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방법 논문

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 쥐 골격근 및 골수에서 작은 세포외 소포 분리

207 조회수

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DOI:

10.3791/70894

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2026년 6월 23일

 ,  ,  , 
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, 3Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, 4Department of Psychiatry, McGill University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 효소 소화 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 소변 골격근과 골수에서 작은 세포외 소포를 분리하여 구조적으로 복잡하고 저수율 조직에서 소포 농축 분획을 재현 가능하게 회수하여 하위 분자 분석에 활용할 수 있도록 합니다.

초록

작은 세포외소포(sEVs)는 나노 크기의 지질 결합 입자로, 단백질, 지질, 리보핵산(RNA)의 전달을 통해 세포 간 통신을 매개합니다. 골격근(SkM)과 골수(BM)와 같은 고형 조직에서 sEV를 분리하는 것은 낮은 수율과 비소포성 성분에 의한 오염 때문에 여전히 어렵습니다. 이 프로토콜은 마우스 SkM과 BM에서 sEV를 분리하는 재현 가능한 워크플로우를 설명합니다. SkM은 효소적으로 소화되고, BM은 직접 가공된 후 차등 원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 거칩니다. SkM의 경우, 공공 부피(~2.5 mL)를 버리고, 이후 ~1.6 mL는 EV 농축 분획으로 수집되며, 일반적으로 400 μL 연속 분획(F1–F4)으로 세분됩니다. BM의 경우, 700 μL 공공 부피를 버리고, 이어서 ~850 μL EV 농축 분획을 수집하며, 이를 ~170 μL 순차적 분획(F1–F5)으로 세분하여 EV 마커 농축에 따라 풀링할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 sEV를 작은 조직 부피(단일 대퇴두근에서 약 500 μL, 대퇴골 및 경골 근육에서 약 150 μL)에서 분리할 수 있으며, 주로 200 nm <입자 직경의 ~10 8 입자·mL·1·1·mg−1 입자를 얻을 수 있습니다. 소포의 완전성과 순도는 투과 전자현미경, 나노입자 추적 분석, 웨스턴 블롯팅을 통해 표준 EV 마커를 검증하며, 단일 입자 간섭계 검출을 통한 추가 특성 분석으로 테트라스패닌 정의 소포 하위 집단을 정량합니다. 이 방법은 최소한의 투입 물질로 구조적으로 복잡한 조직에서 고순도 sEV를 재현 가능하게 하여 조직 유래 소포의 분자 및 기능 분석을 지원합니다.

서론

작은 세포외 소포(sEV)는 단백질, 지질, 핵산의 전달을 통해 세포 간 통신을 매개하는 나노 크기의 지질 결합 입자입니다. 이들은 모든 세포 유형에서 방출되며, 사실상 모든 생물학적 액체에 존재하며, 펩타이드와 미세 리보핵산(RNA)을 포함한 생체 활성 화물의 주요 운반자 역할을 합니다2. 이들의 화물은 선택적으로 분류되어 특정신호를 정밀하게 전달할 수 있으며, 소포 구조 덕분에 자유분비 인자의 일반적인 구배와 희석 제약을 우회하여 농축된 분자 페이로드를 장거리 전달할 수있습니다. 바이오플루이드(예: 혈장, 혈청, 타액)에서 나오는 EV는 전신 신호전달의 편리한 스냅샷을 제공하지만, 여러 조직에서 기원한 매우 혼합된 집단을 대표합니다5. 이로 인해 특정 생물학적 신호를 생성하는 기관이 무엇인지, 또는 조직 수준에서 EV 통신이 어떻게 조절되는지 파악하는 것이 어렵습니다. 순환 EV가 함께 모여 있기 때문에 조직 특이적 변화가 희석되거나 가려져 신호의 진정한 출처를 식별하는 능력이 제한됩니다6.

골격근(SkM)과 골수(BM)는 대사 및 기능적으로 활동적인 주요 조직으로, 세포 구성과 신호 전달 역할이 뚜렷합니다 7,8. 두 조직 모두 고유한 조직 특이적 화물이 풍부한 EV 집단을 방출할 수 있습니다; 그러나 이러한 신호는 면역 세포와 같은 고회전 조직에서 나오는 EV에 의해 플라즈마에서 쉽게 가려질 수 있습니다 8,9. 근육이나 대모에서 직접 EV를 분리하면 민감도를 높이고, 순환 중 관찰되지 않는 미묘하고 조직 특이적 적응을 감지할 수 있습니다. 따라서 조직 유래 EV는 특정 장기가 EV를 방출하는 시기, 그 신호가 얼마나 오래 지속되는지, 그리고 어떤 적응이 급성인지 만성인지 보여주는 필수적인 보완적 정보를 제공합니다. EV에 대한 관심이 높아지고 있음에도 불구하고, 대부분의 확립된 격리 방법은 바이오플루이드(예: 혈장과 혈청)나 세포 배양 시스템에 개발되었습니다. 이러한 맥락에서 전기차는 비교적 높은 수율과 최소한의 구조적 파괴로 얻을 수 있습니다. 그러나 SkM과 BM과 같은 고체 조직에서 전기차를 직접 분리하는 것은 기술적으로 상당한 도전 과제를 제시합니다. 이 조직들은 구조적으로 복잡하고 이질적이어서, 기계적 또는 효소적 해리 단계가 필요하며, 이로 인해 높은 수준의 용해성 단백질, 소기관 조각, 비소포성 나노입자 등 인공물을 유발할 수 있어 고순도 EV 제제를 달성하기 어렵습니다.

