애기장대 핵에서 단일 분자 위치 현미경을 위한 간소화된 프로토콜

Summary

이 프로토콜은 최적화된 분리, 고정, 표지를 활용하여 분리된 애기장대 핵의 단일 분자 위치 현미경 영상을 효율적으로 수행하여 크로마틴과 RNA 중합효소 II의 신뢰성 있는 나노 규모 시각화를 달성합니다. 이 접근법은 고해상도 영상을 위한 다른 염색질 관련 단백질이나 히스톤 변형에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

Abstract

공초점 형광 현미경은 식물 핵 내 염색질 배열에 대한 귀중한 통찰을 제공했지만, 회절 한계 해상도로 인해 염색질 구조 연구가 제한되어 단일 분자 위치 현미경(SMLM)과 같은 초해상도 기법의 사용이 촉진되고 있습니다. 이러한 접근법 중 직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)은 개별 세포에서 나노 규모의 해상도를 제공하여 염색질 도메인, 히스톤 변형, 핵 조직의 정밀한 시각화를 가능하게 합니다. 이러한 방법들은 포유류 시스템에서 점점 더 많이 적용되고 있지만, 식물 생물학에서의 사용은 주로 샘플 준비의 기술적 어려움 때문에 제한적입니다.

여기서는 Arabidopsis thaliana에서 분리한 핵의 SMLM 이미징을 위한 간소화되고 재현 가능한 워크플로우를 제시합니다. 이 프로토콜은 핵 형태를 보존하기 위한 묘목 고정으로 시작하며, 이어서 온전한 핵을 풍부하게 하기 위해 부드러운 조직 절단과 원심분리를 진행합니다. 분리된 핵은 액체 배지에 형광포자 표지한 후 저융 아가로스 패드에 고정되어, 장시간 단일 분자 영상 촬영 시 안정성을 높입니다. 이러한 조치들은 배경 형광을 최소화하고, 표지 일관성을 개선하며, 생물학적 복제체 간 재현성을 높입니다.

이 제제는 식물 내 크로마틴 변형과 핵 구조를 시각화하는 데 향상된 명료성을 제공합니다. 애기장대에서 SMLM 영상을 구현하는 기술적 장벽을 낮춤으로써, 이 프로토콜은 나노스케일에서 후생유전학 조절, 염색질 조직, 핵 위상 변이를 연구할 수 있는 다재다능한 수단을 제공합니다. 이 연구는 식물에 SMLM 적용을 위한 방법론적 토대를 마련하고, 포유류 세포 생물학과의 간극을 메우며, 식물 시스템의 발달 및 환경 신호에 반응하여 핵 구조가 유전체 조절에 어떻게 기여하는지를 연구할 새로운 기회를 열어줍니다.

Introduction

현미경은 오랫동안 염색질 조직과 핵 구조를 연구하는 초석이었으며, DNA와 히스톤 관련 단백질이 3D 핵 공간 내에서 어떻게 배열되고 유전자 조절에 영향을 미치는지 밝혀냈습니다 ^1,2. 기존의 형광 현미경은 염색체 영역, 염색중심, 핵체 ^3,4와 같은 대규모 염색질 도메인에 대한 귀중한 통찰을 제공했으며, 이는 특히 식물의 뿌리 조직 ^3,5,6에서 현장에서 실현 가능하다. 하지만 이러한 기법들은 빛의 회절 장벽에 의해 근본적으로 제한되어 공간 해상도가 측면 약 200 nm,^{축 방향 약} 500 nm로 제한됩니다. 이 한계는 후생유전학 조절의 기초가 되는 염색질 접힘, 히스톤 변형 패턴, 전사 구획화의 나노 규모 세부 사항을 가립니다. 이 장벽을 극복하기 위해 구조화 조명 현미경(SIM)

Protocol

참고: 이 프로토콜에서 사용된 재료 및 기기에 대한 자세한 정보는 재료표에서 확인할 수 있습니다. 별도 명시가 없는 한, 완충류는 무효성 0.2 μm 필터에서 클리어됩니다. 이 프로토콜 전반에 걸쳐 이중 증류 초순수 H₂O(ddH₂O)가 사용됩니다. 원심분리 단계는 고정각 로터를 사용하여 1.5 mL 마이크로튜브에서 수행됩니다.

