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연구 논문

프로펜토필린은 척수 성상교세포 및 미세아교세포의 ERK1/2 인산화를 조절하여 절개 부위의 통각과민을 완화한다

32 조회수

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DOI:

10.3791/70927

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2026년 8월 14일

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, 2Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

이 논문에서

요약

본 연구는 쥐의 척수강 내로 투여한 propentofylline이 절개성 통각과민을 완화하는 효과가 있는지, 그리고 이러한 효과가 척수 글리아 마커의 변화 및 extracellular signal-regulated kinase 1 및 2의 인산화와 관련이 있는지 조사합니다.

초록

척수 성상교세포, 미세아교세포 및 extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2)는 통증 처리에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 본 연구에서는 수술 전 척수강 내 propentofylline (PPF) 투여가 쥐의 급성 절개 통증 과민증을 완화하는지, 그리고 이러한 효과가 척수 글리아 마커 및 ERK1/2 인산화와 관련이 있는지 조사하였습니다. 66마리의 수컷 Sprague–Dawley 쥐를 blank, 절개 통증, 일반 식염수, dimethyl sulphoxide, PPF 및 U0126 군으로 무작위 배정하였습니다. 기계적 및 열적 과민증을 기선 단계와 절개 후 2, 4, 8, 24, 72시간에 평가하였습니다. 척수 뉴런 및 글리아 마커, p-ERK1/2 및 염증 매개체는 Western blotting과 면역형광법으로 평가하였습니다. 또한, ERK1/2 의존적 염증 매개체 방출을 조사하기 위해 일차 척수 성상교세포 실험을 추가로 수행하였습니다. 수술 전 척수강 내 PPF 투여는 72시간의 관찰 기간 동안 기계적 및 열적 과민증을 완화한 반면, U0126은 주로 절개 후 초기 단계에서 과민증을 완화하였습니다. 절개 후 4시간째에 두 처리군 모두 척수 GFAP, Iba-1 및 p-ERK1/2 발현 감소와 TNF-α 및 COX-2 면역 반응 감소와 관련이 있었습니다. 배양된 성상교세포에서 PPF는 LPS로 유도된 염증 매개체 방출을 감소시켰으나, 상시 활성형 ERK1/2는 이러한 효과를 약화시켰습니다. 이러한 결과는 PPF의 항과민증 효과가 절개 후 척수 글리아, ERK1/2 관련 및 염증 반응의 조절과 연관되어 있음을 뒷받침합니다.

서론

수술 절차 후 발생하는 흔한 급성 통증의 한 종류인 절개 부위 통증은 일반적으로 7일 이상 지속되지 않으나, 염증성 및 신경병증성 통증과는 다른 복잡한 병리 기전을 가지고 있습니다1,2. 절개 부위 통증이 발생하는 동안 적절히 조절되지 않으면 만성 통증 증후군으로 더 진행될 수 있으며, 통증의 성격이 급성 조직 손상 통증에서 신경병증성 또는 혼합성 통증으로 변할 수 있습니다3. 일반적으로 절개 후에는 오피오이드 및 비스테로이드성 항염증제와 같은 진통제 투여가 가장 흔한 진통 방법입니다. 하지만 이러한 약물을 지속적으로 또는 고용량으로 사용할 경우 많은 부작용이 발생할 수 있으며, 이러한 상황은 더 안전하고 효과적인 진통 전략의 필요성을 강조합니다.

신뢰할 만한 증거에 따르면 propentofylline (PPF)은 다양한 통증 과정에서 발생하는 통각과민을 완화하는 것으로 나타났습니다4,5. 또한, PPF의 진통 효과는 p38 및 c-Jun N-terminal kinases (JNKs)와 같은 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)의 척수 발현을 억제함으로써 부분적으로 달성될 수 있습니다6. PPF가 p38 및 JNK 경로에 미치는 영향은 이미 입증되었으나, 통증 신호 전달에 관여하는 또 다른 중요한 MAPK 하위 가족인 extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2) 경로에 대한 잠재적 조절 작용은 급성 절개통 모델에서 아직 연구되지 않은 상태입니다. ERK1/2 활성화는 p38 및 JNK와 비교하여 뚜렷한 시간적, 세포적 패턴을 보인다는 점에서 이러한 지식의 공백을 메우는 것은 잠재적으로 독특한 치료 기회를 제시한다는 점에서 특히 중요합니다.

