암컷 마우스 요도 상피를 단일 세포 및 면역형광 분석을 위한 최적화된 방법

요약

이 프로토콜은 유세포분석, 면역염색, 오가노이드 배양 등 후속 분석을 위해 성체 암컷 쥐 요도의 상피 내막을 분리하는 최적화된 방법을 제시합니다. 이 방법들은 유세포 분석, 전체 장착 영상, 효율적인 오가노이드 형성 등으로 입증된 농축되고 생존 가능한 요도 상피 세포를 얻었습니다.

초록

요도는 상피세포로 둘러싸여 소변이 몸에서 배출되는 통로 역할을 합니다. 요도의 상피 내막은 항균 및 면역 방어 역할을 나타내는 유전자 서명을 가진 뚜렷한 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 요도 상피층에 내장된 상주 대식세포는 전사적으로 구분되는 하위 유형으로, 면역 감시와 항원 제시에 역할을 한다고 주장됩니다. 요로 병원체는 요도를 따라 방광까지 올라갑니다. 요도 상피 내막과 관련 면역 세포 연구는 하부 요로에서 숙주의 방어 기전을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜의 핵심 목표는 암컷 마우스의 요도 해부와 상피 내막을 분리하여 후속 분석을 위한 최적의 방법을 제공하는 것입니다. 프로토콜은 부드러운 효소 및 기계적 분리를 통해 암컷 마우스 요도에서 상피 조직을 분리하는 최적화된 방법을 설명합니다. 상피 분리 이후, 분리된 요도 상피와 관련 면역 세포를 부드럽게 효소적으로 소화하여 고생존율 단일 세포 현탁액을 얻는 방법을 기술합니다. 또한 이 프로토콜은 분리된 쥐, 요도 상피 세포 및 상피 관련 면역 세포의 유세포 분석 방법도 상세히 다룹니다. 또한, 분리된 상피세포로부터 층화된 3D 요도 상피 오가노이드를 생성하는 방법도 여기에 제시됩니다. 또한 요도 상피 시트의 전면 면역염색을 최적화한 방법도 상세히 소개하여, 쥐 요도 상피 및 관련 면역 세포의 형태 및 분자 구조를 관찰할 수 있습니다. 전반적으로, 여기서 설명한 마우스 요도 상피세포의 분리 및 단세포 소화법은 면역염색, 유세포분석, 오가노이드 생성, 단세포 RNA 시퀀싱 등 후속 분석을 가능하게 합니다.

서론

쥐 하부 요로(LUT)는 방광과 요도라는 두 부분으로 구성되어 있습니다. 배아 단계 동안 LUT의 구조는 후부 꼬리에 위치한 일시적인 내배엽 유래 구조인 배설강에서 발달합니다. 배변 복부 부분인 요로생식동 부위는 방광을 앞쪽에, 요도를 뒤쪽으로 형성합니다¹. 방광 내벽은 잘 연구되어 있습니다. 이 섬유는 요로플라킨 단백질 ^2,3,4로 구성된 첨단 결정 플라크를 통해 소변 성분에 대한 단단한 장벽을 형성합니다. 방광 내막이 전이 상피인 반면, 요도는 방광 목에서 원위 요도 입구까지 상피 구조에 차이를 보입니다. 또한 요도는 상피 구조와 세포 구조에서 성적 이형성을 보입니다. 수컷 쥐 요도는 방광 목부의 전이 상피로 구성되어 있으며, 그 다음으로 기둥 상피와 층상 상피가 이어집니다. 암컷 쥐 요도는 방광 목부에 전이 상피와 다층 층의 비편평상피로 둘러싸여 있으며, 이 상피는 분비선으로 끝나는 작은 관들이 점점이 있으며, 원^{위 말단} 쪽으로 이어집니다.

여성은 주로 장에서 요도를 통해 올라가 방광을 감염시키는 요로병원성 박테리아에 의해 발생하는 요로 감염(UTI)에 더 취약^합니다. 요도는 LUT에서 상승하는 요로 병원체와 접촉하는 첫 번째 표면입니다. 요도 상피 세포의 기능, 특히 능동적 면역 장벽으로서의 역할은 연구가 부족했습니다. 같은 연구팀의 최근 연구는 성체 암컷 쥐^{요도 5}의 단일 세포 해상도 공간 지도를 제공했습니다. 기저, 중간, 첨단 세포로 이루어진 3층 요도 내막을 확인했습니다. 상피 내막에는 희귀한 신경내분비 세포가 흩어져 있습니다 ^5,7. 요도 중앙 쪽에서 작은 관들이 요도의 주간에서 갈라져 나와 요도의 기질 구획에 박힌 분비선 군집으로 끝납니다. 전사체 데이터는 요도의 상피세포가 숙주 방어를 형성할 수 있는 면역조절 및 항균 유전자를 발현한다는 것을 밝혀냈다⁵. 요도 상피 세포의 방어 잠재력과 면역조절 기능과 관련된 특성과 특성을 연구하는 것은 요로감염(UTI)과 싸우는 새로운 전략을 제공할 수 있습니다.

쥐를 이용해 요도 상피를 연구하면 시간적 연구와 성적 이형성 조사가 가능합니다. 방광과 요도의 세포 구조 측면에서 쥐가 인간과 유사하다는 점을^{고려할 때}, 이 쥐는 하부 요로 ^1,8,9의 배아 발달을 연구하는 데 광범위하게 사용되어 왔습니다. 마우스는 요도 주입 모델에서도 요로 병원체에 의해 발생하는 요로감염(^UTI)을 연구하기 위해 사용되었습니다 ^10,11,12. 하부 요로 조직은 암이나 기타 질환으로 절제하지 않는 한 접근하기 어렵습니다. 일관되고 건강한 인간 조직의 공급원에 접근하기 어렵기 때문에, 이 쥐는 조직의 항상성, 수리 및 염증 손상에 대한 반응을 연구하기 위한 하부 요로 조직을 조사하는 유용한 모델을 제공합니다. 암컷 쥐와 인간 요도 내막은 방광 목부의 전이 상피와 원위 쪽 끝부의 비편평, 비각질화된 상피로 이루어져 있습니다. 편평상피는 인간 여성 요도의 원위 끝에서 관찰되지만,^{5세와 13}세에 이르면 여성 요도 내막에서 변이가 관찰됩니다. 인간과 마우스 요도 간 요도 점막의 전사체 비교는 이루어지지 않았지만, 마우스는 상피 패턴, 상피-면역 상호작용, 요도 감염 반응을 포착하는 유용한 모델입니다.

본 연구에서 저자들은 전체 길이의 암컷 쥐 요도 해부 방법, 요도 상피 분리, 그리고 단세포 현탁액을 준비하는 부드러운 효소 소화 방법을 설명합니다. 이는 암컷 쥐 요도 상피 조직의 분리 및 소화를 위한 최초의 상세한 프로토콜입니다. 최적화된 프로토콜은 다양한 후속 분석에 활용할 수 있는 농축된 단일 세포 상피세포 집단을 생성합니다. 연구에서 제시된 대로, 저자들은 요도 상피 세포 분리물의 단일 세포 현탁액에 대해 유세포검사를 수행했으며, 이는 주로 상피성 성격의 생존 가능한 단일 세포의 존재를 입증했습니다. 더 나아가, 이 상피세포들은 3D 배양에서 생쥐 요도 점막과 유사한 오가노이드를 생성할 수 있습니다. 저자들은 또한 요도 상피 시트의 전면 염색을 통해 상피 관련 면역 세포, 특히 대식세포가 요도 상피 세포와 연관성을 연구하는 것을 시연했습니다. 이 논문에서 설명한 방법들은 요도 점막과 면역 방어에서의 역할에 대한 연구에 도움이 될 것입니다.

