프로펜토필린은 척수 성상교세포 및 미세아교세포의 ERK1/2 인산화를 조절하여 절개 부위의 통각과민을 완화한다

요약

본 연구는 쥐의 척수강 내로 투여한 propentofylline이 절개성 통각과민을 완화하는 효과가 있는지, 그리고 이러한 효과가 척수 글리아 마커의 변화 및 extracellular signal-regulated kinase 1 및 2의 인산화와 관련이 있는지 조사합니다.

초록

척수 성상교세포, 미세아교세포 및 extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2)는 통증 처리에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 본 연구에서는 수술 전 척수강 내 propentofylline (PPF) 투여가 쥐의 급성 절개 통증 과민증을 완화하는지, 그리고 이러한 효과가 척수 글리아 마커 및 ERK1/2 인산화와 관련이 있는지 조사하였습니다. 66마리의 수컷 Sprague–Dawley 쥐를 blank, 절개 통증, 일반 식염수, dimethyl sulphoxide, PPF 및 U0126 군으로 무작위 배정하였습니다. 기계적 및 열적 과민증을 기선 단계와 절개 후 2, 4, 8, 24, 72시간에 평가하였습니다. 척수 뉴런 및 글리아 마커, p-ERK1/2 및 염증 매개체는 Western blotting과 면역형광법으로 평가하였습니다. 또한, ERK1/2 의존적 염증 매개체 방출을 조사하기 위해 일차 척수 성상교세포 실험을 추가로 수행하였습니다. 수술 전 척수강 내 PPF 투여는 72시간의 관찰 기간 동안 기계적 및 열적 과민증을 완화한 반면, U0126은 주로 절개 후 초기 단계에서 과민증을 완화하였습니다. 절개 후 4시간째에 두 처리군 모두 척수 GFAP, Iba-1 및 p-ERK1/2 발현 감소와 TNF-α 및 COX-2 면역 반응 감소와 관련이 있었습니다. 배양된 성상교세포에서 PPF는 LPS로 유도된 염증 매개체 방출을 감소시켰으나, 상시 활성형 ERK1/2는 이러한 효과를 약화시켰습니다. 이러한 결과는 PPF의 항과민증 효과가 절개 후 척수 글리아, ERK1/2 관련 및 염증 반응의 조절과 연관되어 있음을 뒷받침합니다.

서론

수술 절차 후 발생하는 흔한 급성 통증의 한 종류인 절개 부위 통증은 일반적으로 7일 이상 지속되지 않으나, 염증성 및 신경병증성 통증과는 다른 복잡한 병리 기전을 가지고 있습니다^1,2. 절개 부위 통증이 발생하는 동안 적절히 조절되지 않으면 만성 통증 증후군으로 더 진행될 수 있으며, 통증의 성격이 급성 조직 손상 통증에서 신경병증성 또는 혼합성 통증으로 변할 수 있습니다³. 일반적으로 절개 후에는 오피오이드 및 비스테로이드성 항염증제와 같은 진통제 투여가 가장 흔한 진통 방법입니다. 하지만 이러한 약물을 지속적으로 또는 고용량으로 사용할 경우 많은 부작용이 발생할 수 있으며, 이러한 상황은 더 안전하고 효과적인 진통 전략의 필요성을 강조합니다.

신뢰할 만한 증거에 따르면 propentofylline (PPF)은 다양한 통증 과정에서 발생하는 통각과민을 완화하는 것으로 나타났습니다^4,5. 또한, PPF의 진통 효과는 p38 및 c-Jun N-terminal kinases (JNKs)와 같은 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)의 척수 발현을 억제함으로써 부분적으로 달성될 수 있습니다⁶. PPF가 p38 및 JNK 경로에 미치는 영향은 이미 입증되었으나, 통증 신호 전달에 관여하는 또 다른 중요한 MAPK 하위 가족인 extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2) 경로에 대한 잠재적 조절 작용은 급성 절개통 모델에서 아직 연구되지 않은 상태입니다. ERK1/2 활성화는 p38 및 JNK와 비교하여 뚜렷한 시간적, 세포적 패턴을 보인다는 점에서 이러한 지식의 공백을 메우는 것은 잠재적으로 독특한 치료 기회를 제시한다는 점에서 특히 중요합니다.

별아교세포, 미세아교세포 및 희소돌기아교세포를 포함하는 글리아 세포는 초기에 신경 조직의 연결 및 지지 구조인 것으로 생각되었습니다. 하지만 최근 연구들에 따르면 별아교세포와 미세아교세포가 시냅스 가소성을 조절하고 통증 정보를 전달하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌습니다⁷. 뇌와 척수의 상주 대식세포인 미세아교세포는 통증 과정의 매우 초기 단계에서 여러 세포 외 자극 신호에 의해 활성화될 수 있으며, 이후 증식하여 다량의 염증성 사이토카인을 방출함으로써 척수에서 뇌로 전달되는 통증 신호의 전도를 증가시킵니다^8,9. 동시에, 활성화된 별아교세포는 흥분성 신경전달물질인 glutamate의 방출을 상향 조절하고 세포 간 통신을 강화함으로써 감각 뉴런에 정보를 직접 전달할 수 있습니다¹⁰.

연구들에 따르면 성상교세포 활성화는 절개 유발 통증의 초기 단계(첫 24시간 이내)에서 발생하는 반면, 미세아교세포 활성화는 훨씬 나중에 나타나는 것으로 밝혀졌습니다^11,12. 또한, 한 연구에서는 활성화된 미세아교세포가 절개 유발 통증의 기계적 통각과민에 미치는 영향이 제한적임을 시사했습니다¹³. 이러한 발견은 급성 통증에서 성상교세포와 미세아교세포의 서로 다른 역할에 대한 지속적인 의문을 제기합니다. 글리아 조절제인 Propentofylline은 만성 신경 압박 손상, 급성 신경 손상 및 급성 조직 손상 후 성상교세포와 미세아교세포의 활성화를 조절함으로써 통각과민을 완화하는 것으로 보고되었습니다^4,5. 하지만 현재까지 알려진 바로는, 급성 절개 유발 통증에서 PPF가 성상교세포 또는 미세아교세포 활성화에 미치는 영향을 조사한 연구는 없었습니다.

mitogen-activated protein kinase 1 and 2 (MEK1/2)의 하위 단계에서 활성화되는 주요 MAPK 하위 가족인 Extracellular signal-regulated kinase 1 and 2는 통각 처리 및 신경 가소성에 널리 관여하는 것으로 알려져 있습니다^14,15. 이전 연구들에 따르면 phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2)는 통각 자극에 의해 척수 뉴런에서 유도될 수 있으며, 염증성 또는 신경병성 통증 상태의 성상교세포 및 미세아교세포에서도 검출될 수 있습니다^16,17,18,19. 또한, MEK1/2–ERK1/2 신호 전달의 약리학적 억제가 여러 통증 모델에서 기계적 및 열적 통각 과민증을 완화한다는 것이 보고되었습니다^{20,21,22,23,24,25}.

그러나 급성 절개에 의해 활성화되는 척수 ERK1/2의 세포 분포, 특히 성상교세포와 미세아교세포에서의 분포와 절개 유발 통증에서 그 역할은 아직 충분히 정의되지 않은 상태입니다. 본 연구팀의 이전 연구들에 따르면, PPF는 척수의 JNK 및 p38 신호 전달을 감소시킴으로써 쥐의 급성 절개성 통각과민증을 완화하는 것으로 나타났으나, 절개 유발 통증 동안 PPF가 척수 글리아 세포 내의 ERK1/2 관련 신호 전달 또한 조절하는지 여부는 불분명합니다. 따라서 본 연구는 완전히 독립적인 기전적 패러다임이라기보다, 통증 연구에서 기존의 글리아 및 MAPK 체계를 확장한 것으로 간주되어야 합니다. 이전 연구와의 주요 차별점은 급성 절개성 통증에 구체적으로 초점을 맞추었다는 점, 관심 대상인 MAPK 성분으로 p38/JNK 대신 ERK1/2를 조사했다는 점, 그리고 PPF 처리에 따른 p-ERK1/2의 초기 척수 세포 분포를 평가했다는 점에 있습니다.

본 연구는 수술 전 척수강 내로 투여한 PPF가 쥐의 발바닥 절개 모델에서 절개 후 과민증을 완화시키는지, 그리고 이러한 효과가 ERK1/2 인산화 또는 척수 신경 및 글리아 마커와 염증성 매개체인 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현 변화와 관련이 있는지를 조사하기 위해 설계되었습니다. 보다 구체적으로, 본 연구는 행동 평가와 시간별 Western blot 분석을 결합했다는 점, MEK1/2 억제제인 U0126과 약리학적으로 비교했다는 점, 그리고 급성 절개 통증 모델 내의 척수 신경세포, 성상교세포 및 미세아교세포에서 p-ERK1/2의 정성적 면역형광 국소화를 분석했다는 점에서 이전 보고들과 차별화됩니다. 본 연구의 기전적 틀은 글리아 조절 및 MAPK 신호 전달과 통증의 연관성을 다룬 기존 문헌들을 기반으로 하고 있으며, 이를 통해 절개 후 과민증의 초기 단계에서 척수 ERK1/2 관련 글리아 반응의 잠재적 관여에 대한 추가적인 근거를 제공하고자 합니다.

