이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

마우스 뇌 미세혈관 내피세포의 분리 및 배양

175 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70909

⸱

2026년 7월 17일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

이 논문에서

요약

신생아 쥐 뇌 조직에서 뇌 미세혈관 내피세포(BMECs)를 분리하고 1차 배양하여 생리적 및 병리학적 조건에서 혈액-뇌장벽 기능을 연구할 수 있는 견고한 시험관 내 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

뇌 미세혈관 내피세포(BMECs)는 혈액-뇌 장벽(BBB)의 주요 세포 구성 요소로, 분자 수송 조절과 중추신경계 항상성 유지에 핵심적인 역할을 합니다. 신뢰할 수 있는 시험관 내 뇌 내피 모델은 신경학적 및 전신 질환에서 BBB 생리학과 기능 장애를 연구하는 데 필수적입니다. 신생아 쥐 대뇌 피질에서 BMECs를 분리하고 1차 배양하는 재현 가능한 프로토콜을 기술합니다. 이 방법에는 피질 조직 박리, 기계적 및 효소 해리, 소 혈청 알부민(BSA) 밀도 구배를 이용한 수초 잔해 제거, CD31 기반 면역선택을 이용한 내피 세포 농축이 포함됩니다. 분리된 세포는 이후 콜라겐 코팅된 플레이트에서 배양되며, 형태학적 평가, 내피 마커의 면역형광 검출, 혈관신생 관 형성 검사, 그리고 장벽 특성을 평가하기 위한 경내피 전기 저항(TEER) 측정을 통해 특징지어집니다. 이 프로토콜은 생리적 및 병리학적 조건에서 BBB 생물학, 내피 신호 전달, 신경혈관 상호작용을 조사하는 데 적합한 1차 BMEC 배양을 얻는 신뢰할 수 있는 접근법을 제공합니다.

서론

혈액-뇌 장벽(BBB)은 중추신경계(CNS)와 전신 순환계 간의 물질 교환을 엄격히 조절하는 고도로 특수화된 구조입니다. BBB는 주로 뇌의 미세혈관 내피 세포들이 촘촘한 접합으로 연결되어 형성됩니다. 이 내피 세포들은 신경혈관 단위(NVU)로 알려진 다세포 시스템 내에서 기능하며, 여기에는 성상교세포, 주리세포, 뉴런, 교세포, 그리고 기저막2도 포함됩니다. 이들 구성 요소 중에서, 뇌 미세혈관 내피세포(BMECs)는 촘촘한 접합부를 가진 연속된 층을 형성하고, 수천 개의 선택적 수송기 시스템, 제한된 소포 수송, 그리고 접착 분자의 낮은 발현을 통해 용질과 세포의 뇌 실질 통과를 제한함으로써 면역 세포 침투를 제한함으로써 중심적인 역할을 합니다 3,4.

물리적·선택적 장벽 역할 외에도, BMEC는 신경혈관 신호 전달, 뇌 혈류 조절, 국소 면역 반응, 특히 뇌 혈관신생등 필수 과정에 적극적으로 관여합니다. 후자는 배아 발달 중에 핵심이지만, 뇌졸중, 허혈, 염증과 같은 병리적 상태에서도 재활성화됩니다. BMEC는 혈관 내피성장인자(VEGF)와 태반성장인자(PLGF)와 같은 혈관 생성 신호에 반응하여 새로운 혈관의 형성과 성숙을 조절합니다 6,7. 따라서 뇌 내피 기능 이상은 BBB의 완전성과 뇌 항상성을 심각하게 훼손할 수 있습니다.

시험 관 내 BMECs 연구는 BBB의 생리학과 뇌 혈관신생을 조절하는 메커니즘을 모두 모델링할 수 있게 합니다. 그러나 신경 조직의 복잡성, 미엘린 풍부함, 그리고 높은 내피 순도를 가진 배양 획득 필요성으로 인해 이러한 세포를 뇌 조직에서 분리하는 데는 상당한 기술적 도전이 있습니다. 불멸화된 세포주가 존재하지만, 표현형 및 기능적 대표성 측면에서 상당한 한계가 있습니다8.

