성인 줄기세포에서 인간 후각 상피 오가노이드의 생성 및 분화

요약

이 프로토콜은 성인 인간의 상하갑개 조직에서 후각 전구세포를 분리하여 후각 상피 오가노이드를 생성하는 확립된 접근법을 제시합니다. 또한 이 오가노이드들을 성숙한 후각 감각 뉴런으로 분화시키는 화학적 유도 전략을 상세히 설명하여, 인간의 후각 신경 생성 모델링을 가능하게 합니다.

초록

인간의 후각 상피는 기저 줄기세포 집단에 의해 유지되는 놀라운 신경 생성 능력을 가지고 있습니다; 그러나 이 재생 과정을 충실히 재현하는 역동적인 시험관 내 모델을 구축하는 것은 도전적임이 입증되었습니다. 여기서는 성인 인간 상갑개 조직에서 분리된 전구세포로부터 후각 오가노이드를 생성하는 확립된 프로토콜을 제시합니다. 이 오가노이드는 SOX2 발현으로 확인되듯 줄기를 유지하며, 미성숙 신경 마커 GAP43의 균일한 발현과 성숙한 후각 감각 뉴런 마커 OMP의 말초 위치 지정이 특징인 공간적으로 조직된 분화 패턴을 보인다. 이후 노치 억제제 LY411575, Wnt 활성화제 CHIR-99021, 레티노산을 이용한 표적 분화는 OMP와 신경 마커 표지 Tuj1(클래스 III β-튜불린)을 공동 발현하는 마커 양성 후각 감각 신경세포를 생성했습니다. 이 인간 유래 모델은 마우스 시스템의 한계를 우회하여 후각 신경 생성, COVID-19 관련 무감각 및 기타 후각 관련 신경퇴행성 질환을 연구할 수 있는 견고한 시험관 내 플랫폼을 제공합니다.

서론

인간 후각계는 연속적인 신경 발생을 지원^{하며, 이} 과정은 주로 후각 상피의 기저 줄기세포, 특히 수평 기저세포(HBC)와 구상기저세포(GBCs)에 의해 촉진됩니다. ^2,3개의 GBC는 지속적으로 후각 감각 신경세포(OSN)로 분화하는 반면, HBC는 손상에 의해 활성화될 때까지 조용히 있습니다. ^4,5 후각 지각은 후각 분자가 OSN의 섬모에 있는 수용체에 결합하면서 신호 전달 연쇄 반응이 시작되어 후각구와 피질에 정보를 전달합니다. ⁶ 이 감각 기능의 발달과 유지는 후각 상피에 의해 조절됩니다.

신체적, 화학적, 생물학적 자극으로 인한 후각 기능 장애는 종종 자연스럽게 해결됩니다. ⁷ 그럼에도 불구하고, 전 세계 인구의 1.5%에서 25%에 영향을^미치며, 외상, ^감염, 알츠하이머병, 파킨^{슨병 등} 신경퇴행성 질환 등 다양한 원인으로 발생할 수 있습니다. 이러한 경우, 자연 회복은 종종 불완전하거나 부재합니다. 후각 훈련과 코르티코스테로이드 투여와 같은 현재의 치료법은 제한적인 효과를 보입니다. ^12,13 이 치료적 격차는 후각 신경상피의 생존과 손상 후 재생을 지배하는 메커니즘에 대한 불완전한 이해에서 비롯되며, 이는 인간 후각 생물학 연구를 위한 기존 시험관 내 모델의 부실함으로 인해 지식 격차가 더욱 심화된다.

