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방법 논문

노화 세포에서 조건화된 배지를 이용한 시험 관 내 모델 내 건강한 세포 간 소통 복원을 위한 항산화제의 새로운 조합

214 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70923

⸱

2026년 4월 24일

 , 
1Biotechnology Unit, Mesoestetic Pharma Group

이 논문에서

요약

이 방법은 노화된 피부 섬유아세포가 건강한 피부에 미치는 영향을 연구합니다. 노화는 UVB 노출로 유도되며, 조절된 배지를 정상적인 섬유아세포에 적용합니다. 피부 노화 과정에서 세포 간 소통 변화를 표적으로 하는 생리활성 화합물을 평가하는 데 도움을 줍니다.

초록

피부 노화는 분자 및 세포 수준에서의 변화에 의해 촉진되는 다요인 과정으로, 노화의 특징이라고도 합니다. 이 변화 중 하나는 세포 간 통신의 변화로, 피부 조직 기능 장애와 구조적 손상에 기여합니다. 여기서는 건강한 섬유아세포를 노화 섬유아세포에서 나온 조건화된 배지와 함께 배양하여 이러한 피부 노화 특징을 모방하는 시험관 내 모델을 제시합니다. 첫째, UVB 방사선 노출된 섬유아세포를 광노화와 관련된 유전자 발현 변화를 분석할 수 있습니다. 둘째, UVB에 의해 유도된 노화 섬유아세포에서 조건화된 배지를 채취하여 건강한 섬유아세포에 이식할 수 있으며, 이를 통해 세포외 기질 단백질의 하향 조절과 염증성 사이토카인 유전자 발현의 상향 조절을 촉진합니다. 이러한 변화는 새로운 항산화제 조합(비타민 C + 이데베논)을 사용하여 상쇄됩니다. 이 결과들은 시험관 내 모델이 피부 피부 피부 세포 노화 특징에 대한 새로운 화합물의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있음을 보여주며, 이를 통해 피부 재생 및 회춘 세포 과정을 조절할 수 있는 화합물을 선택할 수 있음을 보여줍니다.

서론

피부 노화는 피부 기능과 특성이 자연스럽게 감소하는 과정으로, 단단함과 탄력 상실, 처짐 증가 등이 포함됩니다. 이는 자외선(UV) 노출과 오염과 같은 외부 요인에 의해 가속화되며, 이들은 세포를 손상시키고 분자수준 1에서 변화를 일으킵니다. 이러한 변화들은 최근 연구에서 잘 규명되었으며, 유전체 불안정성, 텔로미어 소멸, 후생유전학적 변화, 단백질 정상성 상실, 결함 있는 대자가포식, 영양 감지 조절 불량, 미토콘드리아 기능 장애, 세포 노화, 줄기세포 고갈, 세포 간 통신 변화, 만성 염증, 그리고 이성균 2 등이포함됩니다. 이러한 특징들은 세포 내 손상이 조직 기능 장애로 이어져 노화 과정을 촉진하는 과정을 설명합니다. 흥미롭게도 이러한 변화는 독립적으로 작용하지 않고 상호 의존적인 네트워크 서명을 형성합니다. 유전체 손상이나 후생유전학적 변이와 같은 1차 손상이 축적되어 결국 세포 노화를 초래합니다. 피부의 경우 주로 자외선 손상에 의해 발생하며, 광노화가 피부 노화 특성의 주요 원인입니다3. 노화 세포는 촉진염증 사이토카인, 기질 금속단백효소, 성장 인자의 생성이 증가하는 모습을 보이며, 이는 노화 관련 분비 표현형(SASP)으로도 알려져 있으며, IL6, IL8, MMP1, MMP3, TNFA, IL1A 등 다양한 형태를 포함합니다 4,5,6. 이러한 분비 인자들은 피부의 구조적 특성, 예를 들어 피부 세포외 기질뿐만 아니라 주변 세포의 기능도 방해합니다. 여기에는 멜라닌세포 활성화를 자극하여 나이 관련 피부 과다색소침착(예: 줄기세포 인자, IL18)이나 주변 건강한 섬유아세포의 기능을 변화시키고 노화 표현형 7,8,9,10,11의 증폭을 강화하는 기타 손상 단백질의 방출이 포함됩니다. 그 결과, 만성 염증과 세포 간 소통 변화가 주름, 처짐, 노화 반점, 단단함 상실 등 피부 노화의 시각적 징후로 나타나는 손상 상태를 촉진하는 주요 원인이 됩니다.

