펩타이드 배열과 천연 뉴클레오좀 풀다운을 통해 인간 스핀들린 가족 4(SPIN4)의 결합 기질로서 변형된 히스톤의 식별

요약

최근 인간 스핀들린 가족 구성원 4(SPIN4)에서 유전적 변이가 발견되었으며, 이는 새로운 발달 장애인 골 과다증식 환자들입니다. 뉴클레오좀 내에서 SPIN4 결합 기질로서 변형된 히스톤을 생화학적 동정하는 프로토콜과 새로운 결과가 제시되었습니다.

초록

인간 스핀들린 가족 4(SPIN4)은 뼈 성장을 조절하는 새로운 인자로 막 등장했습니다. SPIN4에서 기능 상실 변이가 발견되었으며, 이는 X-연관 우성 방식으로 유전되는 출생 전후 과증 증후군을 보인 환자들에게서 확인되었습니다. SPIN4는 튜더 도메인의 세 개의 연속 반복을 포함하며, 각각 개별 방향족 케이지를 형성합니다. 이 튜더 도메인은 서열 상동성에 근거한 히스톤의 메틸화된 아르기닌 및 라이신 잔기의 후생유전학적 리더 도메인으로 간주됩니다. 그러나 SPIN4의 정확한 결합 기질은 여전히 명확하지 않습니다. 인간 SPIN4는 야생형과 질병을 유발하는 돌연변이 형태 모두에서 곤충 세포 발현 시스템을 통해 성공적으로 생성되었습니다. 히스톤 변형 펩타이드 배열을 통해 야생형과 돌연변이 SPIN4 간의 결합 친화력 차이가 밝혀졌습니다. 기능적 검증 결과, SPIN4는 천연 단핵체의 생화학적 풀다운을 통해 히스톤 H3 라이신 4 메틸화(H3K4me)를 진짜로 읽는 존재임이 입증되었습니다. 이 통합 접근법은 후생유전학적 리더 단백질의 빠른 결합 표적 식별을 가능하게 합니다.

서론

스핀들린 가족 구성원 4(SPIN4)는 후생유전학 리더로, 최근 과성장 증후군과 관련이 있는 것으로 밝혀졌으며, 출생 전후 과성장과 키가 큰 별자리를 보입니다 ^1,2. Spin4 녹아웃(KO) 쥐들은 정확한 인간 표현형을 재현하여 인과관계를 뒷받침했다. 현재까지 SPIN4는 뼈 성장에 부정적으로 조절하는 유일한 독점적 후생유전학적 리더입니다. 그러나 성장에 중요한 후생유전학적 리더인 SPIN4의 생화학적 특성은 아직 규명되지 않아 이 새로운 발달 장애의 근본적이고 질병을 일으키는 기전을 이해하는 데 중요한 지식 공백이 남아 있습니다. SPIN4는 일반적으로 메틸화된 아르기닌 또는 라이신 히스톤 리더 단백질 도메인으로 간주되는 튜더 도메인의 세 개의 연속 반복 중복을 포함^{하고 있습니다.} 최근 산전 및 산후 골 과다증식 증후군 환자에서 SPIN4^D82H 미센스 변이가 확인되었습니다. 이 돌연변이는 SPIN4의 첫 번째 튜더 도메인에 영향을 미칩니다; 그러나 이 튜더 도메인의 관련 결합 기질은 명확하지 않아, 뼈 발달 중 SPIN4 의존적 염색질 및 유전자 발현 조절의 기능적 해부를 제한합니다.

리더 단백질 도메인의 새로운 히스톤 결합 기질을 식별하는 것은 단일 표준화된 접근법에 의존하지 않습니다. 히스톤의 번역 후 변형(PTM)은 주로 코어 뉴클레오좀 입자에서 바깥으로 돌출된 히스톤 꼬리에서 발생합니다. 리더 단백질 도메인에 의한 히스톤 꼬리 PTM의 인식은 매우 다양하며, 리더-표적 상호작용을 집단적으로 안정화하기 위해 핵체체 DNA, 링커 DNA 및/또는 기타 히스톤 도메인을 포함하는 다가 정전기 상호작용이 종종^{필요합니다.} 현재 히스톤 꼬리 펩타이드의 PTM은 마이크로어레이 형태로 구성되어 여러 공급업체에 의해 상용화^{되었습니다.} 히스톤 꼬리 펩타이드 기반 PTM 스크리닝은 리더 단백질 도메인의 결합 표적을 위한 처리량이 높지만, 뉴클레오좀이 없을 때 종종 위양성 결과가 나타납니다. 더불어, 이러한 스크리닝의 실험 조건은 매우 경험적이며, 단백질마다 다르기 때문에 기술적으로 다루기 어렵습니다. 합성 뉴클레오좀 기반 PTM 스크리닝 또는 풀다운은 훨씬 더 강력한 판독을 제공하지만, 다양한 PTM 조합을 가진 뉴클레오솜을 재구성하는 것은 본질적으로 어렵기 때문에 비용이 훨씬 더 크고 처리량이 적습니다.