이러한 맥락에서 신생아 마우스 모델에서 BMECs의 1차 배양 프로토콜은 뇌 내피의 형태학적, 분자적, 기능적 특성을 생체 내에서 보존하는 강력한 실험 도구가 됩니다. 그러나 마우스 BMEC 분리를 위한 여러 확립된 프로토콜은 기계적 해리와 밀도 구배(덱스트란 또는 퍼콜)를 결합하여 내피 농축이 다양하고 주변세포, 성상교세포, 수초질 잔해에 의한 오염을 초래하는 경우가많습니다. 푸로마이신을 이용한 항생제 기반 정제는 내피 순도(최대 ~95%)를 개선하지만, 단백질 합성 억제와 내피표현형에 대한 잠재적 영향으로 인해 세포 스트레스를 유발할 수 있습니다. 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기반 접근법은 고도로 정제된 집단을 제공하지만 전문 장비와 광범위한 처리가 필요하여 생존 가능성과 확장성을 저하시킬 수 있습니다11. 최근 신생아 프로토콜은 밀도 구배를 피하고 원심분리 단계를 줄여 수율을 높이면서 오염을 제한합니다.

이러한 배경을 바탕으로, 본 연구는 신생아 마우스 뇌 미세혈관에서 내피세포를 분리하고 배양하는 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 정밀한 해부학적 해부, 효율적인 효소 소화, 소 혈청 알부민(BSA) 구배를 이용한 수초 제거, 그리고 CD31 마커에 결합된 자기 미세구를 이용한 면역선택에 의한 농축을 결합합니다. 이 프로토콜은 생리적·병리학적 조건 모두에서 뇌 혈관신생, 신경혈관 상호작용, 내피 신호 전달, BBB 기능 장애 연구에 적합한 생존 가능하고 재현 가능하며 풍부한 1차 배양을 얻을 수 있게 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

비오비오 대학교의 생명윤리 및 생명안전 위원회는 이 프로젝트를 승인했습니다(재단 보조금 1240925). 동물 관련 연구는 실험동물 사용에 관한 세 가지 R의 기본 원칙에 따라 수행되었으며, 미국 국립보건원(NIH)에서 발표한 실험동물 관리 및 사용 지침14의 권고에 따라 수행되었습니다. 동물들은 비오비오 대학교 생물학 시설에서 표준 사육 조건(12시간 빛/암 주기, 22 ± 2°C의 온도 조절, 사료와 물 이용 자유 ) 하에 적절한 환경에서 보관되었습니다.

세포를 얻기 위해 4개월에서 6개월 사이의 야생형(WT) 임신 쥐(C57BL/6)를 사용했습니다. 출산 후 새끼들은 산후 5일차(P5)까지 어미와 함께 있었습니다. 이 시점에서 새끼들은 반사 사능을 잃을 때까지 이소플루란으로 깊이 마취되었습니다. 저체온증은 움직임을 최소화하기 위한 보조 요법으로만 사용되었고, 곧바로 참수되었다. 모든 절차는 미국 수의의학회(AVMA)의 동물 안락사 지침(2020)15 및 실험동물 관리 및 사용에 관한 국제 규정(NIH)14에 따라 수행되었습니다. 대뇌 피질이 분리되어 이 실험 프로토콜을 개발하는 데 사용되었습니다(프로토콜 단계 3 참조). 재료표 에는 이 프로토콜에 사용되는 재료와 항체가 나열되어 있습니다.

1. 내피 배양지 준비

  1. 쥐 뇌 내피세포용 배양 배지 500 mL를 멸균 용기에서 10% 태아 소 혈청(FBS)과 보조한 250 mL의 DMEM, 10% FBS를 보충한 내피 세포 배양 배지 250 mL를 혼합합니다.
    참고: 배양지는 필수적인 내피 성장 인자를 제공하고 세포 증식을 지원합니다. 참고된 제품( 재료표 참조)이 없으면, DMEM + FBS에 동등한 내피세포 보충제(예: ECGS, 하이드로코르티손, L-글루타민)를 추가하여 유사한성장 조건을 달성할 수 있습니다.
  2. 0.22 μm 필터를 통해 전체 배지(10% FBS)를 멸균하여 멸균을 보장합니다.
  3. 준비된 배지를 4°C에서 보관하다가 사용하세요. 성장 인자 활성을 유지하기 위해 2주에서 4주마다 신선한 배지를 준비하세요.