SASP의 해로운 영향을 유발하는 특정 단백질은 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 루미넥스, 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR), 웨스턴 블롯 등 잘 알려진 기법을 통해 연구할 수 있다 5,12. 그러나 이 접근법은 개별 관점에서 특정 단백질을 식별하고 특정 작용 기전을 특성화하는 데 유용하지만, 전체 SASP가 인접 세포에 미치는 영향을 고려하지 않는다. 여기서는 UVB 유도 노화 피부 섬유아세포가 건강한 이웃 섬유아세포에 미치는 SASP의 영향을 연구하는 시험관 내 프로토콜을 제안하는데, 이는 노화의 세포간 통신 변화 특징을 모방한다. 앞서 언급했듯이, 자외선은 피부 세포 노화의 주요 원인이다. 따라서 복제성 또는 종양유전자 유발 노화보다 자외선 손상이 손상의 원인으로 선택되어 현재 모델3을 구축합니다. 이를 위해 노화 섬유아세포가 분비하는 인자(조건화된 배지)를 포함한 배지를 사용하고, 이 배지와 함께 배양한 건강한 섬유아세포에서 세포 기능 표지를 정량합니다. 이 프로토콜에 따르면, 조절된 배지가 노화 세포에서 건강한 세포로 옮겨지면, UVB 유도 노화 섬유아세포를 채취하여 염증 촉진 및 파라크린 신호 전달에 관여하는 유전자와 같은 분자 특성을 정량합니다. 둘째, 노화 섬유아세포에서 나온 조건 배지로 처리한 건강한 섬유아세포를 채취하여 SASP가 인접 세포에 미치는 영향을 특성화하고, 세포외기질, 성장 인자, 섬유아세포 활성화에 관여하는 유전자를 정량화합니다. 따라서 관심 화합물(COI)의 효과는 처음에는 노화된 섬유아세포에서, 이후에는 조절된 배지를 사용한 건강한 섬유아세포에서 모두 분석됩니다. 이들 화합물에 관해, 이전 연구들은 항산화제가 광노화로 인한 피부 노화의 징후를 보호하고 교정하는 데 효과적임을 보여주었습니다. 따라서 두 가지 항산화제(비타민 C와 이데베논)의 조합은 노화 세포와 노화 세포의 조건 배지로 배양된 건강한 세포 모두에서 UVB에 의해 유발된 일부 변화를 되돌리는 데 사용됩니다 13,14,15

전반적으로 이 프로토콜은 SASP가 피부 세포에 미치는 영향을 연구하고, 변화된 세포 간 소통을 회복하는 새로운 분자/중재를 규명하여 미용 의학 및 재생 피부과에서 재생 및 생체자극 제품에 적합하도록 설계되었습니다.

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프로토콜

본 연구에서 사용된 인간 피부 섬유아세포는 상업용 세포주 제공자로부터 획득하였습니다. 1차 인간 샘플, 환자 데이터, 또는 생체 내 실험이 포함되지 않았기 때문에, 이 연구에는 기관심의위원회(IRB)의 승인과 사전 동의가 필요하지 않았습니다.

1. UVB를 이용한 진피 섬유아세포의 노화 유도

  1. 6웰 플레이트에서 6웰 플레이트에 6× 104세포 밀도의 인간 피부 섬유아세포를 10% 태아 소 혈청(FBS)을 첨가하여 6웰 플레이트에 부착합니다.
  2. 24시간 후에는 세포 배양지를 제거하고 웰당 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 교체합니다.
  3. 세포에 25 mJ/cm 2의 UVB 빛을 조사하세요.
    참고: 이 에너지는 본 프로토콜에서 사용된 UVB 방사선 장치에 최적화되어 있습니다(재료표 참조). 노화를 유발할 충분한 손상을 유도하면서 세포자멸사로 이어질 수 있는 과도한 손상을 피할 수 있습니다. 다른 장치를 사용할 때는 방사선 에너지를 적절히 조절하세요.
    주의: UVB 방사선은 위험합니다. 적절한 보호 장비와 차폐 장비를 사용하여 노출을 피하세요.
  4. PBS를 제거하고 웰당 2mL의 신선한 세포 배양지를 추가하세요.
  5. 72시간 후 세포 배양지를 제거하고, 웰당 1mL의 PBS를 추가한 후 1.3단계에서 설명한 대로 UVB 조사를 반복합니다.
  6. 72시간 후 세포 배양지를 제거하고 웰당 0.05% 트립신-EDTA 0.5 mL를 추가합니다. 37 °C에서 1–2분간 배양한 후 신선한 배양 배지 1.5mL로 세포를 수확합니다.
  7. 세포 배양 배지를 사용해 6웰 플레이트에서 웰당 8×4 개의 세포 밀도로 세포를 배양액(DMEM에 10% FBS을 보충)을 사용해 도판합니다. 이 단계 후 세포 노화가 유도됩니다.