프로토콜

쥐에 대한 모든 연구는 BRIC-줄기세포 과학 및 재생의학 연구소(벵갈루루)의 기관 동물 윤리 위원회(INS-IAE 2022/01(R 1 M2))와 기관 생물안전 위원회(inStem/G-141(3)-22/DBJ)의 승인을 받아 수행되었습니다. 이 연구에 6-12주 된 암컷 CD-1 또는 C57BL6/J 쥐를 사용했으며, 방갈로르 생명과학 클러스터(BLiSC) 국립생물과학센터(NCBS) 동물 돌봄 및 자원 센터(ACRC)에 보관되어 있습니다. 쥐들은 12시간 동안 밝고 어두운 주기 동안 특정 병원체가 없는 환경에서 음식과 물을 자유롭게 섭취하며 키웠습니다.

사용된 모든 재료 는 재료표에 기재되어 있습니다.

1. 성체 암컷 쥐 요도 해리 및 채취

1. 쥐가 숨을 멈출 때까지_CO2 를 사용해 안락사시키세요. 경추 탈구를 2차 안락사의 한 방법으로 시행하세요.
2. 쥐를 누운 자세로 눕히고 복부의 털을 적실 수 있도록 70% 에탄올을 뿌리세요(그림 1A).
3. 겸자로 복부 피부를 들어 올린 후 하체 쪽으로 수직 절개를 하여 외부 요도 입구에서 끝납니다(그림 1B 와 1C).
4. 방광을 확인하고 겸자로 부드럽게 들어 올려 보세요. 경우에 따라 소변이 채워져 있을 수도 있습니다. 겸자 사이에서 방광을 부드럽게 압박해 비우세요.
   참고: 방광은 둥근 구조로 보일 것입니다.
5. 작은 스프링 가위를 사용해 방광 주변의 지방과 결합 조직을 다듬어 치골 결합부에서 두 치골이 만나는 나비 모양 구조를 드러냅니다(그림 1D). 요도는 치골 결합 아래를 지나갑니다.
6. 치골 결합부를 겸자로 들어 올린 뒤 작은 스프링 가위로 절개합니다(그림 1E). 치골 조각을 제거하여 요도가 방광에서 아래로 흐르는 모습을 볼 수 있게 합니다(그림 1F).
   참고: 요도는 질 벽 복측면에 위치한 가느다란 붉은 관으로 나타납니다(그림 1G).
7. 가늘게 잘린 겸자를 사용해 방광을 부드럽게 몸 안에서 위로 당기고, 요도와 질 벽 사이에 작은 스프링 가위를 넣어 요로와 생식기를 분리하세요.
8. 요도 뒤쪽을 절단하여 질 벽과 분리할 때 방광에 약간의 장력을 유지하세요(그림 1H–J). 원위부 요도 입구까지 절단하면 전체 마우스 요도(길이 1.2–1.5cm)가 나옵니다(그림 1K 및 1L).
9. 방광 목에 한 번의 절개를 하여 요도를 방광과 분리하세요.

2. 요도 상피 조직의 분리

참고: 요도에서 상피 시트를 분리하는 프로토콜은 자궁내막 상피¹⁴를 분리하기 위한 프로토콜에서 수정 및 최적화되었습니다. 그림 2 는 요도 상피 시트를 주변 기질 구획에서 분리하는 단계를 보여줍니다(그림 2A).

1. 해부된 요도를 멸균 페트리 접시에 신선한 1x Hanks' Balanced Salt 용액(HBSS, Ca, Mg 프리, 보 충표 1에 상세 설명)을 넣습니다.
   참고: 이 단계에서 상피 분리와 단세포 소화를 위해 4–5개의 요도를 모으는 것이 권장됩니다.
2. 해부 현미경 아래에서 미세 겸자와 작은 스프링 가위를 사용해 요도 주변의 지방과 결합 조직을 다듬습니다(그림 2B).
3. 각 요도를 가로로 두 개의 같은 크기의 조각으로 잘라 100마이크론 나일론 메쉬 체(그림 2C–G) 위에 올려놓습니다.
4. 휴지 위에 1mL의 HBSS(Ca 및 Mg-프리)를 1mL 뿌려 닦으세요.
5. 조직 조각을 1% 트립신(1% 트립신, w/v에서 1x sHBSSa, 보충표 2에 나함) 1mL가 들어 있는 1.5 mL 미세원심분리관(MCT)(그림 2H)으로 옮깁니다.
6. 4°C에서 샘플 로테이터(30rpm)에서 15–30분간 배양하여 조직을 소화합니다.
7. 배양 후에는 4°C에서 관을 제거하세요. 조직 조각과 함께 같은 튜브에 MgCl₂ (1 M MgCl₂, 1x HBSS로 스톡 제조)를 최종 농도 10 mM에 첨가하고, DNase I(10 mg/mL DNase I, 1x PBS로 스톡 제조)를 조직 조각과 함께 최종 농도 10 μg/mL로 첨가합니다.
8. 튜브를 샘플 회전기에서 37°C 하이브리다이제이션 오븐으로 옮겨 15–30분간 배양합니다.
   참고: 4 °C 및 37 °C에서의 트립신 배큐 시간은 하류 적용에 따라 조절할 수 있습니다. 전체 착색은 15분 배양, 단일 세포 소화는 30분 배양이 바람직합니다.
9. 조직을 10% 양혈청 1x HBSS(Ca 및 Mg 프리)에 함유한 1.5mL MCT에 옮겨 트립신 활성을 억제합니다.
10. 요도 조직을 얼음처럼 차갑게 넣은 1x HBSS(Ca 및 Mg 프리)가 들어있는 새로운 관으로 옮깁니다. 그 후 얼음 차가운 1x HBSS가 들어있는 멸균 배양 접시로 옮깁니다.
11. 두 개의 미세 겸자를 사용해 요도에서 상피를 짜내세요. 요도 조각의 한쪽 끝을 한 쌍의 겸자로 잡으세요.
12. 다른 손으로는 요도 조각을 겸자 갈기 사이에 눌러 전체 길이를 따라 상피를 짜내세요. 이 과정을 접시 내 나머지 요도 조각에 대해 반복하여 상피를 분리합니다(그림 2I–J).
    참고: 기계적 분리 시 요도 내강에서 투명한 상피 조직의 얇은 층이 압출됩니다. 요도 상피는 기질 조직보다 색이 밝은(투명한) 얇고 시트 같은 조직 조각으로 식별할 수 있습니다. 상피 분리물은 얇고 투명한 조직 조각이어야 하며, 다진 위해 페트리 접시로 옮길 수 있어야 합니다. 조직 분리는 완전히 분해되어서는 안 됩니다. 조직 조각이 완전히 분해되면 트립신 인베이션 시간을 줄일 수 있습니다.

