이 연구는 동물 실험을 통해 성선취유 약이 심부전에 미치는 치료 효과를 확인하였습니다. 초고성능 액체 크로마토그래피-질량분석법과 네트워크 약리학 분석을 통해 잠재적 치료 표적과 기전이 밝혀졌습니다.
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이 논문에서
요약
초록
성선곡 굴제(SXQY)는 심부전(HF) 치료 전략으로 제안되었으나, 그 치료 기전은 아직 명확하지 않습니다. 이 연구는 HF에서 SXQY의 치료 효과와 기전을 조사하였습니다. 횡대동맥 수축(TAC)에 의해 HF의 쥐 모델을 유도하고 SXQY로 치료하였다. 심장 기능은 흉부 초음파 심초음파로 평가되었고, 헤마톡실린과 에오신, 그리고 마손 삼색염색을 이용해 심근 구조와 섬유증을 평가하였다. 혈청 샘플은 초고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법을 이용한 비표적 대사체학으로 분석되었습니다. 혈액 유입 성분을 표적에 매핑하고, 교차하는 HF 관련 표적은 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 분석을 통해 분석한 후, 유전자 온톨로지와 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG) 분석을 수행했습니다. SXQY는 TAC 쥐에서 심장 기능을 유의하게 개선했으며, 이완기 동안 좌심실 내경과 좌심실 후벽 두께가 감소하고 좌심실 박출률이 증가하여 심근 비대, 염증 및 섬유화를 완화하는 것으로 입증되었습니다. 총 563개의 혈액 유입 화합물(367개의 원형, 196개의 대사산물)이 확인되었으며, 이 중 5개의 주요 활성 화합물이 63개의 표적에 해당하는 중의학 약리학 데이터베이스에서 확인되었습니다. 네트워크 분석 결과 44개의 중복 유전자가 발견되었으며, 포모노네틴, 티모사포닌 BII, 시넨세틴이 핵심 성분이고 PTGS2, PPARG, HSP90AA1가 허브 표적으로 나타났습니다. PPI 분석을 통해 ESR1, PTGS2, PPARG, HSP90AA1, JUN 및 15개의 추가 유전자를 포함한 주요 유전자가 추가로 확인되었습니다. KEGG 분석 결과, SXQY는 주로 Ca2+, 인산인질노시톨 3-키나아제-단백질 키나아제 B, 고리형 아데노신 단인산, 그리고 염증 및 호르몬 관련 경로를 통해 작용함을 밝혔습니다. 결론적으로, SXQY는 다성분, 다중 표적, 다중 경로 메커니즘을 통해 심장 기능을 개선하고 심근 재형성을 완화함으로써 HF에 대한 보호 효과를 발휘합니다.
서론
심부전(HF)은 심장 구조적 또는 기능적 이상으로 인해 심실 충전과 박출 능력이 저하되어 임상 징후군으로 특징지어지며, 이로 인해 여러 임상 징후와 증상이 나타납니다. 심장 질환의 말기 단계인 HF는 환자의 삶의 질을 크게 저하시키고 높은 사망률과 잦은 병원 재입원을 초래하여 가족과 사회 모두에 상당한 질병 부담을 가합니다 2,3. 임상 관리에서 HF 약물치료는 치료의 기초이자 초석을 이루며, 주로 이뇨제, 레닌-안지오텐신계 억제제, 베타 차단제, 미네랄로코르티코이드 수용체 길항제, 나트륨-포도당 공동수송체 2 억제제 3,4,5,6 등 주요 약물군으로 구성됩니다 3,4,5,6 . 이 약물들은 HF 환자의 예후를 부분적으로 개선했지만, 각각 전해질 장애, 서맥, 요로 감염과 같은 제한과 부작용을 가지고있습니다. 따라서 HF에 대한 약물 치료는 여전히 추가 연구가 필요합니다.
전통 중의학(TCM)은 HF의 장기 관리에 있어 풍부한 임상 경험을 축적해 왔습니다. 전체론적 조절과 다타적 중재를 강조하며,독특한 치료 접근법을 제시합니다. 최근 몇 년간 여러 무작위 대조시험(RCT)에서 HF 9,10,11,12,13,14,15에 대한 한방 처방의 치료 효능이 입증되었습니다. 성선곡 끓임제(SXQY)는 이미 치료 효과를 확인하기 위한 엄격한 RCT를 진행 중이지만, 구체적인 치료 기전은 아직 더 포괄적이고 추가적인 조사가 필요하다16. 네트워크 약리학은 시스템 생물학, 다약물학, 계산 분석을 통합하는 신흥 학문으로서, 중국 한방 처방의 전체론적 작용 기전을 밝히는 강력한 도구를제공합니다. 따라서 본 연구는 비표적 대사체학과 네트워크 약리학을 결합한 통합 전략을 사용하여 SXQY의 혈액 흡수 성분을 규명하고 잠재적 치료 기전을 밝히고자 합니다. 이 연구는 SXQY의 추가 임상 적용을 위한 기초를 제공하는 것을 목표로 합니다.