별아교세포, 미세아교세포 및 희소돌기아교세포를 포함하는 글리아 세포는 초기에 신경 조직의 연결 및 지지 구조인 것으로 생각되었습니다. 하지만 최근 연구들에 따르면 별아교세포와 미세아교세포가 시냅스 가소성을 조절하고 통증 정보를 전달하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌습니다7. 뇌와 척수의 상주 대식세포인 미세아교세포는 통증 과정의 매우 초기 단계에서 여러 세포 외 자극 신호에 의해 활성화될 수 있으며, 이후 증식하여 다량의 염증성 사이토카인을 방출함으로써 척수에서 뇌로 전달되는 통증 신호의 전도를 증가시킵니다8,9. 동시에, 활성화된 별아교세포는 흥분성 신경전달물질인 glutamate의 방출을 상향 조절하고 세포 간 통신을 강화함으로써 감각 뉴런에 정보를 직접 전달할 수 있습니다10.

연구들에 따르면 성상교세포 활성화는 절개 유발 통증의 초기 단계(첫 24시간 이내)에서 발생하는 반면, 미세아교세포 활성화는 훨씬 나중에 나타나는 것으로 밝혀졌습니다11,12. 또한, 한 연구에서는 활성화된 미세아교세포가 절개 유발 통증의 기계적 통각과민에 미치는 영향이 제한적임을 시사했습니다13. 이러한 발견은 급성 통증에서 성상교세포와 미세아교세포의 서로 다른 역할에 대한 지속적인 의문을 제기합니다. 글리아 조절제인 Propentofylline은 만성 신경 압박 손상, 급성 신경 손상 및 급성 조직 손상 후 성상교세포와 미세아교세포의 활성화를 조절함으로써 통각과민을 완화하는 것으로 보고되었습니다4,5. 하지만 현재까지 알려진 바로는, 급성 절개 유발 통증에서 PPF가 성상교세포 또는 미세아교세포 활성화에 미치는 영향을 조사한 연구는 없었습니다.

mitogen-activated protein kinase 1 and 2 (MEK1/2)의 하위 단계에서 활성화되는 주요 MAPK 하위 가족인 Extracellular signal-regulated kinase 1 and 2는 통각 처리 및 신경 가소성에 널리 관여하는 것으로 알려져 있습니다14,15. 이전 연구들에 따르면 phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2)는 통각 자극에 의해 척수 뉴런에서 유도될 수 있으며, 염증성 또는 신경병성 통증 상태의 성상교세포 및 미세아교세포에서도 검출될 수 있습니다16,17,18,19. 또한, MEK1/2–ERK1/2 신호 전달의 약리학적 억제가 여러 통증 모델에서 기계적 및 열적 통각 과민증을 완화한다는 것이 보고되었습니다20,21,22,23,24,25.

그러나 급성 절개에 의해 활성화되는 척수 ERK1/2의 세포 분포, 특히 성상교세포와 미세아교세포에서의 분포와 절개 유발 통증에서 그 역할은 아직 충분히 정의되지 않은 상태입니다. 본 연구팀의 이전 연구들에 따르면, PPF는 척수의 JNK 및 p38 신호 전달을 감소시킴으로써 쥐의 급성 절개성 통각과민증을 완화하는 것으로 나타났으나, 절개 유발 통증 동안 PPF가 척수 글리아 세포 내의 ERK1/2 관련 신호 전달 또한 조절하는지 여부는 불분명합니다. 따라서 본 연구는 완전히 독립적인 기전적 패러다임이라기보다, 통증 연구에서 기존의 글리아 및 MAPK 체계를 확장한 것으로 간주되어야 합니다. 이전 연구와의 주요 차별점은 급성 절개성 통증에 구체적으로 초점을 맞추었다는 점, 관심 대상인 MAPK 성분으로 p38/JNK 대신 ERK1/2를 조사했다는 점, 그리고 PPF 처리에 따른 p-ERK1/2의 초기 척수 세포 분포를 평가했다는 점에 있습니다.

본 연구는 수술 전 척수강 내로 투여한 PPF가 쥐의 발바닥 절개 모델에서 절개 후 과민증을 완화시키는지, 그리고 이러한 효과가 ERK1/2 인산화 또는 척수 신경 및 글리아 마커와 염증성 매개체인 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현 변화와 관련이 있는지를 조사하기 위해 설계되었습니다. 보다 구체적으로, 본 연구는 행동 평가와 시간별 Western blot 분석을 결합했다는 점, MEK1/2 억제제인 U0126과 약리학적으로 비교했다는 점, 그리고 급성 절개 통증 모델 내의 척수 신경세포, 성상교세포 및 미세아교세포에서 p-ERK1/2의 정성적 면역형광 국소화를 분석했다는 점에서 이전 보고들과 차별화됩니다. 본 연구의 기전적 틀은 글리아 조절 및 MAPK 신호 전달과 통증의 연관성을 다룬 기존 문헌들을 기반으로 하고 있으며, 이를 통해 절개 후 과민증의 초기 단계에서 척수 ERK1/2 관련 글리아 반응의 잠재적 관여에 대한 추가적인 근거를 제공하고자 합니다.