2. 관심 화합물을 이용한 노화 세포 처리

  1. 24시간 후에는 배양지를 제거하고 관심 있는 화합물을 포함한 배양 배양 배지 2mL를 추가합니다.
  2. 추가로 24시간 후, 1.1단계에서 설명한 단계에 따라 6웰 플레이트에 인간 피부 섬유아세포를 별도의 배치로 플레이트링합니다. 이 세포들은 조절된 배지 전달을 위한 건강한 피부 섬유아세포 역할을 합니다.

3. 노화 세포에서 건강한 세포로의 조건 배지 이동

  1. 노화 세포 화합 처리 후 48시간, 건강한 섬유아세포 도판 후 24시간에, 노화 세포에서 2mL의 조절된 배지를 1우물에 채취하여 건강한 섬유아세포로 옮깁니다.
    참고: 건강한 섬유아세포에서 배양지를 제거한 후 조건화된 배지를 넣기 전에 반드시 제거하여 효율적인 전달을 보장합니다.
  2. 노화 세포에 1mL의 PBS를 추가하고 1.6단계에서 설명한 트립신으로 채취합니다. 이 세포들을 ELISA 키트나 qPCR을 사용하여 노화 또는 염증 마커 분석에 사용하세요.
    참고: 하류 분석이 즉시 수행되지 않을 경우 셀 펠릿은 −80 °C에서 보관될 수 있습니다.
  3. 건강한 섬유아세포를 37°C, 5% CO₂ 배지에서 24시간 배양합니다.

4. 유전자 발현 분석을 통한 섬유아세포 활성화 분석을 위한 건강한 세포 수확

  1. 조절된 배지와 24시간 배양 후, 1.6단계에서 설명한 대로 트립신을 사용해 건강한 섬유아세포를 채취합니다. qPCR을 이용해 세포외 기질 유전자 발현을 분석합니다.
  2. qPCR 분석을 수행하세요.
    1. 제조사의 지침(RNA 추출 키트)에 따라 세포 펠릿에서 RNA를 추출하세요.
    2. 제조사의 지침에 따라 200 ng RNA의 역전사(역전사 키트)를 수행하세요.
    3. 제조사 지침에 따라 cDNA를 증폭하세요(qPCR 마스터 믹스). qPCR은 다음 조건에서 수행합니다: 95 °C에서 30초, 이어 95 °C에서 5초, 60 °C에서 30초 40회 사이클. 사용된 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다.
진순방향 시퀀스역순
CDKN2A5'-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3'5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3'
CDKN1A5'-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3'5'-CCAGGACTGAGGCTTCCT-3'
SCF5'-AATCCTCTCGTCAAAACGAAGG-3'5'-CCATCTCGCTTATCCACAAATGA-3'
IL-185'-TGCAGTCTACACAGCTTCGG-3'5'-GTTTGTTGGGAGGAGAGCG-3'
ELN5'-GCAGGAGTTAAGCCCAAGG-3'5'-TGTAGGGCAGTCCATAGCCA-3'
FBN15'-GGTGAATGTACAAACACACAGTCAGCAG-3'5'-ATAGGAAGAGCACCATGTTGTGTGA-3'
IL-65'-AGCCCTGAGAAAGGAGACATGTA-3'5'-TCTGCCAGTGCCTCTTTGC-3'
IL-85'-ATTTCTGCAGCTCTGTGTGAAGGT-3'5'-TTTTTTATGAATTCTCAGCCCTCT-3'
CTGF5'-GGAAATGCTGTGAGGAGTGTGT-3'5'-TGTCTCTCAGTCGTAGGGAGGCTA-3
IGF15'-CAGAGCATAGAGACCTGCG-3'5'-CAGGTAACTCGTGCAGAGCA-3'

표 1: qPCR 검사에 사용되는 프라이머 목록. 이 모델에서 연구 및 정량된 유전자에 대응하는 각 프라이머에 대해 순방향 및 역서열이 제공됩니다.