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프로토콜
모든 실험 절차는 중일 우호병원 동물윤리복지위원회(승인번호 zryhyy21-23-01-09)의 검토 및 승인을 받았으며, 동물 사용과 고통을 최소화하기 위한 대체, 감소, 정제의 원칙에 따라 수행되었습니다. 데이터 수집 및 분석(심초음파 측정 및 조직학적 평가 포함)을 수행하는 연구자들은 그룹 배정에 대해 눈 보호를 받았습니다.
SXQY 샘플 제조
SXQY는 다음과 같은 허브 성분으로 구성되어 있습니다: Astragalus membranaceus (황치) (30g), Codonopsis pilosula (당셴; 20g), Cornus officinalis(Shanyurou; 15g), Sparganium stoloniferum (Sanleng; 12g), Curcuma zedoaria (Erzhu; 15g), Cimicifuga heracleifolia (Shengma; 10g), Bupleurum chinense (Chaihu; 10g), Platycodon grandiflorus (Jiegeng; 10g), Anemarrhena asphodeloides (즈무; 15g), 그리고 레오누루스 자포니쿠스(이무; 15g), 처방당 총 원초 무게는 152g입니다. 모든 한방 재료는 중국-일본 우호병원 약학과에서 구입하였으며, 표준 약사적 식별 방법에 따라 수석 약사가 인증하였습니다. 임상적으로 SXQY는 하루 1회 처방전(152g)으로 투여됩니다. 평균 성인 체중이 70kg이라고 가정하면, 해당 인간 복용량은 2.17g(조잡한 허브)/kg입니다. 인간과 쥐 간의 체면적 정규화를 바탕으로, 등가 쥐 복용량은 13.67 g(조잡 허브)/kg으로 계산되었습니다. 조제 준비를 위해 SXQY 처방전은 조잡 허브 1그램당 10mL 비율(w/v 비율, 초기 용매 부피를 기준으로 1시간 동안 담갔다가, 전기 가열 맨틀을 이용해 끓인 후 100°C에서 1시간 동안 연속 끓임으로 유지했다. 추출물을 거즈(200–300 μm 기공 크기)로 여과했습니다. 잔류물은 동일한 조건에서 두 차례 더 추출되었다. 축적된 여과액은 60°C의 로터리 증발기를 이용해 저압 하에서 최종 부피 111mL로 농축되어 1.37g(조약 약물)/mL를 얻었습니다. 농축된 증빙액은 다시 거즈(200–300 μm 구멍 크기)로 여과되어 4°C에서 보관한 후 24–48시간 이내에 사용되었다. 투여 시 용액을 직접 사용했고, 1.37 g/mL 농도를 기준으로 간부 부피를 계산하여 약 10 mL/kg의 투여량으로 목표 용량 13.67 g/kg을 달성했습니다.
동물 모델
8주 된 수컷 Sprague–Dawley(SD) 쥐 18마리를 표준 조건 환경(23°C ± 2°C, 50± 5% 상대습도, 12시간 빛/어둠 주기)에서 자유롭게 먹이와 물을 제공했습니다. 동물들은 무작위 숫자표를 사용해 세 그룹(n=6명)으로 무작위로 배정되었습니다: 가짜 수술군(Sham), 횡동맥 협착군(TAC), 그리고 SXQY 처리군(SXQY). TAC 및 SXQY 처리군의 쥐들은 이소플루란 흡입(유도 4%, 유지 2%)으로 마취한 후, 37°C로 유지되는 온도 조절 온열 패드 위에 누운 자세로 눕혔습니다. 발바닥 집기에 대한 반사 반응이 없고, 호흡 속도가 안정되었으며 자발적 움직임이 없음으로 적절한 마취가 확인되었습니다. 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르셨습니다. 기관내 삽관 후, 동물들은 200g 체중당 4–6mL의 조수 부피, 분당 70회 호흡, 흡기 대 호기 비율 1:1의 소동물용 인공호흡기에 연결되었습니다.
모든 수술은 무균 조건에서 진행되었습니다. 수술 기구는 오토클레이빙으로 멸균되었고, 수술 부위는 포비돈-요오드로 면도하고 소독한 후 70% 에탄올로 준비되었다. 수술 부위 준비 후 왼쪽 흉부 피부 절개를 하고, 흉근과 소흉근을 둔하게 해리하여 갈비뼈를 노출시켰습니다. 왼쪽 흉골 경계 인접한 두 번째에서 세 번째 늑간 공간에 약 1.0cm 크기의 수평 절개가 이루어졌습니다. 혈관과 근막은 무딘 분리를 거두고, 흉선은 부드럽게 젖혀져 대동맥궁을 완전히 노출시켰습니다.