기존의 수술 후 진통제와 비교하여, 경로 표적 접근 방식은 특정 신호 전달 성분을 테스트할 수 있지만 혜택이 일시적일 수 있으며 침습적인 투여가 필요할 수 있습니다. MEK1/2–ERK1/2 억제는 여러 실험적 통증 모델에서 항통각과민 효과를 보였습니다^{20,21,22,23,24,25}. PPF는 단일 경로 억제제와 달리 글리아 반응을 조절하며 하나 이상의 MAPK 관련 프로세스와 연관되어 있습니다^4,5,6. 실제 임상 적용은 전임상 설계, 수술 전 척수강 내 투여, 수컷 쥐만 사용한 점, 그리고 더 큰 수술 모델에서의 용량 설정 및 안전성 연구 부재로 인해 여전히 제한적입니다.

프로토콜

수행된 실험은 중국 간수성 란저우 대학교 제2부속병원의 윤리위원회 승인을 받았습니다(윤리 승인 번호 2017-070). 모든 절차는 국제통증연구협회(International Association for the Study of Pain)의 가이드라인을 준수하였습니다²⁶. 공인 실험동물 센터에서 분양받은 체중 200–250 g의 성체 수컷 Sprague–Dawley 쥐 총 66마리가 사용되었습니다. 성별에 따른 호르몬 영향으로 인한 잠재적 변동성을 줄이기 위해 본 연구에는 수컷 쥐만 포함되었습니다. 모든 프로토콜은 국제통증연구협회 가이드라인에 따라 수행되었으며²⁶, 고통을 최소화하기 위해 필요한 조치를 취하였습니다. 본 연구에 사용된 시약, 소모품, 기기 및 소프트웨어에 관한 자세한 정보는 재료 표(Table of Materials)에 제공되어 있습니다.

동물

쥐들은 수술 전에는 쌍으로, 절개 후에는 개별적으로 사육되었으며 먹이와 물은 ad libitum으로 제공되었다. 실험실은 12시간 명기-12시간 암기 주기로 유지되었으며, 온도는 24 °C ± 2 °C로 조절되었다.

척수강 내 주입 및 절개 통증 모델

용액의 척수강 내 투여를 위해, 쥐를 1.5%–3% sevoflurane(노즈 콘을 통해 투여)으로 마취시킨 후 척추를 구부린 복와위 상태로 배치하였다. 요추 부위의 털을 깎고 L5–L6 척추 간 공간 위의 피부를 소독하였다. L5–L6 척추 간 공간에 마이크로 시린지를 경피적으로 삽입하였다. 바늘을 전진시키는 동안 꼬리가 갑자기 튀거나 움직이는 현상은 지주막하 공간에 성공적으로 진입했음을 나타내며, 가볍게 흡인했을 때 뇌척수액이 나타나는 것으로 이를 추가 확인하였다. 이러한 징후가 관찰되지 않을 경우, 주입 전 바늘 위치를 조정하였다. 두 가지 확인 기준이 모두 충족된 후에만 주입을 수행하였으며, 주입 후 비정상적인 신경학적 징후를 보이는 동물은 제외하였다. 이후 해당 용액을 천천히 주입하고, 주입 후 피부를 다시 세척하였다. 수술 절차는 약 3분 동안 지속되었으며, 쥐들은 일반적으로 5–10분 이내에 마취에서 회복되었다.

절개 통증 쥐 모델은 이전에 설명된 방법으로 구축되었다²⁷. 마취 후, 뒷발의 발바닥 표면을 10% 포비돈-요오드로 소독하였다. 뒷꿈치에서 약 0.5 cm 떨어진 지점에서 시작하여 발가락 방향으로 1-cm 길이의 종절개를 발바닥 피부에 가하였다. 절개는 피부와 근막까지 침투하였다. 안과용 포셉을 사용하여 발바닥 근육을 조심스럽게 들어 올린 후, 전체적인 조직 연속성을 유지하면서 종방향으로 절개하였다. 이후 근육을 원래 위치로 되돌리고, 지혈을 위해 가벼운 압박을 가한 다음 3-0 나일론을 사용하여 두 개의 매트리스 봉합으로 상처를 폐쇄하였다. 상처 폐쇄 후 절개 부위를 다시 소독하였다. 수술 후 쥐들은 개별 사육되었으며, 강한 빛으로부터 보호되고 먹이와 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 조용하고 따뜻한 환경에서 회복하도록 하였다. 수술 후 동물들을 모니터링하였으며, 사전 정의된 기준을 충족하지 못한 개체는 즉시 제외하였다. 상처 감염 여부는 상처 주변의 발적, 부종 및 국소 온도 상승, 악취를 동반한 비정상적인 황록색 농성 삼출물, 상처 개방이 지속되는 지연된 상처 치유, 괴사 및 확대, 그리고 체온 상승, 무기력, 식이 거부와 같은 전신 증상을 기준으로 판단하였다. 추가 제외 기준으로는 30 min 이내에 마취에서 회복되지 않은 경우, 수술 중 근육 단열 또는 신경혈관 손상이 발생한 경우, 수술 후 자해 행동, 모델 구축 실패, 그리고 뒷다리 마비나 절개 통증과 무관한 체중 지지 불능과 같은 신경학적 결손이 포함되었다. 상처 감염 또는 상처 벌어짐이 나타난 쥐는 연구에서 제외하였다.

행동 측정

그룹 배정 내용을 알지 못하는 조사자가 발Withdrawal 기계적 역치(PWMT)와 발Withdrawal 열 지연 시간(PWTL)을 측정하였다. 테스트는 최소 10분간의 적응 시간을 거친 후, 조용한 방에서 매일 일정한 시간에 수행되었으며; 케이지, 메쉬 또는 유리 바닥, 주변 조명, 열원 강도는 모든 그룹에서 일정하게 유지되었다. PWMT 테스트를 위해, 보정된 von Frey 필라멘트(0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g, 15.0 g)를 필라멘트가 약 1–2 mm 굽어질 때까지 상처 인접 부위의 발바닥 표면에 수직으로 가하였다. 연속적인 자극 사이에는 2분의 간격을 두었으며, up-and-down 방법을 사용하여 50% PWMT를 결정하였다²⁸. PWTL 테스트를 위해, 쥐를 유리 바닥 위의 개별 투명 케이지에 넣고, 복사열원을 상처 옆의 발바닥 표면에 맞추었다. 조직 손상을 방지하기 위해 30 s의 컷오프 시간을 설정하였고, 연속적인 노출 사이에는 2분의 간격을 두었으며, 3회 측정값의 평균을 기록하였다²⁹. 발을 들어 올리거나, 흔들거나, 핥는 행위를 양성 회피 반응으로 간주하였으며, 그루밍, 이동 또는 열원 정렬 이탈로 인해 영향을 받은 시험은 재적응 후 반복 수행하였다.

웨스턴 블롯 분석

설정된 시간에 쥐를 경추 탈구법으로 안락사시킨 후, L4–L6 요수척수를 단백질 분해 효소 억제제가 100:1 비율로 첨가된 radioimmunoprecipitation assay 용해 버퍼에 신속하게 수집하였습니다. 조직을 균질화한 후 20분 동안 얼음 위에 보관하고, 4 °C에서 15,000 × g로 20분간 원심분리하였습니다. 상층액을 4× 로딩 버퍼와 3:1 비율로 혼합하여 끓는 물에서 5분간 가열한 후 −80 °C에 보관하였습니다. 단백질 샘플(레인당 30 µg)을 10% sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide 젤에서 분리하고 0.45 또는 0.22 µm polyvinylidene fluoride 막으로 전이시켰습니다. 프리스테인 분자량 마커의 예상 이동 거리와 뚜렷한 불균일 또는 중단된 전이 영역의 부재를 확인하여 전이가 성공적으로 이루어졌는지 점검하였습니다. 막을 5% 탈지분유와 3% bovine serum albumin으로 상온에서 2시간 동안 블로킹하고, NeuN (1:8,000), GFAP (1:4,000), Iba-1 (1:3,000), p-ERK1/2 (1:1,000), t-ERK1/2 (1:3,000) 또는 GAPDH (1:2,000)에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시켰습니다. 0.05% Tween 20 (pH 7.4)이 포함된 Tris-buffered saline으로 세척한 후, 해당 horseradish peroxidase-결합 2차 항체 (1:5,000)와 함께 상온에서 1시간 동안 반응시켰습니다. 신호를 강화 화학발광법으로 검출하였으며, 각 표적 내에서 동일한 노출 범위를 사용하여 필름에 기록하였습니다. 그룹 배정을 알지 못하는 연구자가 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 밴드 밀도를 분석하였습니다. 이미지를 8비트 그레이스케일로 변환하고, 각 밴드에 동일한 직사각형 관심 영역을 적용하였으며, 인접한 공백 영역의 국소 배경값을 뺀 후 통합 밀도를 기록하였습니다. 블롯의 모든 레인에 동일한 영역 크기와 배경 처리 절차를 적용하였습니다. NeuN, GFAP, Iba-1 및 t-ERK1/2는 GAPDH로 표준화하였고, p-ERK1/2는 t-ERK1/2로 표준화한 후, 값을 대조군에 상대적으로 표시하였습니다.