이 프로토콜은 SPIN4의 결합 표적으로 뉴클레오좀 내 히스톤 PTM을 빠르게 식별하는 방법을 설명합니다. 재조합 SPIN4를 재구성하여 상업용 히스톤 PTM 펩타이드 배열과 스크리닝하여 잠재적 결합 표적을 확인하였습니다. 이후 다양한 내인성 히스톤 PTM을 포함한 천연 단핵체가 살아있는 세포로부터 생성되었습니다. 단핵체의 SPIN4 풀다운을 통해 초기 스크리닝 후 항체 기반 히스톤 PTM의 표적 검증이 가능해졌습니다. 이 통합 생화학적 전략은 시간 및 비용 효율적인 표적 발견을 위한 원리 증명 접근법을 보여주며, 다른 잘 특성화되지 않은 후생유전학 리더 단백질의 결합 기질을 쉽게 식별하는 데 적용할 수 있습니다.

프로토콜

HEK293FT 세포를 이용한 모든 실험 절차는 버지니아 커먼웰스 대학교의 기관 생명안전 위원회(IBC) 지침을 준수하여 수행되었습니다.

1. 재조합 인간 SPIN4의 정제

1. N 말단 1× FLAG 에피토프 태그를 가진 전장 야생형 SPIN4 또는 SPIN4^D82H를 바큘로바이러스 벡터 ^6,7로 클론합니다.
2. 바큘로바이러스를 제제하여 Sf9 세포를 바큘로바이러스 벡터로 형질전환하고, 세포가 터질 때 바이러스를 채취하며, 알리코트하여 −80 °C ^6,7에 저장합니다.
3. 500mL 얼렌마이어 플라스크에 100mL 배양지,^{1.5× 8개의 Sf9} 세포 10개, 그리고 P1 바큘로바이러스 1mL를 넣습니다.
4. 배양물을 27.5°C에서 125rpm으로 설정한 궤도 셰이커 인큐베이터에서 어둠 속에서 72시간 배양합니다.
5. 프로테아제 억제제가 포함된 BC150 용해 완충제에서 FLAG 친화성 겔을 사용해 FLAG-SPIN4를 정제하고, 0.1 mg/mL의 1× FLAG 펩타이드로 단백질을 용출합니다.
6. 1× FLAG 펩타이드를 완전히 제거하기 위해, 4°C에서 BC150 단백질 저장 버퍼에 대해 다음 순서로 용출된 FLAG-SPIN4를 이물질로 이탈합니다:
   1. 첫 투석: 1 L, 1시간.
   2. 두 번째 투석: 2L, 하룻밤.
   3. 세 번째 투석: 1 L, 1시간.
7. 다이분해된 단백질을 원하는 양(SPIN4의 경우 600 μL에서 150 μL)까지 농축합니다.
8. 비신코닉산(BCA) 분석법을 사용하여 단백질 농도를 측정하고, 그에 따라 몰 농도를 계산합니다.
9. 각 정제 단계에서 회수된 원단백질의 양과 해당 추정 수율은 보충 표 1에 요약되어 있습니다. 정제는 400 μL 항-FLAG 친화성 젤 슬러리를 사용하여 250 mL의 Sf9 배양에서 수행되었습니다.
10. BC150 단백질 저장 버퍼에서 SPIN4를 10× 희석하여 투여했습니다(보충표 2). 1, 2, 5, 10, 20 μL을 15% SDS–PAGE 겔에 적재하고 Coomassie 블루 염색으로 시각화합니다(그림 1A).
11. 영상 분석 소프트웨어를 사용해 동일한 부피를 가진 레인들 간의 상대적 신호 강도를 정량화합니다.
12. 강도비를 각 단백질의 분자량으로 나누어 몰 비율을 구합니다.
13. 이 몰 비율을 사용하여 Step 1.8에서 추정한 몰 농도를 보정합니다.
14. 정제된 단백질을 알리코트(aliquot)로 추출하고, 액체 질소에 급동하여 −80°C에서 보관합니다. 단기 사용 시에는 다음 실험으로 넘어가기 전에 4°C에서 하룻밤 보관하세요.

