철분 과부하로 인해 췌장 조직에서 MEG3 발현이 감소했습니다. MEG3는 철분 유도 섬β세포 세포자살멸사로부터 보호 역할을 할 수 있으며, 이는 NF-ĸB 경로의 조절과 관련이 있을 수 있습니다. 이 기전은 철분 과부하가 있는 β-TM 환자에서 섬 기능 장애에 기여할 수 있습니다.
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연구 논문
철분 과부하로 인해 췌장 조직에서 MEG3 발현이 감소했습니다. MEG3는 철분 유도 섬β세포 세포자살멸사로부터 보호 역할을 할 수 있으며, 이는 NF-ĸB 경로의 조절과 관련이 있을 수 있습니다. 이 기전은 철분 과부하가 있는 β-TM 환자에서 섬 기능 장애에 기여할 수 있습니다.
베타-지중해빈혈 중증(β-TM) 환자는 일반적으로 비정상적인 포도당 대사를 보이며, 철분 과부하, 만성 빈혈, 호르몬 불균형, 간 기능 장애 및 염증 관련 인슐린 저항성 등의 요인이 췌장 섬 기능 장애의 중요한 원인으로 간주됩니다. 장기 비암호화 리보핵산(lncRNA)은 세포 세포자멸사와 포도당 항상성에서 조절 역할로 점점 더 인정받고 있습니다. 본 연구는 철분 유도 섬 β세포 손상에서 모체 발현 유전자 3(MEG3)인 lncRNA의 기능을 탐구합니다. 철 덱스트란 복강 내 주입을 통해 철 과부하 마우스 모델을 유도하였다. 췌장의 철분 침착과 조직 손상은 프러시안 블루와 헤마톡실린 및 에오신 염색을 이용해 평가되었으며, MEG3 발현은 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 정량화되었습니다. 시험관 내에서 MIN6 세포에 MEG3 소간섭 RNA를 형질인화하여 유동세포분석을 통해 세포자멸사를 조사하였고, NF-kappa (ĸ)B 신호전달 경로의 활성은 웨스턴 블롯팅으로 평가되었습니다. 조직학적 염색 검사를 통해 철분 과부하 마우스의 췌장 조직에서 상당한 철분 침착과 구조적 손상이 확인되었습니다. RT-PCR 분석 결과, 췌장에서 MEG3 발현이 현저히 감소하였다(p<0.05). 시험관 내에서 MEG3 크락다운은 대조군에 비해 MIN6 세포의 세포자멸사를 유의미하게 증가시켰습니다. 웨스턴 블롯 분석에서는 NF-ĸB 수치가 상승하여 MEG3 침묵 세포에서 NF-ĸB 신호 경로가 활성화되었음을 나타냈습니다. 이 발견들은 MEG3 하향 조절이 철분 과부하 조건에서 NF-ĸB 신호를 통해 섬 β세포 세포자사멸사를 촉진할 수 있음을 시사합니다. MEG3 유전자 는 철분 유도 섬 β세포 세포자멸사로부터 보호 역할을 할 수 있으며, 이는 NF-ĸB 경로의 조절과 관련이 있을 수 있습니다. 이 기전은 철분 과부하가 있는 β-TM 환자에서 섬 기능 장애에 기여할 수 있습니다.
베타(β)-지중세빈증은 β-글로빈 사슬 생성이 감소하거나 결여되어 만성 빈혈과 효과적인 적혈구 생성 1을 초래하는 유전성 혈액 질환군입니다. 수혈 의존성 β-지중해빈혈(β-TM) 환자에서는 반복적인 수혈과 용혈이 전신 철분 과부하를 유발하여 여러 장기를 손상시키고 비정상적인 포도당 대사를 포함한 다양한 내분비 합병증에 기여할 수 있습니다. 또한 만성 빈혈은 췌장에 부담을 주고, 호르몬 불균형으로 인한 포도당 조절에 영향을 미치며, 간 기능 장애로 인한 포도당 대사를 저해하고, 염증 과정에 의해 유발되는 인슐린 저항성 등이 β-TM 환자의 고혈당에 기여할 수 있습니다. 따라서 β-TM에서의 포도당 대사 장애는 다인자적 성격을 가진다 2,3. 최근 메타분석에 따르면, β-TM 환자에서 공복 혈당 장애, 포도당 내성 장애(IGT), 당뇨병(DM)의 유병률이 각각 17.21%, 12.46%, 6.54%로 이 집단에서 포도당 대사 장애 부담이 증가하고 있음을 나타낸다3.