2. 배양 플레이트 코팅

참고: 세포 부착을 촉진하고 내피 표현형을 유지하기 위해서는 배양 플레이트에 제1형 콜라겐이 미리 코팅되어야 합니다. 이 과정의 단계는 다음과 같습니다:

  1. 1형 콜라겐(0.1 mg/mL), 콜라겐을 용해시키기 위해 아세트산 M, 멸균 기저 배지를 혼합하여 총 부피 15 mL로 만들어 프리코팅 용액을 준비합니다. 콜라겐이 완전히 녹을 때까지 부드럽게 섞고, 필요하다면 pH 4.0 으로 조절하세요. 0.22 μm 필터로 멸균 필터 를 거친 후 콜라겐 안정성을 유지하기 위해 얼음 위에 보관 하세요.
    참고: 제1형 콜라겐은 기저막을 모방하여 내피 세포 부착을 지원하고 세포 표현형 유지에 도움을 줍니다.
  2. 무균 조건에서 용액을 균질화하세요. 용액을 배양 배지 전체 표면에 고르게 바르세요.
    참고: 표면을 덮는 데 필요한 부피만 사용합니다.
  3. 플레이트를 37°C에서 하룻밤(12–16시간) 배양하여 콜라겐이 제대로 흡착되도록 하세요. 세포를 시딩하기 전에 과도한 코팅 용액을 제거하고, 무균 1회 인산염 완충 식염수(1x PBS, pH 7.4)로 플레이트를 2회 세척하여 잔류된 산과 결합되지 않은 콜라겐을 제거합니다.

3. 뇌 혼합 세포 배양 분리

참고: 이 프로토콜은 P5 마우스의 대뇌 피질에서 BMEC를 분리하는 것을 목표로 한 이전 보고서 9,17을 기반으로 합니다.

