩 염료로 사용됩니다.
즉석 구조화 조명 현미경	비시테크 인터내셔널	VT-iSIM	GFP 및 Cy5 형광을 촬영할 수 있는 공초점 현미경;
이소프로판올	서모 피셔 사이언티픽	327272500	RNA 정제에 사용됩니다.
MEGAscript T7 전사 키트	서모 피셔 사이언티픽	AM1334	시험관 내 T7 전사에 사용됩니다. 키트에는 뉴클레오타이드 용액(ATP, CTP, GTP, UTP)과 DNase가 포함되어 있습니다.
마이크로 원심분리기 튜브	제네시 사이언티브	22-284	1.5mL 튜브; 시험관 내 전사, RNA 산물, 정자와 DFHBI-1T. 의 알리코트를 저장하는 데 사용되었습니다; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp;
미니 원심분리기	벤치마크 사이언티픽	Z763845	짧은 원심분리에 사용됩니다.
나노드롭 원 분광광도계	써모피셔 사이언티브	13-400-518	DNA 및 RNA 농도와 품질을 측정하기 위한 마이크로볼륨 분광광도계.
뉴클레아제 없는 물과 nbsp;	서모 피셔 사이언티픽	AM9937	RNA 펠릿의 재현탁, RNA 세척 및 재접기 버퍼 준비, 그리고 스페르민 및 DFHBI-1T 희석에 사용됨.
온라인 몰 질량 계산기	뉴잉글랜드 바이오랩스 (NEB)	해당 없음	몰 수(예: pmol)에서 RNA 질량을 계산하는 온라인 도구입니다.
폴리프로필렌 PCR 튜브	코닝	3745	200 & mu; PCR, 시험관 내 전사, RNA 클러스터링 반응에 사용되는 L PCR 튜브
파워팩 기본 전원 공급 장치	바이오 라디	1645050	DNA 겔 전기영동 실행에 사용됩니다.
Proflex PCR 열 사이클러	써모피셔 사이언티브	44-840-73	PCR, 시험관 내 전사 및 PCR 튜브 내 RNA 샘플 가열에 사용됩니다.
Q5 하이파이어리티 2&타임스; 마스터 믹스	NEB	M0492S	2×로 사용; 고음질 마스터 믹스.
냉장 원심분리기 & nbsp;	에펜도르프	5424R	RNA 정제 및 펠릿 형성에 사용됨.
RNase 오염 제거 용액	서모 피셔 사이언티픽	AM9782	RNase 오염을 최소화하기 위해 실험실 작업대와 표면을 청소하는 데 사용됩니다.
스페르마인  사염산염 사산염	시그마-올드리치	S1141-1G	RNA 클러스터링을 유도하는 데 사용됩니다.
트리스 베이스	밀리포어 시그마	T1503-1KG	Tris 버퍼(pH 7.0) 제제에 사용됩니다.
초순수 아가로스	서모 피셔 사이언티픽	16500500	DNA 겔 전기영동에 사용됨.