최근 몇 년간 다양한 인간 오가노이드 모델의 개발로 인해 인간 질병 연구를 위한 새로운 기술적 플랫폼이 만들어졌습니다. 성인 줄기세포(AdSCs)에서 유래한 ¹⁴개의 오가노이드, 즉 조직 거주 줄기세포는 위, 간, 췌장, 폐, 방광 등 다양한 내배엽 유래 조직에 성공적으로 생성되었습니다. ^{15, 16, 17, 18, 19} 반면, 외배엽에서 유래한 후각 판에서 인간의 후각 상피 오가노이드를 확인하는 것은 기술적으로 여전히 도전적이다. 주요 실질적 도전 과제는 인간 상갑갑이에서 생존 가능한 후각 상피 조직을 일관되게 얻는 어려움입니다. 후각 부위의 위치와 범위는 개인마다 크게 다르며, 노화에 따라 뚜렷한 퇴행을 겪습니다. 호흡기상피가 후각 상피가 아닌 호흡기를 우연히 채취하면 배양 결과에 영향을 미칩니다. 이를 해결하기 위해 Ren 등은 2021년 프로토콜을 개선하여 인간 후각 점막에서 세포 클러스터를 성공적으로 배^{양하여 인간} 후각 상피 오가노이드를 신뢰성 있게 생성했습니다. 우리의 접근법은 3차원적이고 계층적으로 조직된 구조를 가진 인간 후각 상피 오가노이드를 생성하고, 이들이 후각 감각 뉴런으로 분화되는 것을 지원합니다. 이 모델은 후각 상피 줄기세포의 운명을 결정하는 기전을 조사하고 후각 장애에 대한 잠재적 치료제를 선별하는 데 귀중한 실험 플랫폼을 제공합니다.

명확히 요약하자면, 이 방법의 주요 목적은 성체 전구세포로부터 인간 후각 상피 오가노이드를 생성하고 구분하는 표준화된 작업 흐름을 확립하는 것입니다. 이 접근법의 근거는 인간 후각계의 생리학적으로 관련된 시험관 내 모델이 부재함으로써 생긴 중요한 격차를 해소하기 위함입니다. 전통적인 2차원(2D) 단층 배양이나 쥐 모델과 비교할 때, 이 3차원(3D) 인간 유래 시스템은 후각 점막의 복잡한 공간 조직과 인간 특이적 유전적 맥락을 충실히 재현한다는 뚜렷한 장점을 제공합니다. 연구자들이 이 프로토콜을 고려하려면, 인간 상갑개에서 생존 가능한 후각 상피를 정확히 분리하면서도 호흡 상피 오염을 피하는 것이 매우 어렵고 환자의 연령과 개인별 해부학적 차이에 크게 영향을 받는다는 점을 인식하는 것이 필수적입니다. 따라서 이 프로토콜은 인간 임상 표본에 지속적으로 접근할 수 있고, 인간 후각 신경 생성, 바이러스 유발 후각 상실, 또는 신경퇴행성 질환과 관련된 후각 결손을 모델링하려는 연구자들에게 특히 적합합니다.

프로토콜

이 연구는 쓰촨성 대학교 화서병원 기관심사위원회(IRB)의 승인을 받아 수행되었습니다(승인번호 2024 (31)). 조직 채취 및 데이터 출판 전에 모든 참여 환자로부터 서면 동의를 받았습니다. 상부 하비개 조직 표본은 뇌척수액 비경에 대한 내시경 두개저저 수술 또는 사골동동 수술을 받은 환자들로부터 채취되었습니다.

1. 조직 샘플 처리 및 운송

1. 채취 직후, 조직 샘플을 DMEM/F12/HEPES 기저 배지에 10% 태아 소 혈청과 5% 페니실린-스트렙토마이신 용액이 보충된 사전 냉각 멸균 배지에 넣고 4°C에서 실험실로 운반합니다.
   참고: 이 세럼은 세포 생존력을 유지하는 데 도움을 주며, 항생제 혼합물은 운송 중 미생물 오염을 방지합니다. 세포 생존을 위해 이동 시간을 2시간 이내로 유지하세요.

2. 조직 전처리 (얼음 위에서 수행)

1. 샘플을 미리 냉각된 멸균 배양 접시로 옮긴 후 운반 배양지를 제거한 후, 5% 페니실린-스트렙토마이신 용액이 포함된 변형된 PBS 버퍼로 조직을 세척합니다. 세척 방법은 다음과 같습니다: 미리 냉각된 세척액 5mL를 접시에 넣고, 조직을 5–7번 부드럽게 두드린 후 액체를 완전히 흡인합니다. 이 세척 사이클을 3번 반복하여 혈액 세포와 조직 이물질을 제거합니다.
2. 멸균 미세가위를 사용해 조직을 약 1–2 mm³ 크기의 조각으로 잘게 만듭니다.
   참고: 이 단계에서 조직 수분 공급을 유지하고, 둔한 팁 겸자로 고정하며, 세포 생존 시간을 최소화하여 세포 생존력을 유지하세요.

