아코니틴은 쥐에서 JNK1/2 신호 경로 활성화와 관련된 심근 손상을 유발합니다

요약

이 연구는 쥐에서 아코니틴으로 인한 심근 손상에서 JNK1/2 신호전달의 잠재적 역할을 조사하였습니다. JNK1/2 인산화 증가는 심근 손상과 관련이 있었고, JNK 경로의 약리학적 억제는 심근 손상을 부분적으로 완화하여 JNK 신호가 아코니틴 유발 심독성에 관여할 수 있음을 시사한다.

초록

급성 아코니틴(Acon) 중독은 부정맥과 심근 손상을 일으킬 수 있으며; 그러나 그 근본적인 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. 이 연구는 급성 아콘 중독으로 인한 심근 손상의 기전을 조사하였다. 급성 아콘 중독의 쥐 모델(n = 51)이 위내 투여를 통해 확립되었습니다. 심전도 추적을 통해 심장 리듬 변화를 기록하였다. 헤마톡실린과 에오신(HE) 염색 및 마손 염색을 통해 심근 병리학적 손상과 콜라겐 침착을 평가하였다. 정맥혈 내 심장 효소와 단백질의 발현 수준은 효소 결합 면역흡착법(ELISA) 키트를 사용하여 검출되었습니다. Acon과 JNK 경로 간의 구조-활성 관계는 분자 도킹을 통해 조사되었습니다. 인산화된 c-Jun N-말단 키나제 1/2(JNK1/2) 단백질의 발현 수준은 웨스턴 블롯팅을 통해 검출되었습니다. 본 연구에서는 Acon을 위내 투여한 후 쥐에서 심실 부정맥이 관찰되었습니다. 심근 조직은 심근섬유와 세포의 무질서한 배열을 보였으며, 비정상적인 콜라겐 침착이 동반되었다. 분자 도킹 결과는 Acon과 JNK1/2 사이에 잠재적 상호작용이 있음을 보여주었습니다. 한편, 심장 효소와 단백질, 인산화된 JNK1/2의 발현 수준은 유의하게 증가했습니다. 추가 연구에서는 JNK 억제제 치료가 쥐에서 아콘으로 인한 심근 손상을 부분적으로 되돌릴 수 SP600125 있음을 보여주었습니다. 이 결과는 JNK1/2 인산화가 급성 아코니틴 중독으로 인한 심근 손상 발생에 관여함을 나타냅니다. 연구 결과는 JNK1/2 신호 전달 경로의 활성화가 아코니틴에 의해 유발된 심근 손상에 기여하며, JNK1/2 경로의 억제가 급성 아코니틴 중독으로 인한 심근 손상을 완화할 수 있음을 시사합니다.

서론

아콘은 라눙큘라과(Ranunculaceae)의 아코니툼(Aconitum) 식물에서 추출한 천연 디테르펜 알칼로이드 추출물입니다. 항염증^{효과 1,2}, 진통, 항종양, 항류마티스, 면역 대사, 혈액순환 촉진 효과 ^3,4,5. 하지만 아콘 함유 제제를 부적절하거나 과도하게 사용하면 심각한 중독 사건으로 이어질 수 있습니다. 아코니틴 중독으로 인한 증상에는 심장 증상⁶, 신경학적 증상⁷, 위장 증상⁸이 포함됩니다. 최근 몇 년간 전 세계적으로 아코나이트 중독 또는^사망 사례가 빈번하게 보고되고 ^{있습니다.} 아콘 중독은 주로 심혈관계, 신경계, 소화기관에서 나타납니다. 그중 중독으로 인한 주요 사망 원인은 심장 독성입니다. 아콘으로 인한 심장 손상은 매우 심각합니다; 특히, 증후군의 발병 기간이 짧아 적시에 임상 치료를 시행하기 어렵습니다. 보통 급성 아콘 중독은^{몇 시간 이내에} 메스꺼움, 설사, 어지러움, 흉통, 호흡곤란 및 기타 초기 증상을 유발합니다. 현재 급성 아콘 중독으로 인한 심근 손상의 구체적인 기전은 아직 명확하지 않으며, 아콘 중독으로 인한 심근 손상을 효과적으로 완화할 수 있는 임상적으로 효과적인 약물은 없습니다^12,13.

심근 손상의 기전을 탐구할 수 있는 급성 아콘 중독의 손상은 시간 의존적 조사에 중요한 수단이 될 수 있습니다. 이러한 모델은 급성 아콘 중독 환자들의 향후 치료에 잠재력을 지니며, 증후군의 조기 발병을 조기에 예방할 수 있습니다. 연구들은 독에 대한 면역 반응에서 c-Jun n-말단 키나아제(JNK) 신호 전달 경로의 역할을 추측해 왔습니다. JNK 신호 전달 경로는 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 신호 전달 경로 중 하나입니다. JNK 계열은 세 가지 유전자(JNK1/MAPK8, JNK2/MAPK9, JNK3/MAPK10)를 가지고 있습니다. JNK1과 JNK2는 심장을 포함한 대부분의 조직에서 발현할 수 있으며, JNK3는 주로 뇌에서 발견되며(¹⁴) 세포의 산화 스트레스와 염증 반응과 관련이 있습니다¹⁵. 연구에 따르면 JNK 매개 신호 경로가 뇌 및 심근 허혈/재관류 손상에서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌습니다^16,17. C66 투여는 쥐 심장에서 JNK 활성화를 억제하여 고지방 식이로 인한 심근 염증을 완화^합니다. 엽록생성산은 JNK 신호를 억제하여 TNF-α로 인한 심근세포 손상을 완화합니다¹⁹. 피노켐브린은 p38/JNK MAPK 신호 경로를 억제하여 LPS에 의한 심근 손상과 염증 반응을 완화하고, 심장 기능 장애와 부정맥을 완화합니다^. 이 연구들은 주로 JNK1/2 신호 전달의 변화가 심근 손상과 밀접한 관련이 있음을 보여줍니다. 한편, JNK는 일련의 활동으로 Acon의 하류 표적이기도 하다. 한 연구에서는 고용량 Acon에 노출되면 JNK 효소 활성화 경로를 매개하여 제브라피시 배아(유생)에서 체장 단축, 체형의 곡선, 뇌 발달 결함 등 발달 독성을 유발할 수 있다고 밝혔습니다²¹. 이 연구는 Acon이 JNK 신호 전달 경로를 활성화할 수 있음을 시사합니다. 그러나 급성 아코니틴 중독으로 인한 심근 손상에서 JNK 신호 전달 경로의 역할은 명확하지 않습니다.

이 연구는 다양한 위내 용량과 시간 간격을 설정하여 심근 손상에 대한 급성 아콘 중독의 쥐 모델을 확립하였습니다. 더 나아가, 이 모델에서 Acon이 심근에서 JNK1/2의 인산화 수준과 JNK 신호 전달 경로의 활성화에 미치는 영향을 탐구하였습니다. 급성 아콘 중독으로 인한 쥐의 심근 손상에서 JNK1/2 인산화의 역할을 탐구하는 것은 급성 아콘 중독으로 인한 심근 손상 연구에 이론적 기반을 제공합니다.