2. 히스톤 펩타이드 배열

1. 5g 소 혈청 알부민(BSA)을 BC150 단백질 저장 버퍼에 용해하여 최종 부피 100 mL로 펩타이드 배열 차단 버퍼를 준비합니다.
2. 선택적으로 소수성 마커 펜을 사용해 펩타이드 배열의 반응 영역을 윤곽화하여 시약 소모를 최소화할 수 있습니다.
3. 15cm 크기의 페트리 접시에 여러 장의 여과지를 넣고 물로 적셔주세요.
4. 펩타이드 배열을 적신 필터 페이퍼 위에 위치시킵니다.
5. 각 배열 영역을 완전히 덮기 위해 300 μL 차단 버퍼를 신중하게 추가하세요.
6. 배양 접시를 덮고 상온에서 1–3시간 부화시킵니다.
7. 블로킹 버퍼에서 FLAG-SPIN4를 최종 농도인 1 μM으로 준비합니다.
8. 블로킹 버퍼에 1× FLAG 펩타이드를 최종 1 μM 농도로 준비합니다.
9. 신호 대 잡음비를 개선하고 원치 않는 배경을 줄이기 위해 차가운 방에서 다음 단계를 수행하세요. 단백질을 넣기 전에 막힌 배열(페트리 접시와 함께)을 냉장실로 옮기세요.
10. 배열에서 과도한 차단 버퍼를 제거하세요.
11. 각 블록에 원하는 FLAG-SPIN4 단백질 또는 FLAG 펩타이드를 조심스럽게 대조군으로 첨가하세요.
12. 배양 접시를 덮고 냉장실에서 하룻밤 동안 부화시키세요.
13. 웨스턴 블롯 세척 상자에 약 50mL 펩타이드 배열 세척 완충제를 추가한 후 냉장실로 옮깁니다.
14. 단백질 용액을 버리고 즉시 배열을 워시 버퍼에 반응 쪽이 위로 옮깁니다.
15. 배열을 다섯 번 세척하세요: 처음 두 번은 각각 1분씩, 나머지 세 번은 각각 5분씩 세척합니다.
16. 페프타이드 배열 차단 버퍼로 배열을 헹구어 잔류 세제를 제거한 후 페트리 접시로 다시 넣으세요.
17. 1:2000 희석 비율로 항-FLAG 항체 용액을 준비하고 블록당 300 μL을 추가합니다.
18. 실온에서 1시간 정도 배양하세요.
19. 2.14부터 2.16까지 단계를 반복해서 배열을 세척하세요.
20. HRP 결합 염소 항생쥐 IgG(2차 항체) 용액을 1:6000 희석으로 준비하고 블록당 300 μL을 첨가합니다.
21. 실온에서 1시간 정도 배양하세요.
22. 2.14부터 2.16까지 단계를 반복해서 배열을 세척하세요.
23. 배열을 투명한 시트 보호기 안에 넣으세요.
24. 약 1mL의 증강 화학발광(ECL) 기판을 추가하여 반응 표면의 고르게 덮이도록 합니다.
25. 공기 방울을 제거하고 적절한 영상 시스템(예: 디지털 영상기나 자동방사선 필름)을 사용하여 화학발광 및 명예장 이미지를 포착하세요(그림 1B).
26. 펩타이드 배열 소프트웨어와 관련 온라인 도구(그림 2A–C)에 따라 신호 강도를 분석합니다.

3. 풀다운 분석법을 위한 FLAG-SPIN4의 대규모 표현

1. 500mL Erlenmeyer 플라스크에 125mL ESF921 배지,^{1.8 × 8} Sf9 세포 1.8개, 그리고 FLAG-SPIN4 또는 FLAG-SPIN4^D82H를 발현하는 1.2mL P1 바큘로바이러스를 첨가합니다.
2. 궤도 셰이커 인큐베이터(125rpm)에서 27.5°C에서 72시간 배양합니다.
3. 문화를 다음과 같이 분류합니다:
   1. 4mL를 15mL 튜브에 투여하여 적정합니다.
   2. 30mL의 배양물을 50mL 튜브 4개에 담습니다.
4. 튜브를 600 × g에서 15분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.
5. 펠릿을 액체 질소에 급동하여 −80 °C에서 보관하다가 사용하세요.