기존의 수술 후 진통제와 비교하여, 경로 표적 접근 방식은 특정 신호 전달 성분을 테스트할 수 있지만 혜택이 일시적일 수 있으며 침습적인 투여가 필요할 수 있습니다. MEK1/2–ERK1/2 억제는 여러 실험적 통증 모델에서 항통각과민 효과를 보였습니다20,21,22,23,24,25. PPF는 단일 경로 억제제와 달리 글리아 반응을 조절하며 하나 이상의 MAPK 관련 프로세스와 연관되어 있습니다4,5,6. 실제 임상 적용은 전임상 설계, 수술 전 척수강 내 투여, 수컷 쥐만 사용한 점, 그리고 더 큰 수술 모델에서의 용량 설정 및 안전성 연구 부재로 인해 여전히 제한적입니다.

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프로토콜

수행된 실험은 중국 간수성 란저우 대학교 제2부속병원의 윤리위원회 승인을 받았습니다(윤리 승인 번호 2017-070). 모든 절차는 국제통증연구협회(International Association for the Study of Pain)의 가이드라인을 준수하였습니다26. 공인 실험동물 센터에서 분양받은 체중 200–250 g의 성체 수컷 Sprague–Dawley 쥐 총 66마리가 사용되었습니다. 성별에 따른 호르몬 영향으로 인한 잠재적 변동성을 줄이기 위해 본 연구에는 수컷 쥐만 포함되었습니다. 모든 프로토콜은 국제통증연구협회 가이드라인에 따라 수행되었으며26, 고통을 최소화하기 위해 필요한 조치를 취하였습니다. 본 연구에 사용된 시약, 소모품, 기기 및 소프트웨어에 관한 자세한 정보는 재료 표(Table of Materials)에 제공되어 있습니다.

동물

쥐들은 수술 전에는 쌍으로, 절개 후에는 개별적으로 사육되었으며 먹이와 물은 ad libitum으로 제공되었다. 실험실은 12시간 명기-12시간 암기 주기로 유지되었으며, 온도는 24 °C ± 2 °C로 조절되었다.

척수강 내 주입 및 절개 통증 모델

용액의 척수강 내 투여를 위해, 쥐를 1.5%–3% sevoflurane(노즈 콘을 통해 투여)으로 마취시킨 후 척추를 구부린 복와위 상태로 배치하였다. 요추 부위의 털을 깎고 L5–L6 척추 간 공간 위의 피부를 소독하였다. L5–L6 척추 간 공간에 마이크로 시린지를 경피적으로 삽입하였다. 바늘을 전진시키는 동안 꼬리가 갑자기 튀거나 움직이는 현상은 지주막하 공간에 성공적으로 진입했음을 나타내며, 가볍게 흡인했을 때 뇌척수액이 나타나는 것으로 이를 추가 확인하였다. 이러한 징후가 관찰되지 않을 경우, 주입 전 바늘 위치를 조정하였다. 두 가지 확인 기준이 모두 충족된 후에만 주입을 수행하였으며, 주입 후 비정상적인 신경학적 징후를 보이는 동물은 제외하였다. 이후 해당 용액을 천천히 주입하고, 주입 후 피부를 다시 세척하였다. 수술 절차는 약 3분 동안 지속되었으며, 쥐들은 일반적으로 5–10분 이내에 마취에서 회복되었다.

절개 통증 쥐 모델은 이전에 설명된 방법으로 구축되었다27. 마취 후, 뒷발의 발바닥 표면을 10% 포비돈-요오드로 소독하였다. 뒷꿈치에서 약 0.5 cm 떨어진 지점에서 시작하여 발가락 방향으로 1-cm 길이의 종절개를 발바닥 피부에 가하였다. 절개는 피부와 근막까지 침투하였다. 안과용 포셉을 사용하여 발바닥 근육을 조심스럽게 들어 올린 후, 전체적인 조직 연속성을 유지하면서 종방향으로 절개하였다. 이후 근육을 원래 위치로 되돌리고, 지혈을 위해 가벼운 압박을 가한 다음 3-0 나일론을 사용하여 두 개의 매트리스 봉합으로 상처를 폐쇄하였다. 상처 폐쇄 후 절개 부위를 다시 소독하였다. 수술 후 쥐들은 개별 사육되었으며, 강한 빛으로부터 보호되고 먹이와 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 조용하고 따뜻한 환경에서 회복하도록 하였다. 수술 후 동물들을 모니터링하였으며, 사전 정의된 기준을 충족하지 못한 개체는 즉시 제외하였다. 상처 감염 여부는 상처 주변의 발적, 부종 및 국소 온도 상승, 악취를 동반한 비정상적인 황록색 농성 삼출물, 상처 개방이 지속되는 지연된 상처 치유, 괴사 및 확대, 그리고 체온 상승, 무기력, 식이 거부와 같은 전신 증상을 기준으로 판단하였다. 추가 제외 기준으로는 30 min 이내에 마취에서 회복되지 않은 경우, 수술 중 근육 단열 또는 신경혈관 손상이 발생한 경우, 수술 후 자해 행동, 모델 구축 실패, 그리고 뒷다리 마비나 절개 통증과 무관한 체중 지지 불능과 같은 신경학적 결손이 포함되었다. 상처 감염 또는 상처 벌어짐이 나타난 쥐는 연구에서 제외하였다.