조직 유래 EV 분리의 또 다른 주요 과제는 분획 정의와 분리10에 대한 표준화된 워크플로우가 부족하다는 점입니다. 차등 원심분리만으로는 단백질 응집체와 큰 소포가 함께 분리되는 경우가 많으며, 초원심분리 기반 방법은 널리 사용되지만 로터 종류와 실험 조건에 따라 소포 응집, 변형, 변성 회복을 초래할 수 있습니다. 밀도 구배 방식은 순도를 향상시키지만 시간 소모적이고 처리량이 적으며 실험실 간 표준화가 어렵습니다11. 따라서 현재 고순도와 일관된 수율을 가진 고형 조직에서 소형 EV를 분리하는 데 최적화된 널리 채택되고 재현 가능한 방법은없습니다.

크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 크기에 따라 입자를 분리하여 고원심력을 가하지 않기 때문에 EV 격리에 유망한 대안으로 떠올랐습니다. SEC는 소포의 무결성과 생물학적 기능을 유지하면서 소액 EV를 용해성 단백질과 저분자량 오염물질에서 효율적으로 분리할 수 있게 합니다. 특히, SEC는 용출 분획의 명확한 정의를 가능하게 하여 EV 농축 분획의 재현 가능성을 높이고 실험 간 일관성을 향상시킵니다.12. 그러나 SEC 워크플로우는 특히 상류 조직 처리, 잔해 제거, 분획 수집과 관련하여 조직 유래 샘플에 대해 세심한 최적화가 필요합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 SkM과 BM으로부터 sEV를 분리하기 위한 재현 가능하고 표준화된 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 섬유 조직에 대한 제어된 효소 소화, 잔해 제거를 위한 차동 원심분리, 그리고 SEC 기반 정제를 통합하여 고순도 소포를 분리합니다. 이 워크플로우는 세포 내 구성 요소로부터의 오염을 최소화하면서도 소포의 무결성을 유지하고 저수율 조직에서 일관된 회복을 가능하게 하도록 특별히 최적화되어 있습니다.

이 프로토콜은 나노입자 추적 분석(NTA), 표준 EV 마커의 서부 블롯팅, 형태학적 평가를 위한 전자현미경, 항체 포획, 간섭계 크기 측정, 다중 채널 형광 영상을 이용한 단일 입자 EV 분석을 통해 명확한 분획과 검증된 순도를 가진 조직 유래 sEV를 분리하는 실용적이고 확장 가능한 접근법을 제공함으로써 중요한 방법론적 공백을 메운다. 특히 생물체유체 유래 소포만으로는 신호의 세포 기원을 규명하기에 충분하지 않은 조직 특이적 EV 분석이 필요한 연구에 적합합니다. 연구자들은 오염이 최소화되고 소포 완전성을 보존한 고형 조직에서 고순도 sEV를 얻는 것이 목표일 때 이 방법을 사용해야 합니다. 반면, 순도가 덜 중요하고 밀도 구배 방식을 선택할 때는 밀도 구배 방식을 선택할 수 있으며, 순도가 덜 중요하고 밀도 구배 방식을 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 조직 유래 sEV의 분리 및 특성화를 위한 표준화된 프레임워크를 제공하여 분자, 생화학, 기능 분석을 재현 가능하게 합니다.

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프로토콜

모든 동물 시술은 맥길 대학교 동물 관리 위원회(DOUG10029)의 승인을 받았으며, 캐나다 동물 관리 위원회의 지침에 따라 진행되었습니다.