3. 소화에서 단세포 현탁 상태

1. 분리된 상피 조각을 소형 플라스틱 전사 피펫이나 200 μL 피펫 팁을 사용해 멸균 배양 접시로 옮깁니다. 작은 스프링 가위를 사용해 1x HBSS를 조각에 직접 첨가하여 상피를 작은 조각으로 잘라냅니다(그림 2K).
   참고: 상피 분리 후 남은 기질 조직 조각은 분리된 상피와 동일한 방법으로 소화할 수 있습니다.
2. 다진 조각을 피펫으로 2mL MCT에 1.5mL 예열(37 °C) 아큐타제 소화액으로 옮깁니다. Accutase 소화 용액에는 다음 성분이 포함되어 있습니다: Accutase, 10 μM Rocki Y-27632, 그리고 100 μg/mL DNase I.
3. 조직과 소화액이 담긴 튜브를 37°C 하이브리다이제이션 오븐의 샘플 회전기로 옮깁니다. 1시간 동안 부양하세요.
   참고: 진행 전에 튜브 내용물이 소화가 잘 되는지 확인할 수 있습니다. 성공적인 소화: 다진 조직은 아큐타제 용액에 잘 퍼져 있으며, 배양 후 눈에 보이는 조각은 소수만 남아 있습니다. 소화 실패: 아큐타아제 용액에서 배양 후에도 큰 조직 조각이 여전히 존재합니다. 조직은 성공적인 소화를 위해 가능한 한 곱게 다져야 합니다.
4. 1시간 후 2mL MCT의 전체 내용을 5mL 원심분리관에 옮기고, 2mL의 세척 버퍼(Ca와 Mg 없는 1x PBS, 1% 소 혈청 알부민 포함)를 추가합니다.
5. 4 °C 원심분리기와 스윙잉 버킷 로터에서 600 x g 로 5분간 서스펜션을 회전시킵니다.
6. 부드러운 진공으로 상원액을 흡입한 후, 1mL 피펫과 필터 팁을 사용해 1mL 세척 완충제에 펠릿을 재현탁합니다.
7. 피펫 팁을 사용해 펠릿을 위아래로 피펫팅하여 덩어리가 작아질 때까지 부숴버립니다. 1 mL 주사기에 부착된 23 1/2게이지 바늘로 4 스트로크를 통과시키고, 이어서 1 mL 주사기에 연결된 26 1/2게이지 바늘로 4–6 스트로크를 통과시킵니다.
   참고: 균일한 단일 셀 현탁을 얻고 셀 응집을 방지하기 위해서는 소형의 바늘을 통과해야 합니다. 이 단계는 전단 스트레스와 세포 사멸을 유발할 수 있지만, 연구자들은 바늘과 주사기의 스트로크 수를 최적화하여 과도한 세포 사멸 없이 단일 현탁 상태를 제공했습니다. 이 단계를 건너뛰면 많은 세포가 뭉쳐 단일 세포 RNA 시퀀싱이나 유세포분석과 같은 후속 분석에 혼란을 줄 수 있습니다.
8. 30마이크론 프리분리 필터를 5mL 튜브 위에 올려 표면을 적시기 위해 1mL의 세척 완충제를 추가합니다. 26 1/2 게이지 바늘에 연결된 주사기를 사용해 세포 용액 1mL를 체를 통과시킵니다.
9. 세포가 담긴 튜브에 1mL의 추가 세척 완충제를 넣고, 이 용액을 주사기로 채취해 필터를 통과시킵니다. 펠릿 셀은 600 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리하여 스윙 버킷 로터를 사용합니다.
10. 상원액을 흡인하고 펠릿을 100 μL 세척 완충액에 재현탁한 후, 1x 적혈구(RBC) 용해 완충액 100 μL 추가합니다. 현탁액을 실온에서 정확히 3분간 배양한 후 4mL의 세척 버퍼를 추가한 후 펠릿을 다시 현탁합니다.
    참고: 요도 상피 세포 부탁액에서 혈액 세포를 제거하는 데 적혈구 용해를 권장합니다. 이 단계는 상피 세포 생존력에 미미한 영향을 미칠 수 있지만, 프로토콜은 0.5배 희석된 적혈구 용해 완충제와 3분간의 배양을 사용하여 세포 손실을 최소화하고 생존력을 유지했습니다.
11. 스윙 버킷 로터를 사용해 600 x g 원심분리 4°C에서 5분간 세포를 채취합니다.
12. 상원액을 흡입한 후 펠릿을 펠릿 크기에 따라 50–200 μL 세척 완충제에 재현탁합니다.
    참고: 4–5개의 모은 쥐 요도 상피 샘플에서 얻은 조직의 펠릿 크기는 작지만 눈으로 여전히 확인할 수 있습니다. 원심분리기를 위해서는 스윙 버킷 로터를 사용하여 펠릿이 튜브 바닥에 모이도록 하는 것이 필수적입니다. 연구진은 쥐 요도 상피당 28,000에서 34,000개의 생세포 생산량을 기록했습니다.
13. 세포 5 μL 알리코트 양을 0.5 mL MCT에 옮기고 5 μL 트리판 블루를 첨가합니다. 혼합 후 혈구계를 장착해 수율과 세포 생존성을 확인하세요.

4. 요도 상피 단세포 분리물의 유동 세포분석

1. 5mL 원심분리관에 총 100,000개의 세포를 분리하여 요도 상피 또는 기질 구획의 단일 세포에 대한 형광 면역염색을 수행하여 유세포분석을 수행합니다. 튜브 내 부피를 4mL로 보충하고, PBS 1배를 넣으세요.
   참고: 유세포측법으로 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 샘플당 최소 50,000개의 세포를 권장합니다.
2. 스윙잉 버킷 로터를 사용해 셀 현탁액을 500 x g 에서 4 °C에서 5분간 회전시킵니다.
3. 상청액을 버리고 펠릿을 1x PBS 50 μL에 재현탁합니다.
4. 세포 현탁액에 2x 고스트 염료 바이올렛 450(1 μL 고스트 염료 1 μL 1x PBS 500 μL)을 첨가하면 100 μL 1x 고스트 염료 용액을 얻습니다.
   참고: 고스트 다이 V450은 유세포 분석에서 생존 가능한 세포와 비생존 세포를 구별하는 데 사용할 수 있는 아민 반응성 염료입니다.
5. 세포 현탁액 100 μL당 5 μL Fc 수용체 차단액(항마우스 CD16/32)을 추가하고 실온에서 5분간 배양합니다.
   참고: 이 단계는 면역글로불린이 Fc 수용체에 결합하는 것을 차단하는 데 필요합니다.
6. 세포 현탁액을 얼음 위에 추가로 25분 정도 부양하세요.
7. 세포 현탁액을 세포 염색 완충제(1x PBS, 0.02% (w/v) 나트륨 아지드, 1% (w/v) BSA, 보충표 3 참조)를 사용하여 5mL로 희석합니다. 스윙잉 버킷 로터를 사용해 500 x g 압력으로 4°C에서 5분간 돌리세요. 상원액을 버리고 세포 펠릿을 100 μL 세포 염색 버퍼에 재현탁합니다.
   참고: 나트륨 아지드는 매우 독성이 강합니다. 피부, 눈, 옷과의 접촉을 피하세요. 취급 시 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하세요.
8. 세포 현탁액 100 μL 내에 1:20 희석 비율로 5μL 결합 1차 항체(항-CD326/EPCAM, 상피세포 표지), 항-F4/80(생쥐 대식세포 표지), 항-CD45(범면역 마커)를 첨가합니다. 세포 현탁액을 얼음 위에 30분간 부양하세요.
9. 세포 염색 버퍼를 사용해 세포 현탁액을 5mL로 희석한 후, 스윙잉 버킷 로터를 사용해 500 x g 에서 4 °C에서 5분간 회전시킵니다. 상정액을 흡인하고 세포 펠릿을 500 μL 세포 염색 버퍼에 재현탁합니다.
10. 셀 현탁액을 필터 캡 분류관에 부착한 35마이크론 나일론 메쉬 스트레이너를 통해 옮깁니다. 추가 분석이 나올 때까지 튜브를 얼음 위에 올려두세요.
11. 세포계의 초기 설정 및 성능 점검을 수행하세요.
12. 염색되지 않은 샘플과 완전히 염색된 샘플을 사용해 전압을 조절하세요. 비드 컨트롤로 보상을 수행하고 인수를 진행하세요.
    참고: 여러 형광체를 이용한 실험은 보상이 필요합니다. 필요한 보상 통제 장치를 준비하세요. 실험에 사용된 각 형광체마다 단일 염색 대조군(즉, 보상 구슬)이 필요합니다. 보정은 유세포계 소프트웨어 설정에 따라 자동으로 수행할 수 있습니다. 특정 형광체에 대해 양성과 음의 세포 집단을 구분하기 위해 FMO(형광 -1) 대조군이 권장됩니다. FMO는 통제 대상 형광체를 제외한 모든 형광체를 샘플에 포함시켜 준비합니다.
13. FMO(형광 -1) 제어를 사용해 게이트를 조정하면 샘플당 50,000개의 이벤트를 획득할 수 있습니다.