행동 측정

그룹 배정 내용을 알지 못하는 조사자가 발Withdrawal 기계적 역치(PWMT)와 발Withdrawal 열 지연 시간(PWTL)을 측정하였다. 테스트는 최소 10분간의 적응 시간을 거친 후, 조용한 방에서 매일 일정한 시간에 수행되었으며; 케이지, 메쉬 또는 유리 바닥, 주변 조명, 열원 강도는 모든 그룹에서 일정하게 유지되었다. PWMT 테스트를 위해, 보정된 von Frey 필라멘트(0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g, 15.0 g)를 필라멘트가 약 1–2 mm 굽어질 때까지 상처 인접 부위의 발바닥 표면에 수직으로 가하였다. 연속적인 자극 사이에는 2분의 간격을 두었으며, up-and-down 방법을 사용하여 50% PWMT를 결정하였다28. PWTL 테스트를 위해, 쥐를 유리 바닥 위의 개별 투명 케이지에 넣고, 복사열원을 상처 옆의 발바닥 표면에 맞추었다. 조직 손상을 방지하기 위해 30 s의 컷오프 시간을 설정하였고, 연속적인 노출 사이에는 2분의 간격을 두었으며, 3회 측정값의 평균을 기록하였다29. 발을 들어 올리거나, 흔들거나, 핥는 행위를 양성 회피 반응으로 간주하였으며, 그루밍, 이동 또는 열원 정렬 이탈로 인해 영향을 받은 시험은 재적응 후 반복 수행하였다.

웨스턴 블롯 분석

설정된 시간에 쥐를 경추 탈구법으로 안락사시킨 후, L4–L6 요수척수를 단백질 분해 효소 억제제가 100:1 비율로 첨가된 radioimmunoprecipitation assay 용해 버퍼에 신속하게 수집하였습니다. 조직을 균질화한 후 20분 동안 얼음 위에 보관하고, 4 °C에서 15,000 × g로 20분간 원심분리하였습니다. 상층액을 4× 로딩 버퍼와 3:1 비율로 혼합하여 끓는 물에서 5분간 가열한 후 −80 °C에 보관하였습니다. 단백질 샘플(레인당 30 µg)을 10% sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide 젤에서 분리하고 0.45 또는 0.22 µm polyvinylidene fluoride 막으로 전이시켰습니다. 프리스테인 분자량 마커의 예상 이동 거리와 뚜렷한 불균일 또는 중단된 전이 영역의 부재를 확인하여 전이가 성공적으로 이루어졌는지 점검하였습니다. 막을 5% 탈지분유와 3% bovine serum albumin으로 상온에서 2시간 동안 블로킹하고, NeuN (1:8,000), GFAP (1:4,000), Iba-1 (1:3,000), p-ERK1/2 (1:1,000), t-ERK1/2 (1:3,000) 또는 GAPDH (1:2,000)에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시켰습니다. 0.05% Tween 20 (pH 7.4)이 포함된 Tris-buffered saline으로 세척한 후, 해당 horseradish peroxidase-결합 2차 항체 (1:5,000)와 함께 상온에서 1시간 동안 반응시켰습니다. 신호를 강화 화학발광법으로 검출하였으며, 각 표적 내에서 동일한 노출 범위를 사용하여 필름에 기록하였습니다. 그룹 배정을 알지 못하는 연구자가 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 밴드 밀도를 분석하였습니다. 이미지를 8비트 그레이스케일로 변환하고, 각 밴드에 동일한 직사각형 관심 영역을 적용하였으며, 인접한 공백 영역의 국소 배경값을 뺀 후 통합 밀도를 기록하였습니다. 블롯의 모든 레인에 동일한 영역 크기와 배경 처리 절차를 적용하였습니다. NeuN, GFAP, Iba-1 및 t-ERK1/2는 GAPDH로 표준화하였고, p-ERK1/2는 t-ERK1/2로 표준화한 후, 값을 대조군에 상대적으로 표시하였습니다.