프로토콜

실험 설계 및 실행 계획은 2022년 6월 쿤밍의과대학 동물실험위원회(승인번호: Kmmu20220652)에서 승인되었습니다. 모든 실험 계획은 "쿤밍 의과대학 동물실험 지침"에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 모든 재료 목록은 재료표에 나와 있습니다.

주의: Acon의 높은 독성으로 인해 모든 준비 및 투여 절차는 기관 실험실 안전 규정에 따라 진행되었습니다. Acon을 취급하는 인력은 장갑, 실험실 코트, 마스크 등 적절한 개인 보호 장비를 착용했으며, Acon 준비 절차는 노출 위험을 최소화하기 위해 적절한 예방 조치를 취하였습니다. 동물들은 Acon 투여 중과 후에 심각한 독성과 고통의 징후를 면밀히 관찰했으며, 고통을 최소화하기 위해 필요 시 인도적인 평가 조치를 적용했습니다. 생물학적 폐기물과 아콘 오염 물질은 기관 생물안전 규정에 따라 처리되었습니다.

동물 치료

성체 수컷 스프래그-도울리(SD) 쥐(2개월, 230g)는 쿤밍 의과대학 실험동물센터 SPF 동물실험관에서 사육되었습니다. 모든 SD 쥐의 먹이 조건은 SPF 쥐의 먹이 요구에 따라 처리되었습니다. 실험 전 1주일간 적응적으로 키우고 12시간 금식했습니다. Acon은 0.05M 아세테이트 완충제(Acet)에 용해되었고, SD 쥐는 무작위 대조 원칙에 따라 4그룹으로 나뉘었습니다: 그룹 1(Acon-1 mg)은 1mg/kg의 Acon을 가베지(gavage)로 투여했고; 그룹 2(Acon-2 mg)는 위내 투여로 2mg/kg Acon을 투여; 3군(아세트), 2 mL 0.05 M 아세테이트 투여, 위내 완충 투여; 그리고 그룹 4(대조군, 치료 없음). 샘플은 위내 투여 후 1, 3, 6시간에 채취되었습니다. 총 36마리의 쥐가 연구되었으며, 그룹당 1시간, 3시간, 6시간마다 3마리씩 연구되었습니다. 지정된 시점마다 처음으로 심전도 기록이 수행되었습니다. 이후 쥐에게 마취를 시행하고 혈청 생화학적 분석을 위해 혈액 샘플을 채취했습니다. 혈액 채취 후 쥐들은 희생되었고, 심장 조직은 신속히 절제되었다. 심근 조직의 일부는 조직학적 분석(HE 및 마손 염색)을 위해 고정되었고, 나머지 조직은 서부 블롯팅으로 단백질 발현 분석을 위해 저장되었다. JNK1/2 활성화제와 억제제를 시험하는 실험에서, SD 쥐는 무작위 대조 원칙에 따라 5그룹으로 나누어집니다: 모델 그룹은 2 mg/kg 위내 Acon을 투여했고, 억제 그룹은 처음에^복막 내 주사 6 mg/kg SP600125 22 mg, 2시간 후 2 mg/kg Acon을 가베지로 투여했습니다. 작용제군은 처음에 복막 내 주사 0.1 mg/kg 아니소마이신(Anis)^23,24를 받았고, 2시간 후 2 mg/kg Acon을 가베지(가베지)로 투여받았습니다. DMSO 그룹은 0.8% DMSO 코용매 혼합액 2mL의 복막 내 주사를 받았습니다. 대조군은 치료를 받지 않았습니다. 총 15마리의 쥐가 연구되었습니다. 모든 염색 결과는 관찰 편향을 최소화하기 위해 블라인드 방식으로 분석되었습니다. 실험 기간 동안 쥐는 아코니틴 투여 후 생존 상태와 심각한 독성 징후를 지속적으로 모니터링했습니다. 사망률은 각 지정된 관찰 시점(1시간, 3시간, 6시간)에서 기록되었습니다. 죽음은 호흡과 심장 박동이 완전히 멈춘 것으로 정의되었다. 지속적인 호흡곤란, 올바른 반사 상실, 보행 불능, 또는 쇠퇴한 상태가 포함된 심각한 고통을 보이는 동물들은 인도적 최후로 간주되어 고통을 최소화하기 위해 즉시 심마취 하에 안락사되었습니다. 쥐 그룹별 사망자 수(표 1–4).

쥐 심전도(ECG) 추적

각 그룹의 쥐들은 심전도 추적을 받았습니다. 구체적인 방법은 다음과 같았습니다: 마취 후 복막 내 주사로 펜토바르비탈 나트륨을 30 mg/kg 용량으로 투여했습니다. 쥐들은 동물 실험 콘솔 위에 누워 고정되어 있었다. 컴퓨터는 BL-420N 생물학적 신호 획득 및 분석 시스템에 연결되었고, ECG 리드 와이어 플러그는 BL-420N 시스템의 3채널 입력 포트에 삽입되었습니다. 핀은 쥐의 오른쪽 앞다리 안쪽, 오른쪽 뒷다리, 왼쪽 뒷다리에 피하 삽입되었습니다. 수술 전 핀은 75% 알코올에 담가 소독되었으며, 근육에 핀을 삽입하지 않도록 주의했습니다. ECG 리드 와이어 전극 클립은 각 팔다리의 핀에 연결되었습니다. BL-420N 생물학적 신호 획득 및 분석 시스템의 전원 스위치와 시스템 소프트웨어가 켜졌습니다. 신호 획득을 위해 채널 3이 선택되었고, 신호 유형은 쥐 심전도로 설정되었습니다. 매개변수는 다음과 같이 설정되었습니다: 샘플링 속도, 1 kHz; 범위 2.0 mV; 시간 상수(하이패스 필터링), 200ms (0.80 Hz); 저역 통과 필터링, 100 Hz; 스캔 속도, 200.0 ms/div; 50Hz 노치 필터는 꺼져 있었습니다. 유도 II 심전도가 기록되었고, 심전도 변화가 관찰되었습니다. 심전도가 안정된 후 3분간 모니터링 및 기록이 이루어졌고, 데이터는 그룹별로 저장되어 후속 분석을 위해 사용되었습니다. 심전도 기록 후 전극 클립과 핀이 제거되고 쥐들은 다시 우리로 돌아갔다. 쥐들은 따뜻하게 유지되었고, 마취에서 완전히 회복될 때까지 호흡을 모니터링하여 질식사 관련 사망을 막았습니다. 기초 심전도 기록은 치료 1일 전에 수행되었습니다. 2일째에는 쥐들에게 위내 개고지로 Acon을 투여했고, 동일한 방법으로 투여 후 1시간, 3시간, 6시간에 심전도 기록을 수행하였습니다.