임상적 중요성이 커지고 있음에도 불구하고, β-TM에서 비정상적인 포도당 대사의 근본 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않았습니다. 이전 연구들은 반복적인 수혈과 용혈로 인한 만성 철분 과부하가 췌장, 특히 섬 β 세포 내에서 과도한 철분 침착을 초래할 수 있음을 보여주었습니다. 이 축적은 활성 산소 종의 생성을 촉진하고 산화 스트레스를 악화시켜 미토콘드리아 기능 장애를 유발하며, 인슐린 합성과 분비를 저해하고, 궁극적으로 β세포 세포 세포 사멸과 인슐린 결핍을 유도합니다 4,6. 또한, 철분 과부하는 산화 스트레스 매개 염증과 인슐린 신호 경로 간섭을 통해 말초 인슐린 저항성에 기여할 수 있습니다. 그러나 철분 과부하와 β세포 손상 및 전신 포도당 조절 장애를 연결하는 분자 경로는 복잡하며 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 200개 이상의 뉴클레오타이드로 구성되며 단백질을 암호화하지 않는 장기 비암호화 리보핵산(lncRNA)은 포도당 항상성, 인슐린 분비, 산화 스트레스 반응 등 다양한 생물학적 과정에서 중요한 조절자로 등장했습니다 7,8,9. 췌장 섬 β 세포는 1,000개 이상의 lncRNA를 발현하는 것으로 알려져 있어, 내분비 기능 유지에 잠재적 조절 역할을 시사합니다10.
그러나 철분 과부하로 유도된 섬 β세포 손상, 특히 β-TM에서 lncRNA 발현 프로필과 그 기능적 역할에 대해서는 거의 알려진 바가 없습니다. 최근 연구는 LncRNA MEG3(MEG3)가 인슐린 분비를 촉진하고 췌장 β세포 세포 멸사를 억제한다는 것이 밝혀졌습니다. 그러나 철분 과부하 상태에서 췌장 β세포에 미치는 영향은 여전히 불분명합니다. 다른 병리학적 맥락에서는 lncRNA가 산화 스트레스 및 철분 과부하 관련 세포 손상에도 관여하는 NF-kappa (ĸ)B, JNK, Nrf2와 같은 주요 신호 전달 경로와 상호작용하는 것으로 나타났습니다 12,13,14. 구체적으로, NF-ĸB는 산화 스트레스 하에서 활성화되는 중심 전사 인자이며, 철분 과부하 조건 15,16,17에서 β세포 세포자사멸사에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 본 연구는 MEG3 하향 조절이 철분 과부하 조건에서 NF-ĸB 신호를 통해 섬 β세포 세포자멸사를 촉진할 수 있음을 조사합니다. 이 연구는 β-TM에서 비정상적인 포도당 대사의 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰을 제공할 수 있습니다.
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본 연구에 사용된 실험 프로토콜은 하이난 종합병원 윤리위원회(프로토콜 번호 2021-239)의 승인을 받았습니다. 미국 국립보건원의 실험동물 관리 및 사용 지침과 헬싱키 선언은 모든 실험 절차에서 엄격히 준수되었습니다. 이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 동물 모델 및 실험 설계
이 연구에는 4주 된 수컷 C57BL/6J 쥐 36마리(약 20g)가 사용되었습니다. 모든 쥐는 표준 실험실 조건(20–25°C, 50–65% 상대습도, 12시간 빛/어둠 주기) 하에 음식과 물을 자유롭게 제공했습니다. 7일간의 적응 기간 후, 쥐들은 무작위로 두 그룹(n=18명)으로 나뉘었습니다: 철분 과부하 그룹(모델 그룹)은 4주 동안 주 2회 복막 내 주사(0.2 g/kg)를 받았습니다; 대조군은 복막 내 주사를 통해 동등한 용량의 정상 식염수를 투여받았습니다. 4주 후 쥐들은 안락사되었고, 췌장 조직을 채취하여 후속 분석을 수행했습니다.
2. 혈청 철분 측정
후안와동에서 1% 펜토바르비탈 마취 하에 발정 중 혈액 샘플을 채취하였다. 혈액은 1시간 동안 실온에 두었고, 4°C, 3,000rpm에서 15분간 원심분리되었다. 혈청은 분리되어 -80°C에 저장되었다. 혈청 철분 농도는 제조사 프로토콜에 따라 철 비도 측정 키트를 사용해 측정하였습니다.