1. SkM 기반 sEV(SkM-sEV) 격리 프로토콜

  1. 샘플 채취 및 조직 해리
    1. 조직 채취 및 보존
      1. 절제 직후 미리 냉각된 메틸부탄에 담근 SkM 조직을 급동합니다.
        참고: 미리 냉각된 메틸부탄을 준비할 때는 메틸부탄 용기를 드라이아이스 목욕에 넣고 점차 작은 드라이아이스 조각을 액체에 직접 넣으세요. 용액이 식을 때까지 기다려 두면, 온도는 보통 −70°C에서 −80°C 범위 내에 있습니다. 사용 중에는 온도를 유지하기 위해 메틸부탄을 드라이아이스 욕조에 보관하세요. 조직을 완전히 동결할 때까지 약 3–4초간 담그며, 완전히 조직이 경화되고 유연성이 상실되는 것을 나타냅니다.
      2. 조직을 냉동장치로 옮겨.
      3. 샘플을 드라이아이스 위에 올려놓으세요.
        참고: 샘플은 추가 처리 전까지 −80°C에서 보관하세요. 반복되는 냉동-해동 사이클을 피하세요. 샘플이 적절히 밀봉되면 급속 냉동은 전기차를 효과적으로 보존합니다. 조직이 노출되거나 여러 번의 동결-해동 사이클을 거치면 탈수 또는 소포 손상이 발생할 수있습니다.
    2. 조직 해리
      참고: 생물안전 캐비닛 내 모든 단계를 멸균 기기와 장갑을 사용하여 EV 순도를 저해할 수 있는 오염을 방지하세요.
      1. 조직 무게 측정
        1. 핀셋을 70% 에탄올로 소독하고 자연 건조시키세요.
        2. 냉동 조직을 미리 무게가 측정된 현탁 배양 접시에 옮깁니다.
        3. 조직을 밀리그램 밸런스(일반적으로 마우스의 나이와 성별에 따라 ~80–120mg)로 무게를 재세요.
          참고: 프로토콜은 ~80–120 mg의 입력 조직 질량에 대해 검증되었습니다. 이 범위 내의 샘플은 1.2.3.1, 1.3.1.3, 1.3.2.1 단계에서 지정한 시약 부피를 수정 없이 사용하세요. 이 범위를 벗어난 샘플의 경우, RPMI-1640, 콜라겐제 D, DNase I의 검증된 비율(1000:40:4 μL/100 mg 조직)을 유지하면서 모든 시약 부피를 조직 질량에 비례하여 조절합니다. 이는 조직당 약 10 μL RPMI-1640, 0.4 μL 콜라겐제 D(100 mg/mL 스톡), 0.04 μL DNase I(20,000 U/mL 스톡)에 해당합니다. 최종 반응 내 효소 농도를 보존하기 위해 이 비율을 유지하세요. 80–120mg 범위 밖에서 상당한 작업에서 소화 효율과 EV 수율은 경험적으로 검증되어야 합니다.
        4. 샘플을 미리 냉각된 튜브에 다시 넣고 얼음 위에 보관하세요.
      2. 효소 준비
        1. 콜라겐제 D(100 mg/mL 스톡)와 DNase I(20,000 U/mL 스톡)의 해동 알리코트를 얼음 위에 올립니다(효소 스톡 준비는 보충 파일 1, Step 1.4 참조). 이 효소들은 1.3.2.1단계에서 첨가되어 최종 반응 농도인 3.8 mg/mL 콜라겐제 D와 77 U/mL DNase I를 달성합니다. 최종 소화 부피는 1.044mL입니다.
        2. DNase I을 부드럽게 반전시켜 섞으세요. 소용돌이 하지 마세요.
      3. 소화를 위한 조직 준비
        1. 멸균 현탁 배양 접시에 800 μL RPMI-1640을 얼음 위에 올려놓습니다.
        2. 조직을 접시로 옮기세요.
        3. 멸균 일회용 메스를 사용해 조직을 대체로 균일한 크기(면당 2–3mm)의 6–8조각으로 잘라냅니다. 절단 시 멸균 겸자로 조직을 안정시켜 균일한 파편화를 보장합니다. 샘플 간 일관성을 유지하기 위해 샘플당 1분 이내에 이 단계를 완료하세요.
        4. 시술 내내 접시를 얼음 위에 올려 열쇠를 최소화하세요.
    3. 조직 전달 및 효소 소화
      1. 조직 이식
        1. 멸균된 P1000 피펫 팁의 끝을 멸균 블레이드로 다듬어 직경 2–3mm의 개구부를 만들어 1.2.3.3단계에서 생성된 조직 조각이 자유롭게 통과할 수 있도록 합니다.
          참고: 또는 표준화된 개구부(일반적으로 ~2–3mm 내경)를 제공해 수동 트리밍과 관련된 변동성을 없애는 상업용 광구경(넓은 오리피스) 1mL 피펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다.
