녹색 CuO/ZnO 나노입자: 옥수수 내 AFB1 전위 및 축적 감소

요약

이 연구는 녹색 합성 CuO/ZnO 하이브리드 나노입자가 옥수수에서 아플라톡신_B1 (AFB₁) 축적 및 전위를 줄이는 데 효과적임을 조사했으며, 125 mg/kg 처리가 AFB₁ 수치를 유의미하게 낮추고 인간 및 동물의 식이 노출 위험을 최소화함을 입증하였습니다.

초록

아플라톡신 B₁ (AFB₁)은 아스페르길루스 종이 생성하는 강력한 발암물질로, 옥수수 작물을 오염시켜 식이 노출을 통해 인간과 동물에게 심각한 건강 위험을 초래합니다. 전통적인 수확 후 관리와 화학적 개입은 성장 중 토양 유래 독소가 식물로 옮겨지는 것을 막는 데 비용이 많이 들거나 효과가 떨어지는 경우가 많습니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 녹색 합성 구리 산화물/산화아연(CuO/ZnO) 하이브리드 나노입자(NP)를 지속 가능한 수확 전 토양 개량제로 평가하는 것이었습니다. 이 연구는 이러한 자연 노트가 옥수수 조직 내 AFB₁ 의 전위 및 축적을 효과적으로 억제하여 식용 곡물 내 독소 축적을 줄일 수 있는지 규명하는 것을 목표로 했습니다. 무작위 완전 블록 설계를 두 개의 서로 다른 현장 부지에서 사용하여, 옥수수를 AFB₁ 또는 Aspergillus flavus 포자로 접종한 토양에서 재배하고 다양한 농도의 NPs(0–125 mg/kg)로 처리했습니다. 이 프로토콜은 친환경성을 보장하기 위해 Pleurotus ostreatus 기질과 친환경 합성을 사용했습니다. 식물 조직은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 다양한 생리학적 단계에서 분석되어 AFB₁ 수치를 측정하고 인간 및 가축 위험 평가를 산출했습니다. 125 mg/kg 그린 하이브리드 NPs(p < 0.05)로 치료하면 모든 성장 단계에서 AFB₁ 농도가 유의하게 감소했습니다. 캠퍼스 내 연구소에서는 AFB₁ 이 양성 대조군에 비해 식생 단계에서 68%, 개화 단계에서 82%, 성숙 단계에서 76% 감소하였습니다. 특히 곡물 AFB₁ 수치가 6.91 ppb로 떨어져 인간의 예상 일일 섭취량이 크게 감소했습니다. 그러나 잠재적인 나노입자 잔류물과 장기적인 독성을 평가하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 이 방법은 녹색 CuO/ZnO 하이브리드 NP가 효과적인 생물복원제로서 식물의 식용 부위로의 독분 운반을 방지함을 입증합니다. 이 접근법은 아플라톡신 취약한 지역에서 식량 안보를 강화하고 AFB₁ 노출을 완화할 수 있는 확장 가능하고 환경적으로 안전한 전략을 제공합니다.

서론

아플라톡신, 특히 아플라톡신_B1(AFB₁)은 그 유병률, 독성, 그리고 인간에 미치는 영향으로 인해 가장 중요한 마이코톡신 중 하나입니다. 이들은 주로 Aspergillus 종 ^1,2,3에 속하는 특정 균류에 의해 생성됩니다. AFB₁은 간세포암과 연관되어 있으며 모든 아플라^{톡신 중} 가장 위험한 4. 이 강력한 발암물질은 옥수수(Zea mays L.)를 포함한 다양한 농작물을 감염시켜 심각한 식품 안전 문제를 초래합니다 ^5,6. 옥수수 내 AFB₁의 존재는 작물 수확량과 품질에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 식이 노출을 통해 인간과 동물 건강 모두에 심각한 위협이 됩니다 ^7,8.