면역형광염색

설정된 시간에 쥐를 3% 펜토바르비탈 나트륨 (1.5 mL/kg)으로 마취시키고, 300 mL의 냉각된 0.01 mol/L 인산 완충 식염수 (PBS; pH 7.4)를 심장을 통해 관류시킨 후, 이어서 250 mL의 냉각된 4% 파라포름알데히드로 관류하였다. L4–L6 척수를 4% 파라포름알데히드에서 6시간 동안 후고정한 후, 4 °C의 20%–30% sucrose–PBS에서 하룻밤 동안 동결 보호 처리하였으며, −22 °C에서 10 µm 두께로 절편화하였다. 절편을 0.01 mol/L PBS로 세척하고, 상온에서 1시간 동안 10% 염소 혈청으로 블로킹한 후, NeuN (1:100), GFAP (1:1,000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) 또는 COX-2 (1:50)에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. PBS로 3회 세척한 후, 해당되는 녹색 또는 적색 형광체 결합 2차 항체 (1:400)와 함께 상온에서 1시간 동안 반응시켰으며, 다시 PBS로 3회 세척한 뒤 항퇴색제와 커버슬립을 사용하여 마운팅하였다. 1차 항체 없이 처리한 음성 대조군 절편을 각 염색 배치에 포함시켰다. 이미지는 블라인드 처리된 연구자가 형광 현미경을 사용하여 획득하였다. 저배율 개요 이미지는 10× 대물렌즈를 사용하여 획득하였고, 세포 면역 반응 및 공동 국소화 이미지는 해당 피규어 패널에 따라 20× 또는 40× 대물렌즈를 사용하여 획득하였다. 동일한 피규어 및 염색 배치 내의 비교를 위해, 대물렌즈 배율, 조명 강도, 노출 시간, 검출기 게인, 카메라 설정 및 이미지 처리 파라미터를 포화 상태 미만으로 최적화한 후 고정하였다. 채널 중첩을 최소화하기 위해 별도의 형광 채널을 순차적으로 획득하였다. 동물당 동측 후각에서 겹치지 않는 세 영역을 캡처하였다. 형광 강도는 8-bit 변환, 세포가 없는 영역을 이용한 배경 제거, 그리고 각 염색 배치 내에서 동일한 관심 영역(ROI) 및 임계값을 적용한 후 이미지 분석 소프트웨어로 정량화하였으며, 영역 값들을 평균하여 동물당 하나의 값을 얻었다. 과노출, 조직 접힘, 찢어짐, 초점 불량 또는 불균일한 배경이 있는 영역은 제외하고 동일한 비포화 설정 하에서 다시 획득하였다. 조직 구조가 온전하고, 표적 신호가 1차 항체 미처리 대조군보다 높으며, 분석에 영향을 주는 주요 접힘, 찢어짐 또는 포화 영역이 없을 때 염색 결과를 채택하였다.

인비트로 (In vitro) 일차 척수 성상교세포 실험

일차 쥐 척수 성상세포는 습윤화된 5% CO₂ 배양기 내 37 °C의 완전 배양 배지를 사용하여 표준 무균 조건에서 배양되었습니다. 세포가 약 70%–80%의 합류도(confluence)에 도달했을 때 대조군, LPS 자극군, LPS + PPF군, LPS + U0126군 및 ERK1/2 복구군으로 나누어 사용하였습니다. PPF와 U0126은 10 µM 농도로 첨가하였습니다. 각 실험 내 병렬 웰(well) 간의 LPS 자극, 약물 처리 및 수확 조건은 동일하게 유지하였습니다. 경로 선택성 분석을 위해 세포 용해물을 수집하여 p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, total p38, p-JNK, total JNK 및 해당 로딩 대조군에 대한 웨스턴 블로팅을 수행하였습니다. 병렬 웰에서 배양 상층액을 수집하고 원심분리로 불순물을 제거한 후, 제조사의 지침에 따라 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 이용하여 TNF-α, PGE2 및 IL-6를 분석하였습니다. 웨스턴 블롯 밀도 분석은 위에서 설명한 것과 동일한 이미지 분석 원칙을 따랐습니다. 복구 실험을 위해 siRNA 형질전환으로 내인성 ERK1/2를 억제하였으며, 처리 전 구성적 활성 ERK1/2 (CA-ERK1/2) 발현 구조체를 도입하였습니다. 사이토카인 데이터를 해석하기 전, 웨스턴 블로팅을 통해 넉다운 및 과발현 효율을 확인하였습니다. 활성 siRNA나 구조체 없이 형질전환 시약에만 노출된 세포를 해당되는 경우 절차 대조군으로 사용하였습니다.

실험 설계

실험 동물의 하위 그룹화

무작위 숫자 표 방법을 사용하여 쥐를 6개 그룹으로 나누었으며, 그룹 배정은 행동 테스트 및 조직 수집 전에 완료되었다. 6개 그룹은 공백 그룹(n = 6), 절개통(IP) 그룹(n = 18), 생리식염수(NS) 그룹(0.9% NS, 10 µL; n = 9), PPF 그룹(10 µg in 10 µL; n = 12), 디메틸설폭사이드(DMSO) 그룹(10% DMSO, 10 µL; n = 9) 및 U0126 그룹(10 µg in 10 µL; n = 12)으로 구성되었다. 공백 그룹의 쥐는 발바닥 절개나 척수강 내 주사를 모두 받지 않았으며, 처리되지 않은 대조군 역할을 하였다. IP 그룹의 쥐는 척수강 내 주사를 통한 전처치 없이 발바닥 절개를 시행하였다. NS, PPF, DMSO 및 U0126 그룹의 쥐는 발바닥 절개 30분 전에 각각의 약물을 척수강 내로 투여받았다. NS 그룹은 PPF의 용매 대조군으로, DMSO 그룹은 U0126의 용매 대조군으로 사용되었다.

propentofylline 및 U0126의 투여량

Propentofylline은 글리아 조절제이며, 해당 연구진의 이전 연구에서 급성 통각 과민증을 완화시켰으므로 10 µg의 용량을 선택하였다. U0126은 ERK1/2 인산화를 차단하기 위해 사용되는 비 ATP-경쟁적 MEK1/2 억제제이다. 다양한 통증 모델에서 1–10 µg의 효과적인 척수강 내 투여 용량이 보고되었으며^30,31,32, 본 연구에서는 10 µg 용량을 사용하였다. U0126은 10% dimethyl sulfoxide에 용해하였고, PPF는 0.9% 생리식염수에 용해하였다. 최종 농도는 1 µg/µL였다. 약물과 용매는 수술 전에 준비하여 4 °C에서 보관하였으며 12 h 이내에 사용하였다.

프로펜토필린 또는 U0126의 수술 전 척수강 내 투여가 통각과민증에 미치는 영향

수술 24시간 전에 각 군에서 6마리의 쥐를 무작위로 선정하여 행동 측정을 실시하였으며, 이때 얻은 PWMT와 PWTL을 기저선으로 설정하였다. 수술 30분 전에 척수강 내 주사를 투여하였다. 수술 전 PPF 및 U0126의 척수강 내 투여가 기계적 및 열적 통각과민증에 미치는 영향을 평가하기 위해, 절개 후 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 72 h 시점에서 PWMT와 PWTL을 측정하였다.

절개 후 척수 신경 및 글리아 마커 발현에 미치는 수술 전 척수강 내 투여 propentofylline 또는 U0126의 효과를 평가하기 위한 실험 설계

치료 효과 평가를 위한 적절한 절개 후 시점을 결정하기 위해, 먼저 IP군에서 예비 시계열 분석을 수행하였습니다. 구체적으로, IP군의 쥐를 절개 후 2 h, 4 h, 24 h, 72 h에 안락사시킨 뒤, 웨스턴 블롯(n = 시점당 3마리)을 통해 척수 내 세포 마커 NeuN, GFAP, Iba-1의 발현 수준을 측정하였습니다. 이 예비 분석을 바탕으로, NeuN 발현이 4 h 시점에서 최고치에 도달하였고 초기 분자 변화가 절개성 통각 과민증의 초기 발달과 가장 밀접한 관련이 있다고 판단하여, 절개 후 첫 4 h를 초기 절개 후 관찰 창으로 선정하였습니다. 다만, 4 h 시점이 절개 후의 모든 시간적 분자 변화를 대표하도록 의도한 것은 아니었습니다.

선택된 이 시점에서, 척수강 내 주사를 투여받은 쥐들을 안락사시켜 다양한 세포 마커에 대한 Western blot 분석(n = 그룹당 3마리) 및 다양한 세포 유형의 형태학적 분석을 위한 면역형광 평가(n = 그룹당 3마리)를 수행하였습니다. 공백 그룹(blank group)의 경우, Western blot(n = 3)을 통해 척수 내 다양한 세포 마커(NeuN, GFAP, Iba-1)의 기본 발현 수준을 결정하고, 면역형광(n = 3)을 통해 다양한 세포(뉴런, 성상세포, 미세아교세포)의 형태를 확인하기 위해 쥐들을 무작위로 희생시켰습니다. 따라서 공백 그룹은 절개 및 처치를 하지 않은 기저 대조군으로 사용되었습니다.