        2. 조직 조각과 RPMI-1640 배지를 수정된 팁이 장착된 P1000 피펫을 사용해 사전 표지된 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 잔류 조각과 배지를 회수하기 위해 2–3회 연속 흡입을 수행합니다. 이식 후 접시와 피펫 팁을 육안으로 점검하고, 남은 조직이 보이지 않도록 멸균 겸자를 사용해 옮기세요.
        3. 각 튜브에 RPMI-1640 200 μL을 추가합니다.
      2. 효소 소화
        1. 얼음 위에 해동한 알리코트를 각 튜브에 40 μL 콜라겐제 D 스톡(100 mg/mL)과 4 μL DNase I 스톡(20,000 U/mL)을 추가합니다. 최종 반응 농도는 콜라겐제 D 3.8 mg/mL와 DNase I 77 U/mL 수준입니다. 80–120mg 범위 밖의 조직 샘플의 경우, 1.2.1.3 단계에 따른 NOTE 설명에 따라 효소 부피를 비례적으로 조절합니다.
          참고: 이 부피들은 일반적인 80–120 mg 범위 내 조직 질량에 맞춰 보정되었습니다. 이 범위를 벗어난 조직 질량의 경우, 1.2.1.3 단계 이후 NOTE에 설명된 대로 모든 시약 부피를 비례적으로 조절하세요(조직당 0.4 μL 콜라게나제 D 재고와 0.04 μL DNase I 재고). 이는 조직 질량과 관계없이 동일한 최종 반응 효소 농도를 유지합니다.
        2. 여러 샘플을 처리할 때는 효소를 모든 샘플에 동시에 첨가하세요.
        3. 효소 첨가 중에는 튜브를 얼음 위에 보관하세요.
        4. 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞으세요. 소용돌이 하지 마세요.
        5. 튜브를 37°C에서 튜테이션 믹서(24rpm, 20° 기울기; 재료표 참조)에서 30분간 인큐베이팅합니다. 부화 중에는 고르게 섞이도록 하세요.
          참고: 각 샘플을 총 1.044 mL(1000 μL RPMI-1640, 40 μL 콜라겐제 D, 4 μL DNase I; 완충 대 콜라겐제 비율 ~25:1)로 소화하세요.
    4. 잔해 제거
      참고: 첫 번째 원심분리 시작 시 SEC 컬럼 평형화를 시작하세요(Step 1.4.1.1). SEC 컬럼은 플러싱과 평형화에 20–25분이 소요됩니다. 이 시점에서 평형을 시작하면 여과 단계(Step 1.4.3) 완료 직후 컬럼이 시료 적재 준비가 완료됩니다.
      1. 첫 번째 원심분리
        1. 300 × g에서 4°C에서 10분간 원심분리하여 소화되지 않은 잔해, 온전한 세포, 남은 조직 조각을 펠릿으로 제거합니다.
        2. 상원액을 펠릿을 방해하지 않고 새로운 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 조심스럽게 옮기세요.
      2. 두 번째 원심분리
        1. 샘플을 2,000 × g에서 4°C에서 15분간 원심분리하여 큰 잔해, 죽은 세포, 세포자멸 시체, 큰 소포를 펠릿으로 제거하세요.
        2. 상원액을 펠릿을 방해하지 않고 새로운 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 조심스럽게 옮기세요.
          참고: 두 번째 원심분리는 선택 사항이며, 추가 잔해 제거가 필요할 때 포함되어야 합니다. 첫 번째 원심분리 후 상원액이 눈에 띄게 탁하거나 잔류 입자가 있을 경우 이 단계를 수행하세요. 이 단계는 이전 제제에서 EV 농축 SEC 분획에서 세포내 마커(예: 칼넥신 또는 BiP)에 의해 오염되었거나, 투과 전자현미경에서 비소포성 입자가 존재하는 경우에도 권장됩니다. 이 단계의 필요성은 각 조직 유형에 대한 초기 프로토콜 최적화 시 검증되어야 합니다.
      3. 여과
        1. 사전 습식 멸균 30 μm 세포 체를 RPMI-1640으로 헹구어 막을 평형화하고 샘플 손실을 최소화합니다. 가수액은 버리세요.
        2. 각 샘플을 미리 젖힌 30 μm 세포 체를 통해 멸균 저단백질 결합 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 넣어 SEC 전에 남은 세포 잔해와 큰 입자를 제거합니다.
        3. 샘플이 중력에 의해 필터를 통과하도록 허용하세요.
        4. 샘플당 10–15분을 여과하세요.
          참고: 여과는 필터 막 위에 보이는 액체가 남아 있지 않고 수집관 내 여과물 부피가 안정화될 때 완료됩니다. 여과가 느리거나 멈춘다면 잔류 이물질로 인한 막힘을 나타낼 수 있습니다; 이럴 때는 명료화 단계를 반복하거나 샘플 부하를 줄이는 것을 고려하세요.