  1. 이소플루란을 이용한 심마취로 P5 새끼 5마리를 희생; 저체온증은 보조 요법으로만 사용하고, 그 다음에는 경추 참수법을 시행하세요.
    참고: 이 단계부터 모든 절차는 층류 생물학적 안전 캐비닛 내에서 수행되어야 합니다.
  2. 뇌를 수집한 후(그림 1A), 멸균된 냉 PBS(1x)에 50mL 원뿔형 튜브에 넣어 모든 뇌가 처리될 때까지 보관합니다.
  3. 각 뇌를 멸균된 니트로셀룰로오스 막 위에 조심스럽게 말아 뇌막을 분리하세요. 뇌를 100mm 두께의 차가운 PBS(1배) 플레이트로 옮깁니다. 멸균 메스를 사용해 뇌간, 소뇌, 시상, 후각구를 제거한다(그림 1B, C).
  4. 수막이 없는 대뇌 피질을 채취하여 차가운 PBS(1배)에 보관합니다. 즉시 모든 뇌 피질을 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고, 5mL PBS를 얼음 위에 1회 넣으세요(그림 1D).
  5. 멸균 가위를 사용해 조직을 기계적으로 해리시키고, 1mL 피펫으로 조각이 관찰되지 않을 때까지 진행하며, 현탁액이 균일해집니다(그림 1E).
    참고: 분쇄 중 기계적 응력을 줄이기 위해 피펫 팁을 잘라낼 수 있습니다. 조직 해리는 제어된 흡입력과 부드러운 피펫팅으로 이루어지며, 더 넓은 팁 개구부는 전단력과 기계적 세포 용해를 최소화하여 세포 생존력을 유지합니다.
  6. 모든 조직을 모아 15mL 튜브에 넣으세요.
  7. 조직을 소화하기 위해, 샘플을 멸균된 15mL 원뿔형 튜브에 2mL 콜라겐제 용액(DMEM 내 2 mg/mL)을 넣고, 37°C에서 궤도 셰이커에서 2시간 동안 180rpm 배양합니다.
  8. 소화 후에는 10% FBS를 보충한 DMEM 5mL를 현탁액에 넣고 3,000 × g 에서 10분간 원심분리기를 투여합니다( 그림 1F 참조). 상원액은 버리세요.
  9. 미엘린을 제거하려면 20% BSA 4mL에 PBS(w/v)에 재현탁한 후 3,000 × g 에서 20분간 원심분리합니다(그림 1G). 원심분리 후에는 파스퇴르 피펫을 사용해 미엘린이 포함된 상단 우유층을 조심스럽게 제거하고 남은 상청액을 버립니다(그림 1H).
  10. 펠릿을 10% FBS가 포함된 2 mL의 DMEM에 재현탁한 후, 다시 3,000 × g에서 10 분간 원 심분리합니다. 상청액을 버린 후, 최종 펠릿을 10% FBS가 포함된 1mL DMEM에 부드럽게 재현탁합니다.
    참고: 이 단계에서 최종 부유현액에는 조직 해리로 인한 이질적인 뇌유래 세포 집단이 포함되어 있습니다. 이 혼합물에는 뇌 미세혈관 내피 세포, 성상교세포, 주리세포 및 기타 신경 세포가 포함될 수 있습니다. BMEC를 선택적으로 농축하기 위해서는 이후의 정제 및 배양 단계가 필요합니다.
  11. 분리된 세포를 도판하기 전에, 준비된 배양판에서 코팅 용액을 제거하고(2.3단계 참조), 각 웰을 멸균 PBS(1회)로 두 번 헹군습니다.
  12. 재현탁된 세포(3.10단계)를 코팅된 플레이트(권장: 60mm 접시)에 씨앗을 뿌립니다.
    참고: 일반적으로 한 번의 분리에서 얻은 전체 세포 현탁액은 5mL의 내피 배양지를 담은 한두 개의 코팅된 접시에 분배됩니다.
