애기장대 핵에서 단일 분자 위치 현미경을 위한 간소화된 프로토콜

Summary

이 프로토콜은 최적화된 분리, 고정, 표지를 활용하여 분리된 애기장대 핵의 단일 분자 위치 현미경 영상을 효율적으로 수행하여 크로마틴과 RNA 중합효소 II의 신뢰성 있는 나노 규모 시각화를 달성합니다. 이 접근법은 고해상도 영상을 위한 다른 염색질 관련 단백질이나 히스톤 변형에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

Abstract

공초점 형광 현미경은 식물 핵 내 염색질 배열에 대한 귀중한 통찰을 제공했지만, 회절 한계 해상도로 인해 염색질 구조 연구가 제한되어 단일 분자 위치 현미경(SMLM)과 같은 초해상도 기법의 사용이 촉진되고 있습니다. 이러한 접근법 중 직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)은 개별 세포에서 나노 규모의 해상도를 제공하여 염색질 도메인, 히스톤 변형, 핵 조직의 정밀한 시각화를 가능하게 합니다. 이러한 방법들은 포유류 시스템에서 점점 더 많이 적용되고 있지만, 식물 생물학에서의 사용은 주로 샘플 준비의 기술적 어려움 때문에 제한적입니다.

여기서는 Arabidopsis thaliana에서 분리한 핵의 SMLM 이미징을 위한 간소화되고 재현 가능한 워크플로우를 제시합니다. 이 프로토콜은 핵 형태를 보존하기 위한 묘목 고정으로 시작하며, 이어서 온전한 핵을 풍부하게 하기 위해 부드러운 조직 절단과 원심분리를 진행합니다. 분리된 핵은 액체 배지에 형광포자 표지한 후 저융 아가로스 패드에 고정되어, 장시간 단일 분자 영상 촬영 시 안정성을 높입니다. 이러한 조치들은 배경 형광을 최소화하고, 표지 일관성을 개선하며, 생물학적 복제체 간 재현성을 높입니다.

이 제제는 식물 내 크로마틴 변형과 핵 구조를 시각화하는 데 향상된 명료성을 제공합니다. 애기장대에서 SMLM 영상을 구현하는 기술적 장벽을 낮춤으로써, 이 프로토콜은 나노스케일에서 후생유전학 조절, 염색질 조직, 핵 위상 변이를 연구할 수 있는 다재다능한 수단을 제공합니다. 이 연구는 식물에 SMLM 적용을 위한 방법론적 토대를 마련하고, 포유류 세포 생물학과의 간극을 메우며, 식물 시스템의 발달 및 환경 신호에 반응하여 핵 구조가 유전체 조절에 어떻게 기여하는지를 연구할 새로운 기회를 열어줍니다.

Introduction

현미경은 오랫동안 염색질 조직과 핵 구조를 연구하는 초석이었으며, DNA와 히스톤 관련 단백질이 3D 핵 공간 내에서 어떻게 배열되고 유전자 조절에 영향을 미치는지 밝혀냈습니다 ^1,2. 기존의 형광 현미경은 염색체 영역, 염색중심, 핵체 ^3,4와 같은 대규모 염색질 도메인에 대한 귀중한 통찰을 제공했으며, 이는 특히 식물의 뿌리 조직 ^3,5,6에서 현장에서 실현 가능하다. 하지만 이러한 기법들은 빛의 회절 장벽에 의해 근본적으로 제한되어 공간 해상도가 측면 약 200 nm,^{축 방향 약} 500 nm로 제한됩니다. 이 한계는 후생유전학 조절의 기초가 되는 염색질 접힘, 히스톤 변형 패턴, 전사 구획화의 나노 규모 세부 사항을 가립니다. 이 장벽을 극복하기 위해 구조화 조명 현미경(SIM)⁸, 자극 방출 고갈(STED)^9,10, 단일 분자 위치 현미경(SMLM)^11,12와 같은 초해상도 현미경(SRM) 접근법이 개발되어 100 nm에서 몇 nm¹³까지 다양한 해상도를 달성했습니다.

