효소 결합 면역흡착 분석법을 이용한 인간 눈물막에서의 성호르몬 검출

요약

이 프로토콜은 미세모세관을 통해 수집된 인간 눈물액에서 17β-에스트라디올과 테스토스테론을 검출하고 정량하는 최적화된 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 방법을 설명합니다. 이 방법은 눈물 호르몬 수치를 최소 침습적으로 측정할 수 있게 합니다.

초록

눈물막은 복합적이고 다층적인 액체로, 안구 표면 건강, 시각 선명성, 병원체 및 환경 스트레스 요인으로부터 보호하는 데 필수적입니다. 주로 지질, 수용성 액체, 수용성 단백질, 뮤신으로 구성되어 있으며, 눈을 윤활하고 보호하는 역할뿐만 아니라 안구 건조증(DED)과 같은 안구 표면 질환의 진단에 중요한 매개체로도 활용됩니다. 안드로겐과 에스트로겐을 포함한 성호르몬은 눈물막 구성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으나, 눈물액 내 호르몬 측정은 적은 샘플 양과 기술적 어려움으로 인해 제한적입니다. 이 프로토콜은 미세모세관을 이용해 채취한 기저 파열에서 17β-에스트라디올과 테스토스테론을 검출하고 정량하기 위해 시판 중인 효소 결합 면역흡착법(ELISA) 키트를 단계별로 적응시키는 방법을 설명합니다. 이 워크플로우는 최적화된 샘플 수집, 희석, 분석 준비 전략을 포함하여 저부피 눈물 샘플 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 적응된 ELISA 방법을 사용하여 눈물액에서 호르몬 검출의 실현 가능성과 재현성을 입증합니다. 대표성 결과는 통합된 파일럿 샘플에서 도출되며, 생물학적 차이보다는 분석의 성능을 보여주기 위한 것입니다. 이 접근법은 눈물 표면 연구에서 호르몬 측정 매트릭스로서 눈물액을 조사하는 향후 연구를 지원할 수 있습니다.

서론

눈물막은 안^{구 표면을} 보호하고 영양 공급하며 윤활하는 데 중요한 역할을 합니다. 두께는 약 2–5.5 μm, 부피는 3–10 μL이며, 건강한 눈 ^2,3에서 분당 1–2 μL의 회전 속도를 가집니다. 눈물샘은 눈물, 전해질, 단백질, 항균 인자가 풍부한 수성 성분을 분비하며, 마이보미안선은 눈물막의 증발을 늦추는 지질을 생성하고, 결막 안술 세포는 안구 표면의 윤활을 지원하는 점액을 분비합니다^. 눈물 생성은 두 가지 주요 방식으로 일어납니다: 1) 건강한 안구 표면에 안정적인 눈물막을 유지하는 기저 분비, 2) 자극, 감정, 밝은 빛과 같은 자극에 의해 촉발되는 반사 분비. 생화학적 조성은 두 곳에서 다르며, 이는 궁극적으로 분석을 위한 눈물 수집 방법에 영향을 줄 수 있습니다 ^5,6. 기저 눈물은 일반적으로 눈물막 안정성과 각막 건강을 지원하는 단백질과 지질이 더 높은 농도를 포함하는 반면, 반사 눈물은 수성 부피가 더 많고 자극물을 씻어내고 안구 표면을 보호하기 위해 더 희석되어 있는 경향이 있습니다 ^7,8,9.

