치과 줄기세포 유래 엑소좀의 세포 통과 간 분리 및 특성 분석

요약

이 프로토콜은 치과 치수 줄기세포(DPSC) 유래 엑소좀을 여러 통로에서 분리하고 특성화하는 표준화된 워크플로우를 개략하여 재생 응용을 위한 엑소좀 품질 및 기능 활성의 재현 가능 평가를 가능하게 합니다.

초록

치과 치수 줄기세포(DPSC)는 접근하기 쉽고 임상적으로 중요한 간엽 줄기세포의 공급원이며, 이들의 유래 엑소좀은 조직 공학과 재생 의학 분야에서 세포 없는 응용 분야에서 유망한 생체 활성 소포로 부상하고 있습니다. 그러나 DPSC 유래 엑소좀을 분리하고 기능적으로 검증하는 재현 가능하고 표준화된 방법은 여전히 제한적이며, 특히 퍼세이지 간 세포 확장 과정에서 도입되는 변이성 측면에서 그렇습니다. 여기서는 DPSC 조건 배지에서 엑소좀을 분리하고 정제하는 포괄적이고 표준화된 키트 기반 워크플로우를 설명하며, 이는 일상적인 실험실 실무와 호환됩니다. 이 방법은 일반적으로 사용되는 기법을 사용하여 형태학적, 분자적, 기능적 특성 분석에 적합한 온전한 소포를 일관되게 회수할 수 있게 합니다. 외국체 정체성은 형태, 크기 분포, 마커 발현을 기반으로 평가되며, 생물학적 활성은 정의된 시험관 내 항염증 검사를 통해 평가됩니다. 통과 관련 효과를 조사하기 위해, 다양한 DPSC 통과에서 유래한 엑소좀을 이 기능적 측정값을 사용하여 비교하여 세포 확장 시 일관성을 평가하는 실질적인 틀을 제공합니다. 분리, 정제, 특성 분석, 기능 검증을 하나의 워크플로우로 통합함으로써, 이 프로토콜은 생체재료 연구 및 재생 응용 분야에서 기능적으로 검증된 DPSC 유래 엑소좀을 생성하는 재현 가능하고 확장 가능한 접근법을 제공합니다.

서론

중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀은 세포 간 소통의 중요한 매개체 역할을 하며, 조직공학과 재생의학 분야에서 상당한 치료 잠재력을 보여줍니다. 엑소좀은 직경 30–150 nm의 소포로, 생체 활성 분자를 전달하고 증식, 분화, 면역 반응 등 수용 세포의 다양한 기능을 조절할 수 있습니다^. 다양한 간엽 줄기세포(MSC) 공급원 중에서, 치과 치수 줄기세포(DPSC)는 접근성이 뛰어나고, 증식 능력이 강하며, 종양 발생 위험이 낮고, 윤리적 문제가 최소화되어 특히 주목받고 있습니다 ^3,4,5. DPSC에서 유래한 엑소좀(DPSC-Exos)은 단백질, mRNA, 마이크로RNA 등 다양한 기능적 화물을 포함하고 있어 부모 세포의 많은 생물학적 특성을 유지할 수 있습니다. 이전 연구들은 DPSC-Exos가 혈관신생, 신경 수리, 뼈 재생, 항염증 반응을 촉진할 수 있음을 입증했습니다. 조직 공학에서의 역할을 넘어, 엑소좀은 종양 발생과 암 치료에서 종양 미세환경 재형성, 약물 내성, 면역 회피에 기여하는 중요한 조절자로 점점 더 인정받고 있습니다^. MSC 유래 엑소좀은 DPSCs에서 유래하는 것을 포함해 고유한 종양 유도 능력과 면역조절 특성을 가지고 있어, 표적 항암 약물 전달이나 세포 자유 면역치료제로서 유망한 차세대 매개체로 자리매김하고 있습니다. 세포 기반 치료와 관련된 여러 한계를 우회함으로써 DPSC-Exos는^{재생 응용 분야에서} 유망한 무세포 생체 활성 성분으로 부상했습니다 7,8,9,10,11,12.

이러한 장점에도 불구하고, DPSC-Exo 연구를 재현 가능한 실험적 또는 임상용으로 전환하는 것은 여전히 도전적입니다. 주요 한계는 엑소좀 분리 및 정제를 위한 통합되고 표준화된 프로토콜의 부재입니다. 현재 사용되는 방법으로는 초원심분리¹³, 초여과, 침전, 크기 배제 크로마토그래피, 면역친화성 캡처^14,15가 있습니다. 이 방법 중 폴리머 기반 침전은 높은 처리량, 다양한 시료 부피와의 호환성, 그리고 조작 간편성 등 실용적인 장점을 제공하여 대량 샘플 수나 확장 요구사항이 필요한 연구에 적합합니다^{16, 17, 18}. 단백질 수율과 입자 대 단백질 비율에 관한 다양한 분리 방법에 대한 비교 분석은 문헌에서 널리 문서화되어^{있습니다.} 그러나 DPSC 통과 번호가 유래 엑소좀의 특성과 생물학적 활성에 미치는 영향은 충분히 다뤄지지 않아 DPSC-엑소 생산의 표준화 및 품질 관리에 중요한 공백을 나타냅니다.