헤마톡실린과 이오신(HE) 염색 및 마손 염색

심장은 수평 단축축면에서 절단되었고, SD 쥐의 심장 꼭대기에서 심장 조직을 채취하여 4% 폴리포름알데히드에 상온에서 24시간 고정하였습니다. 고정된 조직은 탈수되어 자일렌으로 정화된 후 파라핀 왁스에 박혔습니다. 그 후 표준 절차에 따라 두께 4μm의 절면을 HE 및 매슨 염색으로 염색했습니다. HE 염색에서는 헤마톡실린 염색을 2분간 수행한 후 샘플을 따뜻한 물에 1분간 담갔고, 다시 30초간 에오신 염색을 시행했습니다. 마손 염색에서는 Weigert 철 헤마톡실린 용액으로 5분간 염색한 뒤, 마손 블루 용액으로 3–5분, 마지막으로 아닐린 블루 용액으로 1–2분간 염색합니다. 슬라이드는 일반 광학 현미경으로 관찰되었습니다. 각 단면마다 겹치지 않는 다섯 개의 미세한 필드가 동일한 배율로 무작위로 선택되어 큰 용기와 명백한 인공물을 피했습니다. 콜라겐 부피 분율(CVF)은 ImageJ를 사용하여 식(1)에 따라 계산되었습니다:

(1)

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)

심전도 기록 후 쥐들은 펜토바르비탈나트륨으로 마취를 받았고, 정맥혈을 채취하기 위해 정맥선 복강절개술을 시행했다. 혈액 샘플은 일회용 정맥 채혈 바늘을 이용해 하대정맥을 천공하여 채취하였습니다. 혈액은 4°C에서 하룻밤 배양되었고, 원심분리 후 1000 × g 에서 20분간 상청액을 채취했습니다. CK-MB, AST, LDH, CTn-1, h-FABP의 농도는 ELISA 분석 키트를 사용해 측정하였습니다. ELISA는 제조사의 지침에 따라 수행되었습니다. 각 웰의 광밀도(OD) 값은 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 450nm에서 측정되었습니다.

서부 블롯팅 분석

총 단백질은 단백질 추출 키트를 사용해 심장 조직에서 추출되었습니다. 단백질 농도를 측정하기 위해 BCA 단백질 분석 키트를 사용했습니다. 전체 단백질(검사할 샘플 부피는 10 μL)은 10% 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리하여 PVDF 막으로 옮기고, 5% 탈지우유에 30분간 차단하였습니다. 이후 막은 JNK1/2(1:500), p-JNK1/2(1:1000), GAPDH(1:4000) 1차 항체와 함께 하룻밤 동안 인큐베이팅되었습니다. 다음 날, 모든 막을 PBST로 세 번 세척한 후, 적절한 2차 항체(1:5000)와 함께 1시간 동안 배양했습니다. 마지막으로, 신호 검출을 위해 향상된 화학발광 시약이 사용되었으며; 현상 용액은 PVDF 막 스트립에 고르게 점차 도포되어 10초간 배큐한 후 노출, 현상, 영상 촬영을 진행했습니다. 서부 블롯 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용해 측정되었습니다.

분자 도킹 검증

아코니틴의 SDF 3D 분자 구조는 PubChem 데이터베이스에서 다운로드되었고, OpenBabel 소프트웨어를 사용해 mol2 구조로 변환되었습니다. JNK1과 JNK2의 가장 높은 해상도와 가장 긴 PDB 단백질 구조는 Uniprot 및 Protein Data Bank 데이터베이스에서 다운로드되었습니다. 수소 첨가, 리간드 제거, 완전한 수소 첨가는 고분자 단백질에 대해 수행되었고, 완전한 수소 첨가와 전자 부하는 소분자 화합물에 대해 수행되었으며, 토션 결합이 형성되었습니다. 분자 도킹 실험은 AutoDock Vina를 통해 수행되었으며, 결합 친화도가 -7.0 kcal/mol≤ 강한 리간드-단백질 상호작용을 나타내는 것으로 정의되었습니다. PyMol은 도킹 복합체의 3D 구조를 시각화하는 데 사용되었고, Discovery Studio는 도킹 복합체의 2D 구조를 시각화하는 데 사용되었습니다.

통계 분석

모든 실험은 독립적으로 세 번 반복되었다. GraphPad Prism 8은 모든 데이터를 통계적으로 분석하고 그래프화하는 데 사용되었습니다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시되었습니다. 학생 t-검정은 두 그룹 간 비교에 사용되었습니다. 동일한 시점에서 여러 그룹 간 비교나 동일 그룹 내 시점 분석 시 일원 ANOVA가 사용되었습니다. p < 0.05는 통계적으로 유의미한²⁵를 나타내는 것으로 간주되었습니다.

결과

Acon 개베이지 후 쥐의 심전도 결과

이전 연구들은 아코니틴의 독성 효과가 초기 단계, 즉 투여 후 몇 시간 이내에 발생한다는 것을 입증했습니다^26,27. 따라서 이 시간 창 내에서 급성 심독성의 초기 발생과 진행을 포착하기 위해 실험을 위해 1시간, 3시간, 6시간의 세 시점을 선택했습니다. 심전도 결과는 1시간, 3시간, 6시간 동안 Acon 작용을 시행한 후 대조군과 Acet 그룹에서 부정맥이 없었고, 심전도 변화도 뚜렷하지 않음을 보여주었습니다. Acon-1mg 그룹의 쥐들은 각각 조기 심실 수축과 조기 심실 이중부전, 조기 심실 삼연전, 단기 폭발성 심실 빈맥, 단형성 심실 빈맥, 양방향 심실 빈맥, 그리고 하나 이상의 심실 부정맥을 보였습니다. Acon-2 mg 그룹의 쥐들은 조기 심실 수축, 조기 심실 이중심, 짧은 폭발성 심실 빈맥, 양방향 심실 빈맥을 포함한 하나 이상의 심실 부정맥을 발병했습니다(그림 1, 보충 그림 1–2). Acon은 쥐 심근 조직에서 심근 병리학적 손상을 촉진하고 콜라겐 염색을 증가시킵니다.

심근 조직은 HE 염색으로 평가하였다. 결과는 대조군 및 Acet 그룹과 비교했을 때, Acon-1 mg군 SD 쥐의 심근 조직이 심근섬유 부분 파열, 심근세포 배열의 무질, 심근간질이 확장되고 심근간질에 부종이 발생함을 보여주었습니다. 대부분의 심근 세포는 부풀어 오르고, 핵은 깊게 염색되고 응축되며, 많은 수의 심근 세포가 퇴행하고, 심근섬유 세포질에는 둥근 공포가 형성됩니다(화살표로 표시). Acon-2 mg 그룹의 SD 쥐 심근 조직에서 근육 섬유 줄무늬는 불명확하거나 사라졌으며; 근육 다발의 배열은 느슨하고 무질서했으며, 근육 간 공간이 넓어졌고, 많은 세포핵이 깊게 염색되었고, 핵염병증, 세포간부종, 심근세포가 부풀어 오르고 퇴행했다. 심근 섬유의 세포질은 둥근 공포(화살표로 표시됨)를 보였다(그림 2A, 보조 그림 3A, 보조 그림 4A).