4. FLAG-SPIN4 및 FLAG-SPIN4^D82H의 구슬 대 용해물 비율 적정

1. 섹션 3, 3.1에 설명된 5mL Sf9 배양 펠릿에서 각 Sf9 펠릿에 1mL BC150 용해 완충제를 첨가합니다.
2. 완전한 교란을 위해 용해액을 초음파 처리하세요: 30% 진폭, 5초 켜짐/5초 꺼짐, 총 초음파 처리 시간은 15초입니다.
3. 20,000 × g, 4 °C에서 10분간 원심분리한 후 상원액을 신선한 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
4. 각 풀다운 반응마다 20 μL 반-FLAG 친화성 젤 슬러리를 준비합니다(3회 적정 시 60 μL
5. 비즈를 BC150 용해 버퍼로 세척하세요:
   1. 1mL BC150 용해 완충제를 추가하고 잠시 소용돌이를 사용하세요.
   2. 원심분리기는 3,000 g × 1분간 돌립니다.
   3. 흡인하고 상정액을 버리세요.
6. 1번의 풀다운 반응마다 40 μL BC150 용해 버퍼에 비드를 재현탁합니다(3회 적정 시 120 μL).
7. 용해액을 BC150 용해 완충제와 비드 현탁액이 포함된 1.5 mL 튜브에 혼합합니다 (보충표 3)
8. 튜브를 15rpm, 4°C로 설정한 튜브 회전기에서 1.5시간 동안 인큐베이팅합니다.
9. 3,000 × g 에서 1분간 원심분리기로 넣고 상청액을 흡입하세요.
10. 구슬을 세 번 세척하세요:
    1. 500 μL BC150 용해 완충제와 소용돌이에 비즈를 잠시 재현탁합니다.
    2. 원심분리기는 3,000 × g 에서 1분간 돌립니다.
    3. 상정액을 흡인하세요.
11. 구슬을 20 μL 1× Laemmli 버퍼에 재현탁하고 95 °C에서 5분간 배양합니다.
12. 원심분리기는 3,000 g × 1분간 돌립니다.
13. 상정액을 15% SDS–PAGE 겔에 검사하고 Coomassie Blue로 염색하여 단백질 수율을 추정합니다.
14. 데이터를 바탕으로 비드의 항체 결합 부위를 포화시키는 용해액 대 구슬 비율을 선택합니다. 실험에서는 20 μL 구슬당 ≥ 300 μL 용해액이 완전한 결합 용량을 달성하기에 충분했습니다.
    참고: "항체 결합 부위의 포화도"는 용해액을 증가시켜도 표적 단백질의 회복이 더 이상 증가하지 않는 시점을 의미합니다.
    참고: 같은 몰 농도에서 SPIN4^D82H 는 야생형 젤보다 FLAG 친화력 겔에 대한 결합 친화도가 낮습니다.
    참고: 이 실험 환경에서 600만 개의 Sf9 세포에서 1mL의 용해액이 유래되었으며(1.5 × 10⁶ cells/mL × 4 mL로 계산됨), 이는 ~600만 개의 Sf9 세포에서 발현된 SPIN4가 20 μL 항-FLAG 친화성 젤 슬러리를 포화시키기에 충분함을 나타냅니다.