5. 요도 상피 오가노이드의 배양

참고: 마우스 요도 상피 오가노이드의 경우, 프로토콜 3절, 소화에서 단세포 현탁까지, 3.1단계부터 3.11단계까지 따라야 합니다. 단일 셀 현탁을 얻기 위해서입니다.

1. 요도 상피 세포 펠릿을 50–100 μL 오르가노이드 확장 배지에 재현탁합니다(자세한 내용은 보충표 4에 제공). 헤모세포미터로 세포 생존력과 세포 수를 측정하세요.
2. 세포 부탁액(1부분)과 컬트렉스(4부분)의 1:4 혼합물을 준비하고, 최종 농도는 25 μL에 5000 세포입니다. 12 웰 플레이트의 각 웰에 25 μL 세포 현탁액 3방울(5000 세포/방울)을 첨가합니다.
   참고: 기포를 피하려면 항상 컷오프 팁을 사용해 부드럽게 피펫을 사용하세요.
3. 플레이트를 37°C(5%_CO2) 인큐베이터에 15분간 옮겨 방울을 고체화시킵니다.
4. 방울을 웰 측면에서 부드럽게 800 μL 오가노이드 팽창 매체로 겹쳐 넣고, 판을 다시 인큐베이터로 옮깁니다.
   참고: 미디어 변경은 2일마다 필요합니다. 사용한 배지를 800 μL 신류 오가노이드 팽창 배지로 교체합니다.
5. 0일부터 6일까지 매일 역현미경으로 4배–20배 배율로 오가노이드의 이미지를 촬영합니다.

6. 요도 오르가노이드 조직학 및 면역염색

주의: 자일렌은 매우 가연성이 강한 용매입니다. 화학물질을 처리할 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 사용한 자일렌을 유기 용매 폐기물로 수집하세요. 승인된 유해 화학 폐기물 프로그램을 통해 폐기하세요. 포르말린은 독성이 있으며 피부, 눈, 호흡기 자극을 일으킵니다. 피부 접촉과 흡입은 피하세요. 화학물질을 처리할 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 기관 내 유해 화학 폐기물 처리 시스템을 통해 폐기합니다. 파라핀 블록에 요도 오가노이드를 삽입하는 프로토콜은 자궁내막 오가노이드 삽입 프로토콜에서 수정 및 최적화^{되었습니다.}

1. 오가노이드 배양 6일째에는 사용한 배지를 버리고 실온에서 1x HBSS로 오가노이드를 세척합니다. 중성 완충 포르말린 10%를 웰에 15분간 첨가합니다.
2. 고정제는 버리고 1.5mL 헤마톡실린을 웰에 10분간 넣으세요. 스테인은 버리고 1x HBSS로 두 번 세척하세요.
3. 각 웰에 3방울이 포함된 2% UltraPure 저융점 아가로스 1mL를 1x HBSS로 만든 것을 추가하고, 실온에서 15분간 굳히도록 둡니다.
4. 얇은 주걱의 평평한 끝을 사용해 아가로스를 조심스럽게 우물에서 제거하여 Cultrex 방울이 함께 떨어지도록 합니다.
5. 아가로스 디스크를 조직 카세트에 옮기고 70% 에탄올에 30분간 상온에서 지속적으로 교반하며 탈수합니다.
6. 추가 탈수는 다양한 농도와 지속 시간으로: 90% 에탄올 30분, 100% 에탄올 30분, 100% 에탄올 60분, 100% 에탄올 90분.
7. 과도한 에탄올을 제거하고 실온에서 45분간 자일렌으로 투명하게 만들면서 지속적으로 교반합니다. 자일렌 제거 과정을 60분 동안 반복하세요.
8. 과도한 자일렌을 제거한 후 밤새 침투하는 파라핀 왁스(65 °C)로 옮깁니다.
9. 금속 몰드 바닥에 얇은 임베딩 왁스를 바르고 아가로스 디스크를 그 위에 올려놓으세요. 슬라이드 워머에서 몰드를 제거하고, 카세트 바닥 슬랫에 박힌 왁스를 빠르게 덧씌우세요. 실온에서 고체화시키세요.
10. 미세토름에서 오가노이드 파라핀 블록을 절단하여 5μm 절편을 얻습니다. 양전하를 띤 슬라이드에 섹션을 배치하세요.
11. 헤마톡실린-에오신 염색
    1. 슬라이드를 60°C에서 구운 후 자일렌으로 탈파라핀 후 일련의 에탄올 세척(자일렌 1분, 100% 에탄올 1분, 95% 에탄올 1분, 75% 에탄올 1분) 과정을 통해 재수화합니다
    2. 슬라이드를 수돗물에 씻고 Gill's Hematoxylin No. 2와 함께 3분간 배양하세요. 슬라이드를 수돗물 아래에 놓아 파란색을 발현하세요.
    3. 95% 에탄올에 1분간 슬라이드하고, 이어서 0.25% 에탄올 용액에 1분간 슬라이드합니다. 수돗물에 슬라이드를 씻어 물이 맑아질 때까지 하세요.
    4. 탈수 슬라이드(95% 에탄올 1분, 100% 에탄올 1분)를 제거한 후 자일렌(1분)으로 투명한 후 빠르게 경화되는 마운팅 매체로 마운팅합니다.
12. 파라핀 절편의 면역 염색
    1. 5 μm 파라핀 조각을 하이브리다이제이션 오븐에서 60 °C에서 1–2시간 동안 구운다.
    2. 왁스를 제거하려면 슬라이드 스테인 병에 자일렌에 6분간 담가서 슬라이드합니다.
    3. 증류수에 100%, 95%, 75% 에탄올을 각각 6분씩 재수화하세요. 그 후 증류수를 5분간 세척하세요.
    4. 0.01M 구연산(증류수) 항원 추출액이 담긴 사각형 파이렉스 접시에 슬라이드를 넣고, 접시를 랩으로 덮습니다. 전자레인지로 고출력 20분간 항원 회수를 수행하세요.
    5. 차갑고 미지근하게 20분간 두고, PBS에 슬라이드를 5분간 세척하세요. 조직 절편 주위에 소수성 장벽을 그려 상온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 말 차단 완충제를 1시간 동안 추가하세요(말 차단 완충제 준비는 보충 표 5 참조).
    6. 적절한 희석 비율(1:100–1:200)으로 1차 항체를 첨가하여 말 차단 완충제에 1차 항체 용액을 준비합니다. 각 절면에 1차 항체 용액 100 μL을 추가하세요. 미끄럼틀을 4°C에서 부드럽게 흔들며 밤새 부화시킵니다.
       참고: 오가노이드는 Keratin 5/KRT5(기저상피 표지자), P63(기저 상피 표지자), KRT4(중간/기저부 상피 표지자), KRT13(중간/기저 상피 표지자)에 대한 항체로 면역염색되었습니다.
    7. 하룻밤 부화 후에는 PBS에서 4 x 5분 동안 실온에서 부드럽게 흔들며 세척합니다.
       참고: 이후 모든 단계는 실온의 빛이 차단된 상자 안에서 수행되어야 합니다.
    8. 말 차단 버퍼에 2차 항체 용액을 준비하고, 1:500 희석된 형광 표지 2차 항체를 첨가합니다. 슬라이드를 1시간 동안 실온에서 부드럽게 흔들며 부드럽게 부풀어 넣으세요.
    9. PBS에서 실온에서 4분, 5분씩 부드럽게 흔들며 세척하세요.
       참고: 선택 사항: 자동 형광 신호를 소광하기 위해 자가형광 소광 키트를 사용하세요.
    10. 300 nM DAPI 용액과 함께 5분간 부드럽게 흔들며 배양하세요. PBS에 실온에서 2분씩 5분씩 부드럽게 흔들며 세척하세요.
    11. 페이드 방지 마운팅 용액(90% 글리세롤, 0.2% n-프로필 갈레이트 1x PBS)으로 마운트합니다. 광시각 형광 현미경으로 단면을 촬영하는 것.
        참고: 각 형광체의 카메라 노출 설정은 픽셀 포화를 피하면서 신호 대 잡음비를 극대화하도록 조정해야 합니다. 특정 세션에서 염색된 오가노이드를 촬영할 때도 동일한 노출 설정을 사용하세요.