현재 아플라톡신 관리는 주로 적절한 건조, 손상된 알갱이 분류, 화학 처리(예: 암모니아 또는 오존), 조사, 밀폐 보관 등 수확 후 전략에 의존^{하여 저장 중} 곰팡이 성장을 방지합니다. 전략에는 우수한 작물 관리, 생물학적 방제제(석회와 같은), 개선된^{저장 시설 등이} 포함됩니다. 마이크로파, 자외선(UV), 펄스 광, 전해수, 냉 플라즈마, 오존, 전자빔, 감마선 조사와 같은 물리적·화학적 처리법^{도 시험되었습니다}. 하지만 이러한 수확 후 방법은 비용이 많이 들고 에너지 집약적이거나 널리 사용하기에는 비현실적이며, 성장 중 식물 내 아플라톡신 전위를 막지 못합니다.

현재 사용되는 사전 수확 방법에는 저항성 품종, 적시에 파종, 가뭄 스트레스 감소를 위한 관개, 그리고 독성 균주를 경쟁적으로 배제하지만 반복 적용이 필요하며 토양 전위를 완전히 해결하지 못할 수 있는 아플라시피 같은 농학적 관행이 포함됩니다 11,12,13. 이러한 방법들은 종종 한계에 부딪히는데, 수확 후 개입은 기존 오염을 되돌릴 수 없고, 자원이 제한된 환경에서 분류/저장 인프라에 높은 비용을 발생시키며, 화학물질로 인한 영양분 손실이나 잔류 위험이 있으며, 생물학적 방제 효과는^{환경 조건에} 따라 달라집니다.

반면, 녹색 합성 CuO-ZnO 하이브리드 나노입자는 새로운 사전 수확 토양 개량 전략을 제공합니다. 기존의 화학 자연 식물과 달리, 식물 추출물(예: 버섯 기질)을 이용한 녹색 합성은 독성 용매를 피하고 비용을 절감하며 생체 적합성을 높여 환경 친화적으로 지속 가능하다^15,16. CuO-ZnO 하이브리드화는 활성 산소종(ROS)을 생성하고 곰팡이 막을 파괴하며 AFB₁ 흡착을 위한 높은 표면적을 제공함으로써 항진균 활성을 시너지 효과로 높여 곡물과 같은 식용 식물 부위로의 흡수 및 전이를 방지합니다. 이는 기존 전략과 달리 토양-식물 경계부에서 조기 개입을 가능하게 하여 저용량(예: 125 mg/kg)에서 작물 수확량을 저해하거나 유해 잔류물을 남기지 않고 최대 80-99%의 AFB₁ 감소를 달성할 수 있다는 점에서 다릅니다¹⁷. 주요 장점으로는 화학 살균제에 비해 친환경성, 단일 금속 NPs에 비해 우수한 효능, 또는 가변적인 밭 조건에서의 생물학적 방제, 그리고 사하라 이남 아프리카와 같은 아플라톡신 취약한 지역의 농업 관행에 확장 가능한 통합 가능성이 있습니다.

금속 산화물 NP, 특히 산화아연(ZnO)과 구리산화물(CuO)은 항진균 특성과 독소 흡수 능력 때문에 이들 재료들 사이에서 주목받고 있습니다^18,19. 예를 들어, Cu NPs가 ROS를 생성하여 박테리아 및 곰팡이 생물학적 고분자에 해를 끼칠 수 있다는 보고가 있었습니다²⁰. 또한 또 다른 실험에서는 F. Solani가 키토산 기반 CuO NPs로 처리되었을 때 균주가 뚜렷한 이동과 명확한 차수 증가 경향을 보여 가장 큰 질서 효과²¹을 보였다. NPs의 친환경 합성은 기존 화학 방법보다 안전하고 지속 가능한 대안으로 주목받고 있으며, 이를 통해 유해 부산물과 환경 영향을 최소화합니다^15,22.

