올리브 오일 기반 지질 유제는 NF-κB/NLRP3/IL-1β 경로를 억제하여 면역 체크포인트 억제제에 의해 유발된 심근염을 완화합니다

요약

올리브 오일 기반 지질 에멀젼은 NF-κB/NLRP3/IL-1β 경로를 표적으로 하여 면역 체크포인트 억제제로 인한 심근염을 완화하며, 염증성 연쇄반응을 억제하는 잠재력을 입증합니다. 이러한 발견은 면역 관련 심장 손상에 대한 보조 치료로서의 가능성을 강조합니다.

초록

본 연구는 이필리무맙(IPI)과 니볼루맙(NIVO)에 의해 유발되는 면역 체크포인트 억제제(ICI) 유발 심근염을 완화하는 올리브 오일 기반 지질 유제(OOLE)의 치료 효능과 기전을 조사하는 것을 목표로 했습니다. 염증성 심근세포의 시험관 내 모델이 ICI 처리 마우스에서 분리된 CD4⁺/CD8⁺ T 세포와 HL-1 세포를 공동 배양하여 구축하였습니다. 세포는 10% OOLE로 처리한 후 세포자살사를 위한 유세포검사, 사이토카인 프로파일링을 위한 ELISA(TNF-α, IL-1β, IL-6), 그리고 경로 분석(NF-κB, NLRP3, IL-1β)을 위한 웨스턴 블롯/qPCR을 시행하였습니다. 생체 내에서 IPI/NIVO 투여를 통해 쥐에서 심근염이 유도되었습니다. 심장 기능은 심초음파로 평가되었고, 혈청과 심근 조직에서 염증 지표를 평가하였다. 결과는 OOLE이 HL-1 세포에서 T 세포 유도 세포자멸사를 유의미하게 감소시키고 염증성 사이토카인 생성을 억제했으며, NF-κB, NLRP3, IL-1β의 발현은 하향 조절되었음을 보여주었다. 생체 내에서 OOLE은 좌심실 기능 지표를 개선하고 전신 염증을 완화시켰습니다. 분자 분석 결과, 이러한 보호 효과는 NF-κB/NLRP3/IL-1β 신호 축의 억제를 통해 매개된다는 것이 확인되었습니다. 결론적으로, OOLE은 NF-κB/NLRP3/IL-1β 경로를 표적으로 하여 급성 ICI로 인한 심근염을 완화하며, 초기 염증 연쇄 반응을 억제하고 신속한 심장 보호 효과를 제공하는 잠재력을 입증합니다. 이러한 발견은 면역 관련 심장 손상에 대한 보조 치료로서의 가능성을 강조합니다.

서론

프로그래밍 세포 사멸-1(PD-1)과 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4)를 표적으로 하는 면역 체크포인트 억제제(ICI)는 다양한 악성 종양 치료 환경을 혁신했습니다. 그러나 ICIs의 광범위한 임상 적용은 면역 관련 부작용(irAEs)으로 인해 자주 복잡해집니다. 이 중 ICI로 인한 심근염은 드물지만 치명적일 수 있는 합병증으로, 빠른 임상 경과와 25%에서 50%에 이르는 높은 사망률을 특징으로 합니다^1,2. 심각도에도 불구하고, ICI 유발 심근염에 대한 현재 치료 옵션은 주로 고용량 코르티코스테로이드와 비특이적 면역억제제에 한정되어 있습니다 ^3,4. 이러한 전통적인 중재는 종종 최적이 아닌 반응을 내고^ICIs1의 항종양 효능을 저해할 수 있어, 전신 면역억제 없이 심장 염증을 완화할 수 있는 더 안전하고 표적화된 심장 보호 전략 탐색에 중요한 지식 공백을 초래합니다.