7. 분리된 요도 상피 시트의 전면 면역염색

참고: 전체 면역 염색의 경우, 프로토콜 2절, 요도 상피 조직 분리 단계(2.1단계부터 2.12단계까지)를 따르십시오. 요도 상피 시트를 얻기 위해서입니다.

1. 상피 조직을 24웰 조직 배양 접시의 웰에 조심스럽게 옮기세요. 이 배양 접시에는 10% 중성 완축 포르말린 500 μL가 들어 있습니다. 플레이트 뚜껑을 파라핀으로 밀봉한 후 4°C에서 20분간 로커 위에 키웁니다.
   참고: 상피 조직 손실을 방지하기 위해 모든 단계를 같은 우물에서 수행하세요.
2. 우물에서 포르말린을 조심스럽게 흡입하세요. 1x PBS 500 μL 세척을 수행하고 실온에서 로커 위에서 5분간 배양합니다. 같은 세척 과정을 다시 반복하세요.
3. 1x PBS + 1% Triton X-100을 포함한 투과화 용액 500 μL을 우물에 추가합니다. 플레이트 뚜껑을 파라필름으로 밀봉하고, 4°C에서 2시간 동안 부드럽게 흔들며 배양하세요.
4. 우물에서 투과화 용액을 조심스럽게 흡입하세요.
5. 500 μL 말 차단 버퍼에 조직을 배양하여 추가로 1% Triton X-100을 포함하여 차단을 수행합니다(말 차단 버퍼 레시피는 보충표 5에 제공됨). 접시 뚜껑을 파라필름으로 밀봉하고 4°C에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 배양하세요.
6. 적절한 희석(1:100–1:200)으로 1차 항체를 첨가하여 추가로 1% Triton X-100을 포함한 말 차단 버퍼에 1차 항체 용액을 준비합니다. 흡입 차단액을 흡입하고 1차 항체 용액 500 μL을 추가합니다: 항-CDH1(상피세포 마커)과 항-F4/80(쥐 대식세포 마커). 뚜껑을 파라필름으로 밀봉하고 4°C에서 48–72시간 동안 부드럽게 흔들며 배양하세요.
7. 1차 항체 용액을 조심스럽게 흡인하고, 1x PBS로 30분씩 실온에서 30분씩 부드럽게 흔들며 세척하세요.
8. 적절한 희석(1:500)으로 2차 항체를 첨가하여 말 차단 버퍼에 1% Triton X-100을 추가하여 2차 항체 용액을 준비합니다.
9. 웰에 2차 항체 용액 500 μL을 추가하고 알루미늄 호일로 덮은 후, 락커 위에서 실온에서 4–6시간 배양합니다.
10. 2차 항체 용액을 조심스럽게 흡입한 후 상온에서 PBS 1배로 30분씩 3회 세척하세요.
    참고: DAPI 염색은 희석된 DAPI 정액(최종 농도 300 nM)으로 실온에서 10분간 조직을 배양하여 수행할 수 있습니다. 휴지를 상온에서 로커 위에서 1회 PBS(2회 5분)로 세척하세요.
11. 상피 조직을 유리 슬라이드나 영상 접시에 조심스럽게 옮기고, 페이드 방지 마운팅 용액(90% 글리세롤, 0.2% n-프로필 갈레이트 1x PBS)을 첨가하세요.
12. 형광 현미경으로 조직을 영상 분석하는 거야.
    참고: 샘플의 두께를 고려할 때, 저자들은 광학 절단이 가능한 형광 현미경에서의 영상 촬영을 권장합니다. 이 연구에서 저자들은 광시야 형광현미경과 아포톰 광학 단면을 사용하여 초점이 맞지 않은 빛을 제거하고 z-스택을 얻었습니다. 상피 관련 대식세포의 수지상 돌출을 시각화하기 위해 이미지 z-스택을 얻었습니다.

결과

성체 암컷 쥐 요도 해리 및 채취

이 연구의 첫 번째 부분에서 저자들은 암컷 쥐 요도 해리에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 복측 질벽에 부착하고 치골 결합 아래에 위치해 있기 때문에, 여기서 제시된 방법은 여성 전체 요도를 깔끔하게 해부할 수 있게 합니다(그림 1).

요도 상피 조직 분리 및 단세포 분리균의 유동 세포분석

트립신 소화는 요도의 상피 내막을 주변 기질과 쉽게 분리시킵니다. 분리 후 기질 조직보다 투명도가 높은 상피 시트를 관찰할 수 있다(그림 2). 분리된 상피 시트는 효소 소화 시 단일 세포 현탁물을 생성했다. 요도 상피에서 분리된 단일 세포는 혈구계에서 트리판 블루 배제(그림 2L)와 생존성 염료를 이용한 유동 세포검사(그림 3, 보충 파일 1)를 통해 일관되게 높은 생존율(>80%)을 보였습니다.

저자들은 요도 상피의 단일 세포 현탁액에서 상피세포 풍부도를 평가하기 위해 유세포검사를 수행하였습니다. 세포 생존 가능성을 확인하기 위해 세포 현탁액에 아민 반응성 고스트 염료 V450이라는 생사/사망 마커로 염색했습니다. 저자들은 생사/사망 마커로 볼 때 세포 생존율이 >80%라는 일관된 관찰을 보았습니다. 생사/사망 마커는 유량 분석 중 잔해와 죽은 세포를 차단할 수 있게 했습니다. 이들은 상피세포 마커(CD326/EPCAM), 대식세포 마커(F4/80), 면역세포 마커(CD45)로 샘플을 염색하여 이 방법으로 분리된 세포의 조성을 기록했습니다. 유동 세포검사 결과, 저자들은 암컷 쥐의 요도 상피에서 농축된 상피세포 집단을 분리했다. 두 독립 실험 모두에서 그룹은 게이팅 후 80–90%의 EPCAM 양성 상피세포를 달성했습니다. 저자들은 또한 상피 제제에서 CD45+ 면역 세포의 ~1.30%를 관찰했습니다. 상피 내막과 관련된 대식세포는 상피 구획에서 생세포의 ~1.18%를 차지했습니다. 상피 시트에서 단일 세포 현탁물에 대한 유세포 분석 결과, 기질 오염은 5–6%로 최소한으로 나타나며, 이는 이전 연구에 따르면 주로 혈관 내피 때문이라고 합니다⁵. 보충 파일 1 은 상피 및 기질 구획에서 단일 세포 제제에 대한 유세포 검사 결과를 보여줍니다. 상피 구획에서 분리된 상피세포의 80–90% 농축과 비교하면, 기질 구획은 요도 내강에서 주변 기질로 뻗어나가는 짧은 관과 선원 상피에서 나오는 상피세포의 40–50%도 보였다(그림 3, 보충 파일 1).