대동맥궁은 멸균 곡선 겸자를 사용해 오른쪽 무명동맥과 왼쪽 총경동맥 사이에 조심스럽게 들어 올렸고, 그 밑에 2-0 실크 봉합사가 삽입되었습니다. 무딘 끝이 있는 곡선 16게이지 바늘(외경 1.6mm)은 끝을 무딘 후 적절한 곡률로 구부린 후 사용 전에 수동으로 개조한 뒤, 오토클레이핑으로 멸균했습니다. 준비된 무딘 끝의 곡선바늘은 대동맥궁과 평행하게 위치시키고, 그 후 봉합사를 대동맥과 바늘 모두에 단단히 묶었습니다. 바늘은 즉시 제거되어 표준화된 수축을 만들었고, 흉선은 재배치되었습니다. 활성 출혈이 없음을 확인한 후 흉벽과 피부를 여러 겹으로 닫았습니다. 수술 후에는 약 10분간 기계식 환기를 계속하여 안정적이고 규칙적인 호흡 속도와 인공호흡 없이도 자연 호흡을 유지할 수 있는 자발적 호흡이 회복되었습니다. 이 시점에서 기관내관이 제거되었습니다. 가짜 수술을 받은 동물들도 대동맥궁이 결찰되지 않은 동일한 수술 절차를 받았다.
수술 후에는 절개 부위를 소독하고, 감염 위험을 줄이기 위해 동물들을 깨끗한 회복 케이지에 넣었습니다. 쥐들은 이후 동물 시설로 다시 보내져 회복과 정기 주거 시설로 옮겨졌습니다. 진통제는 부프레노르핀(0.05 mg/kg, 피하 투여)으로 투여되었습니다. 쥐는 첫 72시간 동안 12시간마다 통증, 고통 또는 수술 합병증(운동성 저하, 설문 발동, 비정상적인 자세, 호흡 곤역, 상처 열열 등)을 관찰했습니다.
수술 3일 후, SXQY 치료 그룹의 쥐들은 SXQY 타약 100g 체중 1mL를 9주간 구강 기귀 상태에 투여했습니다. 한편, 가짜 수술군과 TAC 그룹의 쥐들은 가베지(gavage)로 증류수(1 mL/100 g 체중)를 동일한 양으로 투여받았습니다.
흉부 심초음파
치료 기간 종료 시점에 모든 그룹에서 흉부 심초음파 검사가 시행되었습니다. 쥐들은 이소플루란 흡입으로 마취된 후 전용 영상 플랫폼 위에 엎드린 자세로 눕혔습니다. 앞가슴은 조심스럽게 면도되고 초음파 젤을 넉넉히 발랐다. 초음파 영상은 고주파 트랜스듀서(18–40 MHz)가 장착된 고해상도 소동물 초음파 시스템을 사용하여 B-모드와 M 모드로 수행되었습니다. 트랜스듀서는 젤로 덮인 부위에 부드럽게 위치했으며, 깊이 설정은 12.29mm, 이득은 22dB였다; 초점은 이미지 품질을 최적화하기 위해 조정되었습니다. 이후 정량 분석을 위해 이미지와 영상 루프를 수집했습니다. 좌심실 이완기 말단 내경(LVIDd)과 이완말기 좌심실 후벽 두께(LVPWd)를 측정하였고, M 모드 측정을 기반으로 Teichholz 공식으로 좌심실 박출률(LVEF)을 계산하였다. 각 매개변수에 대해 3–5개의 연속 심장 주기 동안 측정값을 평균화하였습니다. 모든 심초음파 획득 및 분석은 표준화된 심초음파 프로토콜에 따라 심초음파 정식 교육을 받은 인증된 운영자가 수행하였습니다.
샘플 채취 및 처리
초음파 검사 후 쥐들은 이소플루란으로 마취되었습니다. 동물들은 등을 대고 눕히고, 흉강을 열어 심장을 드러냈다. 심장은 신속히 절제되어 차가운 인산염 완충 식염수로 헹군 후 시상면을 따라 절개되었다. 심장 조직은 즉시 4% 파라포름알데히드에 4°C에서 24시간 고정되었고, 이후 단계별 에탄올 시리즈(70%, 80%, 90%, 95%, 100%)를 통해 각 단계마다 1시간 동안 탈수를 시행했으며, 이 과정에서 조직은 점차 투명해졌지만 눈에 띄는 수축은 없었다. 샘플은 자일렌에 담겨 정화되고, 60°C에서 용융 파라핀으로 3시간 동안 침투한 후 실온(RT; 20°C–25°C)에서 고체화되었다. 파라핀이 포함된 심장 조직 블록을 4–6 μm 두께로 절단하여 미세단기를 사용하였다. 섹션들은 45°C로 유지되는 수욕에 띄워 유리 슬라이드에 장착한 뒤, 하룻밤 동안 37°C에서 40°C로 건조되었습니다. 슬라이드는 저습도 조건에서 RT에 보관되었으며, 1주일 이내에 조직학적 염색을 위해 사용되었습니다.