NF-κB 신호 경로를 통해 활성화되는 NOD 유사 수용체 단백질 3(NLRP3) 인플라마좀은 ICI 유발 심근염 ^5,6에서 관찰된 사이토카인 폭풍의 중심 동인으로 떠올랐습니다. 특히 IL-1β와 IL-6 같은 염증성 사이토카인의 과도한 생성은 심근세포 손상과 심부전을 초래합니다⁷. 심혈관 질환에서 여러 지질 기반 중재가 탐구되었지만, 이 특정 맥락에서 올리브 오일 기반 지질 유제(OOLE)의 잠재력은 아직 탐구되지 않았습니다. OOLE은 세포막 유동성을 조절하고 염증성 연쇄 반응을 억제하는 독특한 능력으로 알려진 단일불포화지방산인 올레산이 풍부합니다 ^8,9. 그러나 OOLE가 ICI 유발 심근염의 고염증 상태를 특이적으로 완화할 수 있는지는 아직 밝혀지지 않았습니다.

본 연구에서는 OOLE의 치료 잠재력을 조사함으로써 이 격차를 해소하는 것을 목표로 합니다. 우리는 OOL이 NF-κB/NLRP3/IL-1β 신호축을 억제하여 염증 급증을 억제하고 심장 기능을 보존함으로써 강력한 심장 보호 효과를 발휘한다고 가설을 세웠습니다. HL-1 심근세포와 T 세포의 시험관 내 공동 배양 모델을 생 체 내 심근염 모델과 결합함으로써, OOLE 개입이 빠른 기능 회복을 제공하고 심근 손상을 완화함을 입증하였습니다. 이 연구는 OOLE이 ICI 관련 심장독성 관리를 위한 새롭고 표적 있는 영양 약리학적 접근법임을 처음으로 입증합니다.

프로토콜

모든 절차는 광저우 마일스 생명공학 유한회사 동물윤리위원회의 승인을 받았으며, 승인 번호는 IACUC-MIS2023076입니다. 언급된 회사는 동물 실험 센터입니다; 우리의 동물 실험은 이곳에서 진행되며, 따라서 센터 윤리 위원회의 검토를 받습니다.

동물과 실험 설계
상업적으로 30마리의 BALB/c 마우스(수컷, 8주 된 몸무게, 몸무게 22± 2g)가 구매되었습니다. 모델 유도 및 검증 기준: 면역 검사점 억제제(ICI) 유도 심근염 모델은 이필리무맙(5 mg/kg)과 니볼루맙(10 mg/kg)을 2주 연속 정맥 주사로 확립하였습니다. 투여는 3일마다 이루어졌으며, 총 모델링 기간은 2주였습니다. 이 프로토콜은 이전에 상당한 면역 매개 심장 손상을 유발하는 것으로 나타난 바 있습니다¹⁰. 최종 주사 후 24시간 후, 후안와신경총을 통해 혈액 샘플을 채취하여 300 x g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리했습니다; 이후 특정 ELISA 키트를 사용하여 혈청 cTnT 수치를 정량화했으며, 이는 샘플 로딩, HRP 결합 항체 배양, 자동 세척, TMB 염색원 반응의 순차적 단계를 포함했으며, 광학 밀도는 450 nm에서 측정하여 4매개변수 로지스틱 곡선을 기반으로 농도를 계산했고, cTnT 농도≥10 ng/mL는 성공적인 모델 구축으로 간주되었습니다.

체중과 cTnT 농도가 가장 가까운 6개의 모델 마우스를 무작위로 두 그룹으로 나누었는데, 대조군과 처리군(생물학적 복제 모두 n=3). 대조군은 매일 5 mL/kg 용량의 정상 식염수 정맥 주사를 받았습니다. 치료군은 꼬리 정맥을 통해 5 mL/kg 용량의 5% 올리브 오일 기반 지질 유제(OOLE)를 매일 정맥 주사를 6일간 받았습니다(이는 우리 기관 임상 치료에 사용되는 용량이며, 체면 비율을 기준으로 마우스 사용을 위해 추정되었습니다). 다음 검사들은 6일간의 관찰 기간에 수행되었습니다: 심장 기능은 기저선(0일차)과 치료 후 6일차에 초음파 광음향 영상 시스템을 사용하여 평가하였습니다. 6일째에 후안와정맥을 통해 혈액을 채취하였고, 혈청 사이토카인은 ELISA로 정량화하였다. 동물들을 과다 투여한 마취로 안락사한 후, 심장 조직은 단백질 분석을 위해 급속 냉동되었다.