요도 상피 오가노이드 배양, 조직학 및 면역염색

저자들은 또한 요도에서 분리된 단일 상피세포가 생존 가능하며 3D 기질 내에서 오르가노이드를 형성할 수 있음을 보여주었고, 단일 요도 상피 세포에서 배양 6일째까지 오르가노이드 성장을 관찰했습니다(그림 4B–G). 그들은 오가노이드의 조직학을 관찰하기 위해 헤마톡실린-에오신 염색(H&E)을 수행했습니다(그림 4H–J). 저자들은 요도 상피 오가노이드의 두 가지 뚜렷한 형태를 관찰했는데, 하나는 크고 속이 빈 형태였으며, 다른 하나는 작고 단단한 형태였다. 두 경우 모두 오가노이드는 여성 요도 상피 내막에서 발현된 층화되고 재구성된 마커였으며, 여기에는 기저층을 나타내는 KRT5와 P63, 기저부/중간 세포층을 표지하는 KRT4와 KRT13이 포함됩니다(그림 4K–N), 보조 그림 1). 근위 요도와 원위 요도 간의 오가노이드 형성 능력 차이를 조사하였다. 근위 요도에서 생성된 오가노이드는 속이 빈 오가노이드 비율이 더 높았고, 원위 요도에서 생성된 오가노이드는 고체 구를 형성했다(그림 4O–P). 또한, 요도의 근위부와 원위 부위에서 분리된 상피세포에서 오가노이드 형성 효율성의 차이도 관찰했습니다. 원위 요도 상피는 동일한 초기 씨앗 밀도(5000 세포/방울)를 가진 근위 요도 상피보다 더 높은 효율로 오가노이드를 형성했다(그림 4Q–S).

분리된 요도 상피 시트의 전면 면역 염색

연구진은 또한 암컷 쥐 요도 상피 시트의 전면 염색을 위한 최적화된 방법을 제시합니다. 여기서 그들은 상피 시트에 두 가지 마커로 염색했는데, 대식세포는 F4/80, 상피 세포-세포 접합부는 E-cadherin/CDH1이다(그림 5). 조직은 Apotome 3 광학 절면을 사용한 자이스 Axio Observer 7 현미경으로 촬영되었습니다. 상피 시트는 CDH1 항체로 강한 표지가 나타납니다. F4/80에 대한 항체로 표지한 요도 상피의 전면 제제 결과, 대식세포가 상피 내막에 수상돌기의 아버(arbor)를 형성하는 것이 확인되었습니다. 대식세포는 요도의 상피세포 사이에 수지상 돌기를 전달하는 모습을 관찰할 수 있습니다. 전반적으로 이 결과는 암컷 쥐 요도의 상피 내막 연구에 여기서 설명된 프로토콜의 유용성을 입증합니다.