  13. 배양물을 5% CO₂가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C의 내피 세포 배지를 유지합니다. 매체는 2-3일마다 교체하세요. 배양 결과가 90–100% 합류에 도달하면 CD31 코팅 비즈를 이용한 면역선택을 진행하여 내피 세포를 풍부하게 합니다.
    참고: 분리 및 초기 배양 확립 후, 이 절차는 일반적으로 각 준비물당 약 5× 10개의6 세포를 생성하며, 이들은 콜라겐 코팅된 판에 부착되어 내피 단일층의 특징적인 자갈석 형태를 발달시킵니다.

4. CD31 자기 구슬을 이용한 뇌 미세혈관 내피세포(BMECs) 분리

  1. 세포의 준비 및 분리
    1. 배양액이 90–100% 합류에 도달하면 잔류 배지를 제거하기 위해 세포를 PBS(1x)로 3번 세척합니다.
    2. 플레이트에 트립신 1mL(0.5% 1x)를 추가하고 37°C에서 3–5분간 배큐하여 세포를 분리합니다.
    3. 10% FBS가 포함된 내피 배양지 1mL를 첨가하여 트립신을 중화시킵니다. 세포 현탁액(~2 mL)을 멸균 마이크로 원심분리관으로 옮기고 , 220 × g에서 4 °C에서 10분간 원심분리기를 사용합니다. 상원액은 버리세요.
  2. CD31 자기 비드 준비
    1. CD31 자기 구슬 8 μL을 새로운 15 mL 튜브에 넣습니다. 1% 행크스 용액 1mL로 구슬을 세척하고, 튜브를 움직여 부드럽게 재현수하세요.
    2. 튜브를 자석에 2분간 대어 비즈를 침전시키세요. 상정액을 조심스럽게 제거하고 비즈를 손상시키지 마세요. 세척 과정을 3번 반복하세요.
      참고: 구슬이 분실되지 않도록 항상 자석 가까이에서 작업하며, 이 단계는 멸균된 환경에서 수행하여 1차 세포 배양 오염을 방지해야 합니다.
  3. 구슬을 이용한 세포 배양
    1. 세포 펠릿을 FBS가 포함된 1% 행크스 용액 1mL에 재현탁하여 비특이적 결합을 줄입니다.
    2. 세포를 1,000 μL 피펫을 사용해 미리 세척된 비드가 담긴 튜브로 옮깁니다. 혼합물을 얼음 위에 부드럽게 흔들며 20분간 부화시킵니다.
  4. 내피세포의 자기 분리
    1. 튜브를 자석에 3분간 대어 구슬에 결합된 내피세포를 침전시킵니다.
    2. 상정액을 조심스럽게 제거하세요.
      참고: 이 단계에서는 두 가지 분리된 세포 유형을 정제할 수 있습니다—하나는 내피 세포(4.5단계 참조)이고 다른 뇌 세포 유형은 혼합되어 있습니다. 현재 두 가지 선택지가 있습니다.
      1. 상청액(즉, 뇌세포 혼합물)을 제거하고 버리면서 튜브는 자석에 붙인 상태로 유지하세요. 구슬에 결합된 세포(즉, CD31+ 세포)를 행크스 용액 2mL로 세척한 후 3번 반복합니다.
      2. 상청액을 이용해 선발되지 않은 세포(예: 섬유아세포, 성상교세포, 미세교세포, 뉴런, 주위 세포 등)를 포함한 새로운 배양물을 생성합니다.
  5. 정제 BMECs 배양
    1. 구슬에 결합된 내피 세포를 7mL의 완전 내피 배지(10% FBS)에 재현탁합니다.
    2. 세포를 콜라겐으로 코팅된 60mm 플레이트에 하룻밤 동안 씨뿌리세요(2절 참조). 표준 조건(37°C, 5% CO₂)에서 배양하세요.
      참고: 내피 표현형은 기술된 배양 조건 하에서 통도(p) 3까지 보존됩니다. 혈액-뇌 장벽 관련 특성을 유지하기 위해 초기 통과(p0–p3)를 이용한 실험적 분석이 권장됩니다.

