연속 원심 마이크로유이딕스 및 하이드로겔 면역세포화학 을 통한 순환 희귀 세포의 견고한 분리 및 다중화 동원

요약

본 연구는 순환 희귀 세포의 효율적인 분리 및 식별을 위한 연속 원심 마이크로유체 워크플로우를 제시합니다. 이 시스템은 정밀한 액체 조절을 가능하게 하고 세포 손실을 최소화하여 CTC와 cCAF를 포함한 여러 CRC 아형을 동시에 분석하여 진단 정확도를 향상시킵니다.

초록

순환 희귀 세포(CRC), 순환 종양 세포(CTCs)와 순환 암 관련 섬유아세포(cCAFs)를 포함한 유망한 바이오마커입니다. 그러나 극히 낮은 개체 수와 표현형 이질성 때문에 효율적인 분리와 다중 매개변수 분석이 기술적으로 어렵습니다. 여기서는 전혈에서 CRCs의 순차적 분리 및 식별을 위한 연속 원심 마이크로유체 워크플로우를 제시합니다. 카트리지는 5개의 상호 연결된 챔버로 구성되어 있으며, 제어 가능한 밸브가 있어 원심분리 중 밀도 구배 매질과 혈액층을 정밀하게 다룰 수 있습니다. 이전에 검증된 농축 플랫폼을 기반으로 한 현재 워크플로우는 하이드로겔 기반 세포 고정과 다중화 면역세포화학을 통합하여 CTC와 cCAF를 포함한 여러 CRC 아형의 후속 식별 및 특성 분석을 지원합니다. 분리 후, 세포는 하이드로겔 기질 내에 고정되어 반복적인 면역 염색 및 영상 기반 분석 중 세포 보유를 지원합니다. 이 워크플로우를 사용하여 동일한 샘플에서 CTC와 cCAF를 모두 확인하여, 단일 액체 생검 워크플로우 내에서 여러 순환 희귀세포 집단을 통합적으로 분석하는 것이 가능함을 입증했습니다. 이 플랫폼은 액체 생검 응용 분야에서 희귀세포 특성 분석을 위한 실용적이고 재현 가능한 접근법을 제공합니다.

서론

순환 희귀 세포(CRC)는 적혈구, 백혈구, 혈소판과 같은 정상 혈액 구성 요소에 비해 혈류 내 매우 낮은 빈도로 존재하는 세포로 정의됩니다. CRC는 생물학적 과정의 부산물, 조직 재형성, 상처 치유, 혈관 손상 등 다양한 원인에서 기원합니다. 대표적인 예로는 순환 내피세포, 순환 태아 세포, 거핵세포, 적혈구, 다양한 전구세포 또는 줄기세포 등이 있습니다 ^1,2. CRC의 존재만으로 반드시 병리학적 상태를 반영하지는 않지만, 수치가 높아지면 비정상적인 생리적 또는 병리학적 상태를 나타내는 경우가 많습니다 ^3,4. 따라서 CRCs의 민감한 검출과 특성 분석은 신체 내에서 일어나는 역동적인 생리적·병리학적 과정에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다.

CRC 아형 중에서는 순환 종양 세포(CTCs)와 순환 암 관련 섬유아세포(cCAFs)가 암의 주요 바이오마커입니다. CTC는 종양 세포 확산의 직접적인 증거를 제공하며 널리 연구되고^{있습니다.} CTC 수치의 변화는 종종 조기 발견, 예후 및^{치료 반응의} 모니터링과 관련이 있습니다. 동시에 cCAF는 혈류로 배출되는 기질 성분을 나타내며, 이는 종양 미세환경 상호작용과 전이 전 지위(niche⁷)의 형성을 반영합니다. 그러나 CTCs에 비해 cCAF에 대한 연구는 제한적이며, 임상적 유용성도 이제 막 탐구되기 시작^{했습니다.}

CTC와 cCAF는 액체 생검에서 상호 보완적인 생물학적 정보를 제공할 수 있는데, CTC는 종양 세포 전파와 전이 형질을 반영하는 반면, cCAF는 기질 재형성과 종양 미세환경 관련 진행 신호를 나타낼 수 있습니다. 따라서 이 두 순환 희귀세포 집단에 대한 동시 분석은 두 집단만을 분석하는 것보다 암 진행에 대한 보다 더 통합된 이해를 뒷받침할 수 있습니다. 그러나 말초혈에서의 극심한 희귀성, 보편적으로 인정받는 cCAFs 표지자의 부재, 세포 하위 집단 간 표지 발현의 상당한 이질성 등으로 인해 임상 및 번역 효과가 크게 제한되어 신뢰성 있는 식별을 방해합니다. 따라서 농축 및 식별 과정에서 세포 손실을 최소화하는 것이 견고하고 신뢰할 수 있는 분석을 보장하는 데 매우 중요합니다. 더불어, CTC와 cCAF의 기능 및 표지 다양성에 대한 포괄적인 특성 분석은 전이에서 이들의 역할을 명확히 하고 임상적으로 의미 있는 바이오마커를 개발하는 데 필수적입니다 ^8,9.