그림 1: 여성 요도 채취를 위한 쥐 해부. (A) 쥐를 누운 자세로 눕히고 복부에 70% EtOH를 뿌립니다. (B–C) 복부를 피부를 들어 올리고 수직 절개를 합니다. (D) 지방과 결합 조직을 다듬어 (검은색 화살표) 치골 결합부에 연결된 나비 모양의 치골을 노출시킵니다. (E) 치골 결합을 절단하세요. (F) 치골을 제거하면 요도가 방광에서 아래로 뻗어 있는 것을 볼 수 있습니다(검은색 점선으로 둘러싸여). (G) 겸자로 방광을 부드럽게 당겨. 요도는 가느다란 붉은 관으로 뚜렷하게 보입니다. (H–I) 방광을 몸통에서 위로 당겨. 방광에 장력을 가해 요도와 복측 질벽을 분리하세요. 요도와 질 벽 사이에 가위를 넣어 요로와 생식기를 분리하세요. (조-케이) 요도의 원위 끝을 피부에 붙어 분리하세요. (왼쪽) 해부된 암컷 쥐 하부 요로(FLUT) 이미지, 방광과 요도를 보여줌. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 요도 상피 분리 및 단세포 현탁액 준비. (A) 요도의 상피 및 기질 구획의 효소 소화 및 기계적 분리 후 단일 세포 소화를 나타내는 도식. (B) 여성 하부 요로의 과분한 지방을 제거한다. (C–F) 요도를 방광 목 부위에서 잘라내어 요도와 방광을 분리하세요. 그 다음 가위로 요도를 두 반으로 자릅니다. (G) 100마이크론 필터를 통과시켜 1x HBSS 용액으로 요도 조각을 세척합니다. (H) 요도 조직 조각을 1% 트립신 용액에 옮긴다. 냉장실에서 샘플 로테이터로 배양하세요. MgCl₂와 DNase I를 같은 튜브에 추가하세요. 샘플 회전기 위에 37°C 하이브리다이제이션 오븐에서 배양합니다. (I–J) 요도 조각의 길이를 따라 가는 겸자로 부드럽게 압박하여 상피를 분리합니다. (K) 조직을 가위로 작은 조각으로 잘게 만듭니다. 다진 상피 조직을 Accutase 소화액에 옮기고, 샘플 회전기의 하이브리다이제이션 오븐에서 37°C에서 배양합니다. (L) 상피세포를 세고 트라이판 블루와 혈구계를 이용해 생존 가능성을 평가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 요도 상피 및 기질 구획에서의 단일 세포 현탁액을 평가하는 유세포 검사. 유세포검사는 모임 요도(A) 상피 및 (B) 기질 구획의 단일 세포 제제에 대해 수행되었습니다. 살아있는 세포는 고스트 다이 V450으로 염색된 죽은 세포를 차단하기 위해 게이트가 설치되었습니다. 생세포는 CD45(범면역 표지자), CD326/EPCAM(범상피 표지자), F4/80(쥐 대식세포 표지자) 발현을 평가하였다. 데이터는 5–6마리의 마우스 풀을 대상으로 한 두 개의 독립 실험을 대표하여 상피 및 기질 샘플을 생성한 것입니다. 약어; SSC-A = 측면 산란 피크 면적; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; APC = 알로피코시아닌; PE = 피코에리트린. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 요도 상피 오가노이드의 조직학 및 면역 염색. (A) 요도 상피 오가노이드 생성 워크플로우를 보여주는 도식. (B–G) 요도 상피 오가노이드(UEO)의 대표적인 밝시야 현미사진으로, 시험관 내 다양한 날에 단일 세포에서 생성되었습니다. 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색된 (H) 속이 빈 요도 상피 오가노이드(UEO)와 (I) 고체 요도 상피 오가노이드(UEO)의 대표적인 밝시야 이미지입니다. (J) 세 개의 독립적인 실험에서 생성된 오가노이드 유형의 정량화. 오차 바는 평균의 표준오차를 나타냅니다. (K) 속이 빈 요도 상피 기관기관(UEO)과 (L) 고체 요도 상피 기관기(UEO)의 대표 이미지로, KRT13(기저 상피 표지자), KRT5(기저 상피 표지자), P63(기저 상피 표지자)으로 면역염색됨. 단일 형광 채널을 묘사한 이미지는 K', K'', K', L'', L', L'로 표현되어 있습니다. (M) 속이 빈 요도 상피 기체 기질체(UEO)의 대표 이미지로, KRT4(기저 상피 표지자)와 KRT5(기저 상피 표지자)로 면역염색됨. 단일 형광 채널을 묘사한 이미지는 M', M'', N' 그리고 N"으로 표현되어 있습니다. (O) 근위 및 원위 요도 해리 도식. (P) 두 개의 독립적인 실험을 통해 근위 및 원위 요도에서 생성된 오가노이드 유형의 정량화. 6일차 요도 상피 유기체(UEO)의 대표적인 밝시야 현미경사진으로, (Q) 근위 요도와 (R) 원위 요도에서 분리된 상피에서 생성되었습니다. 완전한 요도에서 생성된 오가노이드 데이터는 각 실험당 3–5마리의 쥐 풀을 대상으로 수행된 3개의 독립 실험을 대표합니다. (S) 근위 및 원위 요도에서 생성된 오르가노이드 데이터는 3–4마리의 마우스 풀을 대상으로 한 두 개의 독립 실험을 대표합니다. 핵은 DAPI(파란색)로 표기되어 있습니다. (스케일 바, 100 μM). 도면은 BioRender와 Adobe Illustrator로 작성했습니다. BioRender로 제작되었습니다. 비노이 조셉, D. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 요도 상피 시트의 전면 면역염색. (A) 성체 암컷 쥐 요도의 10마이크론 냉동 절편을 최적의 절단 매체에 사용한 것으로, 마우스 대식세포 표지 F4/80(빨간색)과 상피 단백질 E-cadherin/CDH1(녹색)의 면역 염색 관찰. (A')는 (A) 내석 시점에서 확대된 것을 나타냅니다. (B) 분리된 요도 상피 시트의 전면 착색 단계를 보여주는 도식도. 분리된 암컷 마우스 요도 상피 내막에 대해 전면 면역 염색을 수행했으며, 이는 쥐 대식세포 표지 F4/80(빨간색)과 상피 단백질 E-cadherin/CDH1(녹색)에 대한 항체를 사용하였습니다. (C) 병합된 뷰의 대표 이미지. (D) 대식세포 조직을 보여주는 붉은 채널의 직교 최대 강도 투영. (E–F) 상피와 관련된 대식세포를 확대하여 보았습니다. 흰색 스케일 바, 50 μM. 회색 스케일 바, 500 μM. 데이터는 4–5마리의 쥐 풀에서 수행된 두 개의 독립 실험을 대표합니다. 도면은 BioRender와 Adobe Illustrator로 작성되었습니다. BioRender로 제작되었습니다. 비노이 조셉, D. (2026) https://BioRender.com/tjh9opk 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 1: HBSS 1회 제제(Ca, Mg 없음).이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 2: 1x sHBSSa 및 1% 트립신 용액 제제.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 3: 셀/유동 염색 완충제 준비.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 4: 요도 상피 오가노이드용 오르가노이드 확장 배지 준비.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 표 5: 말 차단 완충제 준비.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 1: 요도 상피 및 기질 구획에서 수행된 두 독립 실험의 단일 세포에 대한 유세포 측정 실험 세포 수.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 1: 성체 암컷 쥐의 요도 상피와 요도 상피 오가노이드 비교. (A) 성체 암컷 쥐의 요도 상피, (B) 속이 빈 요도 상피 오가노이드, (C) KRT13(기저 상피 마커), KRT5(기저 상피 마커), P63(기저 상피 마커)로 면역염색된 고체 요도 상피 오가노이드(UEO)의 대표 이미지입니다. 단일 형광 채널을 묘사한 이미지는 A', A'', A''', B', B', B'', B'', C', C' 그리고 C'''에 표시되어 있습니다. (D) 성체 암컷 쥐의 요도 상피, (E) 속이 빈 요도 상피 오가노이드, (F) KRT4(기저 상피 마커)와 KRT5(기저 상피 마커)로 면역염색된 고체 요도 상피 오가노이드(UEO)의 대표 이미지. 단일 형광 채널을 묘사한 이미지는 D', D'', E'', E', F' 그리고 F"로 표현되어 있습니다. 3개의 독립 실험을 대표하는 데이터로, 각 실험마다 3–4마리의 쥐 풀을 사용했습니다. 핵은 DAPI(파란색)로 표기되어 있습니다. (스케일 바, 100 μM). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

체내 상피 장벽은 숙주 방어에 매우 중요합니다. 이들은 여러 상피 세포 유형과 관련된 거주 면역 세포를 포함하는 특수한 구획입니다. 상피 장벽은 발달 시간에 따라 변화하며, 미생물군이나 환경 노출에 반응하여 숙주 방어 유전자 발현을 획득합니다. 상피 완전성이나 유전자 발현의 결함은 숙주 방어에 영향을 줄 수 있습니다¹⁵. 전사체 서명을 이해하고 세포 간 접촉과 상피 완전성을 조사하기 위해서는 상피 조직을 단독으로 연구하는 것이 필수적입니다. 현재까지 암컷 쥐로부터 요도 상피 조직을 분리하는 데 최적화된 방법은 자세히 기술된 바 없습니다. 방광 상피는 기계적 분리만으로 분리할^{수 있지만,} 요도 상피는 요도의 기질 관 내에 존재하며, 상피 조직을 분리하기 위해 효소적 분리와 기계적 분리의 조합이 필요합니다.

여기서 저자들은 암컷 쥐의 요도 내강에서 상피 시트를 분리하는 최적화된 방법을 제시합니다. 이 방법은 유세포분석, 오가노이드 배양, 면역염색과 같은 후속 응용을 위해 요도 상피 세포의 고생존율 단일 세포 현탁액을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법과 단일 세포 RNA 시퀀싱 워크플로우의 호환성은 같은^{그룹 5}에 의해 이전에 입증된 바 있습니다. 수정과 추가 최적화를 통해 여기서 제시된 프로토콜은 후속 응용을 위해 다른 관 기관에서 상피 조직을 추출하는 데 적응할 수 있습니다.

프로토콜의 핵심 단계는 성체 암컷 쥐의 전장 요도를 신중하게 해부하는 것으로, 이를 통해 근위축과 원위 축을 따라 지역적 차이를 연구할 수 있습니다. 이후 프로토콜은 부드러운 효소 소화를 사용하여 요도의 상피 내막을 주변 기질에서 느슨하게 만듭니다. 효소 소화는 요도관을 겸자 사이에 부드럽게 눌러 상피 조직을 해제하여 기계적 분리를 가능하게 합니다. 연구진은 면역염색 또는 하위 단일 세포 분리를 위한 시트로서 높은 생존율(> 80%)으로 요도 상피를 분리할 수 있도록 트립신 소화 시기를 신중히 최적화했습니다(그림 3, 보조 파일 1). 요도 상피의 단일 세포 소화 결과, 요도 상피 분리물의 80–90%가 발견되었습니다. 이전 연구에 따르면, 이 제제물의 비상피세포는 주로 상피 관련 면역 세포와 혈관 내피⁵로 구성되어 있음을 확인했습니다. 현재 단일 세포 분리 방법은 소게이지 바늘 흡인을 통한 기계적 교란과 부드러운 용해를 통한 적혈구 제거를 통해 유세포 분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱과 같은 후속 응용 분야에 고품질 단일 세포 현탁물을 제공합니다.