이러한 기술적 한계를 해결하기 위해, 본 연구는 DPSC 조건 배지에서 엑소좀을 분리하고 정제하기 위한 표준화된 키트 기반 프로토콜을 제시합니다. 물리적·분자적 특성 분석 외에도, 프로토콜은 다양한 DPSC 통과에서 유래한 엑소좀의 항염증 활성을 평가하는 기능적 분석법을 포함하여, 엑소좀 품질과 기능의 통과 의존적 일관성을 비교 평가할 수 있게 합니다. 워크플로우는 표준 세포 배양 및 분자생물학 시설이 갖춰진 실험실에서 간단히 구현할 수 있도록 설계되었습니다. 이 도구는 실험 간 변동성을 줄이기 위해 시중에 구할 수 있는 키트에 의존하며, 다양한 실험적 요구에 맞게 쉽게 확장할 수 있습니다. 기증자 간 변이를 최소화하기 위해 DPSC는 개별 치아에서 분리되어 여러 기증자로부터 모여 확장되지 않고 독립적으로 증식됩니다. 이 프로토콜은 상처 치유, 골 조직 공학, 면역조절 연구 등 배치별 일관성이 필수적인 후속 응용을 위해 기능적으로 검증된 DPSC 유래 엑소좀을 생성하려는 연구자들에게 특히 유용합니다. 전반적으로, 조직공학 및 재생의학 연구에 사용되는 DPSC 유래 엑소좀을 생산하기 위한 실용적이고 표준화된 프레임워크를 제공합니다.

프로토콜

이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었으며, 기관 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 인간 치수 조직은 기관 윤리 지침에 따라 닝보 스토매트 병원에서 수집된 버려진 제3대금니 또는 교정 전구니에서 채취되었습니다(프로토콜 번호. NBKQYY2025LS-04; 승인일: 2025년 5월 30일). 인간 피부 조직은 기관 윤리 지침에 따라 닝보대학교 인민병원 비뇨기과에서 일상 포경수술 중 채취된 포피 샘플에서 채취되었습니다(프로토콜 번호 2024104; 승인일: 2024년 10월 30일). 샘플 채취 전에 모든 기증자 또는 그 법적 보호자로부터 서면 동의서를 받았습니다.