헤마톡실린 및 이오신(HE) 염색
파라핀 내베드된 절편은 다음과 같이 처리되었습니다. 절편은 먼저 자일렌 I, II, III에 각각 5분간 담가 탈파라핀화되었고, 이어서 무수 에탄올 I, II 및 등급별 에탄올 용액(95%, 90%, 80%, 70%, 50%)을 각각 5분간 수화한 후, 증류수에서 왁스 잔여물이 보이지 않는 상태로 세척되었다. 그 후 해당 부위들은 해리스 헤마톡실린으로 5분간 염색한 후 흐르는 수돗물에 1분에서 2분간 헹궈졌습니다. 산성 알코올 용액에서 약 1–2초 동안 분별이 이루어졌으며, 배경이 창백해 보이고 핵 착색이 명확히 드러날 때 종점은 육안 검사로 결정되었습니다. 그 후 37°C에서 45°C의 물에 블루잉하고 증류수로 헹구었습니다. 그 후 단편들은 알코올 용성 에오신으로 40초간 카운터 스테인을 하고, 증류수로 세척한 뒤, 등급 에탄올로 탈수한 뒤 자일렌으로 깨끗이 처리한 후 중성 수지로 마운팅되었습니다.
매슨 스테인
파라핀 함침 절편은 자일렌 I, II, III에서 각각 5분간 순차적으로 탈파라핀되었고, 이후 무수 에탄올 I, II와 등급 에탄올 용액(95%, 90%, 80%, 70%, 50%)으로 각각 5분간 수화한 후 증류수에서 세척했다. 절편은 0.5% 아세트산(4°C까지 미리 냉각)에 1초간 담갔고, 이후 상업용 Masson's 트리크롬 염색 키트의 푸신 용액으로 10분간 염색한 뒤, 5분간 인산몰리브딘산에 분별한 후 3분간 아닐린 블루로 교환 염색을 했습니다. 모든 시약은 동일한 상업용 키트의 구성 요소였으며 제조사의 지침에 따라 사용되었습니다. 염색 후, 절편은 4°C로 미리 냉각된 아세트산에 세 번 헹군(한 번 헹굶기당 약 30초), 등급 높은 에탄올로 탈수한 뒤, 자일렌으로 투명화한 후 중성 수지로 부착했다.
대사체 분석을 위한 혈청 샘플 채취
8주 된 수컷 SD 쥐 6마리가 위 생체 내 실험과 동일한 조건에서 보관되었습니다. 동물들은 컴퓨터 생성 무작위화 방법을 사용하여 SXQY 처리된 그룹과 증류수(그룹당 n = 3명)로 무작위로 배정되었습니다. SXQY 그룹의 쥐는 체중 100g 1 mL의 용량으로 경구 SXQY를 투여받았고, 차량 대조군은 동일한 용량의 증류수를 투여했습니다. 7일간 매일 게이지를 투여한 후, 7일째 마지막 용량이 두 배로 늘어났습니다. 지난 투여 이후, 동물들은 12시간 동안 단식했습니다. 쥐는 발달 철수 반사가 사라지면 충분한 마취의 지표로 확인될 때까지 이소플루란으로 마취를 투여했다. 무균 모세혈관을 이용해 후안도 정맥신경총에서 혈액 샘플을 채취한 후 즉시 항응고제 없는 1.5mL 미세원심분리관으로 옮겼습니다. 그 후 전혈을 RT에 1시간 동안 방치한 후 1000 × g에서 4°C에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻었습니다. 상부 투명 혈청층과 혈전 사이에 명확한 분리가 나타나면, 상청액 혈청을 조심스럽게 흡인하여 깨끗한 미세원심분리관으로 옮겼습니다. 혈청 샘플은 혈액 유입 성분을 분석할 때까지 −80°C에서 보관되었습니다.
대사체 분석을 위한 샘플 전처리
혈청 샘플은 −80°C 저장에서 꺼낸 후 얼음 위에 해동되어 균일성을 보장하기 위해 잠시 소용돌이 혼합(10초)했습니다. 100 μL 혈청을 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮긴 후, 추출 용매 500 μL(내부 표준 20% 아세토니트릴-메탄올, 2-클로로-L-페닐알라닌 포함, 최종 농도는 1 μg/mL)를 첨가하여 단백질 침전을 유도했습니다. 혼합물은 3분간 격렬하게 소용돌이 처리되고, 12,000 × g에서 4°C에서 10분간 원심분리되었다. 생성된 상청액 중 470 μL 일부를 새로운 튜브로 옮겨 질소 증발기를 이용해 저량 조절된 질소 흐름 하에 건조 상태로 증발시켰습니다. 70% 메탄올-물 200 μL에서 재구성하고 1분간 소용돌이 시술을 한 후, 샘플은 12,000 × g 4°C에서 10분간 원심분리되었고, 정화된 상정액 180 μL을 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 분석을 위해 오토샘플러 바이알에 옮겼습니다.
이후 200 μL SXQY 샘플을 사전 라벨이 부착된 1.5 mL 원심분리관에 옮겼습니다. 내부 표준 추출액은 각 샘플에 1:1(v/v)의 부피 비율로 첨가되었습니다. 혼합물은 15분간 소용돌이 혼합 후 12,000 × g 에서 4°C에서 3분간 원심분리되었다. 생성된 상액은 신중히 수집되어 0.22 μm 미세다공성 막을 통과시켜 투명한 여과물을 얻었고, 이는 눈에 띄는 입자가 없는 상태였습니다. 여과액은 오토샘플러 바이알로 옮겨져 4°C에서 보관된 후 초고성능 LC-MS/MS(UPLC–MS/MS) 분석이 진행되었습니다.