        5. 550–600 μL의 여과된 상청액을 수집하여 SEC 컬럼에 추가 부하를 제공합니다. 샘플 간 일관성을 위해 회수된 총 부피와 상관없이 각 컬럼당 500 μL로 적재 부피를 정규화합니다(2.2.1 단계 참조).
  2. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
    1. 균형 SEC 열
      참고: 가능하다면 원심분리 중에 이 단계를 수행하세요.
      1. SEC 컬럼을 1× PBS(0.22 μm 여과) 17mL로 세척합니다.
      2. 전체 부피가 중력에 의해 컬럼을 통과하도록 허용하며, 예상 유량은 분당 0.75 mL(17 mL 플러시 부피는 총 20–25분)로 설정됩니다. 유량이 빠르거나 느려지면 컬럼의 평형 상태가 부적합하거나 막힘을 나타낼 수 있습니다.
      3. 평형 상태에서는 컬럼과 PBS를 실온(RT, 21°C ± 2°C)으로 유지하여 일정한 유량과 최적의 컬럼 성능을 보장합니다.
      4. 모든 분획을 채취하기 위해 저단백 결합 1.5 mL 미세원심분리관을 준비합니다.
      5. 필요하다면 공허 부피를 수집할 추가 튜브를 준비하세요.
    2. 샘플 로딩 및 용출
      1. 여과된 상청액 500 μL를 SEC 컬럼에 주입하세요.
      2. 샘플이 완전히 수지에 들어가도록 하세요. 액체 반월판이 수지 바닥 표면에 도달할 때 도달하며, 수지 위에 액체가 보이지 않고 수지는 눈에 보아 젖은 상태를 유지합니다.
      3. 반월판이 수지 표면 아래로 떨어지거나 컬럼이 마르게 하지 마세요. 이는 공기가 수지 베드에 유입되어 용출을 방해합니다. 액체 반월판이 수지 표면에 도달하면(2.2.2단계에서 정의됨), 즉시 지체 없이 2.2.4단계로 진행하세요.
      4. 즉시 2mL PBS를 추가하여 용출을 시작하세요.
      5. 공공 부피(~2.5 mL)를 수집합니다.
      6. 공허 부피를 버리거나 비전기(non-EV) 비율로 유지하세요.
      7. 2.5 mL 공공 부피가 용출된 직후 EV 농축 분획을 수집하기 시작하세요.
      8. 공공 부피 후 총 1.6mL의 EV 농축 용액을 수집하는데, 이는 한 튜브에 단일 연속 분획 또는 이후 순차적으로 모아질 수 있습니다.
      9. 또는 순도와 수율 대비 최적화를 위해 0.4 mL의 순차적 분획을 수집할 수도 있습니다. 더 높은 순도가 필요할 때(예: 단백질체 분석이나 민감한 하류 응용 분야) 더 작은 분획이 권장되며, 전체 EV 수율 극대화를 위해 더 큰 분획을 사용할 수 있습니다.
      10. EV 농축 분획을 특성화 방법(예: EV 마커 및 오염물질에 대한 웨스턴 블롯, NTA)을 사용하여 평가하고, 특성화 섹션에서 정의된 대로 EV 농축 분획을 통합합니다.
        참고: 칼럼을 계속 이어가세요. 한 분획이 마무리될 때는 PBS를 추가해 수지 베드 위에 일정한 액체를 유지하고 컬럼이 마르지 않도록 합니다. 저단백질 결합, 뉴클레아아제 없는 튜브를 사용해 채취하세요.
    3. 집중
      1. 원심 필터(100 kDa 분자량 차단 [MWCO])를 사용하여 EV 샘플을 농축하여 후속 응용(예: RNA 시퀀싱, 단백질체학, 웨스턴 블롯)에 적합합니다.
      2. 사용 전에 PBS로 필터를 미리 헹구세요.
      3. 4°C에서 4,000 × g 원심분리하여 원하는 최종 부피(일반적으로 50–100 μL)에 도달할 때까지 2–3분마다 검사합니다. 높은 농도가 필요한 경우에는 최종 부피가 낮음(예: ~50 μL)을, 회수를 극대화하는 경우에는 더 큰 부피(예: ~100 μL)를 사용하세요.
        주의: 목표 부피에 도달하면 원심분리를 중단하여 과농도를 피하세요.
      4. 부드럽게 피펫팅하여 잔류물을 회수하세요.
      5. 필요하다면 회수를 추정하기 위해 농축 전후 샘플 부피를 기록하세요. NTA는 가능하다면 농도 전후의 입자 농도를 평가하는 데 사용될 수 있습니다.
    4. 저장
      1. EV 농축 분획은 얼음 위나 4°C에서 즉시 분석(예: NTA 및 투과 전자현미경[TEM])을 유지하고, TEM은 24시간 이내, NTA는 48시간 이내에 처리하세요.
      2. Aliquot EV 샘플을 저단백질 결합 튜브에 보관합니다.
      3. 장기 사용을 위해 샘플은 −80°C에서 보관하세요.
      4. 반복되는 냉동-해동 사이클을 피하세요.