5. 미끼로서 대량 제제 방지 친화성 겔 결합 FLAG-SPIN4

1. 검사할 각 단백질마다 30mL 배양액에서 두 개의 펠릿을 채취합니다. 각 펠릿을 6 mL BC150 용해 버퍼에 재현탁한 후 15 mL 원심분리관으로 옮긴 후 BC150 용해 완충액으로 전체 부피를 13 mL로 조절합니다.
2. 각 샘플을 얼음 위에 100% 진폭으로 초음파 처리하고, 15초 켜짐/30초 꺼짐으로, 총 초음파 처리 시간은 2분입니다.
3. 용해물을 미리 냉각된 고속 원심분리관으로 옮기고, 20,000 × g, 4 °C에서 15분간 원심분리합니다.
4. 1.5mL 원심분리관에 200×(샘플 수 + 1)× 1.1 μL 항-FLAG 친화성 젤 슬러리를 추가합니다.
5. 비즈를 BC150 용해 버퍼 >5 컬럼 부피(CV)로 한 번 세척합니다.
6. 비즈를 400×(샘플 수 + 1) × 1.1 μL BC150 분해 버퍼에 재현탁합니다.
7. 4단계에서 15mL 원심분리관으로 얻은 상원액을 옮깁니다.
8. 각 튜브에 Step 5.7 비드 현탁액 500 μL을 추가합니다.
9. 한 튜브에 3mL BC150 용해 버퍼와 1× FLAG 펩타이드 60 μL (100 mM)를 음성 대조군으로 추가합니다.
10. 샘플을 120rpm, 4°C로 설정한 튜브 회전기에서 1.5시간 동안 배양합니다.
11. 2,000g에서 원심분리 × 5분간 사용한 후 상청액을 버립니다.
12. 구슬을 적절한 양의 상청액에 재현탁한 후 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
13. 3,000 g× 원심분리기를 1분간 하고 상청액을 흡인하세요.
14. 비즈를 BC150 용해 버퍼로 다섯 번 세척하세요:
    1. 비즈를 1 mL BC150 용해 완충제에 재현탁합니다.
    2. 4번째와 5번째 세척 시에는 샘플을 20rpm, 4 °C로 설정한 튜브 로테이터 위에 10분간 올려놓습니다.
    3. 3,000 g× 원심분리기를 1분간 하고 상청액을 흡인하세요.
15. 비드를 200 μL BC150 용해 버퍼에 재현탁합니다.
16. 구슬/버퍼 현탁액 9 μL을 취해 단백질 함량을 15% SDS–PAGE로 분석한 후 쿠매시 블루 염색을 합니다.
17. 단백질 투입량이 구슬 결합 능력을 초과하기 때문에, 구슬 부피당 단백질 결합량은 샘플 간에 유사해야 합니다. 디지털 이미지 분석을 통해 밴드 강도를 반정량화하고, 이후 반응을 위해 비즈 양을 조정합니다.