면역형광염색

설정된 시간에 쥐를 3% 펜토바르비탈 나트륨 (1.5 mL/kg)으로 마취시키고, 300 mL의 냉각된 0.01 mol/L 인산 완충 식염수 (PBS; pH 7.4)를 심장을 통해 관류시킨 후, 이어서 250 mL의 냉각된 4% 파라포름알데히드로 관류하였다. L4–L6 척수를 4% 파라포름알데히드에서 6시간 동안 후고정한 후, 4 °C의 20%–30% sucrose–PBS에서 하룻밤 동안 동결 보호 처리하였으며, −22 °C에서 10 µm 두께로 절편화하였다. 절편을 0.01 mol/L PBS로 세척하고, 상온에서 1시간 동안 10% 염소 혈청으로 블로킹한 후, NeuN (1:100), GFAP (1:1,000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) 또는 COX-2 (1:50)에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. PBS로 3회 세척한 후, 해당되는 녹색 또는 적색 형광체 결합 2차 항체 (1:400)와 함께 상온에서 1시간 동안 반응시켰으며, 다시 PBS로 3회 세척한 뒤 항퇴색제와 커버슬립을 사용하여 마운팅하였다. 1차 항체 없이 처리한 음성 대조군 절편을 각 염색 배치에 포함시켰다. 이미지는 블라인드 처리된 연구자가 형광 현미경을 사용하여 획득하였다. 저배율 개요 이미지는 10× 대물렌즈를 사용하여 획득하였고, 세포 면역 반응 및 공동 국소화 이미지는 해당 피규어 패널에 따라 20× 또는 40× 대물렌즈를 사용하여 획득하였다. 동일한 피규어 및 염색 배치 내의 비교를 위해, 대물렌즈 배율, 조명 강도, 노출 시간, 검출기 게인, 카메라 설정 및 이미지 처리 파라미터를 포화 상태 미만으로 최적화한 후 고정하였다. 채널 중첩을 최소화하기 위해 별도의 형광 채널을 순차적으로 획득하였다. 동물당 동측 후각에서 겹치지 않는 세 영역을 캡처하였다. 형광 강도는 8-bit 변환, 세포가 없는 영역을 이용한 배경 제거, 그리고 각 염색 배치 내에서 동일한 관심 영역(ROI) 및 임계값을 적용한 후 이미지 분석 소프트웨어로 정량화하였으며, 영역 값들을 평균하여 동물당 하나의 값을 얻었다. 과노출, 조직 접힘, 찢어짐, 초점 불량 또는 불균일한 배경이 있는 영역은 제외하고 동일한 비포화 설정 하에서 다시 획득하였다. 조직 구조가 온전하고, 표적 신호가 1차 항체 미처리 대조군보다 높으며, 분석에 영향을 주는 주요 접힘, 찢어짐 또는 포화 영역이 없을 때 염색 결과를 채택하였다.

인비트로 (In vitro) 일차 척수 성상교세포 실험

일차 쥐 척수 성상세포는 습윤화된 5% CO2 배양기 내 37 °C의 완전 배양 배지를 사용하여 표준 무균 조건에서 배양되었습니다. 세포가 약 70%–80%의 합류도(confluence)에 도달했을 때 대조군, LPS 자극군, LPS + PPF군, LPS + U0126군 및 ERK1/2 복구군으로 나누어 사용하였습니다. PPF와 U0126은 10 µM 농도로 첨가하였습니다. 각 실험 내 병렬 웰(well) 간의 LPS 자극, 약물 처리 및 수확 조건은 동일하게 유지하였습니다. 경로 선택성 분석을 위해 세포 용해물을 수집하여 p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, total p38, p-JNK, total JNK 및 해당 로딩 대조군에 대한 웨스턴 블로팅을 수행하였습니다. 병렬 웰에서 배양 상층액을 수집하고 원심분리로 불순물을 제거한 후, 제조사의 지침에 따라 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 이용하여 TNF-α, PGE2 및 IL-6를 분석하였습니다. 웨스턴 블롯 밀도 분석은 위에서 설명한 것과 동일한 이미지 분석 원칙을 따랐습니다. 복구 실험을 위해 siRNA 형질전환으로 내인성 ERK1/2를 억제하였으며, 처리 전 구성적 활성 ERK1/2 (CA-ERK1/2) 발현 구조체를 도입하였습니다. 사이토카인 데이터를 해석하기 전, 웨스턴 블로팅을 통해 넉다운 및 과발현 효율을 확인하였습니다. 활성 siRNA나 구조체 없이 형질전환 시약에만 노출된 세포를 해당되는 경우 절차 대조군으로 사용하였습니다.