2. BM 기반 sEV(BM-sEV) 격리 프로토콜

  1. 샘플 채취 및 조직 해리
    1. 조직 채취 및 보존
      1. 절제 직후 뼈를 급동시키지 마세요. 이는 골수를 굳히고 관을 찔러 추출하는 데 어려움을 줍니다. 대신, 3.1.1.4단계(−80°C 저장 전 드라이아이스 위에 올려놓기)에 설명된 대로 가공 또는 냉동 전에 짧은 취급 기간 동안 뼈를 얼음 위에 보관하거나 4°C에서 보관하세요.
      2. 해리된 뼈에서 주변 근육과 결합 조직을 제거하세요.
      3. 뼈를 냉동장치로 옮겨.
      4. 샘플을 드라이아이스 위에 올려놓으세요.
        참고: 샘플은 추가 처리 전까지 −80°C에서 보관하세요.
    2. 기질 처리
      참고: 생물안전 캐비닛 내 모든 단계를 멸균 기기와 장갑을 사용하여 EV 순도를 저해할 수 있는 오염을 방지하세요.
      1. 재료를 넣기 전에 1.5 mL 원심분리관을 미리 무게 측정하고 라벨을 붙이세요. 추출 전후의 튜브 무게를 비교하여 BM 질량을 계산하세요.
      2. 0.2mL PCR 튜브(캡 그대로)를 1.5mL 원심분리관에 꼭 맞게 삽입하여 조성합니다. 멸균된 16G 바늘을 바닥에 수직으로 잡아 0.2 mL 튜브 바닥을 한 번 찔러 직경 ~1.6 mm의 균일한 천공을 만듭니다. 한 다리당 한 번씩 한 번씩 준비하세요.
      3. 다리를 모든 근육과 주변 조직을 깨끗이 제거한 상태로 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
      4. 관절 공간을 절단하여 대퇴골과 경골을 분리하세요.
      5. 대퇴골과 경골 양 끝을 잘라 적골수를 드러내세요. 뼈를 1.5mL 튜브 안에 위치한 구멍이 뚫린 PCR 튜브에 넣고, 원심분리 과정에서 안전하게 설치되도록 파라필름으로 조립체를 밀봉합니다.
      6. 샘플을 약 8,000 × g, 즉 장비에서 가능한 가장 가까운 온도에서 상온에서 10초간 원심분리합니다.
      7. 골수 추출 성공 여부는 세 가지 기준으로 검증합니다: (i) 뼈가 눈에 띄게 흰색이며 적골수 잔류가 없음, (ii) 하단 튜브 내 펠릿은 짙은 붉은색으로 단단하여 일반적으로 1.5 mL 튜브의 원뿔형 끝을 채우는 것, (iii) 측정된 골수 질량(Step 3.1.2.9)이 마우스 한 마리당 예상 범위 ~15–30 mg 내에 속함.
      8. 뼈를 재배치하거나 다시 절단한 후 적골수가 보이면 짧은 회전 과정을 반복하세요.
      9. 다시 튜브를 무게 재서 추출한 골수의 질량을 확인하는데(일반적으로 샘플당 약 15–30 mg, 쥐의 나이, 성별, 추출 효율에 따라 다릅니다).
        참고: 이 프로토콜은 샘플당 ~15–30 mg의 골수 수량에 대해 검증되었습니다. RPMI-1640 부유액은 골수 질량과 관계없이 250 μL로 일정하게 유지되기 때문에(단계 3.1.2.10), EV 수율은 후속 분석 시 측정된 시작 골수 질량(입자·mL−1·mg−1 조직)에 정규화됩니다. 15 mg 미만의 샘플은 동요 전에 동일한 나이, 성별, 뼈를 가진 마우스의 골수를 채취하여 후속 특성 분석을 위한 충분한 입력을 유지해야 합니다. 30 mg을 상당히 초과하는 샘플의 경우, 골수를 각각 250 μL씩 두 번의 별도 재현탁에 나누거나, RPMI-1640 부피를 비례적으로(골수당 ~12.5 μL 비율) 조정하여 불완전 부유를 방지합니다; 어느 경우든 분석 시 동일한 질량당 정규화를 적용하세요.
      10. 각 튜브에 250 μL RPMI-1640을 추가하세요. 골수 질량과 상관없이 샘플 간 일정한 부피를 유지하여 EV 수율을 시작 골수 질량에 맞게 정규화할 수 있도록 하세요. 샘플은 얼음 보관하세요.