3. 효소 소화

1. 기계적으로 해리된 조직을 15 mL 원심분리관에 옮기고, 37 °C 예열된 화합 소화 완충제(0.125% 트립신과 10 U/mL DNase I 포함)를 추가하여 효소 대 조직 부피 비율을 3:1로 유지합니다. 튜브를 37°C 물에 넣고 부드럽게 저으며 20분간 부양하세요. 소화 진행 상황을 모니터링하고 조직 응집을 방지하기 위해 5분마다 샘플을 점검하세요.
2. 소화를 멈추려면 같은 양의 종결액, DMEM/F12/HEPES 기저 배지를 10% 태아 소 혈청으로 보충합니다. 혼합물을 10번 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 효소와 억제성 성분 간의 완전한 혼합과 효과적인 접촉을 보장합니다.
   참고: 혈청에 포함된 α1-안티트립신은 트립신 활성을 효과적으로 중화합니다.

4. 단셀 현탁액 준비

1. 50 mL 원심분리기 튜브 위에 40 μm 셀 체를 올려놓습니다. 절단된 1 mL 피펫 팁을 사용해 소화 조직과 액체를 15 mL 튜브에서 체로 옮깁니다. 피펫 팁으로 필터 위의 물질을 부드럽게 휘어 통과를 원활하게 한 후, 1–2mL의 종결 용액으로 체를 세척합니다. 모든 액체가 체를 통과한 후, 50mL 튜브에서 새로운 15mL 원심분리관으로 여과액을 옮깁니다.
2. 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 현상액을 원심분리합니다. 튜브 바닥에 뚜렷한 세포 펠릿을 관찰하고 상청액을 조심스럽게 흡인하여 약 100 μL을 남겨 세포 펠릿을 방해하거나 손실하지 않도록 하세요.

5. 3차원 문화 체계 구축

1. 세포 펠릿을 배양 배지에 재현탁하지 않고, 미리 냉각된 저결합 피펫 팁을 사용해 마트리젤과 직접 결합하여 정확한 10,000 세포/μL의 밀도를 얻습니다. 이 세포-마트리젤 혼합물을 24웰 플레이트의 각 웰에 40 μL, 유리 바닥 공초점 접시에 20 μL을 투여합니다. 판을 37°C에서 30분간 배양하여 마트리젤이 중합하여 3차원 스캐폴드를 형성하도록 합니다.
2. 마트리젤 고화 후, 젤을 손상시키지 않도록 웰 벽을 따라 500 μL의 무후각 신경 줄기세포 배양지를 부드럽게 첨가합니다. 배양균을 37°C의 가습 인큐베이터에 5% CO₂로 보관하고, 매개체는 3일마다 신선한 예열된 배지로 교체하세요.
   참고: 후각 신경 줄기세포 배양지는 DMEM/F12/HEPES와 다음 성분을 보충하여 구성됩니다: R-스폰딘 1(200 ng/mL), 노긴(100 ng/mL), Wnt3a(50 ng/mL), EGF(50 ng/mL), Y-27632(10 μM), 1차 항균제(100 μg/mL), N2 보충제(1%), B27 보충제(2%), L-글루타민(1%).