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결과

본 프로토콜은 시험관 내 노화의 세포 간 통신 특징 변화를 시뮬레이션하는 방법을 설명합니다. 그림 1 은 노화 유도, 마커 정량화, 시험 관 내 피부 세포 내 세포간 통신 변화 분석 등 프로토콜의 주요 단계를 보여주는 그래픽 도식을 보여줍니다.

figure-results-1
그림 1: 주요 단계를 포함한 프로토콜의 그래픽 요약. 프로토콜의 주요 단계에 대한 개요. 먼저, 건강한 섬유아세포에서 UVB 손상을 이용해 노화를 유도합니다. 다음으로, 노화 섬유아세포는 관심 화합물(...

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토론

분자 수준에서 노화 과정을 이해하는 것은 노화 관련 특징을 지연시키고 세포와 조직의 수명과 기능을 연장하는 새로운 접근법과 개입을 설계하는 데 핵심이다. 노화의 특징을 정의하고 식별하는 것은 이러한 중재 개발을 위한 과학적 틀을 마련하는 데 필수적이었다 2,16. 노화의 인정된 특징 중 하나로, 세포 간 통신 변화는 세포 간 신호 전달이 저하되고 기능 장애가 특징이며, 이는 연령 관련 조직 퇴화를 촉진한다. 노화 피부에서는 노화 세포의 축적이 염증성 미세환경을 촉진하여 인접한 비노화 세포의 기능 능력을 변화시키고, 이는 다시 세포 활동 저하로 조직 손상을 악화시킨다. 이 현상은 세포외 기질 단백질과 성장 인자의 합성 감소, 그리고 기질 금속단백효소와 같은 해로운 단백질 수치의 증가로 절정에 달하며, 결국 피부 노화의 눈에 보이는 징후로 나타나는데, 여기에는 칙칙한 ...

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공개 사항

모든 저자는 메소에스테틱 파마 그룹 S.L.에 고용되어 있었습니다.

감사의 글

저자들은 이 프로젝트에서 도움과 조언을 제공해 준 협력자들에게 감사의 뜻을 전합니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6-well platesFisher Scientific10578911세포 배양 다공판을 사용하는 동안 분석(센세넨스 유도 및 화합물 처리)에 사용
Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36 (UVB 조사 장치)Vilber LourmatVL-6111-1090-1UVB 조사로 손상을 생성하고 결과적으로 센세넨스를 유도하는 데 사용되는 장치
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Merck Life scienceD6046-500ML진피 섬유아세포의 표준 세포 배양 배지
Fetal bovine serum (FBS)Fisher Scientific17593595세포 성장을 위한 성장 인자, 호르몬, 단백질 및 필수 미량 영양소의 공급원으로 사용되는 영양 보충제
H3K27me3 ELISA kitEpigentekP-3014T-096생물학적 샘플에서 H3K27me3의 후성 유전자 변형을 검출하는 특정 면역 분석
Human dermal fibroblastsPromocellC-12302진피의 주요 피부 세포 및 피부 광노화의 조절자
Phosphate buffered saline (PBS)Merck Life scienceD8537-500ML생리적 환경을 모방하는 완충 용액. 세포를 세척할 때 스트레스를 유발하거나 세포 생존율을 낮추지 않음
PrimeScript RT reagent kit (reverse transcription kit)Takara BioRR037A 세포에서 분리된 RNA로부터 cDNA를 얻기 위한 키트. RNA 정제 후 qPCR 분석의 2단계.
TB Green Premix Ex Taq  (qPCR master mix)Takara BioRR420AcDNA로부터 유전자 발현 수준을 정량화하기 위한 중합효소 연쇄 반응을 생성하는 키트. 역전사 후 qPCR 분석의 3단계.
Total RNA Purification Kit (RNA 추출 키트)Norgen17200수확된 세포로부터 RNA를 얻기 위한 키트. 세포 수확 후 qPCR 분석의 1단계.
Trypsin/EDTA 0.05% Merck Life scienceT2601-100ML세포 배양 플레이트에서 세포를 분리하는 데 사용되는 효소 용액
```

참고문헌

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