여기서는 cCAFs와 CTCs^의 동시 분리 방법을 ^{제시하며,} 희귀세포의 하이드로겔 캡슐화를 이용한 다중 표지 식별을 결합하여 면역세포화학(ICC)¹²를 수행합니다. 현재 CRC 분리 방법은 다단계 처리 중 세포 손실, 표현형상 이질성 세포의 제한된 포획, 그리고 마커 의존적 농축 전략과 관련된 선택 편향 등 기술적 한계에 직면하는 경우가 많습니다. 반면, 본 연구에서 사용된 연속 원심 마이크로유체 플랫폼은 포괄적인 농축 프레임워크를 기반으로 하여 기존의 양성 선택 마커에 대한 의존도를 줄입니다. 기본 농축 플랫폼의 분석 및 워크플로우 성능은^{이전 연구에서} 설명되었습니다. 9.

검증된 플랫폼을 바탕으로, 본 연구는 하이드로겔 기반 세포 고정과 다중화 면역세포화학의 통합을 통해 CTC와 cCAF를 포함한 여러 순환 희귀세포 집단을 통합된 워크플로우 내에서 포괄적으로 분리하고 식별하는 데 중점을 둡니다. 농축, 안정적인 세포 유지, 반복 염색 호환 분석을 결합함으로써, 이 프로토콜은 액체 생검 샘플에서 통합 희귀세포 분석을 위한 실용적인 틀을 제공합니다.

프로토콜

환자와 건강한 기증자의 인간 혈액 샘플을 포함한 모든 절차는 세버런스 병원의 기관심사위원회(IRB) 지침에 따라 진행되었습니다. 연구 프로토콜은 세버런스 병원 기관심의위원회(IRB No. 4-2013-0059)의 승인을 받았습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 장치 준비

1. 전원 스위치를 눌러 기기를 켜세요.
2. 레이저 인터록 스위치를 작동시키고, 레이저 전원 스위치를 켜세요.
3. 운영 소프트웨어를 실행하고 시스템이 정상적으로 초기화되는지 확인하세요.
4. 메인 소프트웨어 인터페이스에서 장치 작동(Device Operation) 을 선택하고 표준 EDTA 전혈 샘플에 대한 사전 설정 프로토콜 을 선택하세요.

2. 장치 작동 - 1^단계

참고: 흡입구 위치와 탄환 구조에 대한 세부 사항은 그림 1A에 표시되어 있습니다.

1. 입구 6에서 초기 챔버에 2mL의 시약 A(밀도 구배 배지)를 추가합니다.
2. 입구 8에서 875 μL 시약 A를 고갈 챔버에 추가합니다.
3. 카트리지를 디스크 랙에 장착하여 원심분리를 위한 적절한 균형을 확보하세요.
4. CTCeptor의 도어 버튼을 눌러 마운트를 열고, 디스크 랙을 CTCeptor에 장착한 후 고정 나사로 고정하세요.
5. 문 버튼을 눌러 마운트를 닫고, CTCeptor 소프트웨어로 스핀 다운 단계를 실행하세요(약 30초).
6. 시약 A가 초기 챔버 하단에 옮겨졌음을 확인한 후, 고정 나사를 풀고 디스크 랙을 기기에서 분리한 채 카트리지를 장착한 채 제거하세요.

3. 장치 작동 - 2^단계

1. 혈액 샘플을 다루기 전에 모든 절차를 인증된 생물학적 안전 캐비닛에서 수행하고, 기관 생물안전 지침에 따라 장갑, 실험복, 안구 보호 장비 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
2. 카트리지를 기기에서 분리한 상태에서, 6번 흡입구를 통해 초기 챔버에 3mL의 혈액을 주입합니다.
3. 디스크 레일을 CTCeptor에 장착하고 고정 나사로 고정하세요.
4. CTCeptor 소프트웨어를 사용해 적혈구 제거 단계를 실행하세요(약 40분). 이 단계에서 원심분리는 카트리지 내에서 혈장, 적혈구, 말초혈 단핵세포(PBMC)를 분리하고, PBMC 함유 분획은 다음 챔버로 옮겨져 이후 백혈구 고갈을 위해 사용됩니다.
5. RBC 제거 단계를 완료한 후에는 디스크 랙을 악기에서 분리하세요.