6. 통과와 분화

1. 오가노이드 회수 용액은 사용 전에 얼음 위에 10분간 미리 냉각하세요; 웰에서 배양지를 흡입한 후, 각 웰에 1mL의 얼음 냉각 회수 용액을 추가합니다. 판을 45° 각도로 기울이고 부드럽게 흡입한 후 용액을 5–7회 분사하여 기저막 매트릭스에서 오가노이드를 떼어내고 그 결과 현탁액을 15mL 원심분리관으로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 3–5분간 배양한 후, 300 × g 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 상상액을 조심스럽게 제거하여 약 100 μL의 액체를 남겨 펠릿 손실을 방지합니다.
2. 세포 펠릿에 1mL의 오가노이드 해리 시약을 직접 첨가하고, 37°C에서 220rpm에서 부드럽게 흔들며 5분간 배양합니다. 즉시 소화를 종료하기 위해 같은 부피의 스톱 액을 추가하고, 혼합물을 5번 부드럽게 위아래로 움직여 균질성을 유지하세요. 300 × g 원심분리기를 4°C에서 5분간 원심분리하여 해리된 세포를 수집합니다.
3. 세포 펠릿을 Matrigel에 24웰 플레이트의 경우 웰당 40 μL 용량으로, 유리 바닥 공초점 배양 접시의 경우 웰당 20 μL 용량으로 재현탁합니다; 미리 냉각된 저결합 피펫 팁을 사용해 균일한 현탁을 유지하세요. 적절한 배지나 접시에 씨앗을 뿌린 후, 37°C에서 30분간 배양하여 마트리젤 중합과 3차원 스캐폴드 형성을 돕습니다. 그 후 젤을 교란하지 않도록 웰 벽을 따라 후각 신경 줄기세포용 특수 혈청 무첨가 구상 배양지 500 μL을 부드럽게 첨가합니다. 배양물을 인큐베이터에서 37°C, CO₂ 5%, 상대습도 95%로 유지하세요.
4. 통과 후 약 7일 후, 새로운 세대의 후각 상피 오가노이드가 구체로 재형성되면, 유리 바닥 공초점 접시에서 팽창 배지를 흡입하고 분화 배지로 교체합니다. 분화 배지를 신선하고 미리 데운 배지로 3일마다 교체하세요. 형태학적으로 구분되는 후각 신경세포는 보통 약 7일 분화 후 현미경 검사에서 드러납니다.
   참고: 분화 배지는 DMEM/F12/HEPES에 R-Spondin 1(200 ng/mL), Noggin(100 ng/mL), Wnt3a(50 ng/mL), EGF(50 ng/mL), Y-27632(10 μM), LY411575(5 μM), CHIR99021(3 μM), 레티노산(RA, 1 μM), 1차 항균제(100 μg/mL), N2 보충제(1%), B27 보충제(2%), L-글루타민(1%)을 보충하여 구성됩니다.

7. 면역형광

1. 배양지를 흡입한 후 샘플을 500 μL PBS로 부드럽게 세척합니다. PBS를 제거한 후 4% 파라포름알데히드 500 μL 첨가하여 샘플을 실온에서 15분간 고정합니다. 고정액을 흡입하고 버리세요; 고정된 샘플을 PBS(3 x 500 μL)로 세척하여 4 °C에서 최대 48시간 동안 보관합니다.
2. PBS를 흡입하고 500 μL 투과용액(0.2% Triton X-100 in PBS)을 추가한 후 상온에서 15분간 배양한 후 흡입 후 용액을 버립니다. 샘플을 0.02% PBST(0.02% Triton X-100 in PBS; 3 x 500 μL)로 세척하세요.
3. 500 μL 블로킹 용액(PBS 내 3% BSA)을 추가하고 상온에서 1시간 배양합니다.
4. 차단 용액을 흡입한 후, 적절한 1차 항체(예: 1:160의 항-GAP43, 1:50의 항-OMP, 1:50의 항-SOX2)를 희석하여 500 μL 1차 항체 용액으로 교체하고, 4°C에서 하룻밤 배양합니다. 다음 날, 1차 항체 용액을 흡입하고 0.02% PBST(3 x 500 μL)로 샘플을 세척합니다.
5. 500 μL 2차 항체 용액을 추가하고, 여기에는 Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 555가 결합된 2차 항체를 차단액에 1:500 희석한 상태로 넣고, 실온에서 어두운 환경에서 1시간 배큐합니다. 2차 항체 용액을 흡입하고 0.02% PBST(3 x 500 μL)로 추가 세척을 수행합니다.
6. DAPI 작업 용액 500 μL(DAPI PBS에 희석됨)을 추가하고 어두운 곳에서 10분간 배양하여 핵을 염색합니다. DAPI 용액을 흡입하고 0.02% PBST(3 x 500 μL)로 샘플을 세척합니다. 염색된 샘플은 영상 촬영 전 최대 48시간간 4°C에서 보관하세요.