실험 설계

실험 동물의 하위 그룹화

무작위 숫자 표 방법을 사용하여 쥐를 6개 그룹으로 나누었으며, 그룹 배정은 행동 테스트 및 조직 수집 전에 완료되었다. 6개 그룹은 공백 그룹(n = 6), 절개통(IP) 그룹(n = 18), 생리식염수(NS) 그룹(0.9% NS, 10 µL; n = 9), PPF 그룹(10 µg in 10 µL; n = 12), 디메틸설폭사이드(DMSO) 그룹(10% DMSO, 10 µL; n = 9) 및 U0126 그룹(10 µg in 10 µL; n = 12)으로 구성되었다. 공백 그룹의 쥐는 발바닥 절개나 척수강 내 주사를 모두 받지 않았으며, 처리되지 않은 대조군 역할을 하였다. IP 그룹의 쥐는 척수강 내 주사를 통한 전처치 없이 발바닥 절개를 시행하였다. NS, PPF, DMSO 및 U0126 그룹의 쥐는 발바닥 절개 30분 전에 각각의 약물을 척수강 내로 투여받았다. NS 그룹은 PPF의 용매 대조군으로, DMSO 그룹은 U0126의 용매 대조군으로 사용되었다.

propentofylline 및 U0126의 투여량

Propentofylline은 글리아 조절제이며, 해당 연구진의 이전 연구에서 급성 통각 과민증을 완화시켰으므로 10 µg의 용량을 선택하였다. U0126은 ERK1/2 인산화를 차단하기 위해 사용되는 비 ATP-경쟁적 MEK1/2 억제제이다. 다양한 통증 모델에서 1–10 µg의 효과적인 척수강 내 투여 용량이 보고되었으며30,31,32, 본 연구에서는 10 µg 용량을 사용하였다. U0126은 10% dimethyl sulfoxide에 용해하였고, PPF는 0.9% 생리식염수에 용해하였다. 최종 농도는 1 µg/µL였다. 약물과 용매는 수술 전에 준비하여 4 °C에서 보관하였으며 12 h 이내에 사용하였다.

프로펜토필린 또는 U0126의 수술 전 척수강 내 투여가 통각과민증에 미치는 영향

수술 24시간 전에 각 군에서 6마리의 쥐를 무작위로 선정하여 행동 측정을 실시하였으며, 이때 얻은 PWMT와 PWTL을 기저선으로 설정하였다. 수술 30분 전에 척수강 내 주사를 투여하였다. 수술 전 PPF 및 U0126의 척수강 내 투여가 기계적 및 열적 통각과민증에 미치는 영향을 평가하기 위해, 절개 후 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 72 h 시점에서 PWMT와 PWTL을 측정하였다.

절개 후 척수 신경 및 글리아 마커 발현에 미치는 수술 전 척수강 내 투여 propentofylline 또는 U0126의 효과를 평가하기 위한 실험 설계

치료 효과 평가를 위한 적절한 절개 후 시점을 결정하기 위해, 먼저 IP군에서 예비 시계열 분석을 수행하였습니다. 구체적으로, IP군의 쥐를 절개 후 2 h, 4 h, 24 h, 72 h에 안락사시킨 뒤, 웨스턴 블롯(n = 시점당 3마리)을 통해 척수 내 세포 마커 NeuN, GFAP, Iba-1의 발현 수준을 측정하였습니다. 이 예비 분석을 바탕으로, NeuN 발현이 4 h 시점에서 최고치에 도달하였고 초기 분자 변화가 절개성 통각 과민증의 초기 발달과 가장 밀접한 관련이 있다고 판단하여, 절개 후 첫 4 h를 초기 절개 후 관찰 창으로 선정하였습니다. 다만, 4 h 시점이 절개 후의 모든 시간적 분자 변화를 대표하도록 의도한 것은 아니었습니다.

선택된 이 시점에서, 척수강 내 주사를 투여받은 쥐들을 안락사시켜 다양한 세포 마커에 대한 Western blot 분석(n = 그룹당 3마리) 및 다양한 세포 유형의 형태학적 분석을 위한 면역형광 평가(n = 그룹당 3마리)를 수행하였습니다. 공백 그룹(blank group)의 경우, Western blot(n = 3)을 통해 척수 내 다양한 세포 마커(NeuN, GFAP, Iba-1)의 기본 발현 수준을 결정하고, 면역형광(n = 3)을 통해 다양한 세포(뉴런, 성상세포, 미세아교세포)의 형태를 확인하기 위해 쥐들을 무작위로 희생시켰습니다. 따라서 공백 그룹은 절개 및 처치를 하지 않은 기저 대조군으로 사용되었습니다.