심근 조직 내 콜라겐 침착을 평가하기 위해 마손 염색이 수행되었습니다. 대조군과 Acet군에서는 심근세포가 정상적인 형태를 보였으며, 심근간질에서 콜라겐 침착이 최소한으로 관찰되었습니다. Acon-1 mg 그룹에서는 일부 간질 부위에서 청색 콜라겐의 경미한 증가가 관찰되었습니다. Acon-2 mg 그룹에서는 더 넓은 청색 염색 영역이 심근 조직 전반에 확산적으로 분포했으며, 근섬유 배열이 무질서하고 정상 심근 구조가 파괴되었습니다. Acon-2 mg군의 콜라겐 염색 정도는 Acon-1 mg군보다 더 컸습니다. 정량적 분석 결과, Acon-1 mg 및 Acon-2 mg 그룹 모두에서 콜라겐 부피 분율(CVF)이 대조군과 Acet 그룹에 비해 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(n = 3마리당 단방향 ANOVA, p < 0.05). 특히, 위내 투여 후 6시간 후에 Acon-2 mg군에서 CVF 값이 최고 수준에 도달했습니다(그림 2B, 보충 그림 3B, 보충 그림 4B). 짧은 관찰 기간(1–6시간)을 고려할 때, 이러한 소견은 기존 심근섬유증보다는 부종이나 콜라겐 염색 패턴 변화와 같은 급성 간질 변화를 더 잘 반영할 가능성이 높습니다. 또한, Acon-1 mg 또는 Acon-2 mg 치료 후 1시간, 3시간, 6시간 후 그룹 간 심박 무게에 유의한 차이가 없었습니다(표 5).

Acon은 쥐의 정맥혈 내 심장 효소와 심장 단백질 수치를 촉진합니다

Acon에 의한 심근 손상을 평가하기 위해 CK-MB, AST, LDH, CTn-I, h-FABP 등 심장 손상 지표의 혈청 수치를 측정하였습니다. 대조군과 Acet 그룹과 비교하면, Acon-1 mg 및 Acon-2 mg 그룹은 1시간, 3시간, 6시간에서 CK-MB, AST, LDH, CTn-I, h-FABP 수치가 유의하게 증가하였습니다(n=3마리, 그룹당 단방향 ANOVA, p < 0.05). 또한 같은 시점에서 이 마커들의 증가는 Acon-2 mg 그룹에서 Acon-1 mg 그룹보다 더 두드러졌다(p < 0.05)(그림 3).

분자 도킹 결과

Acon이 쥐의 심근 손상 신호 전달 경로에 미치는 영향을 더 조사하기 위해, 우리는 분자 도킹을 사용해 Acon과 관련된 경로 단백질을 확인하였습니다. 도킹 결과는 Acon이 여러 비공유 상호작용을 통해 JNK1과 JNK2의 활성 포켓에 안정적으로 결합할 수 있음을 보여주었다. JNK1에서는 아코니틴이 ALA267과 SER299와 각각 2.0 Å와 2.1 Å의 결합 거리를 가진 두 개의 기존 수소 결합을 형성하여 리간드 고정에 기여하는 강한 방향성 상호작용을 나타냈다. 또한 아코니틴과 주변 잔기 사이에 광범위한 반데르발스 상호작용이 관찰되어 결합 주머니 내에서 밀접한 공간적 상보성이 촉진되었습니다. ILE304와의 알킬/π-알킬 상호작용을 포함한 소수성 상호작용은 소수성 미세환경 내에서 리간드를 더욱 안정화시켰다. 탄소-수소 결합도 확인되어 리간드 결합을 지원하는 협력적 상호작용 네트워크를 형성했습니다(그림 4A–C). JNK2에서는 아코니틴이 LEU302(2.1 Å)와 하나의 전통적인 수소 결합을 형성하여 주요 고정 상호작용 역할을 했습니다. JNK1과 유사하게, 반데르발스 상호작용, 소수성 상호작용, 탄소-수소 결합이 결합하여 리간드-단백질 복합체의 안정화에 기여했습니다(그림 4D–F). 시험된 화합물의 도킹 결과는 결합 점수(kcal/mol)로 보고되며 표 6에 제시됩니다. 전반적으로 수소 결합은 특이성과 고정을 제공했고, 소수성 상호작용은 리간드 임베딩과 결합 친화도를 높였으며, 반데르발스 상호작용은 전체 복합체 안정성에 기여했습니다. 이 발견들은 아코니틴이 JNK1과 JNK2 모두와 안정적인 복합체를 형성할 수 있음을 나타내며, 표적 작용제로서의 잠재력을 뒷받침합니다.

Acon은 JNK 인산화 수준을 상향 조절합니다

심근 조직에서 Acon이 JNK 신호 전달 경로에 미치는 영향을 더 조사하기 위해, JNK1/2 인산화의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다. 대조군과 Acet 그룹과 비교했을 때, Acon-1 mg 및 Acon-2 mg 그룹은 p-JNK1/2 수치가 유의하게 증가하였다(n=3마리, 일방향 ANOVA, p < 0.05). 더욱이, JNK1/2의 인산화 수준은 Acon-2 mg군에서 Acon-1 mg군보다 유의하게 높았다(p < 0.05)(그림 5A). Acon-2 mg 그룹 내에서는 다양한 시점 간 비교에서 p-JNK1/2 수치가 1시간, 3시간, 6시간에 유의하게 증가했으며, 최고 수치는 6시간에서 관찰되었습니다(n=3마리, 일방향 ANOVA, p < 0.05)(그림 5B). 이 결과를 바탕으로 6시간 시점에 Acon-2 mg 그룹이 후속 실험을 위해 선정되었습니다.

JNK 억제제는 쥐 심근 조직에서 심근 병리학적 손상과 콜라겐 염색을 완화합니다

JNK 신호 전달 경로의 조절 역할을 추가로 평가하기 위해, 심근 조직에서 p-JNK1과 p-JNK2의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다. 대조군과 DMSO 그룹과 비교했을 때, Acon군은 p-JNK1과 p-JNK2의 발현 수준이 유의하게 증가했습니다(n=3마리의 쥐, 단방향 ANOVA, p < 0.05). Acon군과 비교했을 때, Acon+SP600125군은 p-JNK1과 p-JNK2 수치가 유의하게 감소하였다(n=3마리, 단방향 ANOVA, p < 0.05). 반면, Acon+SP600125 그룹과 비교했을 때, Acon + Anis 그룹은 p-JNK1과 p-JNK2의 발현 수준이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(n=3마리의 쥐, 단방향 ANOVA, p < 0.05)(그림 6).