척수 p-ERK1/2 및 염증 매개체에 대한 치료 효과

p-ERK1/2 발현 및 염증성 사이토카인 수치에 대한 치료 효과를 평가하기 위한 적절한 절개 후 시점을 결정하기 위해, 먼저 IP 군에서 예비 시계열 분석을 수행하였습니다. 구체적으로, IP 군의 쥐를 절개 후 2 h, 4 h, 24 h 및 72 h에 안락사시킨 후, Western blot을 통해 척수의 p-ERK1/2 발현을 측정하였습니다(n = 시점당 3마리). 이 시계열 실험 결과와 절개 후 NeuN 발현이 가장 높았던 시점을 종합하여, 수술 전 척수강 내로 투여한 PPF 또는 U0126이 척수 p-ERK1/2 발현 및 염증성 사이토카인에 미치는 영향을 평가하기 위한 고정 시점으로 절개 후 4 h를 선정하였습니다. 이 시점은 절개 후의 모든 시간적 변화를 포괄적으로 대표하기보다는, 초기 기전 관찰 창으로서 선정되었습니다.

선택된 해당 시점에서, 척수강 내 주사를 투여받은 쥐를 안락사시켜 p-ERK1/2 발현의 Western blot 분석(n = 그룹당 3마리)과 염증성 사이토카인의 면역형광 평가(n = 그룹당 3마리)를 수행하였습니다. blank 그룹의 경우, 쥐를 무작위로 희생시켜 Western blot(n = 3)을 통한 척수 내 p-ERK1/2의 기본 발현 수준과 면역형광(n = 3)을 통한 염증성 사이토카인(TNF-α 및 COX-2)의 기본 발현 수준을 측정하였습니다. 따라서 blank 그룹은 절개 및 처치를 하지 않은 기저선 대조군으로 활용되었습니다.

뉴런, 성상교세포 및 미세아교세포 내 척수 p-ERK1/2의 세포 내 국소화

절개 후 척수 p-ERK1/2의 세포 내 분포를 추가로 평가하기 위해, 절개 4시간 후 Blank 군과 IP 군을 대상으로 면역형광 염색을 수행하였습니다(n = 3).

통계 분석

데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 표본 크기는 연구팀의 이전 연구 및 예비 실험을 참조하여 결정하였다. 행동 데이터는 집단을 피험자 간 요인으로, 시간을 피험자 내 요인으로 하여 이원 반복측정 분산분석(ANOVA)으로 분석하였다. 시간 경과에 따른 Western blot 데이터는 일원 분산분석(one-way ANOVA) 후 Bonferroni 교정 쌍별 비교를 통해 평가하였다. 특정 시점의 Western blot 및 면역형광 데이터는 Bonferroni 교정 계획 비교를 포함한 일원 분산분석으로 평가하였으며, 두 집단 간 비교는 Student’s t-test로 평가하였다. 정규성과 분산의 동질성은 각각 Shapiro–Wilk 검정과 Levene 검정으로 평가하였다. 양측 p-value < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 통계 분석은 재료 표(Table of Materials)에 기재된 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. in vitro 성상교세포 실험의 경우, 독립적인 배양 실험을 분석 단위로 처리하였으며, Western blot 밀도 측정값과 사이토카인 농도는 적절한 경우 일원 분산분석 후 Bonferroni 교정 계획 비교 또는 사전 지정된 두 집단 비교를 위한 Student’s t-test를 사용하여 비교하였다.

데이터 가용성:

이 연구의 결과를 뒷받침하는 데이터는 보충 파일 1에 제공됩니다.

결과

절개 및 수술 전 propentofylline 또는 U0126의 척수강 내 투여가 절개 후 과민통에 미치는 영향

기계적 통각과민

수술 24시간 전 6개 그룹 간의 PWMT에는 유의미한 차이가 없었다(p > 0.05; Figure 1A,B). IP 그룹의 경우, 절개 후 PWMT가 감소했으며 절개 후 2시간부터 72시간까지 기저치보다 유의하게 낮은 상태를 유지했다(p < 0.05 vs baseline; Figure 1A). NS 및 DMSO 그룹에서는 절개 후 시점 간 PWMT의 유의미한 차이가 나타나지 않았다(p > 0.05 vs the IP group; Figure 1B). PPF 그룹의 PWMT는 절개 후 2시간부터 72시간까지 IP 그룹보다 유의하게 높았으며(p < 0.05 vs the IP group; Figure 1A), 절개 후 72시간에는 더 이상 기저치와 유의미한 차이가 없었다(p > 0.05 vs baseline; Figure 1A). U0126 그룹의 PWMT는 절개 후 첫 24시간 동안 IP 그룹보다 유의하게 높았으나(p < 0.05 vs the IP group; Figure 1A), 이러한 효과는 절개 후 72시간까지 유지되지 않았으며, 이때 PWMT는 기저치보다 유의하게 낮은 상태로 남아 있었고 IP 그룹과 더 이상 유의미한 차이를 보이지 않았다(p < 0.05 vs baseline; p > 0.05 vs the IP group; Figure 1A).

열성 통각과민

수술 24시간 전, 6개 그룹 간의 PWTL에는 유의미한 차이가 없었습니다 (p > 0.05; Figure 1C,D). IP 그룹의 경우, PWTL은 수술 전 24.85 s ± 1.06 s에서 절개 후 4시간째에 4.38 s ± 1.02 s로 감소했으며, 이후 절개 후 72시간째에 18.37 s ± 1.38 s로 일부 증가하였으나 관찰 기간 전반에 걸쳐 기저치보다 유의미하게 낮은 상태를 유지하였습니다 (p < 0.05 vs baseline; Figure 1C). NS 및 DMSO 그룹에서는 절개 후 시점 간 PWTL에 유의미한 차이가 없었습니다 (p > 0.05 vs IP 그룹; Figure 1D). PPF 그룹의 PWTL은 72시간의 관찰 기간 동안 IP 그룹보다 유의미하게 높았으며 (p < 0.05 vs IP 그룹; Figure 1C), 절개 후 72시간째에는 기저치와 유의미한 차이가 없는 수준으로 회복되었습니다 (p > 0.05 vs baseline; Figure 1C). U0126 그룹의 PWTL은 절개 후 첫 24시간 동안 IP 그룹보다 유의미하게 높았습니다 (p < 0.05 vs IP 그룹; Figure 1C). 이러한 효과는 절개 후 72시간째까지 유지되지 않았으며, 이때 PWTL은 기저치보다 유의미하게 낮은 상태를 유지했고 IP 그룹과는 더 이상 유의미한 차이를 보이지 않았습니다 (p < 0.05 vs baseline; p > 0.05 vs IP 그룹; Figure 1C).

절개 후 척수 세포 마커 발현 및 세포외 신호 조절 키나아제 1 및 2(extracellular signal-regulated kinase 1 and 2) 인산화의 시간적 변화에 대한 Western blot 분석

PVDF 막에서 특정 항체를 사용하여 NeuN (48 및 50 kD), GFAP (50 kD), Iba-1 (17 kD), p-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD; p-ERK2 = 42 kD), t-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD; t-ERK2 = 42 kD) 및 GAPDH (36 kD)를 포함하여 정확한 분자량에서 여러 밴드가 확인되었습니다. GAPDH 밴드는 NeuN, GFAP, Iba-1 및 t-ERK1/2의 대조군으로 사용되었으며, t-ERK1/2 밴드는 p-ERK1/2의 대조군으로 사용되었습니다.

IP 그룹 척수에서 얻은 Western blotting 데이터는 절개 후 다양한 정도로 증가했음을 보여주었다(Figure 2A). 뉴런 특이적 핵 단백질(neuron-specific nuclear protein) 발현은 절개 후 4시간에 최고치에 도달했으며(p < 0.001 vs baseline; Figure 2A), 절개 후 72시간까지 유의미하게 높은 수준을 유지했다(p < 0.001 vs baseline; Figure 2A). Glial fibrillary acidic protein 수치는 72시간의 관찰 기간 동안 점진적으로 증가했으며(p < 0.001 vs baseline; Figure 2A), 측정된 시점 중 72시간째에 가장 높은 수치가 관찰되었다. 유사하게, Iba-1 또한 절개 후 4시간에 유의미하게 증가한 수치에 도달했고(p < 0.001 vs baseline; Figure 2A), 좁은 범위 내에서 변동하였다. 특히, IP 그룹 척수의 Western blotting 데이터에서 ERK1/2 활성화는 절개 후 처음 24시간 동안만 증가했으나(p < 0.05 vs baseline; Figure 2B), 절개 후 72시간에는 감소한 것으로 나타난 반면(p < 0.05 vs baseline; Figure 2B), t-ERK/2의 발현은 모든 시점에서 유의미한 변화를 보이지 않았다.

척수 내 propentofylline 또는 U0126의 수술 전 척수강 내 투여가 세포 마커 및 phospho-extracellular signal-regulated kinase 1 및 2의 발현에 미치는 영향에 대한 Western blot 분석

Western blotting 데이터 분석 결과, NeuN 발현은 행동 측정 임계값이 가장 낮았던 절개 후 4시간에 최고치에 도달했습니다. 이에 따라 수술 30분 전 척수강 내로 투여한 PPF 및 U0126이 세포 마커 발현과 ERK1/2 인산화에 미치는 영향을 절개 후 4시간에 평가하였습니다.