T 세포 분리
대조군 쥐들은 과다 복용 마취로 안락사되었습니다. 비장은 75% 에탄올로 5분간 표면 멸균 후 무균적으로 절제되었고, 모든 결합 조직은 제거되었습니다. 비장은 PBS와 2% FBS를 보충하여 70 μm 세포 체를 기계적으로 해리하여 단일 세포 현탁액을 만들었습니다. 이 현탁액은 300 x g., 4 °C에서 5분간 원심분리한 후, 적혈구는 1 mL의 ACK 용해 버퍼로 실온에서 2분간 용해했습니다. 용해 과정은 PBS로 세척하여 종료되었습니다. T 세포는 마우스 T 세포 분리 키트를 사용해 활성화를 방지하기 위해 음농축을 했습니다. 1,000만 세포당 50μL의 선택 칵테일이 추가되어 상온에서 10분간 배양했습니다. 이어 1,000만 세포당 75μL의 스트렙타비딘 자기 구슬을 추가하고 5분간 배양했습니다. 구슬에 결합된 세포는 자석을 사용해 3분간 유지하였고, 상청액에서 농축된 T 세포(순도 94% 이상)를 수집하였습니다. CD4⁺ 및 CD8⁺ 소집합을 분류하기 위해, 농축된 세포는 항-CD3ε-PE, 항-CD4-APC, 항-CD8-FITC 항체로 15분간 어두운 상태에서 염색한 후, 미리 냉각된 PBS로 3회 세척하였다. 유세포계에서는 다음과 같은 게이팅 전략을 사용하여 분류가 수행되었습니다: 림프구(FSC/SSC), 그 다음 CD3⁺, CD4⁺ 또는 CD8⁺ 소집합. 세포는 순도 모드로 분류되어 200 μL PBS가 미리 채워진 채집관에 넣었으며, 98% 이상의 순도를 가진 표적 소집합을 얻었습니다.

심근염 세포 모델의 구성 및 치료
HL-1 세포는 표준 조건(37°C, 5% CO₂)에서 DMEM/F12 배양지에 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS)을 보충하여 배양하였다. 세포는 세 그룹으로 나뉘었습니다: 대조군(미처리), 모델군(24시간 동안 CD4+/CD8+ T 세포로 처리된 HL-1 세포), 그리고 24시간 동안 10% OOLE와 공동 처리한 모델군.

심근손상 관련 단백질의 혈청 검출을 위한 ELISA
키트의 사전 코팅된 항체 풍부 마이크로플레이트 웰에 50 μL 혈청 샘플을 30분간 배양한 후, PBST로 세 번 세척하여 결합되지 않은 성분을 제거합니다. 두 번째 배양을 위해 준비된 고추냉이 과산화효소(HRP) 표지된 아비딘 용액을 추가하세요. PBST로 세 번 다시 세척한 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 100 μL를 추가하여 색도 반응을 시작하고, 시작 후 30–45분 이내에 100 μL 정지 용액으로 반응을 종료합니다. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450nm에서 흡광도(OD)를 측정하고, 알려진 기준 표준과 함께 그려진 표준 곡선을 사용하여 표적 분석물의 농도를 정량화합니다.