내부 표준 솔루션 준비
내부 표준액(2-클로로-L-페닐알라닌) 정액은 기준 표준 1mg을 70%(v/v) 메탄올수 1 mL에 용해하여 1,000 μg/mL 농도를 얻어 제조했습니다. 이 스톡 용액은 같은 용매로 다시 희석되어 최종 농도가 1 ppm인 작동 내부 표준 용액을 얻었으며, 이 용액은 신선하게 준비되어 4°C에서 보관된 후 48–72시간 이내에 사용되었다.
UPLC–MS/MS 조건
크로마토그래피 분리는 UPLC 시스템을 탠덤 질량분석기와 결합하여 수행되었습니다. 분리는 40°C에서 유지된 C18 컬럼에서 이루어졌으며, 유량은 분당 0.35 mL, 주입 용량은 4 μL였습니다. 이동상은 0.1%(v/v) 개산(A)을 함유한 초순수와 0.1% (v/v) 개산(B)을 함유한 아세토니트릴로 구성되었다. 기울기 용출은 다음과 같이 적용되었습니다: 0.0분 동안 5% B; 선형적으로 증가하여 2.0분에 25% B, 3.0분에 35% B, 5.0분에 60% B, 6.0분에 99% B로 증가했다; 99% B에서 1.5분 동안 유지 중; 7.6분에 5% B로 돌아왔다; 5% B에서 10.0분까지 평형을 유지했습니다.
질량분석은 양이온 모드와 음이온 모드로 작동하는 전기분무원 이온화원이 장착된 고해상도 질량분석기를 사용하여 수행되었습니다. 분사 전압은 양극 모드에서 3500V, 음극 모드에서 3200V로 설정되었습니다. 피복 가스와 보조 가스는 각각 30 단위와 5 임의 단위(기기 정의)로 설정되었습니다. 이온 전달관 온도와 증발기 온도는 각각 320°C와 300°C로 유지되었습니다. 전체 MS 스캔은 84–1250 m/z 범위에서 35,000 해상도로 자동 이득 제어(AGC) 목표 1.0 × 10 106 획득 후 데이터 의존 MS/MS 획득(상위 10위)으로 17,500 해상도, AGC 목표 2.0 × 10 m/z, 격리 윈도우 1.0–1.5 m/z로 획득되었습니다. 30, 40, 50의 단계적 정규화 충돌 에너지가 적용되었습니다. 상위 10개의 가장 강한 전구체 이온이 3초의 동적 배제 기간으로 분쇄 생성에 사용되었습니다.
원시 데이터 처리
원시 질량분석법 데이터는 ProteoWizard를 사용해 mzML 형식으로 변환되었습니다. 분석 신뢰성을 보장하기 위해 모든 혈청 샘플을 균등한 양으로 혼합하여 통합 품질 관리(QC) 샘플을 준비하였습니다. QC 샘플은 UPLC–MS/MS 분석 기간 동안 5–10개 분석 샘플마다 한 번씩 정기적으로 주입되어 기기의 안정성, 보존 시간 일관성 및 신호 재현성을 모니터링했습니다. 재현성은 QC 샘플에서 피크 강도의 상대적 표준편차를 기준으로 평가되었습니다.
피크 감지, 보존 시간 보정, 피크 정렬은 XCMS 패키지를 사용하여 수행되었습니다. 어느 그룹에서든 결손률이 50%를 초과하는 특징은 추가 분석에서 제외되었다. 이후 R 통계 소프트웨어에서 QC 기반 모델링을 사용하여 신호 드리프트를 보정하여 지지 벡터 회귀(SVR) 기반 정규화 방법을 사용하여 피크 영역에 신호 드리프트 보정이 적용되었습니다.
대사물 식별은 교정된 특징을 자체 참조 표준 라이브러리(약 5,000개의 화합물, MS1 및 MS2 스펙트럼 데이터를 모두 포함함; 독점적이며 공개되지 않음)와 인간 대사체 데이터베이스(HMDB), 대사체 및 쌍둥이 질량분석데이터베이스(METLIN), MassBank, 글로벌 자연산물 사회적 분자 네트워킹(GNPS) 등 공개 스펙트럼 데이터베이스와 대조하여 수행되었습니다. 정확한 질량 매칭, 보존 시간 정렬, MS/MS 스펙트럼 유사성을 기반으로 합니다. 전구체(MS1)와 조각 이온(MS2)에 대해 ±25 ppm의 내오를 사용하여 질량 매칭을 수행했으며, 보존 시간 내오는 ±6초였습니다. 라이브러리 검색을 위해 전구체 이온(Q1)에는 ±25 ppm, MS/MS 조각에는 ±50 ppm의 허용 범위가 적용되었으며, 최소 MS/MS 매칭 점수는 0.3이었습니다. 비표적 식별에는 포괄적 식별 점수가 0.5 이상인 대사산물만 남겨졌습니다. 최종 점수는 조각(0.1), 순방향(0.3), 역(0.6) 점수의 가중 합으로 계산되었습니다. 양의 이온화 및 음의 이온화 모드에서 수집된 데이터는 화합물 수준에서 병합되었습니다. 중복 주석의 경우, 식별 신뢰도가 가장 높고 점수가 가장 높은 항목을 선택했습니다. 최종 주석은 대사물 주석 파일에 수집되었습니다.