Anis와 SP600125이 심근 손상에 미치는 영향도 추가로 조사되었습니다. HE 염색 결과는 Acon군과 비교해 Acon+SP600125 그룹의 심근 조직 간질성 부종이 감소하고, 일부 심근세포의 부종이 사라졌으며, 세포질이 균일함을 보였음을 보여주었다. 근육 공간은 가득 차고, 근육 간 공간은 얇아지며, 일부 심근 섬유는 단단하고 질서 있게 배열되고, 소수의 세포 핵은 깊게 염색되며, 심근 섬유의 세포질에는 작고 둥근 공포가 나타나 심근 병리학적 손상이 완화됩니다. Acon+SP600125 그룹과 비교할 때, Acon + Anis 그룹은 심근 섬유가 파손되고 근육 틈이 벌어지며, 심근 섬유가 느슨하고 무질서하게 배열되어 있고, 심근 세포가 부풀어 오르고 퇴화되었으며, 핵염색질이 깊게 염색되었고, 세포 간 부종이 발생했다(그림 7A).

심근 조직의 콜라겐 염색을 평가하기 위해 마손 염색이 시행되었습니다. Acon+SP600125 그룹에서는 심근간질에서 중간 정도의 청색 염색 부위가 관찰되었습니다. Acon군과 비교했을 때, Acon+SP600125군의 콜라겐 부피 분율(CVF)이 유의하게 감소하여 아코니틴에 의한 간질성 변화가 약해졌음을 나타냈다. 반면, Acon + Anis 그룹에서는 Acon+SP600125 그룹에 비해 심근간질에서 더 넓은 청색 염색 콜라겐 영역이 관찰되었고, CVF도 유의미하게 증가했습니다(n=3마리의 쥐, 그룹당 단방향 ANOVA, p < 0.05)(그림 7B). 또한, 그룹 간 심박 체중 차이는 유의하지 않았습니다(표 5). 짧은 관찰 기간(1–6시간)을 고려할 때, 이러한 변화는 기존 심근섬유증보다는 부종이나 콜라겐 염색 패턴 변화와 같은 급성 간질성 변화를 반영하는 경우가 더 많습니다. 이 결과는 SP600125가 아코니틴으로 인한 심근 손상을 완화하는 반면, 아니소마이신은 이러한 실험 조건에서 심근 손상을 더욱 악화시킨다는 것을 시사합니다.

JNK 억제제는 쥐 혈청 내 심장 효소와 심장 단백질의 발현을 완화합니다

ELISA 결과는 Acon군과 비교했을 때, Acon+SP600125군에서 CK-MB, AST, LDH 발현이 유의하게 감소한 반면, Anis 작용 후 CK-MB, AST, LDH 발현이 증가한 반면(n = 3마리의 쥐, 단방향 ANOVA, p < 0.05). 또한, Acon군과 비교했을 때, acon + SP600125군에서는 cTn-I와 h-FABP의 발현이 유의하게 감소했습니다(n=3마리, 일방향 ANOVA, p < 0.05). Acon + SP600125 그룹과 비교했을 때, acon + Anis 그룹에서 cTn-I와 h-FABP의 발현이 유의하게 증가했습니다(n=3마리의 쥐, 단방향 ANOVA, p < 0.05)(그림 8A–8B).

데이터 가용성:

이 연구에 사용된 모든 원시 데이터는 원고에 첨부된 보조 파일에서 확인할 수 있습니다.

그림 1: 쥐의 부정맥 심전도 그림(6시간 후 Acon 작용). 위에서 아래까지, 대조군, 아세트 군, 아콘-1 mg 그룹, 그리고 아콘-2 mg 그룹입니다. Acon-1mg-A-gavage와 Acon-2 mg-A-gavage의 부정맥 유형(부정맥 발생 순서대로): Acon-1mg-A-gavage: 조기 심실 수축; 조기 심실 이중증; 양방향 심실 빈맥. Acon-2 mg-A-가베지: 조기 심실 수축; 조기 심실 이중증; 심실 빈맥의 짧은 폭발. 약어; B-가비지 = 에이콘 가비지 이전; A-가베지 = 아콘 가베지 이후. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 쥐 심근 조직에서 HE 염색과 마손 염색으로 나타난 심근 조직의 근 손상 및 콜라겐 염색. (A) 쥐 심근 조직의 병리학적 변화는 HE 염색에 의해 감지되었으며(노란색 화살표는 손상된 심근세포가 형성하는 둥근 공포를 나타냅니다); 스케일 바 = 100 μm. (B) 쥐 심근 조직에서 콜라겐 염색은 마손 염색법으로 검출되었고; 스케일 = 50 μm. 평균 ± SD, n = 3. 모든 P-값은 분산의 독립 일방향 분석을 통해 계산되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01. 40배 및 400배. 이 수치의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 쥐 혈청 내 CK-MB, AST, LDH, CTn-I, h-FABP 수치는 심근 손상을 나타냈다. (A–F). CK-MB, AST, LDH, CTn-I, h-FABP 수치는 ELISA 키트를 사용하여 측정하였습니다. 평균±SD, n = 3. 모든 p-값은 분산의 독립 일방향 분석을 통해 계산되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01. 약어; CK-MB = 크레아틴 키나제-MB; AST = 아스파르트산 아미노트랜스퍼라제; LDH = 낙산 탈수소효소; cTn-I = 심장 트로포닌 I; h-FABP = 심장형 지방산 결합 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: Acon과 JNK 경로의 분자 결합 결과. (A–B) 및 (D–E) Acon과 JNK1/2 단백질의 2차원 상호작용 다이어그램. (C) 및 (F) Acon과 JNK1/2 단백질의 3D 상호작용 다이어그램. 약어; JNK = c-준 N-말단 키나제. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: Acon이 JNK 인산화 수준을 상향 조절합니다. (A–B)쥐 심근 조직에서 p-JNK1/2 및 JNK1/2의 발현 수준 은 웨스턴 블롯팅을 통해 검출되었습니다. 평균 ± SD, n = 3. 모든 p-값은 분산의 독립 일방향 분석을 통해 계산되었습니다. *p < 0.05, *p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: JNK 억제제가 Acon에 의해 유도된 JNK 인산화를 억제합니다. 쥐 심근 조직에서 p-JNK1/2 및 JNK1/2의 발현 수준은 웨스턴 블롯팅을 통해 검출되었습니다. 평균 ± SD, n = 3. 모든 p-값은 분산의 독립 일방향 분석을 통해 계산되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 7: JNK 억제제가 쥐의 심근 병리학적 손상과 콜라겐 염색을 완화합니다. (A) 쥐 심근 조직의 병리학적 변화는 HE 염색으로 감지되었습니다(노란색 화살표는 손상된 심근세포가 형성하는 둥근 공포를 나타냅니다); 스케일 = 100 μm. (B) 쥐 심근 조직에서 콜라겐 염색은 마손 염색으로 검출되었으며; 스케일 = 50 μm. 평균±SD, n = 3. 모든 p-값은 분산의 독립 일방향 분석을 통해 계산되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01. 40배와 400배. 이 수치의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 8: JNK 억제제는 쥐 혈청 내 CK-MB, AST, LDH, CTn-I, h-FABP 수치를 하향 조절합니다. (A–B) CK-MB, AST, LDH, CTn-I, h-FABP 발현 수준은 ELISA 검사 키트로 검출되었습니다. 모든 p-값은 분산의 독립 일방향 분석을 통해 계산되었습니다. 평균±SD, n = 3. *p < 0.05, **p < 0.01. 약어; CK-MB = 크레아틴 키나제-MB; AST = 아스파르트산 아미노트랜스퍼라제; LDH = 락테이트 탈수소효소; cTn-I = 심장 트로포닌 I; h-FABP = 심장형 지방산 결합 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