서부 블롯
심장 조직은 액체 질소를 이용한 조직 균질기를 사용해 분쇄되었습니다. 이후 조직 및 세포 샘플을 200 μL RIPA 버퍼에 30분간 얼음 위에 용해했습니다. 용해액은 12,000 x g. 에서 4°C에서 15분간 원심분리하여 단백질 상원액을 수집했습니다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하였습니다. 단백질 농도를 5 μg/μL로 조절한 후, 샘플은 5× 로딩 버퍼와 혼합되어 95 °C에서 10분간 가열하여 변성시켰습니다. 단백질은 10% SDS-PAGE 겔(100V 90분 주입)에서 분리한 후, 15V 반건식 전기블롯팅을 통해 PVDF 막으로 30분간 전이했습니다. 막은 5% 무지방 우유로 차단한 후 4°C에서 1차 항체(IL-1β, NLRP3, MyD88, NF-κB p65, Tubulin 포함; 1:1,000 희석)로 하룻밤 동안 탐침했다². 0.1% Tween 20(TBST)이 포함된 Tris 완충 식염수로 각각 10분씩 막을 세 번 세척한 후, 고추냉이 과산화효소(HRP) 결합된 2차 항체(1:10,000 희석)와 실온에서 1시간 동안 배양하였습니다. 단백질 밴드는 증강된 화학발광(ECL) 기판을 적용하여 시각화되었고, 신호는 화학발광 영상 시스템을 통해 포착되었습니다. 마지막으로, ImageJ 소프트웨어를 사용해 타깃 단백질 밴드의 밀도 값을 튜불린 내부 대조군에 정규화하여 상대적 발현 수준을 정량적으로 분석하였습니다.

유세포분석에 의한 세포 세포자멸사 분석
HL-1 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 세척하였다. 세포 해리를 위해 트립신 1mL를 첨가하여 1분간 배양한 후, 즉시 2mL의 완전 배양지로 중화하였습니다. 세포 현탁액은 4 °C에서 250 x g 에서 5분간 원심분리한 후 상정액을 버렸습니다. 수집된 세포 펠릿은 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세척한 후 1x 결합 완충제에 재현탁하여 세포 밀도를 1 x 10⁶ cells/mL로 만들었습니다. 이 세포 현탁액 100 μL 분량을 유세포검사 튜브로 옮긴 후, FITC-Annexin V 5 μL와 프로피디움 요오화물(PI) 5 μL가 추가되었습니다. 부드러운 소용돌이 후, 혼합물을 실온(25 °C)에서 어두운 환경에서 15분간 배화했습니다. 마지막으로 각 튜브에 1 x 결합 완충제 400 μL을 추가하고, 이후 유세포 세포 측정기를 사용해 세포 세포자멸사를 분석하였습니다. 게이팅 전략에서는 먼저 전방산란(FSC)과 측면산란(SSC)으로 사건을 게이트하여 세포 내 잔해를 배제하고 온전한 HL-1 세포 집단을 분리했습니다. 이 1차 게이트 내에서 사분면 분석을 통해 세포자멸사 세포가 정량화되었으며, 초기 세포자멸사 세포는 FITC-Annexin V⁺/PI⁻, 후기 세포자멸사 세포는 FITC-Annexin V⁺/PI⁺으로 정의되었습니다.

통계 분석
각 실험은 3회로 수행되었으며, 통계 분석은 통계 소프트웨어를 사용해 수행되었습니다. 두 그룹 간 차이는 독립 표본 t-검정을 사용하여 분석되었으며; 세 그룹 이상의 차이는 일원 ANOVA를 사용한 후 Bonferroni 사후 검정을 통해 분석하였다. 데이터는 표준오차(SEM)± 평균 기준으로 표현됩니다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

이필리무맙과 노볼루맙 병용 조합은 동물 모델에서 ICI로 인한 심근염을 유발합니다
ICI 유발 심근염 모델을 구축하기 위해, BALB/c 마우스에 꼬리정맥을 통해 이필리무맙(5 mg/kg)과 니볼루맙(10 mg/kg)을 정맥 주사로 투여하였다. 이후 심장 트로포닌 T(cTnT)의 혈청 수치를 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 측정하였습니다. 성공적인 모델 유도의 임계치는 cTnT ≥ 10 ng/mL로 정의되었습니다. 그림 1A에서 보듯, 모델링 프로토콜에 적용된 30마리의 쥐에 대한 혈청 분석에서 10마리의 쥐가 cTnT 농도가 10 ng/mL를 초과하는 것으로 나타났으며, 이들 동물에서 성공적인 모델 유도가 확인되었습니다.