1. 치수 줄기세포 유래 엑소좀의 분리

1. DPSC의 분리, 배양 및 식별
   1. 샘플 채취 및 운송
      1. 교정 발치 후 18세에서 25세 기증자로부터 온전한 인간 제3대치를, 또는 교정 발치 후 12세에서 16세 기증자로부터 소어금니를 채취합니다.
      2. 즉시 발치된 치아를 미리 냉각된 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣고, 100 U/mL 페니실린-G와 100 μg/mL 스트렙토마이신을 보충합니다.
      3. 샘플을 4°C에서 실험실로 운반하고 추출 후 6시간 이내에 처리합니다.
   2. 치수 노출 및 조직 해리
      1. 70% 에탄올에 30초간 담그; 3% P/S가 포함된 1× PBS로 세 번 세척합니다(각각 30초). 멸균 가위나 메스를 사용해 치아 표면에 남아 있는 치은과 치주 조직을 조심스럽게 제거하세요.
      2. 치아를 멸균 거즈로 감싼 후, 멸균된 망치로 조심스럽게 크라운을 깨서 치수 챔버를 노출시킵니다.
      3. 상아질에서 치수 조직을 부드럽게 분리하고, 멸균 수술용 칼날로 작은 조각(<1 mm³)으로 잘게 만듭니다.
      4. 조직 조각을 2.5 mg/mL 디스파이즈 II 및 2.5 mg/mL 콜라겐제 타입 I 소화액이 담긴 1.5 mL 원심분리관에 옮깁니다.
      5. 혼합물을 37°C 인큐베이터에서 30–45분간 부드럽게 저어주며 배양하세요.
         참고: 효소 소화 기간은 치수 조직의 부피와 균질화 정도를 기준으로 결정되었습니다.
   3. 소화 종료 및 1차 세포 배양
      1. 효소 소화를 멈추려면 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 10% 태아 소 혈청(FBS)을 보조해 같은 양의 첨가를 합니다.
      2. 세포 현탁액을 200 × g에서 5분간 원심분리하여 세포와 조직 조각을 펠릿으로 분비합니다.
      3. 상원액을 버리고 펠릿을 1mL 완전 배양 배양지(α-MEM 및 20% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신)에 재현탁합니다.
      4. 재현탁된 세포와 식물 제거물을 60mm 배양 접시에 씨앗 뿌리고 최종 5mL 부피에 완전한 배양지를 추가합니다.
      5. 세포를 5% CO₂가 포함된 가습 환경에서 37°C에서 배양합니다.
   4. 세포 유지 및 아임 배양
      1. 배양지는 2-3일마다 교체하세요.
      2. 세포를 매일 모니터링하세요.
         참고: 1차 DPSC는 일반적으로 조직 이식에서 이동하여 7일에서 14일 이내에 80–90% 합류에 도달합니다.
      3. 아함배양 시에는 세포가 80–90% 합류에 도달하면 0.05% 트립신-에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 사용해 세포를 분리합니다.
         주의: 트립신은 자극 물질입니다. 장갑과 안경 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
      4. 전체 배양지(FBS 20% 포함)를 사용하여 1:3 비율로 통과 세포를 투여합니다.
      5. 2, 4, 6 통로에서 DPSC를 사용하여 모든 하류 엑소좀 분리 및 기능 분석에 활용하세요.
   5. 유세포분석을 통한 DPSC의 특성 규명
      1. 원하는 통과에서 0.05% 트립신-EDTA를 사용해 DPSC를 박리하고, 완전한 배양 배지로 중화한 후 세포 현탁액을 수집합니다.
      2. 300 × g 에서 실온에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 버리세요. 세포 펠릿을 PBS에 재현탁하고 세포 수를 세세요. 세포 밀도를 약 1×^{10 6} 세포/mL로 조절합니다.
      3. 각 유세포 측정관에 세포 현탁액 100 μL을 할당합니다. CD44, CD90, CD105, CD45, CD19, CD14에 대한 플루오로크롬 결합 항체를 1:100 희석 비율의 PBS 환경에서 4°C에서 어두운 환경에서 30분간 배양합니다.
      4. 각 튜브에 1mL의 PBS를 추가한 후 300× g에서 5 분간 원 심분리하여 세포를 세척합니다. 상청액을 조심스럽게 버리고 300–500 μL PBS에 재현탁하여 분석을 진행합니다.
      5. 각 플루오로크롬에 대해 적절한 아이소타입 대조 항체를 포함시켜 배경 보정과 게이팅을 가능하게 합니다.
      6. 선택된 형광색소에 적합한 레이저와 필터가 장착된 유세포계를 사용하여 샘플을 분석합니다. 샘플당 최소 10,000건의 사건을 수집하세요.
      7. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 첫째, 전방향 산란(FSC)과 측면 산란(SSC)을 기반으로 게이트 유효 셀을 만들어 잔해를 배제합니다. 그 다음 더블렛을 제거하기 위해 싱글렛 게이팅을 적용하세요.
      8. 형광 강도를 해당 아이소타입 대조군과 비교하여 양성 및 음수 집단을 정의하여 마커 발현을 결정합니다.
2. DPSC-엑소스의 분리 및 정제
   1. 조절 배지 준비
      1. 10cm 배양 배양 배열에서 DPSC를 70–80% 합류점까지 배양합니다.
      2. 사용한 배지를 제거한 후 세포 단층을 미리 데운 PBS로 부드럽게 두 번 세척합니다.
      3. 완전 배지 10mL에 10% 엑소좀 소모 FBS를 보충합니다.
      4. 세포 합류율이 90–100%에 도달할 때까지 37°C에서 배양을 추가로 배양합니다(이 과정은 보통 24시간을 넘습니다).
   2. 조절 매체 수집
      참고: 이후 모든 단계는 얼음 위나 4 °C 온도에서 유지하세요.
      1. 조절된 매지를 원심분리관으로 옮깁니다.
      2. 배지를 4°C, 3,000 × g에서 10분간 원심분리하여 세포와 큰 이물질을 제거합니다.
      3. 펠릿을 건드리지 않고 조심스럽게 상청액을 새 원심분리관으로 옮기세요.
      4. 상청액을 4°C, 10,000 × g에서 10분간 원심분리하여 더 작은 입자와 세포자가멸성 물체를 펠릿 처리합니다.
      5. 상청액을 0.22 μm 주사기 필터를 통해 깨끗한 50mL 원심분리관에 걸러냅니다.