	방제	아셋	아콘-1 mg	아콘-2 mg
쥐들	9	9	9	9
쥐 사망자 수	0	0	0	0

표 1: 1시간 동안 행동한 쥐 사망 횟수. Acon 투여 후 1시간 후, 대조군, Acet군, Acon-1mg군, Acon-2mg군에서 쥐가 사망하지 않았습니다. (그룹당 분석에 최종 포함된 동물 수는 3마리였으며, 죽은 쥐는 대체되지 않았다.)

	방제	아셋	아콘-1 mg	아콘-2 mg
쥐들	9	9	9	9
쥐 사망자 수	0	0	0	0

표 2: 3시간 동안 행동한 쥐 사망 횟수. Acon 투여 후 3시간 후, 대조군, Acet군, Acon-1mg군, Acon-2mg군에서 쥐가 사망하지 않았습니다. (그룹당 분석에 최종 포함된 동물 수는 3마리였으며, 죽은 쥐는 대체되지 않았다.)

	방제	아셋	아콘-1 mg	아콘-2 mg
쥐들	9	9	9	9
쥐 사망자 수	0	0	4	4

표 3: 6시간 동안 행동한 쥐 사망 횟수. Acon 투여 6시간 후, Acon-1 mg군에서 9마리 중 4마리가 사망했고, Acon-2 mg군에서 9마리 중 4마리가 사망했습니다. (그룹당 분석에 최종 포함된 동물 수는 3마리였으며, 죽은 쥐는 대체되지 않았다.)

	방제	DMSO	에이콘	에이콘 + SP600125	아콘 + 아니스
쥐들	9	9	9	9	9
쥐 사망자 수	0	0	3	1	3

표 4: 아니스와 SP600125 행동 후 쥐 사망 수. 쥐 사망 수는 치료군에 따라 달랐습니다: Acon-2 mg 그룹에서는 9마리 중 3마리가 사망했고; Acon+SP600125 그룹에서는 쥐 9마리 중 1마리가 죽었고; Acon + Anis 그룹에서는 쥐 9마리 중 3마리가 죽었습니다. (그룹당 분석에 최종 포함된 동물 수는 3마리였으며, 죽은 쥐는 대체되지 않았다.)

그룹	심박 체중 (g)
방제	0.71 ± 0.03
아셋	0.73 ± 0.02
아콘-1mg (1시간)	0.73 ± 0.06
아콘-2mg (1시간)	0.75 ± 0.02
아콘-1mg (3시간)	0.71 ± 0.04
아콘-2mg (3시간)	0.77 ± 0.03
아콘-1mg (6시간)	0.72 ± 0.03
아콘-2mg (6시간)	0.77 ± 0.02
DMSO	0.70 ± 0.03
에이콘 + SP600125	0.74 ± 0.03
아콘 + 아니스	0.75 ± 0.04

표 5: 쥐의 심장 무게. 그룹 간 심박 체중에는 유의한 차이가 없었습니다.

리간드	JNK1	JNK2
에이콘	-7.8 Kcal/mol	-8.41 Kcal/mol

표 6: 분자 도킹 연구 결과. Acon과 JNK1 간의 도킹 점수는 -7.8 Kcal/mol이며, Acon과 JNK2 간의 도킹 점수는 -8.41 Kcal/mol입니다.

보충 그림 1: 1시간 동안 Acon 작용 후 쥐의 부정맥 심전도(Electrocardiogram) 일러스트. 위에서 아래까지, 대조군, 아세트 군, 아콘-1 mg 그룹, 그리고 아콘-2 mg 그룹입니다. Acon-1mg-A-gavage와 Acon-2 mg-A-가베지의 부정맥 유형(부정맥 발생 순서대로): 조기 심실 수축; 조기 심실 이중증; 조산성 심실 3연합; 단기 폭발 심실 빈맥; 단형성 심실 심박수 빈맥; 양방향 심실 빈맥. Acon-2 mg-A-가비지: 양방향 심실 빈맥. 약어; B-가비지 = 에이콘 가비지 이전; A-가베지 = 아콘 가베지 이후. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: 쥐의 부정맥 심전도(Acon이 작용한 3시간 후)입니다. 위에서 아래까지, 대조군, 아세트 군, 아콘-1 mg 그룹, 그리고 아콘-2 mg 그룹입니다. Acon-1mg-A-가베지와 Acon-2 mg-A-가베지의 부정맥 유형(부정맥 발생 순서대로): 조기 심실 수축; 짧은 심실 빈맥 폭발; 양방향 심실 빈맥. Acon-2 mg-A-가베지: 조기 심실 수축; 양방향 심실 빈맥. 약어; B-가비지 = 에이콘 가비지 이전; A-가베지 = 아콘 가베지 이후. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 3: Acon은 1시간 동안 Acon 작용 후 심근 손상과 콜라겐 염색을 촉진합니다. (A) 쥐 심근 조직의 병리학적 변화는 HE 염색으로 감지되었습니다(참고: 노란색 화살표는 손상된 심근세포가 형성한 둥근 공포를 나타냅니다); 스케일 = 100 μm. (B) 쥐 심근 조직에서 섬유화는 마손 염색으로 검출되었으며; 스케일 = 50 μm. 평균 ± SD, n = 3. 모든 p-값은 분산의 독립 일방향 분석을 통해 계산되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01, 40x, 400x.이 파일을 다운로드하시려면 여기를 클릭하세요.