척수 p-ERK1/2 및 염증 매개체에 대한 치료 효과

p-ERK1/2 발현 및 염증성 사이토카인 수치에 대한 치료 효과를 평가하기 위한 적절한 절개 후 시점을 결정하기 위해, 먼저 IP 군에서 예비 시계열 분석을 수행하였습니다. 구체적으로, IP 군의 쥐를 절개 후 2 h, 4 h, 24 h 및 72 h에 안락사시킨 후, Western blot을 통해 척수의 p-ERK1/2 발현을 측정하였습니다(n = 시점당 3마리). 이 시계열 실험 결과와 절개 후 NeuN 발현이 가장 높았던 시점을 종합하여, 수술 전 척수강 내로 투여한 PPF 또는 U0126이 척수 p-ERK1/2 발현 및 염증성 사이토카인에 미치는 영향을 평가하기 위한 고정 시점으로 절개 후 4 h를 선정하였습니다. 이 시점은 절개 후의 모든 시간적 변화를 포괄적으로 대표하기보다는, 초기 기전 관찰 창으로서 선정되었습니다.

선택된 해당 시점에서, 척수강 내 주사를 투여받은 쥐를 안락사시켜 p-ERK1/2 발현의 Western blot 분석(n = 그룹당 3마리)과 염증성 사이토카인의 면역형광 평가(n = 그룹당 3마리)를 수행하였습니다. blank 그룹의 경우, 쥐를 무작위로 희생시켜 Western blot(n = 3)을 통한 척수 내 p-ERK1/2의 기본 발현 수준과 면역형광(n = 3)을 통한 염증성 사이토카인(TNF-α 및 COX-2)의 기본 발현 수준을 측정하였습니다. 따라서 blank 그룹은 절개 및 처치를 하지 않은 기저선 대조군으로 활용되었습니다.

뉴런, 성상교세포 및 미세아교세포 내 척수 p-ERK1/2의 세포 내 국소화

절개 후 척수 p-ERK1/2의 세포 내 분포를 추가로 평가하기 위해, 절개 4시간 후 Blank 군과 IP 군을 대상으로 면역형광 염색을 수행하였습니다(n = 3).

통계 분석

데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 표본 크기는 연구팀의 이전 연구 및 예비 실험을 참조하여 결정하였다. 행동 데이터는 집단을 피험자 간 요인으로, 시간을 피험자 내 요인으로 하여 이원 반복측정 분산분석(ANOVA)으로 분석하였다. 시간 경과에 따른 Western blot 데이터는 일원 분산분석(one-way ANOVA) 후 Bonferroni 교정 쌍별 비교를 통해 평가하였다. 특정 시점의 Western blot 및 면역형광 데이터는 Bonferroni 교정 계획 비교를 포함한 일원 분산분석으로 평가하였으며, 두 집단 간 비교는 Student’s t-test로 평가하였다. 정규성과 분산의 동질성은 각각 Shapiro–Wilk 검정과 Levene 검정으로 평가하였다. 양측 p-value < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 통계 분석은 재료 표(Table of Materials)에 기재된 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. in vitro 성상교세포 실험의 경우, 독립적인 배양 실험을 분석 단위로 처리하였으며, Western blot 밀도 측정값과 사이토카인 농도는 적절한 경우 일원 분산분석 후 Bonferroni 교정 계획 비교 또는 사전 지정된 두 집단 비교를 위한 Student’s t-test를 사용하여 비교하였다.

데이터 가용성:

이 연구의 결과를 뒷받침하는 데이터는 보충 파일 1에 제공됩니다.

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결과

절개 및 수술 전 propentofylline 또는 U0126의 척수강 내 투여가 절개 후 통각 과민에 미치는 영향

기계적 통각과민

수술 전 24시간 시점에서 6개 그룹 간의 PWMTs에는 유의미한 차이가 없었습니다.p > 0.05; 그림 1A,B). IP 군에서 절개 후 PWMT가 감소하였으며, 절개 후 2시간부터 72시간까지 기저치보다 유의하게 낮은 상태를 유지하였다(p < 기초선 대비 0.05; 그림 1A). NS 및 DMSO 군에서는 절개 후 시점 간 PWMT(압각 통증 측정치)에 유의미한 차이가 없었습니다.p > IP군 대비 0.05; 그림...