      6. 정제된 배지를 즉시 처리하여 엑소좀 분리 또는 알리코트(aliquot)하여 -80 °C에 보관하세요.
         참고: 정액 조절 배지는 -80°C에서 몇 달간 보관할 수 있습니다. 반복되는 냉동-해동 사이클은 피하세요.
   3. 고분자 기반 침전을 이용한 엑소좀 분리
      1. 냉동된 정제된 미디엄은 얼음 위에 해동하세요.
      2. 얼음 위에 무균 튜브 안에서 배지를 4:1 부피 비율로 외국체 농도 용액(예: 20 mL 배지: 5 mL 용액)으로 결합합니다. 혼합물을 1분간 소용돌이로 돌려서 균질성을 유지하세요.
      3. 혼합물을 4°C에서 16–18시간 동안 교란하지 않고 두어 외국체 침전을 허용합니다.
         참고: 배화 시간은 수확량을 높이기 위해 적절히 연장할 수 있으나, 24시간을 넘지 않아야 합니다.
      4. 혼합물을 4°C, 10,000 × g에서 원심분리하여 75–80분간 엑소좀을 펠릿으로 만듭니다. 상청액을 조심스럽게 흡입하고 제거하면서 펠릿을 흔들지 마세요.
      5. 튜브를 다시 4°C, 10,000 × g에서 2분간 원심분리합니다. 피펫으로 잔여된 상정액을 제거하세요.
      6. 엑소좀 펠릿을 1x PBS에 재현탁합니다(20mL 가공 배지당 200 μL PBS 사용).
      7. 현탁액을 새로운 1.5mL 원심분리관으로 옮기고, 4°C와 12,000 × g 에서 2분간 원심분리기를 유지하며, 상청액은 외국체 입자로 농축된 상태로 유지됩니다(필요 시 반복).
   4. 엑소좀 정제
      1. 엑소좀 현탁액을 수집관에 설치된 엑소좀 정제 필터 컬럼에 적용합니다.
      2. 컬럼을 4°C, 3,000 × g 에서 10분간 원심분리합니다.
      3. 수집관 바닥에서 흐르는 액체를 모으세요. 이 액체에는 정제된 엑소좀이 들어 있습니다.
   5. 정제된 엑소좀의 저장
      1. 정제된 엑소좀 현탁액을 일회용 용량으로 분리하여 후속 실험에 적합합니다.
      2. 알리코트는 -80 °C에 보관하세요.
         참고: 알리쿼트는 반복적인 동결-해동 주기를 피하기 위해 매우 중요합니다. 이는 외국체 무결성과 생물학적 활성을 저하시킬 수 있습니다.
   6. DPSCs-Exo의 특성화 및 식별
      1. 1.2.6.2–1.2.6.6 단계에 설명된 투과 전자현미경(TEM)을 이용한 형태학적 분석을 수행합니다.
      2. 피펫을 사용해 준비된 엑소좀 현탁 샘플 10 μL를 채취한 뒤, 미리 준비된 파라필름에 떨어뜨립니다. 폼바르/탄소 코팅 구리 그리드를 필름 면이 아래로 향하게 하여 방울 위에 올려놓고 10–15분 동안 자연 흡착하도록 합니다.
      3. 여과지 스트립을 사용해 과잉 액체를 흡수하고 잠시 자연 건조시키세요.
      4. 피펫을 사용해 2% 인산화산 용액 10 μL을 채취한 후 파라필름에 떨어뜨립니다. 흡착 단계를 완료한 격자를 필름 면이 염색 용액을 향하도록 뒤집어 3–5분간 두세요.
      5. 여과지 스트립을 사용해 과도한 액체를 흡수하고, 백열등 아래에서 그리드가 건조되도록 하세요.
      6. 투과 전자현미경을 사용해 이미지를 관찰하고 포착하세요.
      7. 1.2.6.8–1.2.6.12 단계에 설명된 나노입자 추적 분석(NTA)을 통해 크기 분포 및 농도 분석을 수행합니다.
      8. 샘플 챔버를 초순수수로 세 번 헹구세요.
      9. 제조사 지침에 따라 표준 100nm 폴리스티렌 비즈를 사용해 기기를 보정하세요. 성공적인 교정 후 측정을 진행하세요.
      10. 샘플 챔버를 1× PBS로 세척하세요.
      11. 엑소좀 샘플을 1× PBS(1:500 희석)로 희석한 후 샘플 챔버에 주입하세요. 계측 소프트웨어를 사용해 입자 움직임을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다.
      12. 데이터를 수집하고 해당 분석 보고서를 생성하세요.
      13. 1.2.6.14–1.2.6.24 단계에서 설명된 서부 블롯 분석을 통해 단백질 마커를 식별합니다.
      14. 엑소좀 특이적 단백질 용해 완충제를 이용한 용해체 엑소좀 샘플을 채취하고, 비신코닉산(BCA) 분석법을 이용해 단백질 농도를 정량합니다.
      15. 용액 및 스태핑 젤을 준비하세요. 각 랭크당 단백질을 같은 양 적재하고 각 겔에 5 μL의 단백질 마커를 추가합니다.
      16. 염료 전면이 분해 겔에 도달할 때까지 80 V 일정 전압으로 전기영동을 수행한 후 120 V로 증가시키고 염료 전면이 젤 바닥에 도달할 때까지 계속합니다.
      17. 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막을 적절한 크기로 잘라내고 메탄올에 5분간 담가서 활성화시킵니다.
      18. 25 mM 트리스 염기, 192 mM 글리신, 20%(v/v) 메탄올(pH = 8.3)으로 구성된 전이 버퍼를 준비합니다. 전송 버퍼 내 모든 전달 성분을 평형으로 맞추세요.
      19. 전사 샌드위치를 음극에서 양극으로 다음 순서로 조립합니다: 스펀지 – 필터 페이퍼 – 젤 – PVDF 멤브레인 – 필터 페이퍼 – 스펀지. 기포를 제거하고 300 mA의 일정 전류로 단백질 전달을 수행합니다.
      20. 이식 후에는 0.1% Tween20(TBST)이 포함된 Tris 완충 식염수로 PVDF 막을 잠시 헹구고, 5% 무지방 우유로 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들며 차단합니다.
      21. 막을 1차 항체(예: 항-CD63 및 항-TSG101)를 5% 무지방 우유에 희석한 상태로 4°C에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 인큐브합니다. 멤브레인을 TBST로 각각 5분씩 세 번 세척하세요.
      22. 적절한 2차 항체와 함께 상온에서 30분간 인큐베이팅한 후, TBST 세척 3회(각각 5분씩)를 합니다.
      23. 신선한 전기화학발광(ECL) 작동 용액(용액 A와 B를 1:1 비율로 혼합)을 준비하고, 막에 적용한 후 화학발광 이미징 시스템을 사용해 신호를 검출합니다.