4. 장치 작동 - 3^단계

1. 작업 구역을 신중하게 소독하여 멸균을 유지하세요.
2. 균질한 현탁을 보장하기 위해 시약 B(백혈구 분리 구슬)를 소용돌이로 만듭니다.
3. 세척 완충제는 Ca²⁺/Mg^{2⁺ 프리} DPBS와 0.1% BSA, 2 mM EDTA(pH 7.4)를 혼합하여 준비합니다.
4. 원하는 용량의 시약 B를 1.5 mL 튜브(예: 카트리지당 50 μL)로 옮깁니다.
5. 세척 버퍼를 시약 B 부피의 5배에 넣고, 피펫팅으로 부드럽게 섞으세요.
6. 튜브를 자석 스탠드 위에 1분간 올려 시약 B의 구슬이 모이도록 한 후 상원액을 조심스럽게 버립니다.
7. 세척 버퍼 내 비즈를 초기 비드 부피와 같은 부피로 재현탁합니다.
8. 구슬은 사용 전까지 4 °C에서 보관하세요.
9. 사용 직전, 준비된 비드 50 μL과 DPBS 50 μL을 혼합한 후, 100 μL 혼합물을 7번 입구에 주입합니다.
10. 디스크 레일을 CTCeptor에 장착하고 고정 나사로 고정하세요.
11. CTCeptor 소프트웨어를 사용해 백혈구 제거 단계를 실행하세요(약 50분). 이 프로그램된 단계에서는 적재된 백혈구 분리 구슬을 PBMC 함유 분획과 흔들어 구슬-백혈구 결합을 촉진한 후, 원심분리 기반으로 구슬에 결합된 백혈구 분획을 제거합니다.
12. WBC 제거 단계를 완료한 후에는 디스크 랙을 기기에서 분리하세요.

5. 샘플 회수

1. 최종 챔버의 출구 9에 피펫 팁을 삽입하고 내용물을 재현탁한 후 수집한 샘플을 15 mL 튜브로 옮깁니다.
2. DPBS 2mL를 출구 9에 주입하고, 피펫팅으로 챔버를 깨끗이 세척한 후 같은 15mL 튜브로 세척합니다.
3. 세척 과정을 두 번 반복하세요.
4. 15 mL 튜브 내 수집된 액체 부피를 DPBS로 14 mL로 조절하고, 튜브를 막은 후 부드럽게 반전하여 혼합합니다.
5. 튜브를 380 × g 에서 실온에서 4분간 원심분리하세요.
6. 상원액을 조심스럽게 제거하여 약 1mL를 남기고, 남은 현탁액을 사용해 하류 분석을 수행합니다.

6. CRC의 식별

1. 프리하이드로겔 폴리머를 준비할 때는 Ca^2⁺/Mg^2⁺ 프리 DPBS, 하이드로겔 펠리클 면역세포화학(HypICC) 용액 A(프리폴리머), 광시작기를 80:20:1 비율로 혼합합니다.
2. CRC 현탁액 870 μL과 270 μL 프리-하이드로겔 폴리머를 혼합합니다.
3. 혼합물을 HypICC 챔버로 옮기고 500 × g 에서 원심분리기를 5분간 돌려 세포가 플랫폼에 안정될 시간을 줍니다.
4. 하이드로겔 두께를 설정하기 위해 두께 조절기를 HypICC 챔버에 삽입합니다.
5. 샘플을 바닥에서 20–30초 동안 UV 광선(365nm)으로 照射하여 하이드로겔 층을 가교결합시킵니다.
6. 두께 조절기를 제거하고 하이드로겔 캡슐화된 세포를 DPBS로 세 번 세척하세요.
7. 세포를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 실온에서 10분간 고정한 후, 샘플을 DPBS로 세 번, 각각 10분씩 세척합니다.
8. 0.05% Triton X-100으로 실온에서 10분간 투과성을 가집니다. 그 다음 샘플을 DPBS로 세 번, 각각 10분씩 세척합니다.
9. 샘플을 2% BSA로 실온에서 1시간 동안 차단하세요.
10. 샘플을 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
11. 샘플을 DPBS로 다섯 번, 한 번 20분씩 세척하세요.
12. 호에스트로 핵을 실온에서 10분간 염색한 후, 샘플을 DPBS로 세 번, 각각 10분씩 세척합니다.
13. 필요 시 2차 항체 배양은 1차 항체 배양과 동일한 하룻밤 조건에서 수행할 수 있습니다.
14. 형광 현미경 영상을 수행하고 CRC를 식별합니다.

