$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
이 연구는 허베이 종합병원 윤리위원회(승인 번호: 2025-LW-0265)의 승인을 받았습니다. 연구의 사후 특성상 윤리 승인은 데이터 수집 기간이 끝난 후 익명화된 임상 데이터를 사용한 비중재 연구 위원회의 승인을 받았습니다. 서면 동의 요건은 면제되었습니다.
참가자 선발
잠재 참가자들은 2022년 7월부터 2024년 5월까지 허베이종합병원 신장내과에서 모집되었습니다. 모든 환자는 사전 정해진 포함 및 제외 기준에 따라 선별 검사를 받았습니다.
포함 기준은 다음과 같았습니다: Mogensen 3기23에서 당뇨성 신병증(DN) 진단을 받았으며, 이는 3–6개월 동안 채취된 3개 소변 샘플 중 최소 2개 이상에서 30–300 mg/g의 요로 알부민 대 크레아티닌 비율(UAlb/UCR)을 가진 지속성 알부민뇨로 정의되며, 혈뇨 또는 비당뇨성 신장 질환을 시사하는 급격한 신장 기능 저하가 없음; 추정 사구체 여과율(eGFR) ≥45 mL/분/1.73 m2 , CKD-EPI 방정식을 사용해 계산); 비타민 D, 프로부콜 또는 DN 면역억제제 치료가 전혀 없으면서 DN 최초 진단; 나이 <75세; 그리고 등록 4주 전 4주 이내에 급성 케톤산증, 고혈당 고침투구 상태와 같은 급성 당뇨병증 합병증 없이, 임상적으로 안정적인 상태여야 합니다. 신장 생검은 등록 시 필요하지 않았습니다. 그러나 활동성 소변 침전물, 급속히 진행되는 사구체신염, 전신 자가면역 질환 등 의심되는 비당뇨성 신장 질환 환자는 제외되었습니다.
제외 기준에는 악성 종양, 중증 심혈관 질환, 자가면역 질환과 같은 심각한 전신 질환이 포함되었습니다; 비타민 D, 프로부콜, 발사르탄, 아토르바스타틴 또는 인슐린에 대한 알려진 알레르기; 임신 또는 수유; 그리고 4주 이내에 연구 결과에 영향을 줄 수 있는 약물(면역억제제 또는 코르티코스테로이드 포함)을 최근에 사용한 경우.
그룹 배정
선별 의사는 자격 확인 때까지 최종 그룹 배정에 대해 눈가림 상태였습니다.
연령, 성별, 당뇨병 및 DN 지속 기간, 고혈압 또는 고지혈증 병력 등 기초 인구통계학적 및 임상 특성이 기록되었습니다.
이 연구는 사후적 비무작위 대조 설계를 사용했습니다. 선택 편향을 최소화하고 시간적 변화 및 의사 관련 변동성 등 잠재적 교란 요인을 해결하기 위해, 그룹 배정은 의사나 환자 선호가 아닌 입원 순서에 따라 이루어졌습니다.
2022년 7월부터 2023년 12월까지 입원한 환자들은 발사르탄, 아토르바스타틴, 프로부콜로 구성된 표준 3병 요법을 받고 대조군에 배정되었습니다(n = 56). 2024년 1월부터 2024년 5월 사이에 입원한 환자들 중 4중 요법(발사르탄, 아토르바스타틴, 프로부콜, 비타민 D)을 받은 환자들은 관찰 그룹에 배정되었습니다(n = 94).
관찰군 환자 수가 증가한 것은 2024년 초부터 연구 센터에서 보조 비타민 D 치료의 임상 적용이 증가한 결과로, 새로운 증거에 따른 것입니다. 기초 인구통계학적 및 임상 특성은 그룹 간 유사했습니다(표 1; P>0.05)였으며, 연구 기간 동안 진단 기준, 실험실 방법, 의사 팀 구성에 유의미한 변화가 없었습니다.
치료 요법 투여
모든 참가자는 8개월간의 연구 기간 동안 혈당 조절을 위한 표준화된 일일 피하 인슐린 주입 요법을 받았습니다. 인슐린 용량은 일일 모세혈관 혈당 모니터링에 따라 개별적으로 조정되었습니다. 대조군 환자들은 발사르탄(80mg, 하루 1회 공복), 아토르바스타틴(20mg, 하루 1회), 프로부콜(250mg, 하루 2회)을 8개월간 투여받았습니다. 관찰군 환자들은 동일한 용량과 일정으로 발사르탄, 아토르바스타틴, 프로부콜 요법을 매일 경구 비타민 D 보충제로 받았습니다.