Western blotting 데이터 결과, 절개 후 4시간째에 IP 군의 모든 세포 마커의 척수 발현은 공백군과 비교하여 유의하게 증가하였습니다 (p < 0.05 vs baseline; Figure 3). IP 군과 비교했을 때, 수술 전 척수강 내 PPF 투여는 NeuN (p < 0.05 vs IP 군; Figure 3A), GFAP (p < 0.05 vs IP 군; Figure 3B) 및 Iba-1 (p < 0.01 vs IP 군; Figure 3C)의 척수 발현을 감소시켰습니다. IP 군과 비교하여, 수술 전 척수강 내 U0126 투여 또한 NeuN (p < 0.01 vs IP 군; Figure 3D), GFAP (p < 0.05 vs IP 군; Figure 3E) 및 Iba-1 (p < 0.01 vs IP 군; Figure 3F)의 척수 발현을 감소시켰습니다. 그러나 공백군과 비교했을 때, PPF 군의 NeuN 발현은 baseline보다 유의하게 높게 유지된 반면 (p < 0.01 vs baseline; Figure 3A), U0126 군의 NeuN 발현은 공백군보다 유의하게 낮았습니다 (p < 0.01 vs baseline; Figure 3D). GFAP 및 Iba-1의 경우, Figure 3에 표시된 바와 같이 IP 군과의 비교가 강조되었습니다. 수술 전 척수강 내 NS 및 DMSO 투여는 어떤 세포 마커의 발현에도 유의미한 영향을 주지 않았습니다.

Western blotting 데이터 분석 결과, 절개 4시간 후 Blank, IP, NS 및 PPF 그룹 간의 척수 t-ERK1/2 발현량은 유의미한 차이가 없었습니다(그림 4A). 이와 대조적으로, blank 그룹과 비교하여 절개 4시간 후 IP 및 NS 그룹에서 p-ERK1/2 발현이 유의하게 증가하였습니다(p < 0.001 vs blank 그룹; 그림 4B). IP 그룹과 비교했을 때, 수술 전 PPF의 척수강 내 투여는 절개 4시간 후 p-ERK1/2 발현을 유의하게 감소시켰습니다(p < 0.001 vs IP 그룹; 그림 4B). NS 그룹과 비교하여 PPF 그룹의 p-ERK1/2 발현 또한 유의하게 낮았습니다(p < 0.01 vs NS 그룹; 그림 4B). 하지만 blank 그룹과 비교하면, 절개 4시간 후 PPF 그룹의 p-ERK1/2 발현은 여전히 유의하게 높은 상태였습니다. 마찬가지로, 절개 4시간 후 Blank, IP, DMSO 및 U0126 그룹 간의 척수 t-ERK1/2 발현량은 유의미한 차이가 없었습니다(그림 4C). blank 그룹과 비교하여, 절개 4시간 후 IP 및 DMSO 그룹에서 p-ERK1/2 발현이 유의하게 증가하였습니다(p < 0.001 vs blank 그룹; 그림 4D). IP 그룹과 비교했을 때, 수술 전 U0126의 척수강 내 투여는 p-ERK1/2 발현을 유의하게 감소시켰습니다(p < 0.001 vs IP 그룹; 그림 4D). DMSO 그룹과 비교하여 U0126 그룹의 p-ERK1/2 발현 또한 유의하게 낮았습니다(p < 0.001 vs DMSO 그룹; 그림 4D). 특히, blank 그룹과 비교했을 때 절개 4시간 후 U0126 그룹의 p-ERK1/2 발현은 blank 그룹과 유의미한 차이가 없었습니다. NS 또는 DMSO 전처리는 IP 그룹과 비교했을 때 p-ERK1/2 발현에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다.

척수 세포 마커 및 염증 매개체의 면역형광 관찰

면역형광 결과, 절개 4시간 후 동측 후각에서 대조측에 비해 NeuN 면역반응성이 정성적으로 더 강하게 나타났습니다 (그림 5). 공백군(blank group)의 대표 이미지에서는 동측 척수 후각의 기저 NeuN, GFAP 및 Iba-1 면역반응성이 확인되었습니다 (그림 6A–C). IP군에서는 NeuN 면역반응성이 공백군보다 정성적으로 더 강했으며 (그림 6D vs 그림 6A), GFAP 면역반응성 또한 더 강했고 (그림 6E vs 그림 6B), Iba-1 면역반응성 역시 증가했습니다 (그림 6F vs 그림 6C). 동시에 IP군의 성상교세포와 미세아교세포는 세포체가 확장되고 돌기가 더 굵고 복잡하게 분지된 비대해진 양상을 보였습니다 (그림 6E,F).

PPF 군의 대표 이미지에서는 IP 군에 비해 NeuN 면역반응성이 낮게 나타났으며(Figure 6G vs Figure 6D), GFAP 면역반응성(Figure 6H vs Figure 6E)과 Iba-1 면역반응성(Figure 6I vs Figure 6F) 또한 더 낮게 관찰되었습니다. U0126 군의 대표 이미지에서도 마찬가지로 IP 군보다 NeuN 면역반응성이 낮았고(Figure 6J vs Figure 6D), GFAP 면역반응성(Figure 6K vs Figure 6E) 및 Iba-1 면역반응성(Figure 6L vs Figure 6F)이 더 낮게 나타났습니다. PPF 군과 U0126 군 모두에서 성상교세포와 미세아교세포의 비대증 정도가 덜했으며, 세포체가 더 작고 돌기가 더 적고 가늘게 관찰되었습니다(Figure 6H,I,K,L). 이에 상응하는 NeuN, GFAP 및 Iba-1의 형광 강도 분석 결과는 대표 면역형광 관찰 결과와 일치하였습니다(Figure 6M–O, 각각 참조).

절개 4시간 후, IP 군의 동측 후각에서 TNF-α 및 COX-2 면역 반응성과 상대적 형광 강도가 공백 군에 비해 증가했다. 두 측정값 모두 수술 전 척수강 내 PPF 또는 U0126 처치 후 감소했다(그림 7A–C).

면역형광법을 이용한 척수 p-ERK1/2의 세포 내 국소화 확인

면역형광법 결과, 공백군에서는 척수 내 p-ERK1/2 면역반응성이 약하게 나타났으며 NeuN 양성 뉴런에서만 관찰되었습니다(그림 8A–C). 이와 대조적으로, 절개 후 4시간에는 동측 척수 후각에서 p-ERK1/2 면역반응성이 현저히 증가했으며, 이는 뉴런뿐만 아니라 GFAP 양성 성상교세포 및 Iba-1 양성 미세아교세포와도 함께 국소화되었습니다(그림 8D–I). 이러한 결과는 절개가 p-ERK1/2의 세포 분포를 기저 상태의 뉴런 단독 분포에서 손상 후에는 뉴런, 성상교세포 및 미세아교세포까지 더 넓게 확장시켰음을 나타냅니다.

In vitro 척수 성상교세포 내 ERK1/2 의존적 메커니즘 검증

PPF가 세포 수준에서 ERK1/2 관련 신호 전달을 통해 염증 매개체 방출을 억제할 수 있는지 추가로 평가하기 위해, LPS로 자극한 일차 쥐 척수 성상세포에 PPF 또는 U0126 (10 µM)을 처리하였습니다. 웨스턴 블롯 분석 결과, PPF는 LPS로 유도된 p-ERK1/2 발현을 감소시킨 반면, p-p38 및 p-JNK 인산화는 뚜렷하게 변하지 않았으며(그림 9A), 이는 해당 조건에서 상대적인 ERK1/2 경로 선택성을 뒷받침합니다. 이와 병행하여, PPF는 Stim 군과 비교했을 때 배양 상청액 내의 TNF-α, PGE2 (COX-2 활성의 하위 생성물) 및 IL-6 수치를 감소시켰으며, U0126 또한 유사한 억제 효과를 나타냈습니다(그림 9B).

지속적인 ERK1/2 활성화가 PPF의 항염증 효과를 약화시키는지 테스트하기 위해 구조 실험(rescue experiments)을 수행하였다. siRNA를 사용하여 내인성 ERK1/2를 넉다운시킨 후, 구성적 활성 ERK1/2 (CA-ERK1/2) 컨스트럭트를 도입하였다(그림 9C). CA-ERK1/2를 발현하는 성상교세포에서 PPF는 더 이상 TNF-α, PGE2 또는 IL-6 수치를 동일한 정도로 감소시키지 않았으며(그림 9D), 이는 ERK1/2 인산화의 억제가 이 in vitro 성상교세포 시스템에서 PPF의 항염증 효과에 기여함을 나타낸다.

종합적으로, 이러한 in vitro 연구 결과는 PPF가 척수 성상교세포에서 ERK1/2 의존적 메커니즘을 통해 염증 매개체 방출을 감쇄시킨다는 세포 수준의 기전적 근거를 제공하며, 이는 in vivo 관찰 데이터와 상보적인 관계에 있습니다.