1. 묘목의 핵 고정 및 방출

1. 6웰 배양판을 연기 후드 아래 얼음 위에 올려놓고, 각 웰에 약 4mL의 얼음 냉각 고정액을 즉석에서 즉시 준비한 것을 첨가합니다(4% (v/v) 메탄올 안정화 포름알데히드, 0.1% Triton X-100 in 1× 인산염 완충 생리식염수[PBS]).
2. 깨끗한 겸자를 사용해, 발아 후 8일에서 15일 사이에, MS 묘목에 대해 설명한 MS 묘목에 대해 고형(0.8% 한천) 반도성 무라시게 및 스쿠그 미디엄 2.2 g/L MS 염, 1% 자당(w/v), pH 5.7 위에 키운 묘목을^{제거하여 즉시} 고정 용액에 담가둡니다. 약 20개의 묘목을 위한 한 개....

Results

위에서 설명한 프로토콜은 SMLM에 적합한 고품질 Arabidopsis thaliana 핵을 준비할 수 있게 합니다. 핵 무결성을 개선하고 이미지 품질을 저해하는 세포질 및 세포 잔해를 줄이기 위해 여러 차례 최적화가 수행되었습니다. 각 최적화 단계 후, 핵 준비물의 품질은 올림푸스 IX81 회전 디스크 현미경을 이용한 공초점 영상으로 평가된 후 초해상도 획득으로 진행되었습니다.

공초점 영상
위에서 설명한 절차는 실제로 공초점 영상과 호환됩니다. 이를 위해 3.1단계에서 사용되는 LMA 솔루션은 PBS(또는 어떤 중성 버퍼 또는 매질)를 기반으로 할 수 있습니다. MEA와 GLOX는 SMLM에만 필요합니다. 반면, SMLM(단계 3.3)에 사용되는 JF 기반 Hoechst는 기존 영상 기법으로는 검출할 수 없을 만큼 희석되어 있습니다. 따라서 공초점 또는 에피형광 영상.......