비타민 D 용량은 등록 시 전기화학발광 면역분석법(ECLIA)을 이용해 측정한 기저선 혈청 25-하이드록시비타민 D [25(OH)D] 수치에 따라 결정되었습니다. 비타민 D 충분성은 25(OH)D ≥30 ng/mL, 불충분은 20 ng/mL ≤25(OH)D <30 ng/mL, 결핍은 25(OH)D <20 ng/mL로 정의되었습니다. 결핍 예방을 위해 보충제를 받은 환자들은 하루 600–800 IU를 받았고, 확실한 비타민 D 결핍 또는 결핍 환자에게는 하루 2,000 IU를 받았습니다.
안전 모니터링 및 정지 기준
8개월 치료 기간 동안 참가자의 안전을 보장하기 위해, 혈청 칼슘, 인, 부갑상선 호르몬(PTH) 수치를 기준선과 4주마다 측정하여 비타민 D 유발 고칼슘혈증 및 칼슘-인 불균형을 모니터링하였습니다. 기저라인과 8개월 후에 12유도 심전도(ECG)를 시행하여 프로부콜과 관련된 QTc 간격 연장을 평가하였다. 기저 QTc ≥남성 450ms 또는 여성 ≥460ms 환자에서 1개월 차에 심전도가 재검사되었습니다.
혈청 크레아티닌과 eGFR 및 혈청 전해질을 포함한 신장 기능 지표를 첫 한 달과 이후 월간 격주로 모니터링하였다. 참가자들은 새로운 증상이 있으면 즉시 보고하라는 지시를 받았습니다. 치료 중단 기준에는 48시간 이내에 재검사로 확인된 수정된 혈청 칼슘>10.5 mg/dL (2.62 mmol/L); QTc 간격 >500ms 또는 두 번의 연속 심전도에서 기준선보다 >60ms 증가; 혈청 크레아티닌이 기저치 대비 두 배 증가하거나 급성 신장 손상 발생 시 신장 질환: 글로벌 결과 개선(KDIGO) 기준에 따른 것; 그리고 비타민 D 또는 프로부콜과 관련이 있을 가능성, 아마도 또는 확실히 관련되어 있다고 간주되는 일반 용어의 부작용 기준(CTCAE)에 따른 등급 ≥3 이상반응. 심각한 부작용은 24시간 이내에 병원 윤리 위원회에 보고되었습니다.
생물학적 샘플 수집 및 처리
혈액과 소변 샘플은 치료 시작 전과 8개월 치료 기간이 끝난 후에 수집되었습니다. 모든 샘플은 8–12시간의 하룻밤 단식 후 아침에 수집되었습니다. 표준 채혈 기법을 사용해 약 20mL의 정맥혈을 혈청 분리기와 EDTA 튜브에 채취하였습니다. 혈액 샘플은 실온에서 30분간 응고시키고, 1000 × g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리했습니다. 투명한 혈청 상청액은 혈전이나 버피 코트를 손상시키지 않고 조심스럽게 흡입한 후, 다양한 분석용 냉동병에 분리되어 참가자 ID, 날짜, 샘플 종류를 라벨링하여 −80 °C에서 분석할 때까지 보관했습니다. 혈청 샘플은 −80°C에서 최대 12개월간 저장할 수 있었습니다.
24시간 요백 분비(24시간 UPE)에서는 참가자들이 1일차 오전 7시에 첫 번째 아침 소변 샘플을 버렸고, 이후 2일차 오전 7시에 첫 번째 아침 소변 샘플을 포함한 모든 소변을 제공된 수집 용기에 수집했습니다. 참가자들은 수집 기간 동안 수집 용기를 냉장 보관하라는 지시를 받았습니다. 총 소변량을 기록하고 철저히 혼합한 후 실험실 분석을 위해 할당량을 확보하였습니다. 샘플은 24시간 이내에 분석할 경우 4°C에서, 이후 분석을 위해 −20°C에서 보관되었습니다.
요 알부민-크레아티닌 비율(UAlb/UCR)의 경우, 첫 아침 중간 소변 샘플을 멸균 용기에 채취하여 유사하게 처리하였습니다. 8개월 치료 기간이 끝난 후에도 동일한 절차가 반복되었습니다.
생화학적 및 임상 매개변수 분석
냉동 혈청 샘플은 혈청 크레아티닌(SCr) 분석 전에 얼음 위나 4°C에서 해동되었습니다. SCr는 제조사의 지침에 따라 자동 생화학 분석기에서 효소 색도 측정법을 사용해 측정되었습니다. 일일 교정은 다단계 교정기를 사용해 수행되었으며, 각 배치에는 두 단계의 상업용 품질 관리 물질이 포함되었습니다. 샘플을 중복 분석하고, 변동 계수가 >5%인 검사법을 반복했습니다. SCr의 검출 하한은 2.0 μmol/L였습니다.