3. 조직학적 분석
췌장 조직 표본은 고정을 위해 4% 파라포름알데히드에 담근 후, 절편 준비 전에 파라핀 삽입을 했습니다. 두께 4–5 μm 사이의 일련 조직 절편을 얻어 표준 탈파라핀화 및 재수화 절차를 통해 처리하였습니다. 조직형태학적 검사는 이후 헤마톡실린과 에오신 염색을 사용하여 수행되었으며, 췌장 조직 내 철분 침착은 기존 조직학적 염색 프로토콜에 따라 프러시안 블루 염색으로 평가되었습니다.
4. 세포 배양 및 소량 간섭 리보핵산 형질전환
MIN6 마우스 췌장 β세포는 15% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 10 mM HEPES, 50 mM 나트륨 피루베이트, 50 μmol/L β-머카토에탄올을 보충한 고포도당 Dulbecco's 변형 Eagle 배지에서 배양하였다. 모든 실험은 세포 합류 비율 80%에서 수행되었습니다. 세포 배양 중에는 매번 6–8ml의 배양지를 취합니다. 세포는 5% CO₂의 습기 환경에서 37°C에서 유지되었습니다. 기능적 연구를 위해 로그 성장기의 MIN6 세포에 lncRNA 특이적 소간섭(si)RNA(마이크로어레이 결과를 기반으로 선택된 lncRNA를 표적화)로 형질질질전환하였으며; 제조사 지침에 따라 리포펙타민 2000을 사용하여 리포펙타민 또는 음성 대조군 siRNA(억제제 NC 그룹)를 사용합니다. 24시간 배양 후, 세포는 정량적 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 또는 웨스턴 블롯으로 분석하여 녹다운 효율을 평가하였습니다. 이 siRNA의 표적 서열은 다음과 같았습니다: siMEG3: GCGUCUCUCUCUCCAUUTTAAUGCAGGAAGAGAGGCTT; siNC: UUCUCCGACUCUCACGUTTACGUACACGUGGAGAGAT. 각 실험은 3회로 진행되어 세 번 반복되었다.
5. 역전사 중합효소 연쇄 반응 분석
제조사 지침에 따라 상용 페놀 기반 RNA 분리 시약을 사용해 췌장 조직 샘플과 MIN6 세포에서 총 RNA를 추출하였습니다. 상보적 DNA는 역전사 키트를 사용하여 총 반응 부피 20 μL로 합성되었습니다. 역전사 후 대부분의 샘플의 cDNA 농도는 샘플 정량화 분석에 따르면 약 1 μg/μL로 나타났습니다. 이후 1 μL cDNA 주형을 실시간 PCR 증폭에 사용했습니다. qRT-PCR은 SYBR Green 기반 PCR 검출 키트를 사용하여 다음 사이클링 조건에서 수행되었습니다: 95°C에서 30초, 90°C에서 15초, 60°C에서 34초, 68°C에서 30초. 상대적 유전자 발현 수준은 비교 임계값 주기법(2-ΔCT 방법)을 사용하여 결정하였습니다. GAPDH는 실시간 PCR 데이터의 정규화를 위한 내부 참조 유전자로 사용되었습니다. 모든 실험 절차는 각 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었으며, 각 실험은 최소 세 번 이상 독립적으로 반복되었습니다. 본 연구에서 사용된 프라이머 서열은 보충 표 1 과 표 2에 나열되어 있습니다.
6. 셀 카운팅 키트-8 분석
세포 증식 능력은 제조사의 지침에 따라 세포 계수 kit-8 분석법을 사용하여 측정하였습니다. 간단히 말해, MIN6 세포는 si-MEG3 또는 si-NC로 형질전환한 후 96웰 배양판에 5 x 103 세포 밀도로 도반되어 24시간 동안 유지되었습니다. 지정된 시점에 각 웰에 10 μL의 세포 생존성 시약이 주입되었고, 판은 37 °C에서 2시간 동안 배양되었습니다. 이후 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450 nm 거리에서 흡광도 값을 측정했습니다. 세포 생존율은 대조군에 대한 백분율로 계산되었습니다.