SRM 기법 중 SMLM(광활성화 위치 현미경(PALM)¹³과 직접 확률 광학 재구성 현미경(dSTORM)을 포함하여, 분자 특^{이성과 결합}된 탁월한 공간 해상도를 제공합니다. SMLM은 개별 형광체의 위치를 시간에 따라 검출함으로써 단일 세포 내 염색질 도메인, 히스톤 표식, 핵 구조의 고정밀 나노 규모 이미지를 재구성합니다^15,16. 이 능력은 포유류 시스템에서 염색질 연구를 혁신했으며, SMLM이 적용되어 핵체 군집, 염색질 압축, 히스톤 변형 패턴을 전례 없는 세밀함으로 시각화하는 데 활용되었습니다^{15, 16, 17}. 반면, 식물 핵에 대한 SMLM 적용은 높은 자가형광, 세포벽 강성, 전분과 엽록소 같은 빛 산란 화합물 존재 등 식물 조직 특성과 관련된 기술적 어려움 때문에 제한^{적입니다.} 더불어, 분리 및 표지 과정에서 핵의 섬세함은 장시간 영상 촬영 중 구조적 완전성을 유지하고 배경 형광을 최소화하기 위한 최적화된 작업 흐름을 요구합니다.

여기서 설명한 프로토콜은 원래 Elizabeth Kracik-Dyer와 Célia Baroux가 자극 방출 고갈(STED) 현미경을 위해 개발한 것입니다¹⁹. 이후 STORM 영상의 특정 요구사항에 맞게 최적화 및 조정되었으며,^{20, 21}, ²² 미생물학 응용 분야에서 나온 지식을 통합하였습니다. 전체적인 목표는 분리된 Arabidopsis thaliana 핵의 SMLM 이미징을 위한 간소화되고 재현 가능한 워크플로우를 제공하는 것입니다. 최적화된 고정, 부드러운 기계적 교란, 현탁 형광체 표지를 통합함으로써, 이 방법은 핵 형태를 보존하면서 영상 품질을 자주 저해하는 세포질 오염물질을 효율적으로 제거합니다. 저융 아가로스 패드에 표지된 핵을 고정하면 획득 시 기계적 안정성을 보장하여 나노 규모 정밀도로 장기 단일 분자 이미징을 가능하게 합니다. 이전에 설명된 식물 핵 SRM 프로토콜, 특히 STED 현미경^{기반 프로토콜}과 ^{비교할 때}, 이 워크플로우는 광전환 가능한 형광체(예: AF647, JF549)를 사용하며, 엽록소와 조직 이물질을 제거하는 세척 단계 덕분에 배경 형광을 줄이고, 고정되고 투과된 핵에 표지 분자를 직접 첨가하여 표지의 균질성을 향상시킵니다. 따라서 개별 핵 내 염색질 변형, 핵 구획, 후생유전학적 패턴을 일관되게 시각화할 수 있게 합니다. 식물에서 SMLM 구현의 기술적 장벽을 낮춤으로써, 이 방법은 나노스케일 영상의 접근성을 넓히고, 염색질 조직과 핵 구조가 발생 및 환경 신호에 반응하여 유전자 조절에 어떻게 기여하는지 연구하는 기초를 제공합니다.

Protocol

참고: 이 프로토콜에서 사용된 재료 및 기기에 대한 자세한 정보는 재료표에서 확인할 수 있습니다. 별도 명시가 없는 한, 완충류는 무효성 0.2 μm 필터에서 클리어됩니다. 이 프로토콜 전반에 걸쳐 이중 증류 초순수 H₂O(ddH₂O)가 사용됩니다. 원심분리 단계는 고정각 로터를 사용하여 1.5 mL 마이크로튜브에서 수행됩니다.