CuO와 ZnO NP의 하이브리드제이션은 두 금속의 유익한 특성을 결합하여 분해 또는 흡착 효과가 향상될 가능성이 있습니다 AFB₁^23,24. 현재 이 녹색 합성 NPs는 주로 시험관 내 곰팡이 균주에서 AF 생성 조절에 사용되고 있습니다; 예를 들어, Sheik와 Awad는 AgNPs, AuNPs와 그 혼합물이 Aflatoxi 생성 A. flavus 균주의 성장과 아플라톡신_B1 축적에 미치는 영향을 연구^했다. 그러나 A. flavus의 성장을 조절하는 데 필요한 농도는 알려져 있지 않습니다. 따라서 현장 관련 조건에서 녹색 CuO-ZnO 하이브리드가 기존 NP와 비교해 토양 변형된 원천에서 옥수수 조직으로의 AFB₁ 전위에 미치는 영향을 평가할 필요가 매우 중요합니다. 따라서 본 연구의 목적은 옥수수 식물 조직 내 AFB₁/A. flavus 농도에 미치는 다양한 CuO/ZnO 하이브리드 NP의 영향을 규명하고 AFB₁의 위험을 평가하는 것이었습니다 옥수수를 CuO/ZnO 잡종 그린 NP로 처리한 후 옥수수에서 연구를 진행했습니다. 연구 가설은 그린 합성 CuO-ZnO 하이브리드 NP의 관측된 효능에 대한 기전적 근거를 제공하기 위한 것이었습니다. 본 연구는 다음과 같은 측정 가능한 가설을 검증합니다: 1) 항진균 억제 가설, 즉 하이브리드 NP가 단일 금속 NP에 비해 토양에서 A. flavus 포자 형성과 그 이후의 de novo AFB₁ 생성을 유의미하게 감소시킨다는 것으로, 이는 몰렐웨인 부위의 균류 부하와 독소 농도가 낮음으로 확인됨. 2) 흡착-전위 가설: 기존에 존재하는 독소(캠퍼스 부위)에서 NP들이 AFB₁에 높은 결합 친화력을 보여 토양에서 옥수수 뿌리로 독소 전위 속도를 유의하게 감소시킨다는 가설. 3) 생체적합성(식물독성) 가설: 녹색 합성 하이브리드 NP가 기존 화학 기준에 비해 옥수수 조직에서 잔류 금속 축적을 줄이고 산화 스트레스 표지를 감소시켜 작물 생물안전성을 향상시킨다는 가설.

프로토콜

실험 장소
시험은 7km 떨어진 두 장소에서 진행되었으며; 각 부위에는 다양한 치료가 접종되었습니다. 첫 번째 시험에서는 남아프리카공화국 북서부 주의 몰렐웨인 노스웨스트 대학교(NWU) 연구 농장(25.810°S, 25.630°E, 1276m)에 40% 그늘이 있는 넷하우스 시설이 설치되었습니다. 붉은 모래 양토는 허튼 형태로 분류되었으며, 모래 75%, 실트 4%, 점토²¹%를 포함하고 있었습니다. 두 번째 실험은 NWU 마피켕 캠퍼스(25. 8278°S, 25. 6079°E, 1276m) 그물 시설에서 진행되었습니다. 두 번째 부지의 토양은 모래 82%, 실트 3%, 점토 15%로 구성되어 있었으며, 이전에는 아카디아 폼²⁵로 분류되었습니다. CuO/ZnO 그린 하이브리드 NP는 남아프리카공화국 NWU 자연농업과학부 물리화학과학부 화학과 실험실에서 합성되었습니다.

CuO/ZnO 잡종 그린 NP의 합성
건조된 Pleurotus ostreatus 사용된 버섯 기질(SMS) 10g을 100mL의 탈이온수에 첨가하고, 70°C에서 가열한 후 2시간²⁶분간 저어주었습니다. 혼합물을 실온까지 냉각한 후 여과한 후, 30mL의 여과물을 2.5g 아세트산 구리와 2g 아세트산 아연이 포함된 용액에 증류 30mL에 첨가했습니다. 이 용액의 pH는 수산화나트륨(NaOH)을 사용해 80°C로 조정하고, 2시간 동안 80°C까지 가열한 후 반응 후 원심분리하여 오븐에서 하룻밤 건조한 후 650°C에서 2시간²⁶분간 소성되었습니다. 합성된 NP들은 CuO/ZnO 그린 하이브리드 NP로 특성 분석되어 확인되었습니다.