5. 세포 특성화

  1. 구슬 포획 세포의 현미경 관찰
    참고: 이 프로토콜에서 설명된 배양 조건 하에서는, 1차 BMECs는 일반적으로 최대 3회(p3) 동안 유지할 수 있으며, 그 특징적인 내피 형태와 표현형을 보존할 수 있습니다. 씨앗 밀도와 성장 속도에 따라 배양은 일반적으로 시험관 내에서약 2–3주까지 유지할 수 있으며, 그 후 중요한 표현형 변화가 발생할 수 있습니다.
    1. CD31 자기 구슬로 면역선택을 한 후, 위상 차비 현미경으로 부착된 세포를 관찰합니다(그림 2A).
      1. CD31 양성 내피세포가 전형적인 자갈암 형태를 보이고 5일에서 7일 이내에 균질한 단일층을 형성하는지 관찰하세요.
        참고: 면역선택 과정에서 CD31 코팅된 자기 구슬은 내피세포에 특이적으로 결합하여 내피 집단을 풍부하게 만듭니다. 선택 과정 후에도 구슬(직경 약 4.5 μm)은 초기 통과 과정에서 내피 세포와 연관되거나 내부화되는 모습을 관찰할 수 있습니다. 이들은 일반적으로 세척과 배양 유지 시 감소하며 BMEC 생존력이나 세포 성장에 방해가 되지 않습니다 (그림 2B).
      2. 균일한 형태와 길쭉하거나 성상교세포 유사 세포의 부재를 이용해 내피 집단의 순도를 추정합니다.
  2. CD31과 GLUT1에 대한 면역형광
    1. 콜라겐 코팅 커버슬립과 배양 위에 2× 3개의 BMEC 를 씨앗하여 80–90% 합류에 도달할 때까지 진행.
    2. 세포를 4% 파라포름알데히드로 상온(22–25 °C)에서 10분간 고정한 후 PBS로 세척합니다.
    3. 0.1% Triton X-100으로 5분간 투과성을 사용하고, 비특이적 결합은 5% BSA로 30분간 차단하세요.
    4. CD31과 GLUT1(뇌내피에 특이적인 포도당 수송체)에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 인큐베이팅합니다.
    5. PBS로 세척하고 적절한 형광 2차 항체와 함께 1시간 배큐하세요.
    6. 핵은 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)으로 반염색하고, 표지판에는 안티페이드 마운팅 매체를 장착합니다.
    7. 형광 현미경이나 공초점 현미경으로 시각화하세요. CD31이 세포 경계에 국한되어 있는 경우(그림 3A), GLUT1은 세포질 및 막 분포를 보여 내피 동일성과 뇌 내피 표현형을 확인해 줍니다(그림 3B).
      참고: 독립적인 BMEC 분리에서 얻은 대표 이미지는 배양된 BMECs의 전형적인 형태학과 표지 발현을 보여줍니다. 클라우딘-5와 같은 타이트 접합 단백질의 존재도 뇌 내피를 특성화하는 데 활용될 수 있습니다. 내피 배양물의 순도를 추가로 평가하기 위해, 다른 신경세포 유형에 대한 음성 마커를 이용해 추가적인 면역형광 염색을 시행할 수 있습니다. 예를 들어, 교세포 섬유산성 단백질(GFAP)은 성상교세포를 검출하는 데 사용될 수 있고, 이온화된 칼슘 결합 어댑터 1(Iba1)은 미소교세포를 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 이 마커들에 대한 염색이 없다는 점은 이러한 비내피 세포군에서 오염이 없음을 확인시켜 줍니다(그림 3C,D).
  3. 튜브 형성 분석
    참고: 내피 세포는 Matrigel 분석18에서 전피신경형성 능력을 보이며, 이 분석법을 통해 내피 정체성을 확인할 수 있습니다.
    1. 96웰 플레이트에 마트리젤을 미리 코팅하고 37°C에서 30분간 중합시킵니다.
    2. 완전 내피 배지 100 μL(10% FBS)에 웰당 10×4 BMEC를 씨앗. 37 °C에서 인큐베이션하여 위상 대비 현미경을 사용해 4–8시간 동안 관 형성을 관찰합니다(그림 4A).
    3. ImageJ(혈관신생 분석기 플러그인)를 사용하여 총 튜브 길이, 접합부 수, 메쉬를 정량화하세요19. (그림 4B).
      참고: BMEC가 상호 연결된 관 구조를 형성하는 능력은 이들의 혈관신생 잠재력과 내피 기능을 확인시켜 줍니다.
  4. 경내피 전기 저항(TEER) 측정
    참고: 뇌 내피 세포는 BBB20의 중요한 구성 요소이므로 단단한 장벽을 형성해야 합니다. 내피가 전기적 장벽을 생성할 수 있는 능력이 확인되어야 합니다.
    1. 상부 구획과 배양물에서 콜라겐 코팅 트랜스웰 삽입물(공구 크기 0.4 μm)에 20,000 BMEC를 씨앗하여 합류점에 도달할 때까지 시딩합니다.
    2. 상피 볼토옴미터를 사용하여 단일층 무결성을 평가합니다. 안정화될 때까지 매일 TEER 값을 기록; 저항성이 증가하면 기능적 내피 장벽의 특징인 단단한 세포 간 접합부가 형성되었음을 나타냅니다 (그림 4C).
      참고: 선발되지 않은 세포 혼합물의 잔재, 특히 성상교세포는 공배양 시스템을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 구성은 상부(BMECs)와 하부(비선택적 세포 혼합) 구획 간의 셀 비율을 신중하게 최적화해야 하며, 각 실험실에서 표준화되어야 합니다. 이 공배양 구성은 이전에 설명한 BBB 모델21에서 변형되었습니다.
    3. 비선택된 세포 혼합물(단계 4.4.2.2)은 배양판 하단 웰에, BMEC는 Transwell 삽입막 상단에 씨앗을 뿌립니다.
      참고: 단일 재배와 공동 배양 조건을 비교한 대표 실험이 TEER 측정을 통해 장벽 조밀성을 평가하도록 포함되었습니다 (그림 4C).