1. 묘목의 핵 고정 및 방출

1. 6웰 배양판을 연기 후드 아래 얼음 위에 올려놓고, 각 웰에 약 4mL의 얼음 냉각 고정액을 즉석에서 즉시 준비한 것을 첨가합니다(4% (v/v) 메탄올 안정화 포름알데히드, 0.1% Triton X-100 in 1× 인산염 완충 생리식염수[PBS]).
2. 깨끗한 겸자를 사용해, 발아 후 8일에서 15일 사이에, MS 묘목에 대해 설명한 MS 묘목에 대해 고형(0.8% 한천) 반도성 무라시게 및 스쿠그 미디엄 2.2 g/L MS 염, 1% 자당(w/v), pH 5.7 위에 키운 묘목을^{제거하여 즉시} 고정 용액에 담가둡니다. 약 20개의 묘목을 위한 한 개의 우물을 사용하며(샘플당 충분한 재료를 얻기 위해 3개의 우물이 필요했습니다).
3. 플레이트를 얼음으로 채운 진공 챔버에 넣고, 0.2바에서 0.8바 사이의 압력으로 15분간 진공을 가하여 갇힌 공기를 제거하고 고정제가^{식물 조직에} 깊숙이 침투하도록 합니다. 천천히 진공청소기를 풀고 샘플을 저은 후 추가로 15분간 진공을 적용합니다.
4. 훈기 후드 아래에서 피펫으로 고정액을 제거하고, 5mL의 얼음 차가운 PBS를 사용해 10분간 부드럽게 저어주며 각 웰을 3회 세척합니다.
5. PBS를 제거하고 겸자를 사용해 고정된 조직을 120mm × 120mm 페트리 접시로 옮깁니다. 고정 묘목에 Kracik-Dyer와 Baroux가 설명한 대로 50 μL 핵 분리 완충제(NIB, 45 mM MgCl₂, 20 mM MOPS, 30 mM 시트레이트 나트륨, 0.3% Triton X-100)를 추가합니다. 1 N HCl)¹⁹를 사용해 pH 7로 조절합니다. 칼날로 칩.
   참고: 이 작업에는 미크토름 칼날이 기존 면도날보다 더 효율적이었습니다.
6. 같은 칼날로 다진 조직을 페트리 접시 한쪽 가장자리에 긁어내고 600 μL 닙을 추가하며, 칼날에 붙은 조직도 깨끗이 씻어내세요.
7. 조직 슬러리를 2 mL Dounce 동질관 안으로 옮기고, 작은 공으로 5–10회 스트로크한 뒤, 큰 공으로 튜브 안에서 부드럽게 움직일 때까지 반복합니다(역시 보통 5–10회 스트로크가 필요합니다).
8. 균질화된 샘플을 30 μm 메시 필터로 1.5 mL 마이크로튜브로 필터링합니다.
9. 가속과 감속을 위해 가장 낮은 램프를 사용해 800 × g 에서 10분간 서스펜션을 원심분리합니다. 녹색 조직 잔해 사이에서 작은 흰색 탄환이 보입니다.
10. 상청액을 버리고 펠릿을 150 μL NIB에 재현탁합니다.
11. 800 × g 에서 다시 10분간 원심분리한 후 상원액을 제거하세요. 녹색 이물질이 보이면 두 번째로 세척하세요. 펠릿 크기에 따라 50 μL에서 150 μL 사이의 NIB에 재현탁합니다.
12. 분리된 핵 현탁액은 최대 1주일간 4°C에서 보관한 후 염색을 수행합니다. 하지만 즉시 진행하는 것이 권장됩니다.

2. (면역)염색

참고: 다음 단계에서는 프로토콜을 50 μL 부유액의 핵 현탁액에 적용하며, 이는 일반적으로 20개의 묘목에 해당합니다. 명시가 없는 한, 다음 단계는 상온에서 수행됩니다.