토양 샘플링 및 분석
토양 샘플은 몰렐웨인 대학교 농장과 캠퍼스 시험 현장에서 0–15cm 및 15–30cm 깊이에서 채취되었습니다. 이후²⁷이 설명한 대로 이들은 물리적·화학적 특성에 대해 분류되고 검사되었습니다.

실험 설계
이 연구는 세 번의 복제를 포함한 무작위 완전 블록 설계(RCBD)로 구성된 요인 실험을 사용했습니다. 다양한 오염 시나리오에서 녹색 합성 CuO-ZnO 하이브리드 NP의 효능을 평가하기 위해, 두 가지 독립적인 노출 방식을 별도의 부지에서 설정하였다: Site 1(North-West University Campus)은 추출한 AFB₁ 을 160 ppb/kg의 비율로 토양에 스파이크하여 NPs의 직접 흡착 및 전위 차폐 능력을 평가하는 외인성 오염 모델을 나타냈다. 사이트 2 (몰레웨인 연구 농장): 토양에 160 포자/kg의 A . flavus 포자를 접종하여 NPs가 신규 마이코톡신 생산 및 이후 식물 흡수에 미치는 항진균 효과를 조사한 생물학적 감염 모델을 제시했습니다. 가루 형태의 노트코트는 접종 후 재량되어 1kg의 흙과 균일하게 혼합되어 식재용 비닐봉지에 담겼습니다(AFB₁ 또는 A. flavus 포자). 각 치료는 별도로 진행되었고, 치료 사이에 손은 소독되었습니다. 그 후 처음에는 각 화분에 옥수수 씨앗 4개(상단 지름 9cm, 하단 직경 6.5cm)를 심었습니다. 화분당 건강한 묘목 3개를 유지하기 위해, 모종은 출화 후 일주일 후에 가지치기를 했습니다. 토양 분석에서 도출된 최적의 옥수수 생산 권고에 따라 토양에 비료를 공급했습니다. 화분들은 0.75m× 0.3m의 행 간 및 행 내 간격으로 배치되어 총 216개의 화분이 있었습니다. 씨앗을 뿌린 후 화분에 담긴 토양은 60% 정도의 밭 용량으로 물을 주었습니다. 토양과 식물 샘플은 V10(발달), R1(개화), R6(성숙)의 세 가지 발달 단계에서 수집되었습니다. 샘플은 얼음이 채워진 쿨러 박스에 담겨 실험실로 옮겨져 -20°C에서 추가 검사를 위해 보관되었습니다. 갈색 종이봉투를 사용해 AFB₁ 농도 및 기타 분석용 식물 샘플을 저장하고 냉동했습니다. AFB₁ 농도 및 기타 분석을 위한 나머지 식물 샘플은 갈색 종이봉투에 담겨 냉동 보관되어 분석되었습니다.