2. 인간 1차 피부 표피 각질구의 분리 및 배양

1. 샘플 채취 및 운송
   1. 닝보대학교 인민병원에서 건강한 남성 기증자로부터 포피 조직 샘플을 받아보세요.
   2. 즉시 발출한 포피 조직을 4 °C PBS에 넣고 100 U/mL 페니실린-G와 100 μg/mL 스트렙토마이신을 보충합니다.
   3. 샘플을 4°C에서 실험실로 운반하고 6시간 이내에 가공합니다.
2. 무균 준비 및 조직 분열
   1. 조직을 70% 에탄올에 30초에서 3분 정도 담가세요.
      참고: 초기 소독 시 조직 크기에 따라 침수 시간을 조정하세요.
   2. 멸균 가위나 메스를 사용해 세척된 조직 샘플에서 피하 지방과 결합 조직을 해부하고 제거하세요.
   3. 멸균된 수술용 칼날을 사용해 작은 조각(조각 크기<1 mm³)으로 갈아내세요.
      참고: 3–4개의 조직 샘플을 다지는 데 보통 15분 미만이 소요됩니다. 조직이 건조해 보인다면 다질 때 소량의 PBS를 추가하세요.
   4. 다진 조직 슬러리를 2.5 mg/mL 콜라게나제 1형과 2.5 mg/mL 디스파제 II 소화 용액이 담긴 50 mL 원심분리관에 옮깁니다. 다진 조직 조각당 10–20mL의 소화액을 추가하세요.
   5. 혼합물을 37°C 인큐베이터에서 60분간 배양하세요. 80 × g에서 부드러운 저음을 유지하거나 20분마다 손으로 강하게 저어주세요.
3. 2차 소화 및 DNase 처리
   1. 1:5 부피 비율로 0.25% 트립신-EDTA를 첨가합니다. 튜브를 37 °C에서 25분간 부드럽게 저으며 부순히 부양하세요.
      주의: 트립신은 자극 물질입니다. 장갑과 안경 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
   2. 총 소화량의 10 μL 비율로 혼합물에 DNase I 용액(10 mg/mL)을 첨가합니다. 37°C에서 5분간 부드럽게 저으며 배양하세요.
4. 소화 종료 및 1차 세포 배양
   1. 효소 소화를 멈추려면 10% FBS를 보충한 DMEM을 같은 양으로 추가하세요.
   2. 조직 조각을 분리하기 위해 약 20회 피펫을 위아래로 분쇄하여 혼합물을 완전히 분쇄합니다. 세포 현탁액을 100μm 셀 체를 통해 새로운 50mL 원심분리관으로 걸러냅니다.
   3. 세포 현탁액을 200× g에서 5 분간 원 심분리하여 세포와 조직 조각을 펠릿으로 분비합니다.
   4. 상원액을 버리고 펠릿을 1mL 완전 배양 배양지(α-MEM 및 20% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신)에 재현탁합니다.
   5. 재현탁된 세포와 이식물을 10cm 배양 접시에 씨앗 뿌리고 최종 6mL 부피에 완전한 배양지를 추가합니다.
   6. 세포를 5%_CO2가 포함된 습기 37°C에서 배양합니다.
      참고: 배양 중 최종 농도 5 μM의 Y-27632를 케라티노사이트 배양에 보충하세요.
5. 세포 유지 및 아임 배양
   1. 배양지는 2-3일마다 교체하세요.
   2. 세포를 매일 모니터링하세요.
      참고: 1차 피부 표피 각질세포는 보통 조직 외출부에서 이동하여 10-14일 내에 80-90% 합류율에 도달합니다.
   3. 아위배양의 경우, 세포가 80–90% 합류에 도달하면 0.05% 트립신-EDTA를 사용해 세포를 분리합니다.
      주의: 트립신은 자극 물질입니다. 장갑과 안경 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.