1. 용액을 800× g 에서 10분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다. 펠릿을 만지지 않도록 조심하세요.
2. 핵을 50 μL 블로킹 버퍼(143 mM NaCl, 4% BSA in PBS, 4 °C에 저장)에 부드럽게 피펫팅하여 재현탁합니다. 부드럽게 저어주면서 30분간 부양하세요.
3. 용액을 800 × g 에서 10분간 원심분리한 후 핵 펠릿을 건드리지 않고 상청액을 버립니다.
4. 핵을 1× PBS 50 μL에 부드럽게 피펫팅하여 재현탁합니다. 800 × g에서 다시 10분간 원심분리기를 했습니다. 위와 같이 상정액을 버리세요.
5. 핵을 143 mM NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween 20 in PBS로 구성된 면역염색 버퍼에 조제한 1차 항체 용액 50 μL에 재현탁합니다(항체 및 작동 희석량은 재료표에 상세히 나와 있습니다). 샘플을 60분간 부드럽게 교반 상태로 배양하세요.
6. 2번 세척(2.3, 2.4단계를 반복)으로 진행하세요.
7. 염소 항-토끼 항-AF647 2차 항체 50 μL에 핵을 1/200 희석²⁶으로 재현탁합니다. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 형광체를 빛으로부터 보호하세요. 튜브를 부드럽게 저으며 60분간 부화시키세요.
8. 2번 세척(2.3, 2.4단계를 반복)으로 진행하세요.
9. 펠릿을 50 μL NIB에 재현탁합니다. 현탁액은 알루미늄 호일로 감싼 1.5mL 마이크로튜브에 보관하세요. 표기는 4°C에서 몇 주간 안정적입니다.

3. 장착

1. STORM 영상을 위해 분말을 50 mM Tris pH 8, 10 mM NaCl, 10% 포도당으로 구성된 1.25× 버퍼 B에 용해하여 저녹도의 아가로스 용액(LMA 1.5% w/v)을 준비합니다. 1.25× 스톡 용액을 준비하고 4 °C에서 보관합니다.
2. 90 °C에서 1분간 가열하여 분말을 녹이고 투명한 용액을 얻습니다. 다음 단계로 넘어가기 위해 녹인 LMA 용액을 37°C에서 냉각시키고 유지하세요. 다음 단계로 넘어가기 위해 포도당 산화효소(GLOX) 버퍼의 열 변성을 방지하세요(-20°C에서 100 mM Tris pH 7.5, 25 mM KCl, 1 mM TCEP pH 7.0, 5 mg/mL 포도당 산화효소, 0.4 mg/mL 카탈라아제로 구성된 10x 스톡 용액을 준비), 50% V/V 글리세롤).
3. LMA 용액이 37 °C에 도달하면, 100 mM 머카토에틸아민(MEA)과 GLOX를 따뜻한 LMA 용액에 첨가하여 최종 농도를 1× 달성합니다. MEA 1 M 스톡 용액은 4 °C에서 최대 1개월간 보관하되, 갓 준비된 용액 사용을 권장합니다. 부드럽게 섞으세요.
   참고: 선택적 DNA 표지 시에는 JF549 결합 Hoechst 1.5 nM(최종 농도, DMSO 내 1 mM 스톡 용액)을 추가하세요. 사용 전까지 현탁 온도를 37°C로 유지하세요.
4. 핵 현탁액과 나노다이아몬드를 1/1500 희석 비율로 부드럽게 섞습니다. 샘플과 함께 5분간 배양하세요.
   참고: 나노다이아몬드는 시료 드리프트를 보정하는 기준 마커 역할을 합니다.
5. 혼합물 10 μL을 오존 처리된 1.5H 커버슬립(자외선 오존 세척 시스템에서 20분)에 침착시키고, 핵이 커버슬립에 침착되도록 3분간 기다립니다.
6. 과잉 액체를 제거하고 2분간 기다리세요. 3.3단계에서 준비한 LMA 10 μL을 커버슬립에 추가하고 즉시 현미경 슬라이드로 덮습니다.
7. 커버슬립은 실리콘 실란트로 밀봉하세요. 마이크로피펫 팁을 사용해 작은 페트리 접시에 같은 양의 용액 A와 B를 섞으세요. 커버슬립 가장자리에 혼합물을 바르면 샘플을 밀봉하세요. 실리콘 실란트는 5분 이내에 굳아요.
8. 장착 후에는 최대 4–5시간 이내에 슬라이드를 촬영하여 장착 패드의 산소 흡수 특성을 잃지 않도록 합니다.