눈물은 염증을 조절하고 병원체를 방어하며 무혈 각막에 영양분을 공급하는 역할을 하기 때문에¹⁰번 바이오마커 연구의 중심점이 되었습니다. 눈물은 특히 질병 부위 인근에서 발생하는 생리학적 변화를 모니터링하기 위해 혈액 샘플링에 비해 최소 침습적이고 비교적 비용 효율적인 대안을 제공합니다^. 이 데이터를 정확하게 수집하려면 적절한 수집이 필수적입니다.¹⁰. 유리 미세모세혈관은 자극이 최소화되고 눈물 희석을 최소화하며 채취할 수 있어 기저 파열물 샘플링에 널리 사용됩니다^. 이 방법은 관을 구막과 눈꺼풀 가장자리에 닿지 않도록 조심스럽게 위치시키^{며, 반}사 찢어짐을 자극하여 찢어진 조성을 변화시킬 위험을 최소화합니다. 이 방법을 사용하면 연구자들은 안구 표면의 생리학적 상태를 반영하는 희석되지 않은 기저 파열을 얻을 수 있습니다. 이로 인해 샘플은 성호르몬과 같은 민감한 분석물을 정량하는 신뢰할 만한 매개체로 남게^됩니다. 그러나 얻어진 제한된 양은 하류 생화학 분석에 있어 분석적 도전을 제기합니다. 미세모세관을 이용한 기저 파열 수집은 일반적으로 샘플당 몇 마이크로리터만 생성되어 표준 분석법과의 호환성을 제한합니다.

인간의 안구 표면은 성호르몬의 표적 조직으로 점점 더 인식되고 있습니다^13,14. 이를 뒷받침하는 증거로는 누수선과 마이봄샘의 원세포, 그리고 각막, 결막, 결막 잔 세포의 상피세포에서 안드로겐 수용체(AR), 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR)의 mRNA 전사체가 검출된 것이 포함됩니다^. 더불어, 이 조직들에서 스테로이도인성 효소를 암호화하는 mRNA가 확인되어 스테로이드 전구체를 국소적으로 생물학적으로 활성화된 성호르몬으로 전환할 수 있음을 시사한다¹⁶. 이는 안구 표면에서 현장 호르몬 합성이 가능함을 시사하며, 이 호르몬들이 눈물막에 감지 가능한 수준으로 분비되는지에 대한 중요한 의문을 제기합니다.

현재 증거는 성호르몬이 안구 표면 항상성 유지에 필수적임을 시사하지만, 정확한 분자 메커니즘은 아직 조사 중이다^13,14. 테스토스테론과 같은 안드로겐은 지질 분비를 자극하고 염증을 억제하는 것으로 보이며; 따라서 안드로겐 결핍은 증발^{성 안구} 건조증의 원인으로 널리 인식되고 ^{있습니다.} 반면, 에스트로겐의 역할은 더 미묘하고 상황에 따라 다릅니다 13,14,18. 눈물 구성과 혈액량 조절에 관여하지만, 폐경, 임신, 경구 피임약 사용 중 발생하는 에스트로겐 변동은 종종 수용성 분비 저하, 눈물막 안정성 저하, 안구 표면 염증과 관련이 있습니다^19,20. 따라서 이러한 호르몬 불균형을 경험하는 사람들은 안구건조증(DED)13,14,20 발병 위험이 높은 집단에 속합니다.

이러한 증거에도 불구하고, DED 환자의 호르몬 상태를 모니터링하는 것은 여전히 도전 과제로 남아 있습니다. 구체적으로, 전신 혈청 호르몬 수치가 눈 내 국소 호르몬 수치를 정확히 반영하는지는 아직 확립되지 않았습니다²¹. 이 구분은 매우 중요한데, 안구 표면 조직이 성호르몬 수용체와 스테로이도생 효소 발현을 가지고 있어 국소적으로 성스테로이드의 합성과 대사를 지원하는 것으로 밝혀졌기 때문입니다¹⁶. 이 크라인 내 용량은 눈물막 내 국소 호르몬 농도가 순환 혈청 농도와 유의미하게 다를 수 있음을 시사합니다¹³. 따라서 눈물액 내 호르몬 농도를 직접 측정하는 것이 안구 표면에 미치는 국소 호르몬 효과를 더 잘 이해하기 위해 필요합니다. 그러나 분석 가능한 눈물 샘플 양이 적어 기술적으로 어려운 방법입니다. 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)과 같은 고급 분석 기법이 혈액과 눈물액 내 호르몬을 고민도로 정량화하는 데 사용되었으나, 이 방법은 모든 연구자가 쉽게 접근할 수 있는 것은 아닌 전문 기기와 기술 전문성을 필요로 합니다 ^21,22.