3. 다양한 통과로에서 얻은 엑소좀의 항염증 기능 기능 검증

1. 세포 시딩 및 준비
   1. 12웰 플레이트에 1.5 × 10⁵ 세포 밀도의 표피 각질세포를 씨앗으로 분사합니다. 각 웰에 1mL의 완전 배지를 추가하고 세포를 24시간 배양합니다.
   2. 세포 합류율이 약 70%에 도달하면 배지를 조심스럽게 흡인하고, 세포 단층을 미리 예열된 1× PBS로 두 번 부드럽게 세척합니다.
2. 염증 자극 및 엑소좀 치료
   1. 균열형 세포 모델을 유도하고, 염증성 사이토카인 혼합물인 "M5"(IL-1α, IL-17A, IL-22, 온코스타틴 M, TNF-α 포함, 각각 최종 농도는 10 ng/mL)로 세포를 자극합니다.
   2. 처리 그룹의 경우, 자극된 세포를 DPSC-Exos(웰당 50 μg)와 공동 배양합니다.
   3. 음성 대조군(NC) 그룹에는 엑소좀 대신 동등한 용량의 PBS를 추가하세요.
      참고: 모든 자극과 치료는 염증 신호 경로에 방해가 되지 않도록 Y-27632가 없는 배지에서 수행해야 합니다.
3. 샘플 채취 및 qRT-PCR 분석(통로 간 기능 비교)
   1. 치료 후 24시간 후 세포를 채취하고 RNA를 추출하세요.
   2. 주요 염증 지표인 IL-23A의 발현을 분석합니다.
      1. qRT-PCR을 사용하여 서로 다른 통로(P2, P4, P6)에서 유래한 외국체 처리군 간 IL-23A 발현에 대한 억제 효과를 비교하여 통과 의존적 엑소좀 기능 변화를 평가합니다.
      2. 다음 사이클링 조건을 사용하여 qRT-PCR을 수행합니다: 95 °C에서 초기 변성 3분, 95 °C에서 10초 변성 40회 사이클, 60 °C에서 어닐링/연장 30초.
      3. 증폭 특이성을 확인하기 위해 65°C에서 95°C까지 용융곡선 분석을 수행하세요.
         참고: 프라이머 서열: Human-IL-23A (앞쪽: 5'-GAAGAGGGATGAAGAGAC-3', 뒷면: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'); 인간-H36B4 (앞쪽: 5'-GCAATGTGCCAGTGTGTGT-3', 뒤면: 5'-GCCTTGACCTTTTTCAGCAAG-3')

결과

치수 줄기세포의 식별 및 특성 분석
설명된 프로토콜을 사용하여 분리한 원발치과 줄기세포(DPSC)는 시험관 내 확장 과정에서 안정적인 성장과 전형적인 간엽 형태를 보였습니다. 그림 1에서 보듯, 2, 4, 6번 통로의 DPSC는 방추형 섬유아세포 유사 세포의 균질한 집단을 보였으며, 통로 간 형태학적 차이나 자발적 분화 징후는 없었습니다. 모든 DPSC의 통과는 변이를 최소화하기 위해 동일한 조건에서 배양되었습니다.