4. 영상

참고: 영상 파라미터는 샘플의 특성, 형광포어의 광물리학적 특성, 현미경의 광학 구성에 따라 신중하게 최적화되어야 합니다. 각 형광체에 대해 높은 신호 대 잡음비를 유지하면서 형광 채널 간 스펙트럼 유출과 교차 여기를 최소화하는 것이 매우 중요합니다. 샘플은 고자연 100배 오일 침지 대물렌즈, 초점 유지 장치, 밝은 시야 영상용 백색 LED가 장착된 역형광 현미경으로 관찰되었습니다. 형광 표지 AlexaFluor647(AF647)은 640nm에서, JF549-Hoechst는 561nm에서 여기되었습니다. 방출된 빛은 호환 가능한 이색성 거울과 밴드패스 필터로 필터링되었고, 마지막으로 과학적 상보 금속산화반도체(sCMOS) 카메라로 이미지를 수집했습니다.

1. 샘플 슬라이드를 장착하고 초점을 찾으세요. 시스템에 초점 유지 모듈이 있다면 활성화하세요(장기 획득 시 강력히 권장).
2. 핵을 찾아 집중하세요. 재구성 과정에서 드리프트를 보다 효율적으로 보정하기 위해 관심 핵 근처에 한두 개의 나노다이아몬드를 두는 것이 더 좋습니다.
3. (선택 사항) 저레이저 출력으로 밝은 시야장과 각 형광 채널의 회절 제한 스냅샷을 캡처합니다.
4. 2색 이미징을 수행할 때는 먼저 긴 파장 채널을 획득한 후 짧은 파장 채널로 전환하세요(즉, JF549 이전에 AF647 채널을 획득).
   참고: 이 연구에서 사용된 획득 매개변수의 예시:
   채널 A - 에피토프 표지 - AF647
   노출 시간: 20ms
   레이저 세기: 640 nm – 2.2 kW/cm²
   익시테이션 모드: HiLo²⁷
   채널 B - DNA 표지 - JF549-Hoechst
   노출 시간: 50ms
   레이저 세기: 561 nm - 1 kW/cm²
   흥분 모드: 에피네시
   기록된 이미지 수: 채널당 10,000-30,000개로, 프레임당 형광체 밀도가 충분히 낮아 단일 분자 정지가 가능하도록 보장하며, 누적 위치 수는 초해상도 QUantitative Image Rating and Reporting of Error Locations(SQUIRREL)²⁸을 사용해 실증적으로 결정했으며, 이는 충분한 프레임 수를 나타냅니다.

Results

위에서 설명한 프로토콜은 SMLM에 적합한 고품질 Arabidopsis thaliana 핵을 준비할 수 있게 합니다. 핵 무결성을 개선하고 이미지 품질을 저해하는 세포질 및 세포 잔해를 줄이기 위해 여러 차례 최적화가 수행되었습니다. 각 최적화 단계 후, 핵 준비물의 품질은 올림푸스 IX81 회전 디스크 현미경을 이용한 공초점 영상으로 평가된 후 초해상도 획득으로 진행되었습니다.

공초점 영상
위에서 설명한 절차는 실제로 공초점 영상과 호환됩니다. 이를 위해 3.1단계에서 사용되는 LMA 솔루션은 PBS(또는 어떤 중성 버퍼 또는 매질)를 기반으로 할 수 있습니다. MEA와 GLOX는 SMLM에만 필요합니다. 반면, SMLM(단계 3.3)에 사용되는 JF 기반 Hoechst는 기존 영상 기법으로는 검출할 수 없을 만큼 희석되어 있습니다. 따라서 공초점 또는 에피형광 영상을 위한 DNA 표지가 Hoechst H33258을 1/500...