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 단백질, 항체, 호르몬을 검출하고 정량하는 데 널리 알려진 기술입니다. 성스테로이드와 같은 소분자 분석의 경우, 이 프로토콜은 경쟁적 결합 형식을 사용합니다. 이 방법에서는 눈물 샘플에 포함된 표지되지 않은 호르몬이 효소 표지된 호르몬 유사체와 제한된 수의 항체 결합 부위를 두고 경쟁합니다. 이러한 경쟁으로 인해, 광학 밀도로 측정되는 신호 세기는 샘플 내 호르몬 농도와 반비례합니다; 사실상 신호가 낮을수록 목표 호르몬 농도가 높다는 의미입니다 ^23,24.

ELISA는 목표 정량화에 여러 실용적인 이점을 제공합니다. 비용 효율적이고 기술적으로도 접근성이 뛰어나, 전문 장비 없이도 표준 실험실 환경에서 구현할 수 있습니다. 더불어, ELISA는 최소한의 시료 준비로 96웰 플레이트 형식의 고처리량 스크리닝을 가능하게 하며, 시간 효율성과 높은 재현성을 모두 제공합니다. 하지만 시판 중인 ELISA 키트는 일반적으로 혈청이나 혈장과 같은 대용량 생물학적 샘플에 최적화되어 있으며, 저부피 눈물 샘플에서의 성능은 명확하지 않습니다. 이 한계를 해결하기 위해 프로토콜은 최적화된 샘플 희석 및 취급 전략을 포함하여 분석의 민감도 범위 내에서 호르몬을 검출할 수 있게 합니다.

본 연구에서는 유리 미세모세관 튜브를 이용해 채취한 저용량 인간 눈물 샘플에서 17β-에스트라디올과 테스토스테론을 검출 및 정량하기 위해 시판 ELISA 키트를 적용한 시각화 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 제한된 눈물 부피에서 재현 가능한 호르몬 측정을 가능하게 하기 위해 샘플 수집, 취급 및 분석 준비에 실용적인 수정을 강조합니다. 이 연구는 기존 ELISA 방법론을 유체 분석에 적용할 수 있는 실현 가능한 워크플로우를 확립하는 데 중점을 둡니다. 이 접근법은 향후 안구 표면의 국소 호르몬 수치를 조사하는 연구의 기초가 될 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 인디애나 대학교 기관심의위원회(IRB#1908362633)의 승인을 받았으며, 샘플 수집 전에 모든 참가자로부터 서면 동의를 받았습니다.

1. 눈물막 컬렉션

1. 준비
   1. 수집할 눈물량을 결정하되, ELISA 결과의 통계적 신뢰성을 위해서는 2번의 복제가 필요함을 염두에 두어야 합니다.
   2. 눈물막 저장을 위해 1.5mL 마이크로 원심분리기를 준비하세요.
   3. 적절한 미세모세혈관을 선택하여 눈물을 채취하세요. 3.33 μL 또는 5 μL로 시작해, 안구 표면의 눈물 부피가 적은 경우 더 작은 용량으로 바꾸는 것을 권장합니다.
   4. 미세 모세관 키트에 제공된 고무 압착 구슬을 준비하여 눈물의 액체를 마이크로 원심분리관으로 이동시키기 쉽게 합니다.
2. 눈물 수집
   1. 참가자에게 정면이나 약간 위를 바라보라고 지시하세요.
   2. 외눈 근처 눈 근처 눈물 반월판에 있는 미세모세혈관 입구를 부드럽게 놓아 기저 파열을 수집합니다.
   3. 반사 찢어짐을 최대한 피하려면 구막과 눈꺼풀 가장자리와의 접촉을 최소화하세요.
   4. 튜브를 눈물로 가득 채우세요.
   5. 여러 차례 채취 세션이 필요한 경우, 호르몬 수치 변동을 최소화하기 위해 24시간 간격 이내와 비슷한 시간에 세션을 예약하세요.
3. 눈물 저장
   1. 고무 압축 전구 상단의 구멍을 막은 후 미세모세관을 전구에 삽입한 뒤, 열린 끝을 미세모세관 안에 넣어 미세 모세관 밖으로 찢어진 물이 흘러나오도록 합니다. 미세 모세관 밖의 눈물 샘플을 최대한 빼내기 위해 구막을 추가로 압박해야 할 수도 있습니다.
   2. 증발을 막기 위해 마이크로 원심분리기 튜브 캡을 닫으세요.
   3. 벤치탑 마이크로 원심분리기를 사용해 2,000 × g에서 3–5초 동안 튜브를 돌려 샘플이 튜브 바닥에 머물도록 하여 저장 전에 보관합니다.
   4. 분석 전 분석물 안정성을 유지하기 위해 -80 °C에 보관하세요.