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토론

대부분의 환자들은 수술 후 신체적 고통뿐만 아니라 때로는 정신적으로도 급성 통증을 겪지만33, 급성 수술 후 통증의 세부 메커니즘에 대해서는 여전히 알려지지 않은 것이 많습니다. 진통제의 강력한 효과와 더불어 불가피한 부작용이 수반되기에, 더 안전하고 효과적인 진통제를 탐색하는 것이 매우 중요합니다. 본 연구는 준비가 쉽고 실현 가능한, 급성 수술 후 통증을 모사하기 위해 이전에 검증된 쥐 절개 모델을 기반으로 하였습니다27. 본 연구에서는 절개 후 척수 뉴런 및 글리아 마커, ERK1/2 인산화 및 염증 매개체의 변화를 평가하였으며, 수술 전 척수강 내 PPF 투여의 항과민증 효과가 척수 ERK1/2 인산화 및 염증성 사이토카인 발현의 평행한 변화와 관련이 있는지 조사하였습니다.

절개 후, IP 군의 쥐들은 강력한 기계적 및 열적 통각과민증을 나타냈으나, vehicle 전처리는 행동학적 또는 ...

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공개 사항

저자들은 개인적, 재정적, 상업적 또는 학술적 이해관계의 충돌이 없음을 밝힙니다.

감사의 글

저자들은 기술적 지원을 제공한 Haijiao Zhou와 Ming Wang에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.01 M PBS 완충액SolarbioP1020
1.0 M Tris-HCl 완충액 (pH 6.8)SolarbioT1020
1.5 M Tris-HCl 완충액 (pH 8.8)SolarbioT1010
10% sodium dodecyl sulfate (SDS)SolarbioS1010
10× TBST 스톡 용액SolarbioT1081
30% 아크릴아마이드SolarbioA1010
4× 단백질 로딩 버퍼SolarbioP1041
Adobe PhotoshopAdobe—
과황산암모늄SolarbioA1030
자동 플레이크 제빙기창슈 쉬커IMS-40
소혈청알부민 (BSA)SolarbioA8020
Cryostat CM150LeicaCM150
디지털 pH 미터—PHS-3C
디메틸설폭사이드 (DMSO)SolarbioD8371
전자 분석 저울캔(Cany)—
강화 화학발광(ECL) 시약SolarbioPE0010
필름Kodak—
형광 현미경 DP71OlympusDP71
동결 절편 임베딩 배지사쿠라4583
겔 전기영동 장치BIO-RAD—
글리세롤SolarbioIG0910
글리신SolarbioG8200
염소 항마우스 Alexa Fluor 594 이차 항체ProteintechSA00013-3
HRP-접합 염소 항-마우스 2차 항체ZSGB-BIOZB2305
염소 항-토끼 Alexa Fluor 488 2차 항체ProteintechSA00013-2
염소 항-토끼 호르스라디쉬 퍼옥시다아제 결합 2차 항체ZSGB-BIOZB2301
염소 혈청SolarbioSL038
GraphPad PrismGraphPad 소프트웨어5
고속 냉장 원심분리기 3K15시그마3K15
수평 궤도 쉐이커 TS-1000하이먼 치린베이얼TS-1000
ImageJ미국 국립보건원1.51j8
메탄올Tianjin Guangfu—
마우스 항-랫 GAPDH 1차 항체Proteintech60004-1-Ig
마우스 항-랫 p-ERK1/2 1차 항체CST9101S
Na2HPO3천진 북진 방정—
NaH2PO3Tianjin Damao—
파라포름알데히드BiosharpBL539A
병리 진단용 현미경 슬라이드시체—
페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)BeyotimeST506
족저 검사 37370우고 바실레37370
폴리비닐리덴 플로라이드 막Solarbio—
프로펜토필린 (Propentofylline, PPF)TaosuT19812
토끼 항-랫 COX-2 1차 항체AbcamAb179800
토끼 항-쥐 GFAP 1차 항체Proteintech16825-1-AP
토끼 항-쥐 Iba-1 1차 항체Proteintech10904-1-AP
토끼 항-쥐 NeuN 1차 항체AbcamAb279297
토끼 항-래트 t-ERK1/2 1차 항체Proteintech11257-1-AP
토끼 항-쥐 TNF-α 1차 항체Proteintech29652-1-AP
RIPA 용해 버퍼SolarbioR0010
SDS (도데실황산나트륨)SolarbioS8010
탈지분유SolarbioD8340
SPSSIBM22
테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)SolarbioT8090
TrisSolarbioT8060
Triton X-100SolarbioT8200
U0126-EtOHSelleckS1102
초저온 냉동고Haier—
초저온 냉동고Sanyo—
초순수 정제 시스템힐포스(Heal Force)—
폰 프레이 필라멘트 (von Frey filaments)North Coast Medical—

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