6. 정제된 BMEC의 확장 및 유지

  1. 배양 조건
    1. 정제된 BMECs는 완전한 내피 배양 배양지(10% FBS)에서 37°C, 습도 95%의 가습 인큐베이터에서 5% CO₂를 유지합니다. 배양지를 2-3일마다 교체하여 신선한 영양분을 공급하고 세포 생존력을 유지하세요.
  2. 세포 성장 및 형태 모니터링
    1. 세포 부착, 성장 및 형태를 모니터링하기 위해 매일 위상 차 현미경으로 배양을 관찰하세요. BMECs의 특징적인 자갈석 형태를 찾아보세요. 이 자갈은 5일에서 7일 이내에 합류 단일층을 형성합니다.
  3. 서브컬처링과 통과
    1. 배양 세포가 80–90% 합류율에 도달하면 37 °C에서 0.05–0.1% 트립신을 사용해 3–5분간 세포를 분리합니다.
    2. 트립신을 같은 부피의 완전 배지로 중화시키고, 4°C에서 220 × g에서 10 분간 원 심분리한 후 펠릿을 신선한 내피 배지에 다시 떠올립니다.
    3. 세포를 원하는 밀도로 콜라겐 코팅된 플레이트에 씨앗을 주어 지속적인 확장을 돕습니다.
      참고: 내피 표현형과 기능적 무결성을 유지하기 위해 BMEC 통과 횟수를 3–5회로 제한하세요.
  4. 선택적 냉동 보존
    1. 장기 보관을 위해서는 BMEC를 냉동 배지(완전 내피 배지에 10% DMSO를 넣음)에 재현탁합니다. 조절 속도 냉동고에서 –80 °C까지 점차 동결한 후, 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮깁니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

여기서 설명한 프로토콜은 신생아 마우스(P5)에서 원발성 BMECs의 분리 및 배양을 가능하게 합니다. 이 세포들은 BBB의 주요 세포 구성 요소로, 뇌혈관 생리학과 병태생리를 연구하는 데 귀중한 실험 도구입니다. 형태학적, 표현형적, 기능적 평가를 통해 뇌 미세혈관 내피세포(BMECs)의 성공적인 분리 및 배양이 입증되었습니다.

분리 작업 흐름은 비피질 영역 제거, 효소 소화, BSA 구배를 이용한 미엘린 제거 후 해리된 대뇌 피질에서 유래한 세포 현탁을 얻었으며, 이는 그림 1A–H에 나타난 바와 같다. 원심분리 과정을 거친 후, 세포 내 펠릿을 얻어 이후 배양에 사용했습니다.

분리 후 5일째에는 면역선택 전 혼합 세포 집단이 전체 세포 풀로 구성되어 있었습니다(

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

BMECs의 분리는 뇌졸중을 포함한 다양한 중추신경계(CNS) 병리에서 BBB의 생리와 기능 장애를 조절하는 메커니즘을 연구하는 데 중요한 도구입니다. 불멸화된 세포주와 달리, 1차 BMEC 배양은 뇌 내피의 주요 표현형 및 기능적 특징, 즉 단단히 결합된 단백질의 발현과 생체 내 혈액 생성 능력을 보존합니다. 맥락 8,10.

본 논문은 산후 생쥐 뇌 조직에서 BMECs를 분리하고 배양하기 위한 최적화되고 재현 가능하며 기술적으로 접근 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생존 가능하고 기능성이 뛰어난 내피 풍부 세포 집단을 얻어, 신호 전달 연구, 혈관신생, 장벽 특성 평가에 적합하게 만...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

이 원고의 일부는 OpenAI의 ChatGPT(GPT-4, 2025년 7월 버전)로 작성되어 명료성, 언어, 일관성을 향상시켰습니다. 저자들은 모든 AI 지원 콘텐츠를 비판적으로 검토, 편집, 승인했습니다. 데이터 분석, 결과 해석, 과학적 결론 생성을 위한 AI 도구는 사용되지 않았습니다.