보조 그림 4: Acon은 3시간 동안 Acon 작용 후 심근 손상과 콜라겐 염색을 촉진합니다. (A) 쥐 심근 조직의 병리학적 변화는 HE 염색으로 감지되었습니다(노란색 화살표는 손상된 심근세포가 형성한 둥근 공포를 나타냅니다); 스케일 = 100 μm. (B) 쥐 심근 조직에서 콜라겐 염색은 마손 염색으로 검출되었으며; 스케일 = 50 μm. 평균 ± SD, n = 3. 모든 p-값은 분산의 독립 일방향 분석을 통해 계산되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01. 40배 및 400배. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

토론

Acon은 부정맥과 심근 손상을 유발할 수 있습니다; 그러나 아콘 유발 심근 손상의 근본 기전은 아직 명확하지 않습니다. 본 연구에서는 심근손상을 동반한 급성 아콘 중독의 쥐 모델을 성공적으로 확립하였습니다. 이 결과는 JNK 신호 전달 경로의 활성화가 급성 아콘 중독으로 유도된 심근 손상의 주요 하위 메커니즘일 수 있음을 보여주었다. 특히, Acon으로 인한 부정맥과 심근 손상이 있는 쥐에서 JNK1/2 인산화 수준이 유의하게 높았습니다. 더 나아가, JNK 경로의 억제는 급성 아콘 중독으로 인한 심근 손상을 부분적으로 되돌렸다. 이 발견들은 JNK 경로의 활성화가 아코니틴에 의해 유발된 심근 손상의 발병 기전에서 중요한 역할을 함을 시사합니다.

급성 아콘 중독으로 인한 주요 사망 원인은 심장 독성입니다. 이전 연구들은 Acon 치료 후 쥐의 심근 섬유가 퇴행하고 무질서해졌으며, 핵 착색이 심화되고 호중구 침투가 발생하고, 둥근 액포^{가 나타}난 것으로 나타났습니다. 연구 결과와 일치합니다. HE 염색 결과, Acon 치료 그룹의 심근 조직이 근육다발 배열의 불규칙, 근육 간격의 확장, 근섬유 파열 등 병리학적 변화를 보였다. 또한, 정상 조건에서는 심장 효소인 CK-MB, AST, LDH, 심장 단백질인 cTn-I 및 h-FABP가 혈청²⁹에 매우 소량으로 존재합니다. 심근 세포가 손상되면 이 표지자들이 대량으로 혈액 내에 방출됩니다 30,31,32,33.

이 연구 결과는 Acon 게베지그룹 쥐의 정맥 혈청에서 CK-MB, AST, LDH, cTn-I, h-FABP가 각 관찰 시점마다 다양한 정도로 증가함을 보여줍니다. 발현 수치는 위내 투여 후 6시간 이후에 가장 높습니다. 이 결과는^{이전 연구들과} 일치합니다. 그들은 Acon이 쥐의 H9C2 심근세포에 손상을 주고 AST 수치를 증가시키는 것을 발견했습니다. 한편, 이전 연구들은 Acon을 이용해 쥐에서 심근 손상을 유도하여 해독제가 심근 손상에 미치는 영향을 연구했습니다³⁵. 그들은 심근 손상이 있는 쥐의 혈청에서 LDH와 CK-MB 수치가 높게 나타났습니다. 요컨대, 심근 손상 마커의 관절 검출 실험 결과는 급성 아콘 중독으로 인한 심근 손상의 쥐 모델이 1–2 mg/kg Acon을 위내 투여 후 1, 3, 6시간 이내에 성공적으로 확립할 수 있음을 보여줍니다. 위내 투여 후 6시간 동안 2 mg/kg Acon의 모델링 효과가 가장 우수하며, 이후 실험의 요구사항을 충족합니다.

연구에 따르면 Acon이 Na⁺ 및^Ca-2+ 이온 채널에 미치는 영향은 세포 내 칼슘 이온 농도를 증가시키고, 이는 P38-MAPK 신호 전달 경로를 추가로 활성화하여 JNK 연쇄반응 36,37,38을 유발합니다. JNK 활성화는 심근 손상을 촉진합니다^39,40. 이는 이 실험 결과와 일치합니다. 이 연구에서 우리는 Acon이 심근세포에서 JNK1/2 인산화를 촉진하고 JNK 신호 전달 경로를 활성화한다는 사실을 발견했습니다. 이는 JNK 활성화가 아코니틴으로 인한 심근 손상에 기여하는 하위 신호 반응일 수 있음을 시사합니다. 그러나 Acon이 JNK1/2 인산화를 자극하는 분자 및 약동학적 기전은 추가 연구가 필요합니다.

연구에 따르면 JNK1/2가 다량 인산화되면 JNK 신호 전달 경로가 활성화되고, 이는 심근세포 핵에서 유전자의 통제되지 않은 발현을 매개하고 세포 주기를 방해합니다. JNK 신호 전달 경로를 억제하면 심근 손상을 완화할 수 있습니다^41,42. HE 결과에서 JNK 경로 억제제 SP600125은 Acon에 의해 유도된 심근 조직의 병리학적 변화를 현저히 줄일 수 있습니다. 한편, 이전 연구들은 관상동맥 결찰로 인한 급성 심근경색 모델에서 심근 조직 내 청색 염색 콜라겐 섬유와 콜라겐 침착이 현저히 증가하고 JNK 신호 전달 경로가 활성화된 것으로 나타났습니다. 전통 중의학 과립 치료는 JNK 신호 전달 경로를 억제하여 심근 콜라겐 침착을 감소시켰습니다^43,44.

당뇨병성 심근 손상이 있는 쥐에서는 콜라겐 섬유 함량(청색 염색)과 콜라겐 부피 분율(CVF)이 유의하게 증가했습니다. 동시에 JNK 신호 경로가 활성화되었다. 저용량 에탄올은 JNK 경로 활성화를 억제하여 쥐 심근 조직에서 콜라겐 섬유 침착과 CVF 증가를 완화하는 것으로 보고되었습니다⁴⁵. 본 연구에서 분자 결합 분석 결과, 아코니틴이 JNK1과 JNK2와 여러 비공유 상호작용을 통해 상호작용할 수 있음을 보여주었으며; 그러나 이러한 결과는 생리학적 결합의 직접적인 증거로 간주되지 않아야 합니다. 더 나아가, 생체 내 실험에서는 아콘이 스트레스 요인으로서 JNK1/2 인산화를 상향 조절하여 JNK 신호 전달 경로를 활성화하는 것으로 나타났습니다. 이 활성화는 쥐 심근 조직에서 콜라겐 침착(청색 염색)과 CVF 상승과 연관되어 궁극적으로 심근 손상으로 이어졌습니다. 그러나 JNK 억제제 첨가SP600125 Acon의 독성 효과를 유의미하게 억제하여 심근 조직의 CVF 값 증가를 감소시켰다. 심근 손상은 정상적인 심장 근세포 막의 완전성을 방해하고 세포 내 내용물이 세포 외 공간으로 손실되어, 혈액 내 심근효소 수치 증가로 나타납니다^46,47. 이 결과는 쥐 혈액 내 심근효소 수치 증가가 Acon이 심근 손상을 일으킨다는 신호도 나타냈다. 동시에 JNK 억제제는 심근효소 분비를 억제하여, JNK 억제제가 Acon에 의해 발생하는 심근 손상을 부분적으로 완화할 수 있음을 시사합니다.