결과는 이 방법이 구획 특이적 면역 세포를 풍부하게 만드는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다(그림 3). 근위 요도와 원위 요도에서 분리된 상피도 별도로 연구할 수 있습니다. 또한, 저자들은 분리된 상피세포가 이전에 기술되지 않은 요도 오가노이드 생성에 사용될 수 있음을 입증했습니다(그림 4). 이 결과는 여성 요도에서 오가노이드 생성 능력의 지역적 변동성도 보여줍니다. 저자의 최근 연구들은 암컷 쥐 요도에서 근위-원위 유전자 발현과 면역 세포 조직의 차이를^{보여주었으}나, 현재 연구에서는 근위 요도 상피세포가 원위 요도에서 분리된 상피보다 적은 수의 오가노이드를 형성한다는 것을 보여줍니다(그림 4). 근위 요도와 원위 요도로 공간적으로 구분하는 것의 한계 중 하나는 해부 시점에 이 두 영역을 구분할 수 있는 해부학적 기준이 없다는 점입니다. 이 연구에서 저자들은 요도 길이를 절반으로 나누어 근위 구획과 원위 구획을 구했습니다. 여기서 설명한 상피 분리 방법은 근위 요도 상피와 원위 요도 상피 간 유전자 발현과 세포 구성 차이를 더 자세히 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.

여기서 제시된 최적화된 프로토콜은 접근 가능하고 재현 가능하지만, 일부 단계는 연습과 신중한 보정이 필요합니다. 특히, 여기 제시된 절리 방법은 요도 전체를 보존하면서 치골 결합 아래에서 요도관을 신중하게 추출해야 합니다. 또한, 박리 후에는 배측 요도벽에 부착된 질 조직을 반드시 제거해야 합니다. 방광 목 주변에 존재하는 지방은 단세포 RNA 시퀀싱과 같은 후속 적용 시 지방세포 오염을 줄이기 위해 신중히 제거해야 합니다. 또한, 효소 배치마다 트립신 소화를 신중하게 최적화하여 일관된 소화를 보장해야 합니다. 조직의 과소화는 세포 생존력 저하로 이어질 수 있습니다. 저자들은 4 °C와 37 °C에서 인큐베이션 단계에 15–30분 정도의 시간 창을 제시하여 트립신 소화 시간을 신중하게 최적화했습니다. 이 방법은 사용되는 효소 배치에 따라 추가로 최적화할 수 있습니다. 효율적인 단일 세포 소화를 위해 조직을 작은 조각으로 잘게 만드는 것도 매우 중요합니다. 저자들은 부드러운 해리를 유도하여 추가 단일 세포 소화를 위해 Accutase를 사용했습니다. 세포 생존력이 감소할 경우, Accutase 배양 시간을 단축할 수 있습니다. 또한, 저자들은 세포 생존을 높이기 위해 아큐타제 소화 혼합물에 Rock 억제제를 포함시켰습니다. DNase 소화는 죽은 세포와 죽어가는 세포에서 방출된 세포외 DNA를 소화하여 세포 응집을 줄이기 위해 권장됩니다. 저자들은 또한 적혈구 오염을 줄이기 위해 적혈구 용해 버퍼 사용을 권장하며, 이는 유세포 분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱과 같은 후속 결과를 혼란스럽게 할 수 있습니다.

여기서 제시된 상피 분리 방법의 한계 중 하나는 암컷 마우스 요도에 최적화되어 있다는 점입니다. 수컷 쥐 요도는 해부학적으로 더 복잡하며, 상피 구조가 근위부에서 원위 요도로 변합니다. 또한, 이 방법은 요도 내강을 덮고 있는 상피세포만 분리할 수 있습니다. 요도 분비선은 짧은 상피관을 통해 요도 내강에 연결되어 있어 기질 조직에 박혀 있어 분리할 수 없습니다. 대신, 요도 상피 내피를 분리한 후 남은 기질 구획에서 이러한 상피 구조가 풍부해집니다(그림 3).

이러한 한계에도 불구하고, 이 방법은 요도 상피 구조에 대한 중요한 통찰을 제공했으며, 상피 관련 대식세포의 현장 시각화를 통해 상피 관련 면역 세포에 대한 추가 연구를 가능하게 할 것입니다. 이 방법은 요도 상피와 관련^{면역 세포의} 세포 이질성을 식별하기 위한 단일 세포 RNA 시퀀싱 워크플로우와 이미 호환되는 것으로 입증되었습니다. 또한, 근위 및 원위 요도에서 상피를 분리하는 능력은 요도의 공간적 차이를 이해하는 연구를 가능하게 할 것입니다. 특히, 상피세포 소화 방법은 요도 상피 오가노이드를 생성할 수 있는 생존 가능한 단일 세포를 생성하여 숙주-병원체 상호작용 및 요도의 상피 생물학 연구에 유용하게 활용합니다. 전반적으로 이러한 방법들은 요도 상피 생물학에 대한 더 깊은 연구를 가능하게 하는 도구 키트를 보완합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
#5 fine forceps
10% 중성 완충 포르말린	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12웰 플레이트	Corning	3513
30-마이크론 사전 분리 필터	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		그림 패널 만들기
Adobe Photoshop	Adobe		그림 패널 만들기
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
항생제/항진균제	Sigma Aldrich	A5955
Anti-CD326 (EpCAM)	Invitrogen	17-5791-82	1:20 희석, 유세포 분석용
Anti-CD45	Tonbo	35-0451-U100	1:20 희석, 유세포 분석용
Anti-CDH1 (Rabbit)	Cell Signalling Technology	3195S	1:200 희석
Anti-F4/80	Tonbo	50-4801-U100	1:20 희석, 유세포 분석용
Anti-F4/80 (Rat)	Invitrogen	14-4801-82	1:200 희석
Anti-Keratin 13 (Rabbit)	Abcam	ab92551	1:200 희석
Anti-Keratin 4 (Mouse)	Abcam	ab9004	1:200 희석
Anti-Keratin 5 (Chicken)	Biolegend	905904	1:800 희석
Anti-Keratin 5 (Rabbit)	Cell Signaling Technology	71536	1:200 희석
Anti-p63 (Mouse)	Biocare medical	CM163A	1:200 희석
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27 보충제	Invitrogen	12587010
소 혈청 알부민 (BSA), 분획 V	Genetix	PG-2330
CD-1 마우스	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI 용액	Sigma Aldrich	D5942
D-글루코스	Qualigens	Q15405
디메틸 설포옥사이드 (DMSO)	Himedia	MB058
디-나트륨 수소 오르토인산염 (Na2HPO4)	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
Donkey anti-Chicken IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	703-545-155	1:500 희석
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	715-545-151	1:500 희석
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	715-585-151	1:500 희석
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	711-585-152	1:500 희석
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	711-605-152	1:500 희석
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	1:500 희석
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	712-585-153	1:500 희석
EGF	PeproTech	AF-315-09
Eosin	Himedia	GRM938
에탄올	Supelco	1.00983
Eukitt 실장 매체	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
필터 캡 분류 튜브	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
무수 글리세롤	Merck	DA1P692899
헤마톡실린	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
말혈청	Gibco	26050088
Kaluza 분석	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	유세포 분석 데이터 분석
염화 마그네슘 (MgCl2)	Qualigens	Q15535
Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32 )	Biolegend	101320
N-아세틸 시스테인	Sigma Aldrich	A9165
니코틴아미드	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
n-프로필 갈레이트	Sigma Aldrich	P31