흡수 화합물 식별 기준
흡수된 프로토타입 성분은 SXQY 추출물과 SXQY 처리 그룹에서 ±0.1분 내의 동일한 보존 시간을 가진 화합물로 정의되었습니다. 또한, 이 화합물들은 SXQY 처리군에서 차량 대조군보다 최소 두 배 이상 높은 피크 영역을 보여야 하며, 그렇지 않으면 차량 대조군에서 존재하지 않아야 했습니다.
흡수된 대사산물은 다른 기준을 사용하여 확인되었습니다. 이 화합물들은 SXQY 추출물에서는 검출되지 않았으나 SXQY 처리군에서는 발견되었습니다. 이들의 질량분석적 특징은 하이드록실화(Δm/z = +15.9949 Da)와 탈메틸화(Δm/z = −14.0157 Da) 등 특징적인 대사 변형과 일치해야 했다. 더불어, SXQY 처리 그룹의 피크 영역은 신호 드리프트 보정 후 정규화된 피크 영역을 기준으로 차량 대조군보다 최소 두 배 이상 높아야 하며, 그렇지 않으면 해당 신호가 차량 제어 샘플에서 탐지되지 않아야 했습니다.
흡수된 화합물 관련 유전자의 추출
혈액 유입 성분은 중의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼(TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph; 2026년 1월 접속)20에서 조사되었습니다. TCMSP에 기록된 화합물은 경구 생체이용률 ≥30%와 약물 유사성 0.18≥ 확립된 약동학적 역치를 바탕으로 후보 생활성 성분으로 선별되었습니다. 보유된 화합물에 해당하는 추정 표적들은 이후 추출되었고, 모든 표적 식별자는 UniProt 데이터베이스22를 사용해 공식 유전자 기호로 표준화되었습니다.
질병 관련 표적 및 교차 유전자의 회수
HF 관련 유전자는 GeneCards 데이터베이스(https://www.genecards.org/; 2026년 1월 접속)에서 "심부전"이라는 검색어를 사용하여 수집했으며, 관련 점수가 10≥ 유전자를 선정하여 추가 분석을 수행하였습니다. HF 관련 표적은 이후 Weishengxin 플랫폼을 사용해 TCMSP에서 확인된 화합물 관련 표적과 교차되었습니다(https://www.bioinformatics.com.cn; 2026년 1월 접속). 겹치는 유전자들은 교차 표적으로 정의되었으며, 이후 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 구축 및 기능 풍부 분석에 사용되었습니다.
네트워크 구축 및 기능 풍부화 분석
확인된 표적에 대한 PPI 분석은 STRING 데이터베이스(http://cn.string-db.org/; 2026년 1월 접속)23을 사용하여 종을 호모 사피엔스로 설정하고 신뢰 점수 임계값을 ≥0.7로 설정하여 수행하였습니다. 상호작용 데이터는 네트워크 시각화를 위한 Cytoscape 시각화 도구로 가져왔습니다. 위상학적 분석은 시각화 도구의 NetworkAnalyzer 플러그인을 사용해 수행되었고, 허브 유전자는 CytoHubba 플러그인24,25를 사용해 식별되었습니다. 유전자 온톨로지(GO) 풍부화 분석은 생물학적 과정(BP), 세포 구성 요소(CC), 분자 기능(MF) 범주를 포함한 교차 표적에 대해 수행되었습니다. P 값 0.05< Go용어는 유의한 것으로 간주되었으며, 각 범주에서 상위 10개의 풍부 용어가 시각화를 위해 선정되었습니다. 교차 표적들은 통계 소프트웨어의 clusterProfiler 패키지를 이용해 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG) 경로 풍부도 분석을 추가로 수행했습니다. P 값이 0.05< 경로는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었으며, 상위 20개의 농축 경로가 시각화를 위해 선정되었습니다. 이 경로들은 이후 표적-경로 상호작용 네트워크를 구축하는 데 사용되었다27.
통계 분석
데이터는 평균 ± SD로 제시되었습니다. 데이터 분포의 정규성은 Shapiro–Wilk 검정을 사용해 평가했으며, 분산의 균일성은 분석 전에 Levene 검정 또는 Brown-Forsythe 검정으로 평가되었습니다. 그룹 간 통계적 비교는 분산의 일방향 분석을 사용한 후 Tukey의 사후 검정(GraphPad Prism)을 사용해 수행되었습니다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
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결과
흉부 심초음파
심장초음파 분석 결과, TAC 쥐에서 뚜렷한 심장 재형성과 기능 장애가 나타났다(그림 1). 샴 대조군과 비교했을 때, TAC는 LVIDd와 LVPWd를 유의미하게 증가시킨 반면, LVEF는 현저히 감소했습니다. 특히, SXQY 투여는 이러한 병리학적 변화를 부분적으로 역전시켰으며, 이는 LVIDd와 LVPWd의 유의미한 감소와 TAC 그룹에 비해 LVEF의 동반 개선으로 나타났습니다.