그림 1: 수술 전 척수강 내 PPF 또는 U0126 투여가 절개 유발 기계적 및 열적 통각 과민에 미치는 영향. (A) blank, IP, PPF 및 U0126 군의 PWMT. (B) IP 및 vehicle-control 군의 PWMT. (C) blank, IP, PPF 및 U0126 군의 PWTL. (D) IP 및 vehicle-control 군의 PWTL. 데이터는 평균 ± SD (군당 쥐 n = 6마리)이며, 이원 반복 측정 분산 분석(two-way repeated-measures ANOVA)으로 분석되었습니다. ***p < 0.001 (기초선 대비); #p < 0.05, ##p < 0.01 및 ###p < 0.001 (IP 군 대비). 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 절개 후 척수 세포 마커 발현 및 ERK1/2 인산화의 시간 경과. (A) 절개 후 기저 상태부터 72 h까지 IP 그룹의 NeuN, GFAP 및 Iba-1에 대한 정량 분석 및 대표적 Western blot. (B) 동일 기간 동안의 t-ERK1/2 및 p-ERK1/2에 대한 정량 분석 및 대표적 Western blot. 수치는 대조군(100%)을 기준으로 정규화되었으며, 평균 ± SD (시점당 쥐 n = 3마리)로 표시되었다. 전체적인 차이는 표시된 쌍별 비교를 포함한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 분석되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 (기저 상태 대비). 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 절개 4시간 후 척수 신경 및 글리아 마커에 미치는 수술 전 척수강 내 PPF 또는 U0126의 효과. (A–C) blank, IP, normal-saline 및 PPF 군의 NeuN, GFAP 및 Iba-1. (D–F) blank, IP, dimethyl-sulfoxide 및 U0126 군의 NeuN, GFAP 및 Iba-1. 대표적인 Western blot 결과가 오른쪽에 표시되어 있다. 값은 blank 군(100%)을 기준으로 정규화되었으며 평균 ± SD로 표시되었다 (군당 n = 3마리 쥐). *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001 vs blank; #p < 0.05 및 ##p < 0.01 vs IP; Δp < 0.05, ΔΔp < 0.01 및 ΔΔΔp < 0.001 vs 해당 vehicle 군. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 절개 4시간 후 척수 ERK1/2 인산화에 미치는 수술 전 척수강 내 PPF 또는 U0126의 영향. (A,B) blank, IP, 생리식염수 및 PPF 군의 t-ERK1/2 및 p-ERK1/2. (C,D) blank, IP, dimethyl-sulfoxide 및 U0126 군의 t-ERK1/2 및 p-ERK1/2. 대표적인 Western blot 결과가 오른쪽에 제시됨. 수치는 blank 군(100%)을 기준으로 정규화되었으며, 평균 ± SD (군당 n = 3마리의 쥐)로 표시됨. **p < 0.01 및 ***p < 0.001 (blank 대비); ###p < 0.001 (IP 대비); ΔΔp < 0.01 및 ΔΔΔp < 0.001 (해당 용매 대조군 대비). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 절개 후 동측 및 반대측 척수의 NeuN 면역반응성. 절개 4시간 후 IP 그룹의 대표적인 요추 척수 횡단면에서 반대측 및 동측 후각의 NeuN 염색을 보여준다. 이 이미지는 n = 3마리 쥐를 대표하며 정성적인 해부학적 비교를 위해 제공되었다. 스케일 바 = 500 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 절개 4시간 후 척수 신경세포 및 글리아 세포의 면역반응성에 미치는 PPF와 U0126의 효과. (A–C) 대조군(blank group)의 NeuN, GFAP 및 Iba-1. (D–F) IP군의 해당 염색 결과. (G–I) PPF 처리 후의 해당 염색 결과. (J–L) U0126 처리 후의 해당 염색 결과. (M–O) 각각 NeuN, GFAP, Iba-1의 상대적 형광 강도. 막대는 평균 ± SD (그룹당 쥐 n = 3)를 나타내며, 표시된 비교군에 대해 *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001임. 스케일 바 = 200 µm. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 절개 및 처치 후 척수의 TNF-α 및 COX-2 면역반응성. (A) 절개 4시간 후 blank, IP, PPF 및 U0126 군의 대표적인 TNF-α 및 COX-2 이미지. (B) 상대적 TNF-α 형광 강도. (C) 상대적 COX-2 형광 강도. 막대는 평균 ± SD (군당 n = 3마리의 쥐)를 나타냄; 표시된 비교군에 대해 ***p < 0.001. 스케일 바 = 200 µm. 여기에서 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

그림 8: 절개 4시간 후 척수 p-ERK1/2의 세포 내 국소화. (A–C) 대조군에서 각각 NeuN, GFAP 및 Iba-1과 p-ERK1/2의 이중 염색 결과. (D–F) IP 군에서의 해당 이중 염색 결과; 화살표는 대표적인 공동 국소화 세포를 나타냄. 적색은 p-ERK1/2, 녹색은 세포 마커, 황색은 공동 국소화를 나타냄. (G–I) 각각 NeuN, GFAP 및 Iba-1 양성 영역과 관련된 상대적 형광 강도. 막대는 평균 ± SD (그룹당 n = 3마리의 쥐)를 나타냄; 표시된 비교에 대해 **p < 0.01 및 ***p < 0.001. 스케일 바 = 100 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 일차 랫드 척수 성상세포에서 PPF의 ERK1/2 의존적 항염증 효과. (A) PPF가 p-p38 또는 p-JNK에는 뚜렷한 영향 없이 LPS로 유도된 p-ERK1/2를 감소시켰음을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯. (B) LPS, PPF 또는 U0126 처리 후 배양 상층액 내의 TNF-α, PGE2 및 IL-6 농도. (C) siRNA 매개 ERK1/2 넉다운 및 구성적 활성 ERK1/2(CA-ERK1/2)의 발현을 확인하는 웨스턴 블롯. (D) PPF 처리 여부에 따른 CA-ERK1/2 발현 후의 TNF-α, PGE2 및 IL-6 농도. 막대는 독립적인 in vitro 실험의 평균 ± SD를 나타내며, 표시된 비교군에 대해 ***p < 0.001, ns는 유의미하지 않음을 의미함. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 본 연구의 결과물을 뒷받침하는 데이터.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

대부분의 환자들은 수술 후 신체적 고통뿐만 아니라 때로는 정신적으로도 급성 통증을 겪지만³³, 급성 수술 후 통증의 세부 메커니즘에 대해서는 여전히 알려지지 않은 것이 많습니다. 진통제의 강력한 효과와 더불어 불가피한 부작용이 수반되기에, 더 안전하고 효과적인 진통제를 탐색하는 것이 매우 중요합니다. 본 연구는 준비가 쉽고 실현 가능한, 급성 수술 후 통증을 모사하기 위해 이전에 검증된 쥐 절개 모델을 기반으로 하였습니다²⁷. 본 연구에서는 절개 후 척수 뉴런 및 글리아 마커, ERK1/2 인산화 및 염증 매개체의 변화를 평가하였으며, 수술 전 척수강 내 PPF 투여의 항과민증 효과가 척수 ERK1/2 인산화 및 염증성 사이토카인 발현의 평행한 변화와 관련이 있는지 조사하였습니다.

절개 후, IP 군의 쥐들은 강력한 기계적 및 열적 통각과민증을 나타냈으나, vehicle 전처리는 행동학적 또는 분자적 결과 모두에서 감지 가능한 영향을 미치지 않았습니다. 이러한 결과는 모델의 안정성을 뒷받침하며, PPF 및 U0126 군에서 관찰된 효과가 주입 절차나 vehicle 자체로 인한 것일 가능성이 낮음을 시사합니다. 또한, 절개 후 NeuN 발현이 증가했으나, 이러한 변화는 신경세포 활성화의 직접적인 증거라기보다 신경세포 마커 발현의 변화로 신중하게 해석해야 합니다. 종합적으로, 이러한 관찰 결과는 절개 통증의 초기 발생 과정에서 글리아 및 ERK1/2 관련 반응을 조사하기 위한 기초를 제공합니다.

글리아 세포는 시냅스 형성, 시냅스 정보 전달 및 통합, 그리고 시냅스 가소성 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다. 통증 처리 과정에서 글리아 세포, 특히 활성화된 척수 성상교세포와 미세아교세포의 면역학적 및 염증 촉진 기능은 통각 과민 및 수술 후 행동 변화를 매개하는 중추 감작을 강화할 수 있습니다^7,34. 척수 내의 부적응성 신경학적 변화는 유해하거나 유해하지 않은 자극에 대한 반응성을 증가시킬 수 있습니다. 상당한 증거들에 따르면, 척수 성상교세포와 미세아교세포의 활성화가 척수 신경 손상 모델³⁵, 조직 플라스미노겐 활성제 유발 통증¹⁶, 절개 통증^11,12, 그리고 골암 통증^19,31의 통각 과민 발생 및 유지에 관여하는 것으로 나타납니다. 따라서 척수 글리아 활성화는 다양한 통증 상태의 공통된 특징인 것으로 보이며, 절개 통증에서 이들의 역할에 대한 추가적인 탐구는 수술 후 통증 기전에 대한 현재의 이해를 확장할 수 있을 것입니다.