6. HEK293FT 세포에서 단핵체를 준비하는

1. 15cm 조직 배양 접시에서 10% 태아 소 혈청(FBS)을 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 37°C의 DMEM 배지에 10% 태아 소 혈청(FBS)을 사용해 약 90% 융합률까지 배HEK293FT양합니다.
2. 초기 통과 HEK293FT 세포는 상업적으로 얻어져 STR 프로파일링으로 인증됩니다.
   참고: 15cm 접시 하나에 ~2,700만 세포가 생성되며, 이는 1–2번의 풀다운 반응에 충분합니다. 여섯 번의 반응(음성 대조군 포함)을 위해서는 최소 세 개의 15cm 접시를 준비하세요. 표적 히스톤 번역 후 변형(PTM)이 드물거나 불안정할 경우, 2번에서 10번까지의 세포 수를 그에 맞게 늘려×
3. (선택 사항) 관심 있는 히스톤 변형에 따라 적절한 PTM 억제제(보충표 2)를 배양지에 추가하고 24시간 배양합니다.
   참고: 풍부한 히스톤 PTM이 존재하는 경우 이 단계를 생략할 수 있습니다.
4. 세포가 거의 100% 합류에 도달하면 다음과 같이 수집하세요:
   1. 배양지를 흡입하세요.
   2. 10mL 얼음 냉각 PBS로 세포를 부드럽게 헹군 후 흡인하세요.
   3. 얼음 차가운 PBS 5mL를 추가하세요.
   4. 세포를 얼음에 긁어 50mL 튜브로 옮기세요(모든 접시를 결합할 수 있습니다).
   5. 원심분리기 온도는 13,000 × g, 4 °C에서 10분간 진행합니다.
   6. 상원액은 버리세요.
5. (선택 사항) 즉시 진행하거나 세포 펠릿을 냉동 보관하여 나중에 사용하세요:
   1. 펠릿 부피를 추정하세요.
   2. 버퍼 G 9× 펠릿 부피에 재현탁하여 최종 글리세롤 농도인 20%에 도달합니다.
   3. 액체 질소에 급동하여 −80 °C에서 보관합니다.
6. 냉동 펠릿을 사용할 경우, 얼음 위에 해동한 후 1,300 × g, 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버리세요.
7. (신선하거나 해동된) 펠릿을 혈청학적 피펫을 사용해 프로테아제 억제제가 포함된 TMSD 버퍼 10× 부피의 펠릿에 재현탁합니다(40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 250 mM 자당, 1 mM DTT).
8. TMSD 버퍼에 10% NP-40을 신선하게 준비하고, 총 반응 부피를 0.11× 추가하여 최종 NP-40 농도는 ~1%로 만듭니다.
9. 서스펜션을 120rpm, 4°C로 설정한 튜브 로테이터에 5분간 인큐베이팅하세요.
10. 현탁액 10 μL와 10 μL 트리판 블루를 혼합한 후 현미경으로 관찰하여 핵 염색을 모니터링합니다. 핵이 세포질에서 완전히 분리되도록 하세요(그림 3A).
11. 약 95%의 핵이 트리판 블루 양성이면 다음 단계로 넘어갑니다. HEK293FT 세포의 경우, 일반적으로 1% NP-40 배양 5분이 충분합니다. 다른 세포 유형은 배양 시간을 확인하고 조정하세요.
12. 1,300 × g, 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.
13. 펠릿을 10× 부피의 TMSD 완충 부피에 재현탁합니다.
14. 6.12부터 6.13까지 과정을 다섯 번 반복하여 잔류 NP-40을 완전히 제거합니다.
15. 완충제 B 5× 펠릿 부피에 펠릿을 재현탁하세요.
16. 10,000개의 핵당 1단위 미세코칼 뉴클레아제(MNase)를 추가하고 37°C 수욕에서 배양합니다. 배양 중에는 핵이 고르게 재현착되도록 관을 가끔 흔들어 보세요
17. 지정된 시점(0.5, 1, 2.5h)에 반응의 50 μL을 1.5 mL 튜브에 추출한 후 즉시 0.5 M EDTA-Na (pH 8.0) 1 μL 첨가한 후 소용돌이를 투여합니다.
18. 아래 절차에 따라 각 시점에서 DNA를 추출합니다:
    1. 80 μL H₂O, 30 μL 10% SDS, 20 μL 5 M NaCl을 추가; 소용돌이.
    2. 200 μL 페놀/클로로포름을 추가; 완전히 소용돌이.
    3. 원심분리기 20,000 × g, RT, 3분.
    4. 상원액을 조심스럽게 새 1.5mL 튜브로 옮기세요.
    5. 100% 에탄올 1mL와 20 μL 3M 아세테이트 나트륨(pH 5.2)을 추가; 소용돌이.
    6. 원심분리기 20,000 g, RT, RT, 5분×.
    7. 상원액을 제거하고 70% 에탄올 1mL를 추가하세요.
    8. 원심분리기 20,000 g ×, RT, 1분.
    9. 상원액을 제거하고 캡을 열고 55°C에서 10분간 말립니다.
    10. 펠릿을 50 μL TE 버퍼에 재현탁합니다.
19. 1% TBE 아가로스 겔에 샘플을 분석하여 단핵체 DNA 크기(147 bp)를 확인한다(그림 3B).
20. (선택 사항) 미세코클레아제(MNase) 소화 효율은 세포 유형에 따라 다르며, 필요시 반응 중에 추가 MNase를 추가하여 폴리뉴클레오좀을 완전히 제거할 수 있습니다. 예를 들어, 1시간 샘플과 2시간 샘플이 비슷하다면 3시간 동안 MNase를 더 추가합니다.
21. 우세한 ~147 bp 밴드가 관찰되거나 추가 MNase/장기 배양이 더 이상 조각 크기를 변화시키지 않을 때, 최종 농도인 2 mM에 0.5 M EDTA-Na(pH8.0)를 첨가하여 반응을 멈춥니다.
22. 원심분리기 1,300 × g, 4 °C에서 5분간 사용. 상청액(S1)을 채취하세요.
23. 펠릿을 10× 부피의 TE 버퍼 + 프로테아제 억제제에 재현탁한 후, 4 °C에서 20 rpm으로 설정된 튜브 회전기 위에서 최소 30분간 배양합니다.
    참고: 단핵체의 추출 효율은 세포 유형에 따라 다릅니다. 0-300 mM NaCl은 뉴클레오좀을 효율적으로 추출하는 데 사용될 수 있습니다.
24. 원심분리기 1,300 × g, 4 °C에서 5분간 사용. 상정액(S2)을 채취하세요.
25. 각각 50 μL씩 각각 1.5 mL 튜브에 전달합니다.
26. 아가로스 겔 전기영동(6.17단계부터 6.18단계)으로 모든 분획을 분석하여 DNA 크기 분포와 추출 효율을 평가합니다. 대부분의 단핵체는 S2 분획에 존재합니다(그림 3C).
27. S2를 고속 원심분리관으로 옮기고 20,000 × g, 4 °C에서 10분간 회전시켜 불용성 물질을 제거합니다.
28. 상청액을 채취하고 BC150 용해 완충제(억제제 없이)에 대해 투석합니다:
    1. 첫 투석: 1 L, 1시간.
    2. 두 번째 투석: 2L, 하룻밤.
29. 투석 후에는 다시 20,000 × g, 4 °C에서 10분간 원심분리하여 남은 불용성 이물질을 제거합니다.
30. 최종 상정액을 채취하세요.
31. 상청액 5 μL에 35 μL BC150 용해 버퍼 및 10 μL 5× Laemmli 버퍼를 혼합하고, 95 °C에서 5분간 가열한 후 15% SDS–PAGE 겔에 1, 2, 5, 10, 20 μL 용량을 적재합니다.
32. 수율 추정의 기준으로 라엠리 버퍼에 0.1 mg/mL BSA 1, 2, 5 μL 주입.
33. 쿠매시 블루로 염색하고, 영상 분석 소프트웨어를 사용해 반정량적으로 뉴클레오좀 수율을 추정합니다(그림 3D).