      11. P1000 피펫을 사용해 골수를 부드럽게 위아래로 10–15회 재현탁하여 현탁액이 눈에 보이는 균일함과 보이는 덩어리나 온전한 조직 조각이 남지 않을 때까지 반복합니다. 과도한 피펫팅이나 기포 형성은 소포의 무결성을 방해할 수 있으므로 피하세요.
  2. 잔해 제거
    1. 첫 번째 원심분리
      1. 300 × g에서 4°C에서 10분간 원심분리하여 소화되지 않은 잔해, 온전한 세포, 남은 조직 조각을 펠릿으로 제거합니다.
      2. 상원액을 펠릿을 방해하지 않고 새로운 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 조심스럽게 옮기세요.
    2. 두 번째 원심분리
      1. 샘플을 2,000 × g에서 4°C에서 15분간 원심분리하여 큰 이물질을 제거하세요.
      2. 상원액을 펠릿을 방해하지 않고 새로운 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 조심스럽게 옮기세요.
    3. 세 번째 원심분리
      1. 샘플을 10,000 × g에서 4°C에서 30분간 원심분리하여 세포자멸 세포와 큰 소포를 제거합니다.
      2. 상원액을 펠릿을 방해하지 않고 새로운 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 조심스럽게 옮기세요.
      3. 최종 부피가 200 μL의 상정액을 얻도록 합니다.
  3. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
    1. 컬럼 준비
      1. SEC 컬럼을 1× PBS 6mL(0.22 μm 여과)로 세척하여 평형을 맞추세요.
        참고: 평형 부피는 열별로 다르며, 재료표에 나열된 열의 유형과 일치해야 합니다. 이 컬럼은 SkM 샘플에 사용되는 컬럼과 달리 6 mL의 평형 부피가 필요합니다.
      2. 전체 부피가 중력에 의해 통과하도록 허용하세요.
      3. 최적의 유량과 컬럼 성능을 보장하기 위해 평형 상태에서 컬럼과 PBS를 RT 상태로 유지하세요.
    2. 샘플 로딩 및 용출
      1. 여과된 상정액 150μL를 SEC 컬럼에 주입합니다.
      2. 샘플이 완전히 수지에 들어가도록 하세요. 끝점은 액체 반월판이 수지 베드 표면에 도달할 때 수지 위에 보이는 액체가 남아 있지 않고 수지는 젖은 상태로 유지되는 시점입니다(2.2.2단계에서 설명됨).
      3. 반월판이 수지 표면 아래로 떨어지거나 컬럼이 마르게 하지 마세요(3.3.2.2단계에서 정의된 종점 참조). 이는 수지 베드에 공기를 유입시키고 용출을 방해합니다. 액체 반월판이 수지 표면에 도달하면 즉시 지체 없이 3.3.2.4단계로 진행하세요.
      4. 즉시 550 μL PBS를 추가하여 용출을 시작한다.
      5. 공허 부피(700 μL)를 수집합니다.
      6. 공허 부피를 버리거나 비전기(non-EV) 비율로 유지하세요.
      7. 700 μL 공공기합이 용출된 직후 EV 농축 분획을 수집하기 시작하세요.
      8. 700 μL 공공 부피 후 850 μL EV 농축 용액을 수집합니다.
      9. 또는 순도와 수율을 최적화하기 위해 약 170 μL 단위의 순차적 분획을 수집할 수도 있습니다.
        참고: 더 높은 순도가 필요한 경우(예: 단백질체 분석이나 민감한 하류 응용)에는 더 작은 분획이 권장되며, 전체 EV 수율 극대화를 위해 더 큰 분획을 사용할 수 있습니다.
      10. EV 마커 분획을 평가하고 필요에 따라 EV 농축 분획을 모으세요.
        참고: 칼럼을 계속 이어가세요. 한 분획이 마무리될 때는 PBS를 추가해 수지 베드 위에 일정한 액체를 유지하고 컬럼이 마르지 않도록 합니다.