본 연구 결과는 척수 성상교세포와 미세아교세포가 절개 후 초기 신경염증 반응에 참여한다는 견해를 뒷받침합니다¹². GFAP, Iba-1 및 p-ERK1/2는 동일한 시간적 패턴을 보이기보다 부분적으로 뚜렷하게 구분되는 시간 경과를 나타냈으며, 이는 서로 다른 글리아 관련 프로세스가 수술 후 통증 발생의 서로 다른 단계에 기여할 수 있음을 시사합니다^31,35. 면역형광법 결과는 절개 후 성상교세포와 미세아교세포에서 비대성 형태학적 변화가 나타남을 보여줌으로써 이러한 해석을 더욱 뒷받침하였습니다. TNF-α 및 COX-2 면역반응성의 증가와 더불어, 이러한 관찰 결과들은 글리아 관련 염증 신호 전달이 급성 절개성 통각과민증에 기여한다는 개념과 일치합니다^7,36.

메틸잔틴 유도체인 Propentofylline은 항혈소판 활성과 장기 기억 유지 지원 능력으로 인해 초기에는 뇌혈관 활성 약물로 연구되었습니다³⁷. 하지만 PPF의 글리아 세포 조절 효과는 진통제로서의 잠재적 가치 또한 부여합니다. 연구에 따르면 PPF는 세포 내 cyclic adenosine monophosphate의 분해를 억제하고 세포 외 adenosine의 재흡수를 감소시킴으로써 미세아교세포의 활성화를 저해할 수 있습니다^4,5. in vitro 연구에서 PPF는 TNF-α로 유도된 mammalian target of rapamycin 경로를 방해하여 성상교세포의 증식을 억제했습니다⁶. 따라서 글리아 세포에 대한 PPF의 조절 효과가 통증 과정의 조절에 참여할 수 있게 합니다.

본 연구에서 나타난 PPF의 지속적인 항통각 과민 효과는 GFAP 및 Iba-1 발현의 감소와 더불어, 이 모델에서 글리아 조절이 PPF의 진통 작용에 중요한 구성 요소라는 해석을 뒷받침합니다. 이전 연구들 또한 PPF가 통증 상태에서 글리아 관련 염증성 신호 전달을 억제할 수 있음을 시사해 왔습니다^5,31. 또한, TNF-α와 COX-2의 병행 감소는 PPF가 글리아 관련 염증 반응을 완화함으로써 절개 통증을 부분적으로 경감시킬 수 있음을 시사합니다. 하지만 현재의 데이터는 기전적이라기보다 연관성에 기반한 것이므로, 이러한 결과는 직접적인 인과 경로의 증거라기보다는 글리아의 관여를 뒷받침하는 근거로 해석되어야 합니다.

중요한 세포 내 신호 조절 인산화효소 쌍인 ERK1/2가 (뇌와 척수에서 신경 세포의 흥분성과 시냅스 가소성을 매개함으로써) 다양한 통증 과정의 발생 및 유지에 관여한다는 것이 입증되었습니다²¹. 예를 들어, 한 연구에 따르면 캡사이신이나 포르말린을 주입했을 때는 척수 내 p-ERK1/2가 짧고 빠르게 증가한 반면, 완전 프로인드 보조제(complete Freund’s adjuvant)나 벌독을 주입했을 때는 (짧은 잠복기 이후) 척수의 ERK1/2 활성화가 훨씬 더 오래 지속되었습니다^38,39. 반대로, 다른 연구에서는 신경 손상으로 유도된 척수 ERK1/2 활성화가 매우 초기에 정점에 도달하고 일정 기간 지속되었으며, p-ERK1/2의 정점 이후에 통각 과민증이 나타났습니다³⁵. 따라서 ERK1/2의 인산화는 서로 다른 통증 과정의 각기 다른 단계에서 발생할 수 있으며, 척수 내 p-ERK1/2의 상향 조절은 즉각적인 유도와 장기적인 유전자 반응 모두에 중요할 수 있습니다.

본 연구에서 절개로 유도된 ERK1/2의 인산화는 대조군에 비해 절개 후 첫 24시간 동안 유의하게 증가하였으며, p-ERK1/2의 발현은 NeuN 발현이 가장 높았던 시점과 일치하게 절개 후 4시간에 정점에 도달하였다(이전 기술 내용 참조)²⁴. 동시에 면역형광법 결과에서 나타난 바와 같이, 절개로 유도된 ERK1/2의 인산화는 동측 척수 후각의 뉴런, 성상세포 및 미세아교세포에 동시에 분포하였으며, 이는 ERK1/2 관련 신호 전달이 절개성 통각과민증의 초기 단계와 특히 밀접한 관련이 있다는 관점을 뒷받침한다. 또한, 수술 전 U0126을 척수강 내로 투여했을 때 절개 후 4시간 시점에서 척수 글리아 마커, NeuN 및 p-ERK1/2의 발현이 감소하였고, 절개 후 초기 기간 동안 기계적 및 열적 통각과민증이 모두 완화된 것으로 나타나, 척수의 p-ERK1/2가 절개 후 급성 통각과민증의 초기 단계에 관여할 수 있음을 시사한다. 그러나 GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 및 행동 결과가 서로 다른 시간적 프로파일을 보였으므로, 본 기전 해석은 전체 수술 후 기간으로 일반화하기보다 4시간 시점으로 대표되는 절개 후 초기 단계로 제한되어야 한다.

또한, 본 연구에서 수술 전 척수강 내 PPF 투여는 절개 후 4시간째의 ERK1/2 인산화를 감소시켰으며, 이는 척수 내 NeuN, GFAP 및 Iba-1 발현에서 관찰된 변화가 적어도 부분적으로는 ERK1/2 관련 신호 전달과 연관되어 있을 수 있음을 시사합니다. 수술 전 척수강 내 U0126 투여 또한 TNF-α 및 COX-2 면역 반응성을 감소시켰으며, 이는 절개 후 ERK1/2 인산화와 염증 매개체 발현 사이에 잠재적인 연관성이 있음을 뒷받침합니다. 그림 9에 제시된 추가적인 in vitro 별아교세포 실험에서는 지속적인 ERK1/2 활성화가 TNF-α, PGE2 및 IL-6 방출을 감소시키는 PPF의 능력을 약화시켰으므로, ERK1/2 의존적인 항염증 성분이 존재한다는 세포 수준의 근거가 마련되었습니다. 하지만 이러한 회복 실험(rescue experiments)은 온전한 척수가 아닌 배양된 별아교세포에서 수행되었고, in vivo 회복 실험이나 세포 유형 선택적 조작이 이루어지지 않았으므로, in vivo 결론은 인과적인 ERK1/2 의존적 메커니즘에 대한 결정적인 증거보다는 이를 뒷받침하는 결과로 해석되어야 합니다.

글리아 세포 활성화, p-ERK1/2 발현 및 염증성 사이토카인 방출 사이의 가능한 관계를 더 자세히 논의하기 위해, 면역형광법으로 관찰된 공간적 국소화 패턴을 고려하였다. 절개 후 4시간째의 척수 후각에서 p-ERK1/2는 GFAP 양성 성상교세포 및 Iba-1 양성 미세아교세포와 함께 발현되었다. PPF와 U0126 모두 p-ERK1/2, TNF-α 및 COX-2 발현의 감소와 관련이 있음을 보여준 Western blot 및 면역형광 분석 결과와 종합해 볼 때, 이러한 데이터는 척수 글리아 세포의 ERK1/2 인산화가 절개 후 염증 반응에 관여할 수 있음을 시사한다. 일차 배양 성상교세포에서의 in vitro 데이터는 PPF 처리, ERK1/2 억제 및 염증 매개체 방출 사이의 직접적인 세포적 연결을 더욱 뒷받침한다. 그럼에도 불구하고, in vivo 증거는 연관성과 치료 관련 평행 변화를 보여주는 반면, 세포 실험은 in vivo 세포 유형별 인과적 검증을 보완할 뿐 이를 대체하지는 않는다. 면역형광 분석이 제한된 수의 동물과 시야를 기반으로 이루어졌기 때문에, 이러한 관찰 결과는 Western blot 및 in vitro 결과와 함께 신중하게 해석되어야 한다.

여러 절차적 단계들이 재현성에 불균형적인 영향을 미칩니다. 척수강 내 주사는 특유의 꼬리 반응과 뇌척수액 확인이 모두 필요합니다. 주사 중 저항이 느껴지거나, 확인 과정이 없거나, 새로운 신경학적 결손이 나타난 경우에는 동일 부위에 다시 주사하기보다 제외하는 것이 바람직합니다. 행동 테스트는 순응 과정, 케이지 조건, 자극 배치 및 연구자의 기대치에 민감하므로, 블라인드 테스트, 고정된 간격, 그리고 일관된 환경 조건이 필수적입니다. 조직 수집 시간, 균일한 단백질 이동, 항체 배양, 그리고 각 염색 배치 내에서의 동일한 현미경 설정 또한 매우 중요합니다. 일반적인 문제로는 불충분한 순응으로 인한 가변적인 회피 역치, 불완전한 이동 또는 과노출로 인한 약하거나 불균일한 Western blot 밴드, 그리고 불충분한 세척, 과도한 항체 농도 또는 포화된 획득 설정으로 인한 높은 형광 배경 등이 있습니다.