8. 공초점 현미경 영상

1. 직경 ≤100 μm의 오가노이드에 대해서는 Z축 크기의 1 μm, 100 μm 이상의 오가노이드의 경우 0.5 μm의 공초점 현미경을 수행합니다. 다중 채널 순차 모드로 이미지를 획득하며, DAPI, FITC, TRITC, Cy5 순서대로 스캔합니다. 획득한 Z-스택 이미지 시퀀스 파일을 3D 렌더링 소프트웨어(예: Imaris)에 가져오세요. 3D 부피 렌더링 기능을 활용해 오르가노이드의 완전한 3차원 모델을 생성하세요. 이 재구성된 모델을 관찰하여 특정 세포 마커(예: SOX2, GAP43, OMP)의 공간적 분포를 시각화하고, 후각 상피 오가노이드의 계층적 구조와 신경 분화 상태를 최종 종착점으로 정성적으로 확인하라.

결과

후각 상피 조직의 분리 및 1차 후각 상피 오가노이드 배양
후각 상피 오가노이드의 배양 시스템을 구축하기 위해, 우리는 인간 상갑갑개 조직에서 후각 상피를 분리하여 3차원 매트리겔 매트릭스에 삽입했습니다(그림 1). Ren 등이 보고한 정의된 배양 조건을 바탕으로, 우리는 주요 성장 인자인 EGF, Noggin, Wnt3a, R-pondin 1의 농도와 ROCK 억제제 Y-27632를 검증하고 미세 조정하였습니다. 이 조합은 후각 상피 오가노이드의 클론 확장과 증식을 견고하게 지지했다. 이러한 조건에서 단일 후각 상피세포는 Matrigel에서 생존하여 1차 배양 후 7–12일 이내에 고전적인 구형 오가노이드로 발달했습니다(그림 2). 12일간 배양한 오가노이드는 고정되어 신경 줄기세포 재생 능력 유지에 중요한 전사 인자인 SOX...

토론

오르가노이드는 자기조직화되는 3차원 구조가 토착 인간 조직과 거의 동일하며, 경우에 따라 실제 기관과 조직학적으로 구별이 불가능할 수 있어 독특한 시험관 내 모델을 대표합니다. ^따라서 인간 오가노이드 모델 구축은 인간 질병 연구에 매우 중요합니다. 여기서는 성숙한 후각 감각 뉴런으로 신뢰성 있게 분화하는 1차 인간 후각 상피세포로부터 오가노이드 배양 시스템을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 오르가노이드 생성에 마우스 후각 상피에만 의존해온 기존 방법들의 한계를 극복^{하며, 인간} 후각 장애의 스펙트럼과 그 근본적인 병리학적 기전을 연구할 수 있는 견고한 기반을 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ALEXA FLUOR 488 DONKEY	Thermo	A11055	1:500
ALEXA FLUOR 555 DONKEY	Thermo	A31572	1:500
Anti-GAP43 항체	Abcam	ab75810	1:160
Anti-OMP 항체	SANTA CRUZ	sc-365818	1:50
Anti-Sox-2 항체	SANTA CRUZ	sc-365823	1:50
B-27 보충제	Gibco	17504044	2%
CHIR99021	Novoprotein	HY-10182	3 μM
DMEM/F12/HEPES	Procell	PM150310	/
Glutamax (L-글루타민 보충제)	Gibco	35050061	1%
LY411575	Novoprotein	HY-50752	5 μM
Matrigel (기저막 매트릭스)	Corning	356231	4% (Vol/Vol)
N-2 보충제	Gibco	17502048	1%
오르가노이드 분리 시약	Precedo	PRS-ODR	/
오르가노이드 회수 용액	Thewellbio	MS04-100	/
프리모신(1차 항균제)	Invivogen	ant-pm-05	100 μg/mL
재조합 인간 EGF	Novoprotein	C029	50 ng/mL
재조합 인간 Noggin	Novoprotein	CB89	100 ng/mL
재조합 인간 RSPO1	Novoprotein	CX83	200 ng/mL
재조합 인간 Wnt3a	Novoprotein	C18K	50 ng/mL
레티노산	MCE	HY-14649	1 μM
Y27632	MCE	HY-10071	10 μM