2. 테스토스테론 분석법

1. 테스토스테론 기준을 준비하고 프로토콜을 따르세요
   1. 키트 프로토콜을 준수하고, 테스토스테론 기준, 대조 및 샘플을 준비할 시약과 장비가 준비되어 있는지 확인하세요.
   2. 탈이온수 또는 증류수로 테스토스테론 표준을 재구성하여 100 ng/mL의 기본 용액을 얻습니다. 완전히 재구성되도록 하고 최소 15분간 방치하세요.
   3. 실험 당일에 테스토스테론 기준을 준비하세요.
   4. 표준용 마이크로 원심분리기 튜브 6개를 준비하고, 10 ng/mL 튜브에는 900 μL 교정기 희석제를, 나머지 튜브에는 400 μL를 첨가합니다.
   5. 첫 번째 튜브(10 ng/mL 튜브)에 100 μL 스톡 용액을 피펫 주입하고, 충분히 혼합한 후 다음 이송을 위해 피펫 팁을 교체합니다.
   6. 첫 번째 튜브(10 ng/mL 튜브)의 200 μL 피펫을 다음 튜브(3.33 ng/mL)로 옮기고, 충분히 혼합한 후 다음 전송을 위해 피펫 팁을 교체한 후 마지막 튜브(0.041 ng/mL)까지 이 과정을 반복합니다.
   7. 참고: 모든 단계를 완료하면 7개의 기준 집중 구역이 있어야 합니다. 교정기 희석제는 제로 표준(0 ng/mL) 역할을 합니다. 각 준비된 표준체는 두 번의 복제에 충분합니다.
2. 테스토스테론 조절 조제: 저농도, 중도, 고농도
   1. 각 바이알은 대조 키트의 분석 증명서(COA)에 명시된 이온수 또는 증류수 부피로 재구성합니다
   2. 분석 전에 각 컨트롤을 교정기 희석제에 2배로 희석하여 분석에 사용하세요
3. 샘플 준비
   1. 눈물 샘플을 -80°C에서 꺼내 얼음 위에 올려 해동하세요.
   2. 샘플이 완전히 해동되면, 눈물 샘플을 잠시 원심분리하여 모든 샘플이 관 바닥에 실온에서 3–5초 동안 머뭅니다.
   3. 샘플 20 μL과 교정기 희석제 80 μL을 혼합하여 복제당 총 부피 100 μL를 얻습니다.
   4. 신뢰성을 위한 실험용 2회 복제 계획과 배경 대조를 위한 비특이적 결합(NSB) 웰을 계획합니다.
   5. 참고: 각 샘플은 중복 우물에서 분석됩니다. 따라서 검사를 수행하려면 참가자당 40 μL의 눈물 샘플이 필요하며, 160 μL의 교정기 희석제와 혼합하여 총 200 μL의 부피를 얻습니다.
4. 분석 절차
   1. 모든 시약, 작업 기준, 눈물 샘플, 대조 검사를 준비하세요.
   2. 마이크로플레이트 프레임에서 과도한 웰을 제거하여 4 °C 건조제 팩에 복원합니다.
   3. NSB 정을 제외한 각 웰에 50 μL의 1차 항체 용액(파란색)을 추가하세요. 접시를 알루미늄 호일로 덮으세요.
   4. 플레이트를 실온에서 500 ± 50rpm으로 설정한 수평 궤도 마이크로플레이트 셰이커(0.12" 궤도)에서 1시간 동안 인큐베이팅하세요.