그림 1. 군...
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토론
SXQY는 20년 넘게 임상 실무에서 광범위하게 사용되어 다양한 심혈관 질환 치료에 효능을 입증해 왔습니다. 최근에는 박출률이 감소하거나 박출률이 약간 감소한 심부전 환자에도 적용이 확대되었습니다. 본 연구에서는 심장 고전의 병리적 변화를 모방하기 위해 TAC 수술을 통해 쥐 모델을 구축하였고, 일부 쥐에게는 SXQY를 투여하여 그 효능을 조사하였습니다. 흉부 심초음파, HE 염색, 마손 염색을 사용하여 모델이 성공적으로 확립되었는지와 SXQY가 효과를 발휘하는지 평가하였다. TAC 유발 HF는 LVIDd와 LVPWd를 유의미하게 증가시키고 LVEF를 감소시켜 심장 기능 장애를 시사합니다. SXQY 치료는 이러한 변화를 부분적으로 역전시켜 LVIDd와 LVPWd를 감소시키고 LVEF를 TAC 그룹에 비해 개선하였습니다. 조직학적 분석 결과 심근세포 비대, 불규칙한 심근 구조, 광범위한 염증이 TAC 그룹에 나타나고, 마손의 삼...
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공개 사항
저자들은 이 연구에서 이해 상충이 없다고 보고했습니다.
감사의 글
동물 관리 및 수술 절차에 도움을 준 중국-일본 동물실험센터 우정병원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-클로로-L-페닐알라닌 | 알라딘 | C105993-1g | 내부 표준; ≥ 98% |
| 아세토니트릴 (LC-MS 등급) | 알라딘 | A120771-1L | 추출 용매 |
| 아세트산 | 솔라비오 | G1340 | 마손 스테인; 4 & 도(4 & deg)로 미리 냉각; C |
| 오토샘플러 바이알 | 애질런트 | 5190-9590 | LC-MS/MS 샘플 로딩을 위한 |
| 부프레노르핀 | 세릴리안트 | B-044S | 진통제 |
| C18 열(1.8 & mu; m, 2.1 mm & 시간; 100 mm) | 수역 | 176001125 | ACQUITY 프리미어 HSS T3 칼럼 |
| 모세관, 멸균 | 피셔브랜드 | 22-362-566 | 역안과 혈액 수집 |
| 원심분리기(냉장) | 쿠보타 | N61196-F000 | 세럼 및 샘플 처리를 위해 |
| clusterProfiler 패키지 | 생체도체 | — | KEGG 농축 분석을 위한 R 패키지; v4.0.2 |
| 굽은 겸자, 멸균 | HL-SQX | HL-JP | 대동맥궁 조작 |
| 사이토스케이프 소프트웨어 | NHGRI | NIH NHGRI U24 HG012107 | 버전 6.4.1 |
| 전용 영상 플랫폼 | 후지필름 비주얼소닉스 | 비주얼소닉스 Vevo 1100 초음파 영상 시스템 | 심초음파 중 동물 위치 |
| 증류수 | 해당 없음 | 해당 없음 | 조제 준비 및 차량 제어 |
| 전기 난방 맨틀 | 미디아 | WK2102 | 끓이기 |
| 기관내관 | CWE 주식회사, 미국 | SAR-1000 | 기관내 삽관; 이 연구에서 사용된 기관내관은 인공호흡기 구성에 통합되어 있었으며, 별도의 또는 독립된 장치가 아니었습니다 |
| 에탄올(절대 수도) | 베이징 이리 순정화학유한회사. | 64-17-5 | 탈수 및 불임 |
| 개미산 | 알라딘 | O930702 | 이동상 가산법 |
| 거즈 | 솔라비오 | YA0720 | 조임 여과; 200– 300 & mu; m 공극 크기 |
| GeneCards 데이터베이스 | 유전자 카드 | — | 질병 관련 표적 회수; 2026년 1월 접속 |
| GNPS 데이터베이스 | 캘리포니아 대학교 샌디에이고 캠퍼스 | — | 스펙트럼 데이터베이스; 버전 1.3.16, 데이터는 2025년 12월에 보관됨 |
| 그래프패드 프리즘 소프트웨어 | 그래프패드 소프트웨어 | — | 버전 10.1.2; SCR_002798 |
| 온열 패드(온도 조절기) | 물리적 성향 | HP-4M | 37 & 도(37 & 도) 유지; C |
| 헤마톡실린과 이오신(H& E) 염색 키트 | 솔라비오 | G1120 | 조직학적 염색 |
| 고주파 변환기 | 비주얼소닉 | 베보 F2 | 18– 40 MHz |
| 고해상도 질량분석기 | 써모피셔 사이언티브 | Q 익스액티브 | Q 익스액티브 HF-X |
| 고해상도 소동물 초음파 시스템 | 후지필름 비주얼소닉스 | 비주얼소닉스 Vevo 1100 초음파 영상 시스템 | 베보 2100 |