Discussion

Arabidopsis thaliana 핵을 단일 분자 위치 현미경(SMLM)을 위해 준비하는 과정은 최종 샘플 품질에 큰 영향을 미치는 여러 중요한 단계를 필요로 합니다. 앞서 설명한 ^19,35, 완전한 핵 회복을 극대화하기 위해서는 철저하고 일관된 조직 절단이 필수적입니다. 표준 면도날 대신 미세절기 날을 사용하면 조직 조각이 더 깨끗하고 균일하게 이루어져 핵 방출이 개선됩니다. 이후 세척과 원심분리 과정도 잔해 감소에 똑같이 중요합니다. 이 단계는 신중하게 수행되며, 상원액은 200 μL 마이크로피펫으로 천천히 제거한 후 10 μL 마이크로피펫으로 진행하여 핵 손실을 최소화합니다. 펠릿이 특히 컴팩트할 경우, NIB 버퍼의 부유액을 200–250 μL로 늘리면 응집을 방지하고 더 균일한 현탁을 보장합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody	Abcam	ab5095	Primary antibody used at 1/200 dilution in immunostaining buffer to visualize the active form of the polymerase (Polyclonal antibody raised in rabbit )
Acquisition software	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Certified Low Melting Agarose	Bio-Rad	1613111
Coverslips thickness 1.5H round	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-Glucose, anhydrous, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Dichroic mirror	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Dichroic mirror for excitation/emission separation
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10´	biowest	X0515 - 500	Work in sterile conditions
Epredia Ultra Disposable Microtome Blades	FisherScientific	12191830	Low profile, single use
Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	Falcon	353046
Formaldehyde solution 37%	Carl Roth	7398	Work under the fume hood
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Glycerol	VWR	24388.295
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Used at 1/200 as secondary antibody coupled to AF647
Hoechst 33258 solution	Sigma-Aldrich	94403	Used at 1/500 to counterstain the DNA, added to the agarose pad
Hydrochloric Acid Solution	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia)	JF549-Hoechst	Used to counterstain DNA, added to the agarose pad at 1.5 nM final concentration
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	2 mL tube with both large (0.0030-0.0050 inch) and small (0.0005-0.0025 inch) clearance pestles
Lasers unit	Oxxius	L6Cc	Equipped with six lasers: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW and 730 nm - 30 mW
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	HN03
Mercaptoethylamine (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS sodium salt 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Multiband emission filter	Semrock	FF01-446/523/600/677	Multiband emission filtration to block laser scatter light
Nanodiamonds	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Stock 1 mg/mL
ORCA-Fusion Digital CMOS camera	Hamamatsu	C14440-20UP
Petri dish, 100/20 mm, PS, clear, with vents, sterile	Greiner Bio-One	664161	Used to grow plants on 1/2 MS medium
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile	Greiner Bio-One	688161	Used when chopping the plant seedlings
pluriStrainer Mini cell strainer	pluriSelect	43-10030-50	Mesh size 30 µm, suitable for 1.5 mL Eppendorf tube
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Single band emission filter	Semrock	FF01-698/70	Specific emission filter for AF647 channel
Single band emission filter	Chroma	ET600/50m	Specific emission filter for JF549 channel
Sodium chloride (99,5%)	Euromedex	1112-A
Star-Frost slides 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Sterile syringe filterø 33 mm porosity 0.2 µm Luer Lock cone	ClearLine	146560
Super-resolution system	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 equipped with 100x NA1.5 oil-immersion objective
Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO-33615.268
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodent	13001002	Silicone sealant
Ultraviolet Ozone cleaning system UVOCS oven	UVOCS Inc.	T10X10	20 min exposure for coverslip cleaning
Vacuum pump	Vacuubrand	VP 100C
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Scientific		Rotor TX-400 75003629. Centrifugation performed with Eppendorf tubes.