확장된 DPSC가 이후 통과에서 간엽 줄기세포 특성을 유지하는지 확인하기 위해, 6번째 통과 세포에 대해 유세포 분석을 수행하여 시험관 내 증식 중 줄기세포 특성을 유지하기 위한 대표적인 품질 관리를 수행하였습니다. 이 세포들은 간엽 줄기세포 표지자 CD44, CD90...

토론

본 연구에서 설명된 표준화된 프로토콜은 치수 줄기세포(DPSC)의 분리, DPSC 유래 엑소좀(DPSC-Exos) 생성, 그리고 여러 세포 통로에 걸친 이 소포의 기능적 검증을 위한 재현 가능한 틀을 제공합니다. 아래의 논의는 중요한 절차적 고려사항, 최적화 전략, 방법론적 한계, 그리고 재생의학 연구와 관련해 이 워크플로우의 광범위한 관련성을 강조합니다.

이 프로토콜의 신뢰성은 조직 조달과 취급부터 시작하는 초기 단계의 엄격한 품질 관리에 달려 있습니다. DPSC는 젊은 기증자로부터 얻은 건강한 치수 조직에서 분리되었으며, 성인(18–25세)의 제3대구니와 청소년(12–16세)의 교정 소어니를 포함합니다. 젊은 개체의 치수는 일반적으로 증식 능력이 더 높고 줄기가 보존된 세포를 생성하여 하류 엑소좀 생산에 일관된 생물학적 기반을 제공합니다 ^3,20