   5. 총 8회 세척(400 μL/웰/세척)을 위한 충분한 세척 완충제를 준비하세요(3시간 배양 단계 전 4회, 후 4회 세척).
   6. 각 웰의 내용물을 흡입한 후 세척 버퍼로 플레이트를 4번 세척하세요.
   7. NSB 웰과 표준 웰 0에 100 μL 교정기 희석제를 추가합니다.
   8. 지정된 웰에 표준 샘플, 대조 샘플, 준비된 눈물 샘플 100 μL을 추가합니다.
   9. 각 웰에 50 μL의 테스토스테론 결합액을 첨가하고 피펫으로 완전히 혼합합니다.
   10. 500 ± 50 rpm 또는 가장 가까운 설정으로 설정된 수평 궤도 마이크로플레이트 셰이커(0.12" 궤도)에서 3시간 동안 실온에서 인큐베이션합니다.
   11. 각 웰을 흡입하고 세척 버퍼를 사용해 4번 세척하세요.
   12. 사용 직전에 색료 시약 A와 색소 시약 B를 1:1 비율로 혼합하여 기판 용액을 준비하세요. 유정당 200 μL 할당. 기판 추가 전에 잔류 세척 완충제를 완전히 흡입합니다.
   13. 각 웰에 15분 이내에 200 μL 기질 용액을 첨가합니다. 상온에서 30분간 부양시키세요. 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호하세요.
   14. 각 웰에 기질 용액과 동일한 순서로 50 μL의 스톱 솔루션(Stop Solution)을 추가합니다. 각 웰을 충분히 섞으면 색이 파란색에서 노란색으로 변할 것입니다.
   15. 스톱 용액을 첨가한 후 30분 이내에 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450 nm와 560 nm의 광학 밀도를 측정합니다.
   16. 참고: 제조사 설명서에는 기준 파장이 540 nm 또는 570 nm를 권장합니다. 이 프로토콜에서는 배경 신호 보정과 광학 결함을 위해 마이크로플레이트 리더기에서 가장 가까운 옵션으로 560 nm 파장이 사용되었습니다.
5. 계산
   1. 560 nm(기준 파장)에서 측정된 광학 밀도를 450 nm에서 측정한 광학 밀도에서 빼는 값입니다.
   2. 표준 값, 샘플, 대조군의 각 개별 측정값에서 평균 NSB 광 밀도를 빼고, 중복 측정값의 평균을 계산합니다.
   3. 4파라미터 로지스틱(4PL) 모델을 사용해 데이터를 적합시켜 표준 곡선을 생성합니다.
   4. 표준 곡선에서 샘플 값을 보간하여 테스토스테론 농도를 측정합니다.
   5. 샘플 희석 비율을 1:5로 고려하여 희석 계수 5를 적용하여 계산된 농도를 조정하세요.
   6. 복제 간 변동 계수(CV)를 계산하여 측정값을 검증해야 합니다.
      1. 참고: %CV = (SD/평균) × 100