Discussion

Arabidopsis thaliana 핵을 단일 분자 위치 현미경(SMLM)을 위해 준비하는 과정은 최종 샘플 품질에 큰 영향을 미치는 여러 중요한 단계를 필요로 합니다. 앞서 설명한 ^19,35, 완전한 핵 회복을 극대화하기 위해서는 철저하고 일관된 조직 절단이 필수적입니다. 표준 면도날 대신 미세절기 날을 사용하면 조직 조각이 더 깨끗하고 균일하게 이루어져 핵 방출이 개선됩니다. 이후 세척과 원심분리 과정도 잔해 감소에 똑같이 중요합니다. 이 단계는 신중하게 수행되며, 상원액은 200 μL 마이크로피펫으로 천천히 제거한 후 10 μL 마이크로피펫으로 진행하여 핵 손실을 최소화합니다. 펠릿이 특히 컴팩트할 경우, NIB 버퍼의 부유액을 200–250 μL로 늘리면 응집을 방지하고 더 균일한 현탁을 보장합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
항RNA 중합효소 II CTD 반복 YSPTSPS (인광 S2) 항체	앱캠	AB5095	면역염색 완충액에서 1/200 희석 상태에서 중합효소의 활성 형태를 시각화하기 위해 사용한 1차 항체(토끼에서 생성한 폴리클론 항체)
획득 소프트웨어	아버블라이트	NEO 라이브이미징 v2.18
소 혈청 알부민	시그마-올드리치	A7906  그리고 nbsp;
카탈라제	시그마-올드리치	C40
인증 저융 아가로스	바이오-래드	1613111
커버슬립 두께 1.5H 라운드	마리엔펠트	117640	& 슬래시;: 24 mm
D-(+)-포도당, 무수, 99%	써모 사이언티픽	A16828-36
이색성 거울	셈록	디03-R405/488/561/635-t1	여기/방출 분리를 위한 이색성 미러
둘벡코 인산염 완충 식염수 10급성;	바이오웨스트	X0515 - 500	멸균 환경에서 작업
에프레디아 울트라 일회용 미세토름 블레이드	피셔스티언	12191830	저프로파일, 일회용
Falcon 6-웰 투명 평평 바닥 TC 처리 다중웰 배양판, 뚜껑 포함	그리고 nbsp; 팔콘	353046
포름알데히드 용액 37%	칼 로스	7398	훈풍 후드 아래에서 작업
포도당 산화효소	시그마-올드리치	G2133
글리세롤	VWR	24388.295
염소 항토끼 IgG (H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor Plus 647	써모 사이언티픽	A32733TR	1/200 용량에서 AF647과 결합된 2차 항체로 사용됨
Hoechst 33258 솔루션	시그마-올드리치	94403	1/500 비율로 사용되어 DNA를 반염색하고, 아가로스 패드에 첨가됩니다
염산 용액	화학 실험실	CL05.0311.1000
JF549-호에스트트	라비스 실험실과 오픈 케미스트리 팀 (자넬리아)	JF549-호에스트트	DNA 역염색을 위해 사용되며, 최종 농도는 1.5 nM 밀도로 아가로스 패드에 첨가됩니다.
킴블 도운스 티슈 그라인더 세트	시그마-올드리치	D8938	2 mL 튜브에 크고 크고 0.0005-0.0050 인치와 작은 클리어런스 스플이 모두 있습니다
레이저 유닛	옥시우스	L6Cc	6개의 레이저를 탑재: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW, 730 nm - 30 mW
육수화마그네슘 클로라이드	칼 로스	HN03
머캅토에틸아민 (MEA)	시그마-올드리치	30070
MOPS 나트륨 염 98%	피셔 사이언티브 SAS	352590010
다중 대역 방출 필터	셈록	FF01-446/523/600/677	레이저 산란 광을 차단하는 다중 밴드 방출 여과가 적용되었습니다
나노다이아몬드	아다마스 나노테크놀로지	NDNV100nmHiWGA2ml	스톡 1 mg/mL
ORCA-퓨전 디지털 CMOS 카메라	하마마츠	C14440-20UP
페트리 접시, 100/20 mm, PS, 투명, 통풍구 포함, 멸균	그레이너 바이오-원	664161	1/2 MS 배지에서 식물을 키우는 데 사용했습니다
페트리 접시, 정사각형, PS, 투명, 120/120/17 mm, 멸균	그레이너 바이오-원	688161	식물 묘목을 자를 때 사용됩니다
플루리스트레너 미니 셀 스트레이너	플루리 셀렉트	43-10030-50	메시 크기 30 및 마이크로; m, 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 적합
염화칼륨	시그마-올드리치	P9333
단일 밴드 방출 필터	셈록	FF01-698/70	AF647 채널용 특정 방출 필터
단일 밴드 방출 필터	크로마	ET600/50m	JF549 채널의 특정 방출 필터
염화나트륨(99.5%)과 nbsp;	유로메덱스	1112-A
스타-프로스트 슬라이드 76 x 26 mm	니텔	그리고 nbsp; VS112711FKB.01
멸균 주사기 필터 및 슬래시; 33 mm 공극성 0.2 & 마이크로; m 루어 록 콘	클리어라인	146560
초분해상 시스템	아버블라이트	SAFe360	100배 NA1.5 오일 침지 대물렌즈가 장착된 올림푸스 IX83
트리-나트륨 시트레이트 2H2O Gen-Apex 바이오몰	프로라보	PRO-33615.268
트리스 염기 분자생물학 등급	프로메가	H5135
트리스(2-카복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP)	써모 사이언티픽	20491
트리톤 X-100	유로메덱스	2000-B
트윈 20세	유로메덱스	2001-B
트윈실 스피드	피코덴트	13001002	실리콘 실란트
자외선 오존 청소 시스템 UVOCS 오븐	UVOCS 주식회사	T10X10	커버슬립 청소를 위한 20분 노출
진공 펌프	배큐브랜드	VP 100C
헤라우스 메가퓨지 16R 원심분리기	써모 사이언티픽		로터 TX-400 75003629. 에펜도르프 튜브를 이용한 원심분리.