OOLE은 면역성 심근염을 가진 쥐의 부분 심장 기능을 향상시킵니다

토론

이 연구에서 우리는 올리브 오일 기반 지질 유제(OOLE)가 IL-1β/NLRP3/NF-κB 신호 경로를 억제하여 면역 검사점 억제제(ICI)에 의해 유발된 심근염을 효과적으로 완화한다는 것을 처음으로 입증했습니다. 우리의 결과는 OOLE이 심장 기능을 개선할 뿐만 아니라 생 체 내외 모두에서 심근 염증을 완화한다는 기전적 및 기능적 증거를 모두 제공합니다 . ICI 유발 심근염 모델에 대해 말입니다.

기전적으로 이 연구 결과는 T 세포 매개 심장 손상이 NLRP3 인플라마좀 조립과 NF-κB 신호^{전달 16}을 통해 IL-1β 연쇄 반응의 과도한 활성화를 유발한다는 모델을 지지합니다. 이 염증 축은 심근괴사를 악화시키고 Th17 분극을 촉진하며 장기적인 심장 재형성을 유도하는 것으로 알려져 있습니다.^이

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22um PVDF 막	밀리포어	ISEQ00010
4% 파라포름알데히드	광저우 옥이드 생명공학 유한회사.	BL539A
BALB/c 마우스	광둥즈위안 생명의학기술유한회사.
BCA 분석 키트	딩궈 바이오테크	BCA02
밝시야 현미경	MSSHOT	ML31
cTnT 엘리사 키트	런탕슈오바이오테크	ED-28107
전기영동 장치	WIX	미니프로4
완전 자동화 화학발광 영상 분석 시스템	후지필름	LAS-3000
헤마톡실린-에오신 키트	광저우 옥이드 생명공학 유한회사.	BL2236A
IFN-및 감마; ELISA 키트	샤먼 렌창슈오 바이오테크놀로지 주식회사(푸젠, 중국).	ED-10284
IL-1&베타; 항체	친화력	BF8021
IL-1&베타; ELISA 키트	샤먼 렌창슈오 바이오테크놀로지 주식회사(푸젠, 중국).	ED-10351
IL-6 ELISA 키트	샤먼 렌창슈오 바이오테크놀로지 주식회사(푸젠, 중국).	ED-10377
ImageJ 1.54 소프트웨어	NIH
이필리무맙	MCE	CAS: 477202-00-9
MyD88 항체	친화력	AF5195
NF-& 카파; B p65 항체	친화력	BF8005
니볼루맙	MCE	CAS: 946414-94-4
NLRP3 항체	친화력	BF8029
올리브 오일 기반 지질 에멀젼	광저우 푸다 암병원 영양과에서
급속 반건식 회전 필름 장치	바이오-래드	788BR04132
실시간 형광 qPCR 정량 시스템	야루이	MA-6000
RIPA 용해 완충제	비요타임	P0013B
회전식 미세절기	라이카	RM2235
SDS-PAGE 겔	비요타임	P0052A, P0053A
Annexin V-FITC/PI 세포자퇴증 탐지 키트	대롄 메이룬 생명공학 유한회사.	MA0220-1
EasySep 마우스 CD4+ T 세포 분리 키트	스템셀	19765
HL-1 쥐 심근세포 세포주	광저우 올퍼펙트 바이오테크놀로지 유한회사.	TCM-C783
TNF-&α; ELISA 키트	샤먼 렌창슈오 바이오테크놀로지 주식회사(푸젠, 중국).	ED-11776
초음파 광음향 영상 시스템	후지필름 비주얼소닉스	VEvo3100
요동역학 검사 시스템	테크맨	BL-420