감사의 글

저자들은 GRIVAS Health와 NEUROVAS 소속 연구진의 귀중한 의견에 감사드립니다. 이 연구는 Fondecyt Regular 1240295의 지원을 받았습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
60 mm 배양 플레이트Corning430166
96 웰 배양 플레이트Corning41122107
아세트산Sigma-AldrichA6283
항생제-항진균제(선택 사항)Gibco15240062
Anti-CD31Santa Cruzsc-466941:100
Anti-GFAPThermo Fisher Scientific13-03001:500
Anti-GLUT1Abcamab1157301:200
Anti-Iba1Santa Cruzsc-327251:500
Anti-mouse IgG Alexa Fluor (594 Dye)Thermo Fisher ScientificA-110051:500
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor (488 Dye)Thermo Fisher ScientificA-110081:500
자동 및 혈청 파이펫Oxford LPOXL.OXL.OSP-5C
기본 배지(콜라겐 용액용)Gibco (DMEM)11965092
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9647
Collagenase type IISigma-AldrichC6885
DAPIThermo Fisher Scientific622481 μg/mL
DMEM (고 포도당)Thermo Fisher Scientific11965092
EndoGRO-MV Complete MediumMerck MilliporeSCME004내피 세포 성장 배지
Falcon 튜브(15 및 50 mL)Corning352096 / 352070
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco (Thermo Fisher)16000044
형광 현미경MoticBA410
장갑, 마스크, 실험실 소모품다양한 공급업체—
헤파린(100 U/mL)Sigma-AldrichH3393
역행 현미경OlympusCKX41
마그네틱 분리 자석EasySepNC9284020
오르비탈 셰이커(37 °C)Thermo Fisher ScientificSK-0180-S
ParafilmBemisPM996
PBS (1×)Thermo Fisher Scientific10010023
냉장 원심분리기HITACHICT5RE
스칼펠Fine Science Tools다양함
가위 및 미세 핀셋Fine Science Tools다양함
무균 니트로셀룰로스 멤브레인BIO-RAD1620094
Type I 콜라겐Corning30394
```

참고문헌

  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. , (2020).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. , (2006).
  3. Saili, K. S., et al. Blood-brain barrier development: systems modeling and predictive toxicology. Birth Defects Res. , (2017).
  4. Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. J Neuroimmune Pharmacol. , (2006).
  5. Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. , (2010).
  6. Crouch, E. E., et al. Ensembles of endothelial and mural cells promote angiogenesis in prenatal human brain. Cell. , (2022).
  7. Risau, W. Developing brain produces an angiogenesis factor. Proc Natl Acad Sci U S A. , (1986).
  8. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: an overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. , (2016).
  9. Assmann, J., et al. Isolation and cultivation of primary brain endothelial cells from adult mice. Bio Protoc. , (2017).
  10. Bernard-Patrzynski, F., et al. Isolation of endothelial cells, pericytes and astrocytes from mouse brain. PLoS One. , (2019).
  11. Czupalla, C., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. Collagenase-based single cell isolation of primary murine brain endothelial cells using flow cytometry. Bio Protoc. , (2018).
  12. Nicolicht-Amorim, P., et al. Simple and efficient protocol to isolate and culture brain microvascular endothelial cells from newborn mice. Front Cell Neurosci. , (2022).
  13. Lee, K. H., Lee, D. W., Kang, B. C. The 3Rs principles in laboratory animal experiments. Lab Anim Res. , (2020).
  14. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington (DC). (2011).
  15. American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg (IL). (2020).
  16. Ruck, T., et al. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  17. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. , (2021).
  18. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  19. Carpentier, G., Berndt, S., Ferratge, S., Rasband, W., Cuendet, M., et al. Angiogenesis analyzer for ImageJ: a comparative morphometric analysis of "endothelial tube formation assay" and "fibrin bead assay". Sci Rep. , (2020).
  20. Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies. Int J Mol Sci. , (2024).
  21. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB J. , (2002).
  22. Liebner, S., Czupalla, C. J., Wolburg, H. Current concepts of blood-brain barrier development. Int J Dev Biol. , (2011).
  23. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. , (2010).
  24. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. , (2005).
  25. Rahman, N. A., Rasil, A. N. H. M., Meyding-Lamade, U., Craemer, E. M., Diah, S., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: a systematic review. Brain Res. , (2016).
  26. Wu, W. Z., Bai, Y. P. Endothelial GLUTs and vascular biology. Biomed Pharmacother. , (2023).
  27. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines (Basel). , (2021).
  28. Pusztaszeri, M. P., Seelentag, W., Bosman, F. T. Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand factor, and Fli-1 in normal human tissues. J Histochem Cytochem. , (2006).
  29. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. , (2023).
  30. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: from physiology to disease and back. Physiol Rev. , (2019).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

신경과학제233호제233호이달의 JoVE호뇌혈관내피세포일차 배양혈뇌장벽뇌 혈관신생
마우스 뇌 미세혈관 내피세포의 분리 및 배양
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.