7. 수정된 뉴클레오좀 풀다운

1. 1g BSA를 BC150 용해 버퍼에 녹여 최종 부피 10 mL로 2× 비드 차단 버퍼를 준비한 후, 완전히 용해될 때까지 소용돌이를 돌립니다.
2. 5절 5.16부터 5.17단계까지 단백질이 동등한 몰량의 FLAG-SPIN4-WT와 FLAG-SPIN4^D82H 비즈를 별도의 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
3. FLAG-SPIN4-WT 샘플에 동일한 부피의 네거티브 컨트롤 비즈(섹션 5, 10단계)를 추가합니다.
4. BC150 용해 버퍼를 사용해 모든 비드 샘플의 총 부피를 동일하게 조정합니다.
5. 각 튜브에 같은 부피의 2× 구슬 차단 버퍼를 넣고 BC150 용해 버퍼를 추가합니다.
6. 샘플을 20rpm, 4°C(O/N)로 설정한 튜브 로테이터에서 하룻밤 동안 인큐베이팅합니다.
7. 얼음 위에 올려 HEK293FT 세포에서 추출한 1× 뉴클레오좀을 적당량 해동하세요. 필요한 부피는 원하는 뉴클레오좀 대 SPIN4 몰 비율에 따라 달라집니다. 초기 최적화를 위해 뉴클레오좀과 SPIN4의 몰 비율을 1:1로 설정하세요.
8. 1× 뉴클레오좀과 같은 부피의 2× 비드 블로킹 버퍼를 충분히 섞어주세요.
9. 7.8단계에서 사용한 혼합물을 미리 차단한 비즈와 15mL 튜브에 섞으세요.
10. 혼합물을 4°C에서 20rpm으로 설정한 튜브 회전기에서 4시간 또는 하룻밤 동안 인큐베이팅하세요.
11. 3,000 × g, 4 °C에서 3분간 원심분리기.
12. 상액을 조심스럽게 버리세요.
13. 비즈를 1 mL BC150 용해 완충제에 재현탁한 후 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
14. 구슬을 세 번 세척하세요:
    1. 3,000 g× 원심분리기, 1분 후 상청액을 흡인하세요.
    2. 비즈를 1 mL BC150 용해 완충제에 재현탁합니다.
    3. 세척할 때 튜브를 흔들어 비즈가 고르게 다시 매달려 있도록 하세요.
15. 비즈는 다음과 같이 두 번 더 세척하세요:
    1. 3,000 g× 원심분리기 1분 후 상청액을 흡인하세요.
    2. 비즈를 1mL BC150 용해 완충제에 재현탁합니다.
    3. 20rpm, 4°C로 10분간 회전합니다.
16. 세척 후에는 비드를 BC150 용해 완충제의 9열 부피(CV)에 재현탁합니다.
17. 각 샘플에서 160 μL을 추출하여 40 μL 5× Laemmli 버퍼와 혼합한 후 95 °C에서 5분간 가열합니다.
    참고: 단백질-뉴클레오좀 복합체의 플래그 펩타이드 용출을 권장하며, 배경 조사가 적은 더 깨끗한 결과를 얻을 수 있습니다.
18. 3,000 × g에서 실온에서 5분간 원심분리기.
19. 상정액 5μL을 15% SDS–PAGE 겔에 주입하고 은염색을 수행합니다(그림 4A).
20. 상청액 5 μL을 15% SDS–PAGE 겔에 추가로 적재한 후 PVDF 막으로 옮긴 후, 표적 히스톤 PTM에 특이적인 1차 및 2차 항체로 프로브를 탐침합니다(그림 4B).