3. 에스트라디올 분석

1. 에스트라디올 표준, 대조 및 샘플을 준비하세요
   1. 키트 프로토콜을 준수하고, 표준, 통제, 샘플 준비를 위한 시약과 장비가 준비되어 있는지 확인하세요.
   2. 사용 전에 모든 시약과 재료가 실온에 도달할 때까지 기다려야 합니다.
   3. 실험 당일에 신선한 시약을 준비하세요.
   4. 표준과 통제는 즉시 사용 가능합니다. 오염을 최소화하고 취급 중 반복적인 온도 변화를 제한하기 위해 현재 분석에 필요한 양만 알리코트합니다.
   5. 6개의 표준(No. 0–5)을 준비하고, 0은 0 pg/mL를 나타내며, 키트에 포함된 대조 샘플 1개를 포함하세요.
   6. 냉동 샘플은 -80°C에서 얼음에 올려 해동하세요.
   7. 눈물 샘플을 돌려서 모든 샘플이 튜브 바닥에 있는지 확인하세요.
2. 분석 절차
   1. 마이크로플레이트에서 남는 웰을 제거하여 4 °C 건조제 팩에 복원하세요.
   2. 20 μL의 표준, 대조, 샘플을 웰에 추가하세요.
   3. 참고: 각 표준과 샘플은 2번의 복제로 분석해야 합니다.
   4. 균질한 분포를 보장하기 위해 피펫팅 직전에 모든 표준, 대조, 샘플을 철저히 혼합하세요.
   5. 시험 웰에 17 베타 에스트라디올-HRP 결합액 160 μL을 추가합니다.
   6. 기질을 위한 빈 우물을 남겨두세요.
   7. 인큐베이터에 넣기 전에 우물을 알루미늄 호일로 덮으세요. 우물 내 용액은 알루미늄 호일로 증발할 수 있습니다.
   8. 37°C에서 2시간 배양하세요.
   9. 배화 시간 동안 10배 세척액으로 세척 버퍼를 준비하세요.
   10. 인큐베이션이 완료되면 알루미늄 호일을 제거하고 웰에서 액체를 흡입합니다.
   11. 각 웰을 워시 버퍼로 3번 세척하세요. 세탁 사이클마다 > 5초씩 담가세요.
   12. 모든 웰에 100 μL TMB 기판 용액을 추가하세요.
   13. 전체 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 정확히 30분간 배양하세요.
   14. 이전에 추가한 TMB 기질 용액과 동일한 순서와 속도로 모든 웰에 100 μL 스톱 용액을 첨가합니다.
   15. 마이크로플레이트를 부드럽게 흔들면 시약이 파란색에서 노란색으로 변합니다.
   16. 정지 용액을 추가한 후 30분 이내에 450 nm에서 흡광도를 측정하세요.
3. 계산
   1. 모든 표준, 샘플, 제어 값에서 빈 웰의 흡광도를 빼서 배경 신호와 광학적 결함을 보정합니다.
   2. 중복된 측정값의 평균을 계산하세요.
   3. 4매개변수 로지스틱(4PL)을 사용하여 최적 적합 표준 곡선을 생성합니다.
   4. 표준 곡선에서 샘플 값을 보간하여 에스트라디올 농도를 결정합니다..
   5. 복제 간 변동 계수(CV)를 계산하여 측정값을 검증해야 합니다.
      1. 참고: %CV = (SD/평균) × 100.

4. R과 RStudio를 이용한 데이터 분석

1. R 및 RStudio를 설치하고, 데이터 분석을 수행하기 전에 재료표 에 나열된 필수 패키지를 설치하세요.
2. 표준 물질, 제어 및 샘플에 대한 광학 밀도 측정값을 분석 소프트웨어로 가져오세요.
3. 분석법에서 지정한 파장 보정을 통해 데이터를 전처리합니다. 그 다음 빈칸 값이나 NSB 값을 빼고 중복 측정값의 평균을 계산합니다.
4. 4매개변수 로지스틱(4PL) 회귀 모델을 사용하여 집중도를 독립 변수, 광학 밀도를 응답 변수로 표준 곡선에 적합합니다.
5. drc 패키지의 drm() 함수를 사용하여 R에서 곡선 적합을 수행하며, 4PL 회귀 시 fct = LL.4()로 모델이 지정되고, 입력값은 농도 및 광밀도 데이터입니다.
6. 샘플 농도를 해석하기 전에 곡선 적합도의 품질(예: R² > 0.99 또는 허용 가능한 적합 이성)을 검증하세요.
7. 적합 표준 곡선을 기반으로 ED() 함수를 사용해 호르몬 농도를 역예측하여 계산하며, 적합 모델에 기반한 샘플 광학 밀도 값에 해당하는 유효 선량을 지정합니다.
8. 적절한 희석 계수를 적용하여 계산된 농도를 조정하세요(예: 1:5 희석의 경우 ×5).
9. 최종 호르몬 농도를 적절한 단위(예: ng/mL 또는 pg/mL)로 보고하여 표준 곡선과의 일관성을 확인하고, 처리 데이터를 내보내 추가 분석 또는 시각화를 수행하세요.