24시간 소변 알리코트의 단백질 농도는 피로갈롤 적몰리브데이트 방법을 사용하여 측정하였다. 샘플은 중복 분석되었고, 각 실험마다 품질 관리 물질이 포함되었습니다. 보정 범위(>3.0 g/L) 이상의 샘플은 생리식염수로 희석한 후 재평가하였다. 24시간 UPE는 요 단백질 농도와 총 소변량을 사용하여 계산되었습니다.
첫 아침 소변 샘플에서 생화학 분석기를 사용해 요로 알부민과 크레아티닌 농도를 측정하였고, 이후 UAlb/UCR 비율을 계산하였습니다.
제조사 지침에 따라 검증된 혈당 측정기와 모세혈관 손가락 혈액 샘플을 사용해 공복 혈장 혈당(FPG)과 2시간 식후 혈당(2h-PPG)을 측정했습니다.
당화 헤모글로빈(HbA1c)은 전용 HbA1c 분석 시스템을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피로 분석되었습니다. 참가자들은 치료 후 혈액 채취 전 7일간 지질 저하 약물과 24시간 동안 고지방 식사 또는 알코올을 피하도록 지시받았습니다. 혈청 총콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C), 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C)을 효소 분석법으로 측정하였습니다. 2단계 품질 관리 물질이 매일 분석되었습니다. 지질 매개변수는 처음에 싱글리케이트에서 측정되었고, 변동 계수가 >10%인 샘플은 중복하여 재평가되었습니다. 검출 한계는 TC의 0.1 mmol/L, TG의 0.05 mmol/L, HDL-C의 0.08 mmol/L, LDL-C의 0.10 mmol/L였습니다. LDL-C 값은 직접 분석법 또는 프리데발트 방정식으로 결정되었으며, 중성지방 수치가 <400 mg/dL일 때 측정되었습니다.
면역 기능 및 염증 지표 분석
혈청 면역글로불린 G(IgG) 농도는 상업용 인간 IgG ELISA 키트를 사용하여 측정하였습니다. 분석 검출 범위는 1.37–1000 ng/mL였고, 민감도는 0.52 ng/mL, 검사 내 변동 계수는 <6%, 분석 간 변동 계수는 <9%였습니다. 모든 샘플은 중복 분석되었으며, 키트에 제공된 고품질 및 저품질 관리 물질이 각 플레이트에 포함되었습니다. QC 값이 목표 값에서 2 표준편차를 벗어난 판은 거부하고 반복 검사를 했습니다. 상한선을 초과한 샘플은 1:2로 희석하여 재평가하였습니다.
모든 시약과 혈청 샘플은 분석 전에 상온에 평형화되었다. 혈청 샘플은 키트 설명서에 따라 희석되었으며, 보통 1:100,000 희석 비율로 사용되었습니다. 표준 샘플, 희석된 샘플, 그리고 블랭크(100 μL)를 적절한 사전 코팅된 마이크로플레이트 웰에 추가하여 37 °C에서 90분간 배양했습니다. 웰은 37°C에서 60분간 바이오티닐화 검출 항체로 세척하기 전에 세 차례 세척되었습니다. 추가 세척 후에는 고추냉이 과산화효소 결합액을 첨가하여 어둠 속에서 30분간 배양했습니다. 세척 후 기질 용액을 추가하고, 혼합물을 어둠 속에서 15분간 배양한 후 정지 용액을 추가했습니다. 광학 밀도는 450 nm에서 측정되었으며, 기준 파장은 570 nm 또는 630 nm였습니다. 표준 곡선을 생성하여 IgG 농도를 계산했습니다.
림프구 소집합은 488nm 및 640nm 레이저가 장착된 BD FACSCanto II에서 유세포분석으로 분석되었습니다. 순방향 산란 전압은 300 V, 측면 산란은 350 V, 광증배관 전압은 각각 400 V, 550 V, 480 V로 설정되었습니다. 더블릿은 FSC-A 게이팅과 FSC-H 게이팅을 사용하여 제외하였다.
생존 가능성 염색은 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)를 사용하여 수행되었으며, 7-AAD 음성 사건만 분석되었습니다. 전혈 샘플은 염색되지 않은 아이소타입 대조관과 시험관에 분배되었습니다. 항인간 CD3-FITC, CD4-APC, CD8-PE 항체가 시험관에 첨가되었고, 대조관에는 일치된 아이소타입-대조 항체가 첨가되었습니다. 샘플은 실온에서 어두운 환경에서 30분간 배양되었습니다. 보상 제어는 BD CompBeads로 준비되었고, 자동 보상은 FACSDiva 소프트웨어로 수행되었습니다. 적혈구는 적혈구 용해 완충제로 용해한 후 세척 후 7-AAD가 포함된 염색 완충제에 재현탁하였습니다.