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결과

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토론

이 프로토콜은 SkM과 BM, 두 가지 저수율 및 매우 이질적인 조직에서 sEV 농축 물질을 직접 분리하는 견고하고 재현 가능한 접근법을 설명합니다. 바이오플루이드와 세포 배양 시스템에서 EV 분리는 잘 확립되어 있지만, 조직 해리, 세포 내 물질 오염, 수율 변동성 등으로 인해 조직 유래 EV에 대한 표준화된 방법은 여전히 제한적입니다. 여기서는 EV 순도, 수율, 재현성에 영향을 미치는 주요 단계, 문제 해결 전략, 제한 사항을 개괄하며, SkM 및 BM 준비에 대한 구체적인 고려사항을 설명합니다. 본 연구에서 EV 농축된 분획은 표준 EV 마커 농축, 세포 내 오염물질의 최소 검출, 예상되는 SEC 용출 프로필과의 일치 등 여러 보완 기준에 따라 운영적으로 정의되었습니다10. 따라서 초기 분획(SkM의 F1–F4, B의 F1–F5)이 후속 분석에 선택되었고, 이후 분획은 EV 마커가 계속 존재했으나 단백질 함량 증가와 세...

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공개 사항

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

기술 지원과 유익한 토론을 제공해 주신 Jennie Yang, 다리우시 주라웩, 볼로디미르 예르코에게 감사드립니다. 응용 나노의학 센터 플랫폼, 특히 나딤 타윌과 로라 몬테르미니의 도움을 받아 세포외 소포 특성 분석과 데이터 수집에 감사드립니다. 또한 쥐 취급을 도와주신 동물 시설 직원 가일레인 가두리와 타라 톰슨께도 감사드립니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 원심분리 튜브Sarstedt72.690.300프로토콜 전반에 사용되는 일반 마이크로원심분리 튜브
1.5 mL 저단백질 결합 튜브Sarstedt72.706.600EV 취급, SEC 분획 회수 및 저장에 사용
0.2 mL PCR 튜브Fisher Scientific14-222-262파켓-튜브 골수 추출 설정에 사용
16 G 바늘BD3051970.2 mL PCR 튜브를 뚫는 데 사용
30 µm 세포 여과기Miltenyi Biotec 130-098-458골격근 샘플 여과에 사용
70% 에탄올Sigma-Aldrich1.11727핀셋 소독에 사용
바이오안전 캐비닛NANA무균 조직 취급에 사용
뼈 절단 도구Fisher Scientific10-001-976대퇴골과 경골을 분리하고 골수를 노출시키는 데 사용
우청백질(BSA)BioShopALB001웨스턴 블롯 블록킹 및 항체 희석에 사용
염화 칼슘 이수화물(CaCl2·2H2O)BioShopCCL302HEPES 버퍼 준비에 사용
탄소 코팅 구리 그리드, 200-메시Sigma-Aldrich930342TEM 샘플 준비에 사용
원심 필터, 100 kDa MWCOMilliporeSigmaUFC810096EV 농축에 사용
콜라게나제 DRoche11088858001골격근 효소 소화에 사용
크리오바이얼Sarstedt72.690.300조직 및 골수 저장에 사용
디이온화수(초순수)NANA버퍼 준비 및 TEM 세척 단계에 사용
DNase IRoche11284932001골격근 효소 소화에 사용
드라이아이스NANA샘플 냉각 및 운송에 사용
엔한스드 화학발광 기질Biorad1705061웨스턴 블롯 검출에 사용
필터 유닛, 0.22 µmSarstedt83.3941.501해당되는 경우 PBS 필터에 사용
포스셉/핀셋MilliporeSigmaF3892조직 취급에 사용
글루타르알데하이드NANATEM 고정에 사용
글리신NANATEM 그리드 세척 단계에 사용
Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)Gibco14175-095DNase I 스톡 준비에 사용
HEPESBioShopHEP001.500HEPES-NaOH 버퍼 준비에 사용
호박 과산화물 결합 스트렙타비딘Thermo FisherS911웨스턴 블롯 검출에 사용
화학발광 이미징 시스템Biorad12003153웨스턴 블롯 멤브레인 이미지화에 사용
KClBioShopPOC308HEPES 버퍼 준비에 사용
염화 마그네슘(MgCl2)BioShopMAG510.500HEPES 버퍼 준비에 사용
2-메틸부탄Thermo Fisher78-78-4골격근 스냅 동결에 사용
밀리그램 저울MilliporeSigmaZ741359조직 및 골수 무게 측정에 사용
NaClBioShopSOD004.1HEPES 버퍼 준비에 사용
나노입자 추적 분석 기기Malvern PanalyticalNanoSight NS300입자 크기 및 계수에 NanoSight NS300 사용
NaOHBioShopSHY500.500pH 조절에 사용
니트로셀룰로스 멤브레인BioRad1704271웨스턴 블롯 전이에 사용
뉴테이팅 믹서Labnet S0500효소 소화 중 사용
P1000 피펫MilliporeSigmaFA10006M-1EA조직 전달에 사용
피펫 팁, 1 mLSarstedt70.3050.275조직 단편 전달을 위해 팁이 잘려 구멍이 넓어짐
인산염 완충 생리 용액(PBS)WisentINC 811.012-FL프로토콜 전반에 사용; SEC ��

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