이 연구의 몇 가지 한계점을 인정해야 합니다. 첫째, 각 시점의 표본 크기가 상대적으로 작았고(그룹당 n = 3개), 이는 분석의 통계적 검정력을 제한할 수 있으며, 표본 크기 결정 전에 공식적인 검정력 분석이 수행되지 않았습니다. 또한 단일 아코니틴 용량 범위와 비교적 짧은 관찰 기간(1–6시간)만 평가되어 장기적 병리학적 변화와 용량 반응 관계 평가가 제한되었습니다. 둘째, JNK1/2 인산화 증가와 약리학적 개입은 JNK 신호 전달 경로가 아코니틴 유발 심근 손상에 관여할 가능성을 시사했으나, 아코니틴 노출과 JNK 활성화의 상류 메커니즘은 완전히 조사되지 않았다. 아코니틴은 주로 전압 개폐 Na⁺ 채널과 세포 내 Ca²⁺ 항상성에 영향을 미치며, 이는 JNK 활성화에 기여할 수 있습니다. 그러나 본 연구에서는 산화 스트레스 및 칼슘 과부하 경로 등 관련 신호 전달 사건을 직접 조사하지 않았습니다. 셋째, 분자 결합 분석은 아코니틴과 JNK1/2 간의 잠재적 상호작용에 대한 지지 증거만을 제공했으며, 직접적인 생리적 결합을 나타내지 못했습니다. 표면 플라즈몬 공명이나 풀다운 분석과 같은 추가 실험적 검증은 수행되지 않았습니다. 더불어, JNK1/2만 조사되었으며, JNK3가 아코니틴 유발 심독성에서 어떤 역할을 하는지는 아직 명확하지 않습니다. 마지막으로, SP600125 또는 아니신 중재 후에는 심전도 평가가 수행되지 않았습니다. 따라서 JNK 경로 조절이 아코니틴 유발 심실 부정맥에 직접적인 영향을 미치는지는 추가 조사가 필요합니다.

요약하자면, Acon은 JNK 신호 전달 경로를 활성화하며, 이는 JNK1/2의 인산화 증가로 입증되며, 이는 심근 손상에 기여할 수 있습니다. 이는 쥐 심근 조직에서 콜라겐 침착 증가와 심장 효소 분비 증가로 나타납니다. 아코니틴 유발 심독성은 Na⁺ 채널 활성화, Ca²⁺ 과부하, 산화 스트레스 등 여러 상류 사건을 포함하므로, JNK 경로의 활성화는 심근 손상에 기여하는 주요 하위 신호 사건일 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4% 파라포름알데히드	우한 서비스-바이오 유한회사.	HJ203501	조직 고정
아코니틴 (아콘)	청두 데시테 생물학기술유한회사(Chengdu DeSiTe Biological Technology Co., Ltd.)	DRK-0335-960330	가비지 모델용 독성 화합물
아닐린 블루 솔루션	베이징 솔라비오 유한회사.	G1350	마손 염색
아니소마이신 (아니스)	메드켐익스프레스 주식회사	153154	JNK 경로 활성화자/제어
AST 엘리사 키트	우한 화메이 생명공학 유한회사.	CSB-E13023r	심장 효소 검출
오토독 비나	오픈 소스	해당 없음	분자 도킹
BCA 단백질 분석 키트	상곤 바이오텍 (상하이, 중국)	명시되지 않음	단백질 정량화
원심분리기	동관CNZCN 유한회사.	TD5M-WS	1000 & times; G 원심분리
Chem3D 소프트웨어	퍼킨엘머	해당 없음	리간드 에너지 최소화
CK-MB 엘리사 킷	우한 화메이 생명공학 유한회사.	CSB-E14403r	심장 효소 검출
cTn-I ELISA 키트	우한 화메이 생명공학 유한회사.	CSB-E08594r	심장 단백질 검출
일회용 정맥 혈액 채취 바늘	KINDLY 주식회사	https://www.kdlchina.cn/specimen-collection/220.html	혈액 채취
향상된 화학발광(ECL) 시약	밀리포어 주식회사	21302A4	서부 블롯 시각화
이오신	베이징 솔라비오 유한회사.	20200905	H& E 염색
그래프패드 프리즘 8	그래프패드 소프트웨어 주식회사	해당 없음	통계 분석
헤마톡실린	우한 서비스-바이오 유한회사.	CR2203066	H& E 염색
h-FABP 엘리사 키트	우한 화메이 생명공학 유한회사.	CSB-E16184r	심장 단백질 검출
ImageJ 소프트웨어	국립보건원(NIH)	해당 없음	서부 블롯 정량
JNK1/2 1차 항체	화안 바이오테크놀로지 (중국 항저우)	ET1609-42	웨스턴 블롯 항체
LDH 엘리사 키트	상하이 효소 연관 생명공학	ML003416	심장 효소 검출
매슨 블루 솔루션	베이징 솔라비오 유한회사.	20220303	마손 염색
마이크로플레이트 리더	써모피셔 사이언티브	ME001000C	ELISA 외측 측정 (450 nm)
광학 현미경 (올림푸스 C33)	올림푸스 (도쿄, 일본)	C33	조직학 영상
파라핀 왁스	라이카  주식회사	2110068	조직 임베딩
PBST 버퍼	메이룬비오 주식회사	MA0015-4월 27G2	세척 완충제
p-JNK1/2 1차 항체	화안 바이오테크놀로지 (중국 항저우)	ET1601-28	인산화된 JNK 항체
단백질 데이터 뱅크(PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	단백질 구조 원천
단백질 추출 키트	상곤 바이오텍 (상하이, 중국)	C510003-0050	조직 단백질 추출
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SDS-PAGE 젤 (10%)	베이징 솔라비오 유한회사.	817X031	단백질 전기영동
탈지 분유	베이징 솔라비오 유한회사.	http://www.solarbio-hd.com/solarbiohd-Products-23261665/	블로킹 시약 (5%)
나트륨 펜토바르비탈	써모피셔 사이언티브 주식회사	57-33-0	동물 시술용 마취제
SP600125 (JNK 억제제)	메드켐익스프레스 주식회사	112518	JNK 경로 억제제
SPF 동물 사육 시설	쿤밍 의과대학교	해당 없음	동물 사육 환경
스프래그-도울리 쥐 (수컷, 2개월, ~230g)	베이징 화푸캉 생물기술유한회사.	http://www.hfkbio.com/	실험 동물 (n = 51)
바이게르트 철 헤마톡실린	광저우 웨시스 유한회사.	18092001	마손 염색
자일렌	톈진 Tjhxsj 유한회사.	20220208	조직 정리