7. 유동 세포검사에 의한 세포자멸증 검출
제조사 지침에 따라 Annexin V-FITC/PI 세포자멸사증 검출 키트를 사용해 MIN6 세포의 세포자멸사 변화를 조사하였습니다. siRNA 형질인화 48시간 후, 세포를 채취하여 차가운 인산염 완충 식염수로 두 차례 세척한 후 결합 완충제에 재현탁했습니다. 그 후 세포는 5 μL Annexin V-FITC 및 5 μL 프로피듐 요오다이드와 함께 실온에서 어두운 조건에서 15분간 배양되었습니다. 염색 직후에는 유세포측법으로 샘플을 분석했습니다. 초기 및 후기 세포자멸사 세포 집단은 유세포 분석 소프트웨어를 사용해 정량화하였다. 이후 집단 간 비교를 위해 세포자사자 세포의 비율이 계산되었습니다. 각 실험은 독립적으로 세 차례 진행되었다.
8. 서부 블롯 분석
서부 블롯 실험은 이전에보고된 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 세포는 먼저 트립신으로 소화되고, 수집된 후 방사면역침전법 용해 완충제를 이용해 얼음 위에서 용해했습니다. 단백질 농도를 정량화하였고, 동등량의 단백질을 10% 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 겔에 분리한 후 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮겼습니다. 막 차단 후, 샘플은 NF-κB(1:1000), Bcl-2(1:1000), Bax(1:1000), 카스파제-3(1:1000), 글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)(1:2000)에 대한 1차 항체와 함께 권장 희석 비율로 인큐베이션되었고, 이후 고추냉이 과산화효소 연관 2차 항체로 배양하였습니다. 단백질 신호는 화학발광 시스템을 사용해 검출되었고, ImageJ 소프트웨어로 정량화되었습니다. 내부 부하 조절군으로 GAPDH가 사용되었고, 단백질 발현 수준은 대조군에 비해 접힘 변화로 표현되었습니다.
9. 통계 분석
데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표현되었습니다. 그룹 간 비교는 통계 분석을 사용한 Mann–Whitney U 검정19 를 사용하여 수행되었습니다. p-값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
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췌장 조직에서 철분 과부하 마우스 모델 평가와 모체 발현 유전자 3 발현 측정
MEG3의 생체 내 역할을 조사하기 위해, 우리는 철 덱스트란을 복막 내 주입으로 쥐에서 철분 과부하 모델을 구축했습니다. 대조군과 비교했을 때, 모델 그룹의 혈청 철분 수치는 유의하게 증가했습니다(p<0.05)(그림 1A). 조직학적 검사 결과, 췌장 조직에서 헤마톡실린-에오신 염색과 프러시안 블루 염색으로 알 수 있는 뚜렷한 철분 침착이 확인되었습니다. 또한 전자현미경 검사에서는 췌장 선반세포에서 부어오른 미토콘드리아를 포함한 구조적 손상이 발견되어 성공적인 모델 구축과 췌장 손상을 나타냈습니다(그림 1B).
우리는 RT-PCR을 사용해 철분 과부하가 있는 쥐의 췌장 조직에서 MEG3 발현을 조사했으며, 대조...
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비정상적인 포도당 대사는 β-TM 환자에서 흔하고 심각한 합병증으로, 종종 IGT 또는 DM으로 나타납니다. 본 연구에서 철분 과부하가 췌장 손상을 유발하고, 췌장 조직에서 lncRNA MEG3의 발현을 유의미하게 감소시키며, 섬β 세포의 세포자멸사가 증가함을 발견했습니다. 더불어, MIN6 세포에서 MEG3의 노크다운은 β세포 세포자사멸을 촉진하고 NF-ĸB 활성화와 연관되어 MEG3와 철 과부하로 인한 β세포 기능 장애 사이의 잠재적 기전적 연관성을 시사합니다. 이 결과는 MEG3가 철분 과부하 상태에서 췌장 β세포에서 보호 역할을 하며, β-TM에서 비정상적인 포도당 대사의 발병에 기여할 수 있음을 시사합니다. β-TM에서의 포도당 조절 이상은 고전적인 제1형 또는 제2형 당뇨병과는 기전적으로 구별됩니다 20. β-TM에서는 췌장의 철분 침착이 주요 원인이며, 이는 섬세포 손상과 인슐린 분비 결핍을 초래합니다
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저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.
이 연구는 중국 하이난성 자연과학기금(822QN445)과 하이난 교육위원회(Hnky2024-30)의 지원을 받았습니다.
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| ABI 7500 실시간 PCR 시스템 | Applied Biosystems, USA | ||
| Annexin V-FITC/PI 세포사멸 키트 | MULTI SCIENCES | AP101-100-kit | |
| BCA 단백질 분석 키트 | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd. | E-BC-K318-M | |
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