7. CRC의 다중성 면역염색

1. 면역염색과 영상 촬영 후, CRC는 담냉 후 추가적인 항체 염색을 받을 수 있습니다.
2. PBS에 4.5% H,₂O₂ , 24 mM NaOH로 구성된 담질 용액을 준비합니다.
3. HypICC 챔버에서 DPBS를 분리하고 담냉 용액을 추가하세요.
4. 실온에서 백색광 아래 1시간 동안 진동시키세요.
5. 소환액을 교체하고 같은 조건에서 추가로 1시간 더 배양하세요.
6. 샘플을 DPBS로 4번, 10분씩 세척하세요.
7. 차단 단계에서 2% BSA를 사용해 면역염색 절차를 다시 시작하세요.

결과

그림 1A 는 희귀 세포 분리에 사용되는 단일 카트리지 이미지를 보여줍니다. 카트리지는 마이크로채널과 액체 흐름을 조절하는 제어 가능한 밸브로 연결된 다섯 개의 개별 챔버로 구성되어 있습니다. 카트리지의 구조는 다음과 같습니다: (1) 전혈에서 분리된 혈장을 수집하는 혈장 챔버; (2) 전혈을 혈장, 적혈구, PBMC 층으로 분리하는 초기 챔버; (3) 분리된 PBMC와 백혈구 분리 구슬을 결합하는 혼합실; (4) 백혈구를 제거하는 고갈실; (5) 농축된 희귀 세포 분획을 수집하는 최종 챔버; (6) 전혈을 주입하는 흡입구; (7) 백혈구 분리 구슬을 도입하는 입구; (8) 밀도 구배 매질을 도입하는 유입구; 그리고 (9) 농축된 세포를 회수하는 배출구 역할을 하는 수집 구멍.

초기 챔버는 밀도 기반 분리 후 적혈구(RBC) 오염을 방지하기 위해 경사진 구조를 가지고...

토론

CRC는 암 진단과 예후 모두에 잠재적 가치를 지닌 중요한 바이오마커입니다. 그러나 CRC 분석의 임상적 유용성을 높이기 위해서는 표현형적으로 다양한 CRC 집단을 더 넓게 포착하고 병렬 다중 매개변수 특성화를 지원하는 것이 중요합니다¹³. 또한, 종양면역학 분야의 증가하는 증거는 면역 요소와 종양 미세환경이 치료 반응 형성에 중요한 역할을 한다는 점을 시사하며, 종양 세포 중심 정보만을 넘어서는 필요성을 강조^합니다. 이러한 고려사항은 암 진행과 치료 반응과 관련된 복잡한 세포 상호작용을 더 잘 반영하는 통합 CRC 분석 워크플로우 개발을 지원합니다.

CRC 분리 접근법은 종종 단일 대상 집단에 최적화되어 있거나 단일 워크플로우 내에서 여러 순환 희귀세포 아형의 통합 하위 분석을 위해 쉽게 구성되지 않습니다. 본 연구에서 사용된 연속 ...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL Conical Tube	SPL	50015
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Bovine Serum Albumin	GenDepot	A0100-010
CD45 antibody	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	디스크 카트리지
CTCD rack	CTCELLS	CTDR-CM3	디스크 랙
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Reagent A	CTCELLS	CTR-S1001	밀도 구배 매체
CTR-S Reagent B	CTCELLS	CTR-S1002	백혈구 분리 비드
FAP antibody	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC Photoinitiator	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC Solution A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC Unit	CTCELLS	CTH-V01	HypICC 챔버
Latex glove	Ansell	93743080
Magnetic stand			3D 프린터를 사용하여 자체 제작
Manual Pipetting (0.5-10 μL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting (100-1000 μL)	Eppendorf	3120000062
Manual Pipetting (10-100 μL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting (20-200 μL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting (2-20 μL)	Eppendorf	3120000038
pancytokeratin antibody	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Welegene	LB001-02
SMA antibody	Invitrogen	PA5-18292
Tip, 10 μL	TipOne	9104020333
Tip, 1250 μL	TipOne	9104020740
Tip, 200 μL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Whole Blood			EDTA로 수집하여 4-8 °C에서 보관
β 액틴 항체	abcam	ab8226

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