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신-EDTA 용액	깁코	25300054	소화 능력 덕분에 트립신은 세포 해리, 일상적인 세포 배양 전달, 1차 조직 해리에 널리 사용됩니다.
100mm 세포 및 조직 배양 접시	바이오파일	TCD010100	표면 처리/비처리 멸균 및 비발열유발 DNase/RNase 없는 DNase
100 nm PS 비드	써모피셔	3100A	나노입자 추적 분석(NTA) 실험을 수행하기 전에, 기기는 정확히 알려진 입자 크기(100 nm)를 가진 표준을 사용하여 보정되어야 합니다.
15mL 벌크 원뿔 원심분리관	키르겐	KG2611	멸균, RNase/Dnase, 그리고 발열 물질 없는 상태입니다
200메시 폼바 탄소 코팅 구리 격자	Zhongjing  과학 및 nbsp; 악기	AZH200	TEM 이미징을 위한 엑소좀 샘플을 지원합니다. Formvar-탄소 코팅은 샘플 접착력과 전도성을 향상시키며, 200메시 그리드는 입자 분포와 안정적인 이미징을 위한 충분한 개방 공간을 제공합니다.
37 & deg; C 인큐베이터	써모 사이언티픽	51032877	37도 CO2 인큐베이터는 이상적인 시험관 내 환경을 제공합니다.
50mL 벌크 원뿔 원심분리관	키르겐	KG2811	멸균, RNase/Dnase, 그리고 발열 물질 없는 상태입니다
항-CD63 항체 [MX-49.129.5]	앱캠	AB193349	항-CD63 항체 [MX-49.129.5] (ab193349)는 CD63 in 를 감지하는 마우스 단클론 항체입니다; 웨스턴 블롯, 유세포측(Intra), 유세포측, IHC-P, ICC/IF. 적합한   인간.
항-TSG101 항체 [EPR7130(B)]	앱캠	AB125011	항-TSG101 항체 [EPR7130(B)] (ab125011)는 TSG101 in 를 감지하는 토끼용 단클론 항체입니다; 웨스턴 블롯, 유세포측(Intra), 유세포측, IHC-P, ICC/IF. 적합한   인간, 쥐, 쥐.
자동 셀 카운터	카운트스타	IC1000	빠르고 정확한 셀 카운터를 위한 자동 셀 카운터
BCA 단백질 분석 키트	비요타임	P0012	농도 50 - 2000 및 μ 범위 내에서 선형 관계가 좋음; g/ml.
벤치탑 원심분리기	바이오리지	TD5	실험실 환경에서 빠르고 효율적인 샘플 분리를 위한 벤치탑 원심분리기
생물학적 안전 캐비닛	써모 사이언티픽	1379	생물학적 안전 캐비닛은 공기 중 병원체를 걸러내고 미생물학 작업 중 교차 오염을 방지하여 작업자, 샘플 및 환경을 생물학적 위험으로부터 보호하는 멸균 격리 장치입니다.
세포 배양 플레이트, 12-웰	에펜도르프	0030721110	조직 배양 처리, 뚜껑, 평평한 바닥< br/> 멸균, 검출 가능한 발열물질, RNase 및 포함 DNase, 인간 및 박트. DNA 비세포독성
세포 배양 플레이트, 96-웰	NEST	701001 0714B	조직 배양 처리, 폴리스티렌, 비발열성 무효
셀세이브	NCM	C40100	혈청 무첨가, 동물성 단백질 무첨가 세포 냉동 배지
콜라게나아제, 타입 I, 분말	깁코	17100017	콜라겐제는 중성 아미노산(X)과 글리신 사이의 결합을 분해하는 프로테아제로, Pro-X-Gly-Pro라는 서열에서 콜라겐에서 높은 빈도로 발견됩니다.
디스파이즈 II, 분말	깁코	17105041	디스파제 II(중성 프로테아제)는 비극성 아미노산 잔기의 N-말단 펩타이드 결합을 가수분해하는 아미노-엔도펩티다아제입니다.
둘벡코의 변형 독수리 미디엄	깁코와 nbsp;	C11995500BT	[+]4.5g/L D-글루코스<브루/> [+]L-글루타민 [+]110mg/L 나트륨 피루베이트
Evo M-MLV 역전사 키트	AG	AG11707	실시간 RT-PCR을 위한 전용 역전사 시약입니다. 이 연구는 강한 신전 능력을 가진 Evo M-MLV 역전사효소를 활용하여 짧은 시간 내에 효율적인 cDNA 합성을 가능하게 합니다.
엑소좀 농축액	우미비오	UR52111	세포 상액에서 엑소좀을 추출합니다
엑소좀 고갈된 태아 소 혈청	우미비오	UR50202	엑소좀 없는 태아 소 혈청은 멸균된 건강한 태아 소 혈청을 여과하여 얻었으며, 태아 소 혈청 내 내인성 엑소좀의 99%가 제거되었다. 이 혈액은 태아 소 혈청과 동일한 세포 성장 속도와 형태를 가졌습니다.
태아 소 혈청, 자격, 호주	깁코	10099141	헤모글로빈 수치:  ≤ 30 mg/dL (수치는 일상적으로; 25 mg/dL)
인간-H36B4	상곤 바이오텍	SB002	포워드: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGT-3'; 후면: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3'
휴먼-IL-23A	상곤 바이오텍	SB002	포워드: 5'-가아가-3'; 후진: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'
역형 생물 현미경	라이카	DMI1	배양 플라스크나 페트리 접시 같은 용기 벽에 부착된 살아있는 세포나 조직을 직접 관찰하세요.
최소 필수 매체	깁코와 nbsp;	C12571500BT	[+]L-글루타민 [+]리보뉴클레오사이드 [+]디옥시리보뉴클레오사이드
NcmSpin 신속 RNA 추출 키트	NCM	M5106	이 키트는 최대 3,000,000개의 세포와 최대 10mg의 조직에서 총 RNA를 빠르게 추출할 수 있습니다.
페니실린-스트렙토마이신	NCM	C100C5	페니실린 10,000 단위/ml와 10,000 마이크로그램/ml 스트렙토마이신이 함유되어 있습니다. 박테리아를 제거하기 위해 여과되어 세포 배양에 직접 사용할 수 있습니다. 이 방법은 세포에 대한 박테리아 오염을 효과적으로 방지합니다.
퍼펙트스타트 그린 qPCR 슈퍼믹스	트랜스젠	AQ601-02-V2	모든 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브에 결합하여 여기 시 녹색 빛을 내는 형광 염료입니다. PCR 증폭 과정에서 새로 증폭된 DNA에 통합되어 형광이 증가합니다. 변성 단계에서 DNA 가닥이 분리되어 염료가 방출되고, 형광 신호가 크게 감소합니다.
인산염 완충 식염수(PBS)	비바 셀 생명과학	C3582-0500	이 방법은 배지의 pH를 생리적 범위 내에 유지하고, 세포 안팎의 삼투압 균형을 유지하는 것입니다.
인산화산	솔라비오	G1870	TEM 시료 준비를 위한 음수 염색제로 사용됩니다.
SW 흔들기 물탕	줄라보	(DIN 12876-1)I	작동 온도 범위는 +20에서 +99.9 & deg까지; C
주사기 필터, 0.22 & mu; m/33 mm, PES	비요타임	FF362	DNase/RNase 자유 저단백 결합 비열성 개별 포장
투과 전자현미경(TEM)	히타치	HT7700	엑소좀을 포함한 나노입자 형태의 고해상도 이미징에 사용됩니다. 가속 전압 80&ndash로 작동; 100 kV는 음수 염색된 샘플을 시각화하고 입자 크기, 형태, 구조적 완전성을 확인하기 위해 사용됩니다.
ZetaView_Particle 메트릭스	입자 메트릭스	PMX-120	나노입자의 입자 크기, 농도, 제타 전위, 형광 특성을 측정하는 데 사용됩니다.