결과

인간 SPIN4의 결합 기질을 조사하기 위해, 야생형 SPIN4와 과증배 증후군과 관련된 환자 유래 돌연변이를 Sf9 곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 재구성하였습니다. 구체적으로, 이는 잔기 82(D82H)에서 아스파르트산(D)에서 히스티딘(H) 사이의 오스센스 돌연변이로, SPIN4의 첫 번째 튜더 도메인에 존재하여 SPIN4의 기질 결합 조절에 중요한 역할을 함을 시사합니다. 단일 FLAG 태그 SPIN4를 암호화한 바큘로바이러스 벡터가 Sf9 세포에서 단백질 발현에 사용되었고, 이어서 1단계 FLAG 친화력 정제와 1× FLAG 펩타이드 경쟁 용출을 수행했습니다(그림 1A). 정제된 SPIN4 단백질의 동일한 몰 농도를 384개의 고유한 히스톤 PTM 조합으로 구성된 히스톤 펩타이드 배열에 배양하였습니다. 특정 히스톤 PTM에 결합한 SPIN4 단백질은 FLAG 항체와 HRP 결합 2차 항체에 의해 검출되었습...

토론

특성이 부족한 단백질의 특정 히스톤 PTM을 생화학적으로 정확히 찾아내고, 질병 관련 돌연변이가 표적의 결합 친화도에 미치는 영향을 평가하는 시간과 비용 효율적인 방법이 제시되었다. 이 방법의 장점은 합성 뉴클레오좀의 비용이 많이 들거나 시간이 많이 드는 재구성 작업이 필요 없다는 점입니다. 이 접근법은 상용화된 히스톤 PTM 펩타이드 배열의 편리함을 활용하면서도, 생리학적으로 중요한 결합 기질로 천연 단핵체를 사용하여 SPIN4가 진정한 H3K4me 리더임을 보장했습니다. 이 방법의 중요한 단계는 관심 단백질의 성공적인 재구성입니다. 경험적이고 도전적일 수 있습니다. 경우에 따라 후보 단백질의 절단 버전을 사용해 기술적 장애물을 극복할 수 있습니다. 이 방법의 한계는 생화학적으로 정의되지 않은 천연 뉴클레오솜을 사용할 수 있다는 점입니다. 그러나 이 방법을 따르면 풀다운 후 단핵체를 질량분석법으로 추가하여 결합 특이성을 전반적으로 파악하고 시스톤 내 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 마이크로 원심분리관	사르스테트	72.690.001	일반 실험
15cm 조직배양 접시	사르스테트	83.3903.300	일반 실험
15 mL 원뿔형 원심분리기 튜브	사르스테트	62.554.101	일반 실험
50 mL 원뿔형 원심분리기 튜브	사르스테트	62.548.004	일반 실험
500 mL 에를렌마이어 플라스크	스텔라 사이언티브	CT229809	Sf9 세포 배양
Amersham ImageQuant 800 CCD 이미저	시티바	IMQ800	CCD 영상 시스템
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안티-FLAG M2 항체	시그마-올드리치	F1804	서부 블롯
아프로티닌	메드켐익스프레스	HY-P0017	프로테아제 억제제
Array Analyze Sofrware	액티브 모티프	https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip	MODified 펩타이드 배열 데이터 분석
ASI 아가로즈 법	알칼리 사이언티픽	A7700	DNA 겔
Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템	써모 사이언티픽	10359016	바큘로바이러스 발현
벤자미딘 염산염	메드켐익스프레스	하이-W018781	프로테아제 억제제
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