품질 관리를 위해 매일 세포계 설치와 추적 구슬이 사용되었습니다. 게이팅 계층 구조에는 이중선 배제, 림프구 선택, 생존 가능 게이팅, CD3+ 게이팅, CD4/CD8 하위 집합 식별이 포함되었습니다. 샘플당 최소 50,000건의 생림프구 이벤트가 채취되었으며, 총 획득 이벤트는 100,000건에서 150,000건 사이였습니다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어를 사용해 분석되었으며, CD3+, CD4+, CD8+ 세포의 비율과 CD4+/CD8+ 비율을 계산하였습니다.
상용 ELISA 키트를 사용하여 혈청 hs-crp, IL-6, TNF-α, MCP-1 농도를 측정하였습니다. 검출 범위와 감민도는 다음과 같았습니다: hs-CRP (0.07–12.5 ng/mL; 감도 0.022 ng/mL), IL-6 (0.7–300 pg/mL; 감도 0.35 pg/mL), TNF-α (1.6–100 pg/mL; 감도 0.8 pg/mL), MCP-1 (5–1000 pg/mL; 감도 2.5 pg/mL). 모든 분석은 중복하여 수행되었습니다. 모든 판에는 저품질 및 고품질 관리 재료가 포함되어 있었습니다. 분석 내 변동 계수는 <8%, 분석 간 변동 계수는 <10%였습니다. 검출 한계 이하의 값은 하한의 절반으로 기록되었고, 최고 기준 이상은 희석되어 재평가되었습니다. 샘플은 분석 전 단 한 번의 냉동-해동 사이클만 거쳤습니다. 사이토카인 ELISA 시술은 희석 인자, 배양 조건, 온도에 관한 제조사 지침에 따라 IgG ELISA에 기술된 프로토콜과 동일한 절차를 따랐습니다.
임상 결과 평가 및 데이터 관리
8개월 치료 기간이 끝난 후, 그룹 배정에 눈가림 상태에서 주치의들이 참가자들의 임상 상태를 평가했습니다. 환자는 당뇨병성 신병증에 대한 모든 사전 정의된 임상 개선 기준을 최소 2주 연속으로 충족하면 퇴원으로 분류되었습니다: 24시간 UPE 기저치 대비 ≥30% 감소, eGFR의 안정화 또는 개선은 기저선 대비 <5 mL/min/1.73 m2 감소, 급성 당뇨병 합병증 또는 지속적인 입원 치료가 필요한 기타 질환 부재. 모든 기준을 충족하지 못한 참가자는 퇴원 미완료로 분류되었습니다. 이후 각 그룹별로 임상 반응률을 계산하였습니다.
수집된 모든 인구통계학, 실험실 및 임상 데이터는 두 명의 독립 연구자가 이중 데이터 입력을 통해 전자 데이터베이스에 입력되었습니다. 데이터 정확성을 보장하기 위해 범위 검사와 일관성 검사가 수행되었습니다. 주요 평가변수에는 24시간 UPE 및 UAlb/UCR 등 신장 기능 지표의 기저선 대비 8개월 변화와 면역 기능 지표(CD3+ T세포 비율 및 CD4+/CD8+ 비율 포함)가 포함되었습니다. 2차 평가 지표에는 혈당 지표(FPG, 2h-PPG, HbA1c), 지질 프로필(TC, TG, LDL-C, HDL-C), 염증 지표(hs-CRP, IL-6, TNF-α, MCP-1), 임상 반응률 변화가 기저라인에서 8개월로 이루어졌습니다. 모든 결과 측정은 치료 시작 48시간 전의 기저라인과 8개월 치료 종료 후 1주일 이내에 평가하였습니다.
통계 분석
모든 통계 분석은 SPSS 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 정규분포를 가진 연속 변수는 평균 ± 표준편차로 표현되었고, 범주형 변수는 빈도와 백분율로 표현되었습니다. 독립 표본 t-검정은 그룹 간 비교에 사용되었고, 카이제곱 검정은 범주별 변수에 사용되었습니다. 통계적 유의성은 P<0.05로 정의되었습니다. 연구의 탐색적 성격과 평가된 결과가 많았기 때문에, 부차적 결과는 다중성에 대해 조정되지 않았습니다. 따라서 P-값은 확인적이라기보다는 기술적 것으로 간주되었습니다. 후향적 비무작위 연구 설계로 인해 대조군과 관찰군 간의 모든 비교는 잠재적 교란변수에 대해 조정되지 않았으며, 잔여 교란이 남아 있을 수 있습니다. 등록된 150명의 환자 전원(대조군 56명, 관찰군 94명)은 8개월간의 치료 및 추적 관찰 기간을 모두 마쳤습니다. 추적 관찰, 철회 또는 등록 후 제외된 환자는 없었습니다. 신장 기능, 혈당 및 지질 프로필, 면역 표지자, 염증 인자 등 기저 특성이나 결과 측정에 대한 누락된 데이터는 확인되지 않았습니다. 따라서 인피테이션 절차가 필요하지 않았습니다.