본 프로토콜은 연구 목적에 따라 수정될 수 있습니다. 후기 글리아 반응(glial responses)이 관심 대상인 경우 더 넓은 시간 범위를 설정할 수 있으며, 중개 가능성의 실용성이 우선시되는 경우에는 용량 범위 설정이나 다른 투여 경로를 추가할 수 있습니다. 염증성 또는 신경병성 통증 모델과 비교했을 때, 발바닥 절개 모델은 상대적으로 신속하고 실용적이며 정의된 수술 후 손상을 재현합니다²⁷. 행동 테스트, Western blotting 및 세포 관련 면역형광법을 결합하면 상호 보완적인 기능적, 분자적, 공간적 정보를 얻을 수 있습니다. 다만, 이는 단일 엔드포인트 분석보다 더 많은 자원이 소요되며, 그 자체만으로는 세포 특이적 인과 관계를 확립하지 못합니다. U0126을 이용한 약리학적 비교는 경로 해석을 강화하지만, 유전적 또는 세포 유형 선택적 조작보다는 특이성이 낮습니다^{20,21,22,23,24,25}.

향후 적용 범위에는 양성 테스트, 더 큰 수술적 손상, 임상적으로 실행 가능한 투여 경로, 추가적인 수술 후 시점 및 특정 글리아 세포 집단을 대상으로 하는 중재가 포함됩니다. 절개 모델이 간단하고, 행동 종말점이 반복 가능하며, 분자 분석에 표준 실험실 방법이 사용되기 때문에 이 워크플로우는 후보 진통제 또는 글리아 조절 치료제를 스크리닝하는 데 실용적입니다. 그럼에도 불구하고 재현성은 사전 정의된 제외 기준, 맹검 처리된 결과 평가, 일관된 이미지 획득, 그리고 원시 데이터와 분석 설정의 완전한 보고에 달려 있습니다.

한계점

본 연구에는 몇 가지 한계점이 있습니다. 첫째, 발바닥 절개 모델은 상대적으로 경미한 외과적 손상을 나타내므로 흉부 절개술이나 개복술과 같은 더 큰 외과적 수술을 완전히 반영하지 못할 수 있습니다. 따라서 본 연구 결과를 다른 형태의 수술 후 통증에 외삽할 때 주의가 필요합니다. 또한, 수컷 Sprague–Dawley 쥐만을 대상으로 하였기 때문에 성별에 따른 결과의 일반화에 한계가 있습니다. 통증 반응, 진통 효과 및 글리아 세포 활성화 패턴에서 알려진 성별 차이를 고려할 때, 암컷 동물을 포함한 추가 연구가 필요합니다.

주요 분자 및 조직학적 관찰은 절개 후 4시간 시점에 집중되었습니다. GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 및 행동 결과 등 서로 다른 종료점들이 절개 후 각기 다른 시간적 프로파일을 보였으므로, 본 연구 결과에 대한 기전적 해석은 주로 절개 후 초기 단계로 제한되어야 합니다. 또한, 본 연구의 분자 실험은 상대적으로 제한된 표본 크기로 수행되었으며, 이는 관찰 결과의 통계적 강건성을 저하시켰을 가능성이 있습니다.

세포외 신호 조절 키나아제 1 및 2는 p-ERK1/2로 함께 평가되었으며, 각각의 개별적인 기여도는 따로 조사되지 않았습니다. 따라서 본 연구에서는 절개로 유발된 통증 처리 과정에서 ERK1과 ERK2의 각각의 역할을 결정할 수 없었습니다. 또한, 형광 강도 정량화는 제한된 수의 동물과 시야를 기반으로 수행되었으며, 입체 세포 계수나 정식 공동 국소화 계수가 포함되지 않았습니다. 그러므로 이러한 관찰 결과는 Western blot 결과와 함께 신중하게 해석되어야 합니다.

마지막으로, in vitro 성상교세포 구조 실험을 통해 ERK1/2 의존적 염증 매개체 조절에 대한 기전적 근거를 확인하였으나, 절개 후의 상위 조절 사건 및 손상되지 않은 척수 조직 내의 하위 사건들에 대해서는 심도 있게 조사되지 않았습니다. 또한, in vitro 배양 시스템은 척수 후각 내의 뉴런, 성상교세포, 미세아교세포 및 침윤된 면역 세포 간의 상호작용을 완전히 재현할 수 없습니다. 따라서 본 연구는 ERK1/2 관련 기전을 뒷받침하지만, 완전한 in vivo 세포 특이적 인과관계를 확립한 것은 아닙니다.

결론

본 연구는 수술 전 PPF의 척수강 내 투여가 절개로 인해 유도된 척수 NeuN, GFAP 및 Iba-1 발현 증가를 완화시켰음을 보여줍니다. 이러한 효과는 절개 후 급성 기계적 및 열적 통각 과민증의 완화와 ERK1/2 인산화 및 TNF-α 및 COX-2 발현의 감소를 동반하였습니다. 그러나 이러한 결과는 PPF의 항통각 과민 효과와 척수 글리아 세포 내 ERK1/2 인산화 감소(염증 매개체 발현 감소와 연관됨) 사이의 연관성을 지지하지만, 확정적인 기전적 증거를 제공하는 것은 아닙니다. PPF의 항통각 과민 효과는 절개 후 관찰 기간 내내 지속된 반면, MEK1/2 억제제인 U0126의 효과는 주로 절개 후 초기 단계에 국한되었습니다. 이러한 발견은 ERK1/2 신호 전달이 절개 통증의 초기 발생 단계에서 특히 중요할 수 있음을 시사합니다. PPF의 효과가 더 오래 지속되었다는 점은 그 작용 기전이 ERK1/2 억제 외에 추가적인 경로를 포함할 수 있음을 나타냅니다. 따라서 PPF는 급성 수술 후 통증 관리를 개선하기 위한 생물학적 표적이라기보다 잠재적인 치료적 개입 방법이 될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.01 M PBS 완충액	Solarbio	P1020
1.0 M Tris-HCl 완충액 (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl 완충액 (pH 8.8)	Solarbio	T1010
10% sodium dodecyl sulfate (SDS)	Solarbio	S1010
10× TBST 스톡 용액	Solarbio	T1081
30% 아크릴아마이드	Solarbio	A1010
4× 단백질 로딩 버퍼	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
과황산암모늄	Solarbio	A1030
자동 플레이크 제빙기	창슈 쉬커	IMS-40
소혈청알부민 (BSA)	Solarbio	A8020
Cryostat CM150	Leica	CM150
디지털 pH 미터	—	PHS-3C
디메틸설폭사이드 (DMSO)	Solarbio	D8371
전자 분석 저울	캔(Cany)	—
강화 화학발광(ECL) 시약	Solarbio	PE0010
필름	Kodak	—
형광 현미경 DP71	Olympus	DP71
동결 절편 임베딩 배지	사쿠라	4583
겔 전기영동 장치	BIO-RAD	—
글리세롤	Solarbio	IG0910
글리신	Solarbio	G8200
염소 항마우스 Alexa Fluor 594 이차 항체	Proteintech	SA00013-3
HRP-접합 염소 항-마우스 2차 항체	ZSGB-BIO	ZB2305
염소 항-토끼 Alexa Fluor 488 2차 항체	Proteintech	SA00013-2
염소 항-토끼 호르스라디쉬 퍼옥시다아제 결합 2차 항체	ZSGB-BIO	ZB2301
염소 혈청	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	GraphPad 소프트웨어	5
고속 냉장 원심분리기 3K15	시그마	3K15
수평 궤도 쉐이커 TS-1000	하이먼 치린베이얼	TS-1000
ImageJ	미국 국립보건원	1.51j8
메탄올	Tianjin Guangfu	—
마우스 항-랫 GAPDH 1차 항체	Proteintech	60004-1-Ig
마우스 항-랫 p-ERK1/2 1차 항체	CST	9101S
Na2HPO3	천진 북진 방정	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
파라포름알데히드	Biosharp	BL539A
병리 진단용 현미경 슬라이드	시체	—
페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)	Beyotime	ST506
족저 검사 37370	우고 바실레	37370
폴리비닐리덴 플로라이드 막	Solarbio	—
프로펜토필린 (Propentofylline, PPF)	Taosu	T19812
토끼 항-랫 COX-2 1차 항체	Abcam	Ab179800
토끼 항-쥐 GFAP 1차 항체	Proteintech	16825-1-AP
토끼 항-쥐 Iba-1 1차 항체	Proteintech	10904-1-AP
토끼 항-쥐 NeuN 1차 항체	Abcam	Ab279297
토끼 항-래트 t-ERK1/2 1차 항체	Proteintech	11257-1-AP
토끼 항-쥐 TNF-α 1차 항체	Proteintech	29652-1-AP
RIPA 용해 버퍼	Solarbio	R0010
SDS (도데실황산나트륨)	Solarbio	S8010
탈지분유	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)	Solarbio	T8090
Tris	Solarbio	T8060
Triton X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
초저온 냉동고	Haier	—
초저온 냉동고	Sanyo	—
초순수 정제 시스템	힐포스(Heal Force)	—
폰 프레이 필라멘트 (von Frey filaments)	North Coast Medical	—