옥수수 아플라톡신 분석
옥수수 발달 성분(뿌리, 줄기, 잎, 곡물)은 다양한 성장 단계에 걸쳐 멸균 비닐봉지에 담겨 조심스럽게 라벨을 붙인 후 실험실로 운송되었습니다. 성장 데이터의 무결성을 유지하고 각 발달 단계별로 독립적인 관찰을 보장하기 위해 파괴 샘플링 프로토콜이 도입되었습니다. 나노입자 농도와 접종 유형 간의 교차 오염을 제거하기 위해, 각 처리단 사이에 수확 도구와 장갑을 70% 에탄올로 세척하고 탈이온수로 헹군 것을 수행했습니다. 절구와 공을 사용해 식물 재료 10g과 염화나트륨(NaCl) 1g을 80% 메탄올 25mL와 증류수 20%에 10분간 분쇄했습니다. 옥수수 알갱이와 옥수수 심부에는 25g 분쇄 샘플과 2.5g NaCl을 80% 메탄올:20 증류수 100mL와 고속으로 10분간 혼합하였습니다. 그 후 균질화된 추출물을 유리 마이크로화이버 필터로 여과한 후, 20% Tween-2 20mL를 인산 완충 식염수(PBS)에 세척했습니다. 아플라톡신은 1초당 한 방울의 유량으로 용출 후 면역친화성 컬럼에서 추출되었고, 상원액(세포질)은 호박색 바이알에 수집되었습니다. 그 후 AFB₁ 및 기타 아플라톡신은 액체 크로마토그래피 방법²⁸ 을 통해 측정되었는데, 이 방법은 o-프탈디알데히드 용액으로 아플라톡신을 유도화하고 유도화된 화합물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템에 주입하는 방식이었습니다. HPLC 시스템은 362nm 여기와 425nm 방출 범위의 Jasco FP-920 형광 검출기를 장착했습니다. AFB₁ 은 본질적으로 362 nm의 여기 파장에서 검출되도록 생리학적 구조를 갖추었습니다. 5 μm 입자를 가진 히크롬 컬럼(4.6 mm × 150 mm)이 사용되었고, 유도화 반응기는 100 μA의 KOBRA 셀 프로그램이었습니다. 크로마토그래피 피크의 분리는 유사한 고정상의 프리컬럼이 장착된 히크롬 컬럼에서 이루어졌습니다. Inertsil ODS-3와 ODS-3 V는 각각 가드 및 분석용 카트리지로 사용되었으며, 인젝터는 레오다인 밸브가 장착된 오토샘플러로 구성되었습니다. 이동상은 물로 구성되었으며, 메탄올(65:35, v/v), 브로마이드 칼륨(119 mg), 그리고 리터당 4 M 질산(350 μL)으로 구성되었으며, 분당 1.0 mL의 유량으로 아이소크라틱 프로그램으로 펌핑되었다. 아플라톡신 검출은 각 피크에 대해 양성으로 간주되었으며, 각 피크의 보존 시간은 각 표준과 유사하며, 기준^{선 잡음}의 5배 높은 높이에서 측정되었습니다.

검출 한계(LOD), 정량 한계(LOQ), 그리고 회수율(%)을 각각 1, 2, 3 식을 사용하여 HPLC의 분석 접근법을 확인했습니다. LOD는 배경 잡음과 신뢰성 있게 구분할 수 있는 가장 낮은 아플라톡신 농도이며, LOQ는 허용 가능한 정밀도와 정확도로 정량적으로 측정할 수 있는 아플라톡신 농도가 가장 낮은³⁰입니다. AFB₁ 과 그 대사산물은 음성 옥수수 대조군 샘플에 총 10 μL 아플라톡신 표준(AFB₁,_{AFB 2}, AFG₁, AFG₂)을 3배로 첨가하여 회수하였다. 그 후 앞서 언급한 절차를 이용해 HPLC를 사용해 샘플을 추출했습니다.

LOD = X + 3s 1

LOQ = X + 10s 2

3

여기서 "X"는 강화된 샘플 빈 값의 평균 농도이고, "s"는 샘플 표준편차입니다.

AFB1 노출 추정
옥수수 식단 내 평균 아플라톡신 수치, 옥수수 일일 섭취량, 평균 체중(어린이, 성인, 육소, 젖소, 병아리 포함)을 사용하여 추정 일일 섭취량(EDI)을 계산했습니다. 평균 아플라톡신의 EDI는 방정식 2에 따라 계산되었으며 (ng/kg 체중/일)로 표현되었습니다; 위험 지수(HI) 계산을 위해 EDI 값은 TD5032³¹의 단위와 일치하도록 ng/kg 체중/일(1 ppb/kg/day = 1,000 ng/kg 체중/일)로 변환되었습니다.

4

위험 평가 및 특성화
위험 지수(HI)는 EDI를 TD50으로 나누고 안전계수 50,000을 곱하여 계산되었습니다. 중앙 독성 용량(TD) 50은 0 용량 ^{31,32 31,32} 기준으로 0 용량 시에는 종양이 발생하지 않았을 실험 동물의 50%에서 종양을 유발하는 데 필요한 용량(ng/kg/체중/일)입니다.