| HMDB 데이터베이스 | 위샤트 연구 그룹 / 앨버타 대학교 대사체학 혁신 센터 | — | 스펙트럼 데이터베이스; HMDB 현재 버전 5.0; 5.0 릴리스; 2022년 1월 |
| 자체 참조 표준 라이브러리 | 메트웨어 | — | 내부 참조 표준 라이브러리의 구성: 라이브러리는 총 5,000개의 화합물을 포함하고 있으며, MS1(전구체) 정보와 MS2(단편화) 스펙트럼 데이터를 모두 포함하고 있습니다. 이용 가능 성명서: 도서관 데이터 형식은 .txt. 저장 상태: 데이터베이스는 회사 내부 서버에 저장됩니다. 접근 권한: 이 자체 구축 표준 라이브러리는 회사의 독점 자체 스펙트럴 라이브러리입니다. 이는 회사의 통제된 분석 워크플로우 내에서 대사체 확인, 결과 검증, 품질 추적에만 사용됩니다. 도서관은 공개적으로 다운로드할 수 없습니다. 클라이언트는 이 라이브러리를 기반으로 생성된 주석 결과, 히트 정보 및 필요한 필드 설명을 얻을 수 있습니다. |
| 이소플루란 | 시그마-올드리치 | 792632 | 흡입 마취제 |
| 액체 크로마토그래피 시스템(UPLC) | SCIEX | 엑시온LC AD | 엑시온LC AD |
| 매스뱅크 데이터베이스 | 매스뱅크 컨소시엄; 일본 질량분석학회 / MassBank 유럽 | — | 스펙트럼 데이터베이스; 버전 2024.06; 데이터는 2025년 12월에 보관됨 |
| 마손 s 트리크롬 스테인 키트 | 솔라비오 | G1340 | 조직학적 염색 |
| 멤브레인 필터 (0.22 & mu; m) | 비요타임 | FF362 | 폴리에테르설폰 (PES) |
| 메틀린 데이터베이스 | 스크립스 연구소 / 시즈닥 연구소 | 리드: SCR_010500 | 스펙트럼 데이터베이스; 이 데이터베이스는 고정된 연간 버전 번호를 제공하지 않습니다; 2023년에 다운로드된 데이터 |
| 메탄올 (LC-MS 등급) | 베이징 이리 순정화학유한회사. | 67-56-1 | 추출 용매 |
| 마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL) | 코닝 생명과학(우장) 유한회사. | MCT-150-C | 샘플 처리 |
| 미세토름 | 라이카 | DSC1 | 조직 절편 |
| 중성 수지 | 솔라비오 | G8590 | 슬라이드 장착 |
| 질소 증발기/가스 소스 | 조직화 | N-EVAP | 샘플 건조 |
| 안과 연고 | 알라딘 | 08-03-8009 | 마취 중 눈 보호 |
| 파라핀 | 솔라비오 | YA0010 | 조직 임베딩 |
| 파라포름알데히드 (4%) | 솔라비오 | P1110 | 조직 고정 |
| 인산 완충 식염수 | 너 너 | DYP1021 | 휴지 세척 |
| 인산몰리브딘산 | 솔라비오 | G1340 | 마손 염색 |
| 포비돈– 요오드 | 솔라비오 | IP3800 | 외과적 소독 |
| 프로테오위저드 소프트웨어 | 프로테오위저드 재단 | — | 버전 3.0.19254 |
| R 소프트웨어 | R 재단 | — | 버전 4.2.2 |
| 회전 증발기 | 칭다오 징청 기기 유한회사 | JC-2LZF | 감압 하에서의 흡입 농도 |
| 실크 봉합 (2-0) | 풀란 | NL30RH26A-76 | 대동맥 협착 |
| 소동물 인공호흡기 | CWE 주식회사, 미국 | SAR-1000 | 기계적 환기 |
| 스프래그와 대시; 도울리 쥐 (수컷, 8주) | SPF 바이오 주식회사 | — | RGD_70508; 면허 번호. SCXK(jing)2024-0001 |
| 문자열 데이터베이스 | 스트링 컨소시엄 | — | 단백질 상호작용 분석; 2026년 1월 접속 |
| 지원 벡터 회귀 정규화 패키지/스크립트 | 메트정규화 | — | 신호 드리프트 보정; v1.3.02 |
| TCMSP 데이터베이스 | TCMSP | — | 화합물 및 표적 회수; 2026년 1월 접속 |
| UniProt 데이터베이스 | 유니프로트 컨소시엄 | — | 유전자 기호 표준화 |
| 초음파 젤 | 매그나플럭스 | 25-912 | 심초음파 |
| 초순수 | 실험실에서 준비 | — | 이동상 용매 |
| 보텍스 믹서 | 야린 | VM-ST | 샘플 믹싱 |
| 물욕 | 줄라보 | 푸라22 | 45 & 도에 부유하는 단면; C |
| 위성신 플랫폼 | 위성신 | — | 목표 교차점 분석; 2026년 1월 접속 |
| XCMS 소프트웨어 | R 재단 | — | 버전 3.16.1 |
| 자일렌 | 알라딘 | X775162 | 탈파라핀화 |