결과

파일럿 눈물막 연구

총 20명의 여성(45세에서 63세)이 이 연구에 포함되었습니다. DED 분류는 증상과 최소 한 가지 이상의 임상 징후를 기준으로 하였습니다. 구체적으로, 모든 DED 참가자는 안표면질환지수(OSDI) 점수가 12> 있었고, 최소 한 쪽 눈은 형광 눈물 분해 시간(TBUT)이 < 5초, 각막 형광 염색 점수(CFSS)가 > 3(NEI 척도²⁵)을 보였습니다. 비DED 분류 참가자는 OSDI 점수< 12, 양쪽 눈 모두 TBAT > 5, 양쪽 눈 모두 CFSS≤ 3을 보였습니다. 제외 기준에는 현재 콘택트렌즈 착용자, 30일 이내 안과 약물 사용, 안구 감염, 결막 흉터, 임신 또는 자진 신고로 간호하는 경우가 포함되었습니다. 각 참가자의 양쪽 눈에서 유리 미세모세관 튜브를 사용해 기저 눈물 샘플을 채취하여 참가자 수준에 모아 전...

토론

눈물 수집과 분석을 통해 안구 표면 건강 평가와 잠재적 바이오마커 식별이 용이하게 이루어집니다^10,22. 우리 프로토콜은 일반적으로 사용되는 ELISA 방법을 성공적으로 적응시켜 성호르몬을 위해 눈물막 샘플을 분석하는 과정을 설명합니다. 우리는 눈물 분석의 주요 한계인 상대적으로 적은 양의 눈물 분석을 해결하기 위해 이 방법을 개발했습니다. 이러한 미세한 부피 제약을 수용하도록 워크플로우를 최적화함으로써, 정확한 호르몬 정량화에 필요한 감도를 해치지 않으면서 신뢰할 수 있는 탐지를 보장합니다.

이 프로토콜에서는 알리코트당 최소 20 μL의 검출이 필요하며, 신뢰성을 위해 두 번 샘플을 검사할 경우 참가자당 최소 40 μL이 필요합니다. 이 과정은 여러 차례 수집이 필요한데, 일반적으로 미세모세관을 이용해 한 번의 세...

재료

```html

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
17 beta Estradiol ELISA Kit	Abcam	ab108667
알루미늄 호일	Reynolds Wrap	10900000154	조리용 알루미늄 호일 중 어떤 것이든 광원으로부터 시약을 보호하기 위해 사용
마이크로 모세관 튜브 3.33 µL	Drummond	1-000-0033	유체 이동을 위한 압축 불브 포함
마이크로 모세관 튜브 5 µL	Drummond	1-000-0050	유체 이동을 위한 압축 불브 포함
마이크로 원심분리기 장치	Benchmark Scientific	C1012
마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL	Fisher	05-408-129
마이크로 플레이트 판독기	Promega	GM3000
궤도 마이크로 플레이트 셰이커	Labnet International Inc.	S2030-1000-B
R 컴퓨터 언어	Posit Software, PBC (formerly RStudio Inc.)	R 버전 4.5.1	https://cran.r-project.org/ 를 통해 Rstudio 전에 R 언어 다운로드
RStudio 소프트웨어	Posit Software, PBC (formerly RStudio Inc.)	RStudio 2023.06.1 Build 524 "Mountain Hydrangea"	https://posit.co/downloads/
R 패키지 "drc", "ggplot2", "patchwork", "ggpp", "dplyr", "readr", "tidyr", "writexl"	Posit Software, PBC (formerly RStudio Inc.)		Rstudio에서 패키지 설치
테스토스테론 컨트롤 키트	R&D Parameter	QC165	ELISA 키트(KGE010)와 별도로 판매
테스토스테론 ELISA 키트	R&D Parameter	KGE010

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