데이터 분석
분산 분석은 SAS 9.4(SAS Institute Inc., 캐리, 미국 NC)에서 RCBD 절차를 사용하여 수집된 성장 및 수확량 데이터를 분석하였습니다. Tukey's honestly significant difference(HSD^{) 검정}을 사용하여 최소 제곱 평균의 다중 비교가 수행되었습니다.

결과

성장 성분 내 아플라톡신 농도
결과는 성장 성분과 녹색 합성 CuO/ZnO NP로 처리된 옥수수 곡물에서 아플라톡신 농도가 검출되었음을 보여주었으며, 이는 모든 주요 아플라톡신 유형(AFG₂, AFG₁, AFB₂, AFB₁)의 존재를 나타냈다. 아플라톡신 농도 계산에 사용된 보정 곡선은 서로 다른 아플라톡신 간에 선형성이 좋았으며, r² 값은 0.9999에서 1까지 범위가 넓었습니다(그림 1 및 보조 파일 1). HPLC 검증은 아플라톡신 유사체의 LOD 및 LOQ 값이 각각 0.006에서 0.07 ppb, 0.002에서 0.2 ppb 사이로 나타났습니다(표 1)....

토론

이 프로토콜이 옥수수에서 AFB₁ 전위 및 축적을 줄이는 데 성공할 수 있는지는 생물학적 효능과 분석 신뢰성을 보장하는 여러 중요한 단계에 달려 있습니다^16,27. 결과는 125 mg/kg의 그린 합성 CuO-ZnO 하이브리드 NP가 두 실험 모델 모두에서 AFB₁ 농도를 유의미하게 감소시켰음을 보여주는데, 이는 잠재적으로 서로 다른 메커니즘을 통해 이루어졌음을 보여준다¹⁶. 흡수 역학(캠퍼스 부지): 옥수수가 미리 추출된 AFB₁에 노출된 캠퍼스 부지에서는 식물 조직의 유의미한 감소(V10에서 68%, R1에서 82%)가 보이며, 이는 하이브리드 NP가 토양 매트릭스 내에서 독소를 효과적으로 흡착하여 뿌리 흡수를 위한 생체이용률을 감소시킨 것으로 보인다(

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
구리(II) 아세테이트 [Cu(CO2CH<>3)2]	시그마-올드리치 Pty, 세인트루이스, 미주리, 미국	10,53,753	짙은 청록색 결정질 고체 (순도 98%)
유리 마이크로화이버 필터 & nbsp;	시그마-올드리치 Pty, 세인트루이스, 미주리, 미국	1703965	붕규산염 유리 & nbsp;
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템	시마즈	20H2	분석 물질의 분리 및 정량화를 위해;
HPLC 등급 에탄올	시그마-올드리치 Pty, 세인트루이스, 미주리, 미국	34923	고순도 무색 용매 (& 99%)
HPLC 등급 메탄올	독일 다름슈타트 메르크 KGaA	322415	고순도 무색 용매 (& 99%)
면역 친화도 칼럼	시마즈	KJ524	표적 분석물의 선택적 정제를 위해
PAN 5R-590R 옥수수 씨앗	NWK	해당 없음	작고 단단한 알갱이로 흰색 콜루어가 있습니다
인산염 완충 식염수 (PBS)	독일 다름슈타트 메르크 KGaA	3526580	등장성 완충 용액
비닐봉지	에코-아그로 엔터프라이즈(Pty) Ltd	해당 없음	천공
정화된 AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 및 AFs-총 현장	트릴로지 분석 연구소 주식회사 (워싱턴주 보스브링크 드라이브, 미국)	TAS-M12DA1-10	흰색에서 오프화이트 결정체 고체
염화나트륨(NaCl)	시그마-올드리치 Pty, 세인트루이스, 미주리, 미국	해당 없음	흰색 결정 고체
아세트산 아연 [Zn(CH3COO2)2H2O]	VWR 화학물질	2331 210 2	흰색 결정 고체 (순도 99%)