단일 및 반복 회전 폐쇄 뇌진탕성 뇌손상의 마우스 모델

요약

회전성 뇌충격의 재현 가능한 마우스 모델을 기술하여, 명백한 구조적 뇌 손상이 없는 상태에서 단일 또는 반복적 충격 후 신경혈관, 염증, 행동 등 미묘한 기능적·생물학적 기초를 조사할 수 있는 다재다능한 방법을 제공합니다.

초록

뇌진탕(CBI)은 임상 뇌진탕의 병태생리학적 기질로, 흔하지만 충분히 이해되지 않은 상태로, 일부 환자에서 장기적인 신경학적 장애가 발생할 수 있습니다. 특히 반복적인 CBI, 즉 접촉 스포츠에서는 지속적인 인지 결손과 진행성 신경퇴행(예: 만성 외상성 뇌병증, CTE)과 관련이 있습니다. 이 지식 격차를 해소하기 위해, CBI의 주요 생체역학적 및 병리학적 특징을 재현하는 폐쇄 두부 회전 뇌손상의 재현 가능한 마우스 모델이 확립되었습니다. 입체전술 유도 전자기 충격기를 사용해 온전한 두개골에 표준화된 타격을 가했다. 두개골과 인접 뇌 조직에 가해지는 국소적 부담을 줄이기 위해 임팩터 팁에는 맞춤형 실리콘 캡이 장착되었습니다. 이 구성은 동물 간 변동성이 낮으며 두개골 골절이나 미세한 조직 손상을 예방하면서 머리 회전을 신뢰성 있게 유도했습니다. 생리적 신경 및 혈관 활동을 보존하고 심부 마취의 잠재적 신경 조절 효과를 피하기 위해, 의식 있는 쥐에서 α2-작용제 메데토미딘을 사용해 가벼운 진정 상태에서 뇌 손상을 유도하였다. 유도된 충격은 머리 위치에 따른 약간의 변동만을 동반한 재현 가능한 회전 머리 움직임을 일으켰다. 뇌 구조적 완전성은 생체 내 T2 가중 자기공명영상(inbi) T2 가중 자기공명영상( invivo )을 사용해 평가되었으며, 체외 조직학적 분석으로 확인되었으며, 조직 파열, 타박상, 미세출혈의 증거는 없으나 미세혈관 경계부의 경미하고 광범위한 파란이 나타났습니다. 이 회전성 폐쇄성 뇌손상 모델은 명백한 구조 병리가 없을 때 발생하는 미묘한 신경혈관, 염증, 혈뇌장벽 변화를 종단적으로 조사할 수 있는 견고한 실험적 플랫폼을 제공합니다. 이 적용은 임상 뇌진탕의 병태생리와 반복 손상의 잠재적 신경퇴행성 결과에 대한 메커니즘적 통찰을 가능하게 하여, 긴급히 필요한 임상 바이오마커 개발을 촉진합니다.

서론

외상성 뇌손상(TBI)은 모든 연령대에서 장기 장애의 중요한 원인으로 남아 있으며, 청소년과 청년이 불균형적으로 영향을 받는다 ^1,2,3. 대부분의 외상성 뇌손상은 경증(mTBI)으로 분류되며, 임상적으로는 흔히 뇌진탕이라고 불립니다. 뇌진탕은 정의상 기존 신경영상으로 감지할 수 있는 명백한 구조적 뇌 손상과 연관되어 있지 않지만, 점점 더 많은 증거가 근본적인 손상 기전인 뇌진탕성 뇌손상(CBI)이 독특하고 임상적으로 중요한 병태생리학적 실체임을 시사합니다.

특히, 접촉 스포츠나 군사 환경에서 자주 발생하는 근거리 연속 반복 CBI는 지속적인 인지 저하, 신경정신과적 증상, 만성 외상성 뇌병증(CTE)의 발병과 연관되어 있습니다^1,2,3. 초기 손상의 경미한 성격과 장기적인 신경학적 후유증 가능성 사이의 이러한 명백한 차이는 임상 진단과 기전 연구 모두에 큰 도전 과제를 제기합니다.

신흥 증거는 신경혈관 및 신경아교세포 경계부에서의 미묘하지만 지속적인 변화가 관련 질병 메커니즘을 제시함을 보여줍니다. 이러한 변화는 혈액-뇌장벽(BBB) 완전성, 미세혈관 구조, 교세포 활성화, 신경 흥분성, 내인성 수리 과정을 포함하며, 특히 반복적인 CBI 5,6,7,8 이후 관찰되는 장기적인 기능적·행동적 결손과 세포 수준의 병태생리를 연관시킬 수 있습니다.. 이러한 변화들은 CBI 이후 지연된 기능 및 행동 결손의 잠재적 원인으로 점점 더 인식되고 있습니다. 그러나 이러한 분산되고 다면적인 특성은 기전적 이해를 복잡하게 만들었고, 지금까지 표적 치료 개입의 개발을 방해해왔습니다.

병태생리학적 연쇄 반응의 핵심 측면을 재현하는 전임상 모델은 이러한 메커니즘을 해부하고 새로운 치료 경로를 찾는 데 중요한 도구입니다. 다양한 실험용 TBI 모델이 존재하지만, 대부분은 중등도에서 중증 부상을 모방하거나 국소 구조적 손상에 의존하도록 설계되었습니다^{9, 10, 11}. 반면, CBI⁵의 특징적인 손상 기전을 나타내는 동물 모델이 놀라울 정도로 부족합니다. 대부분 '경미한' 뇌 외상은 고정된 두부에 국소 충격이 가해지거나, 두개절개 후 직접적인 피질 충격에 의해 유발되며, 이는 인간 뇌진탕을 정의하는 확산성 가속-감속 부상 메커니즘과 근본적으로 모순됩니다 ^6,7. 이러한 접근법은 부상 매개변수를 정밀하게 제어할 수 있지만, 실제 뇌진탕의 역학을 재현하는 능력이 제한적이어서 번역적 관련성이 떨어집니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 재현 가능하고 확산성 폐쇄성 뇌손상을 유도하는 여러 방법이 존재한다 12,13,14. 이러한 개념을 바탕으로 기술적 복잡성을 최소화하기 위해, 다른 실험적 외상 모델에서 자주 사용되는 상업용 전자기 충격체(즉, 통제된 피질 충격, CCI)를 이용한 쥐 대상 통제 회전 손상 모델이 개발되었습니다. 자유롭게 움직이는 머리에 재현 가능한 타격을 제공함으로써, 이 접근법은 구조적 완전성을 보존하는 동시에 단일 반복 CBI 후 신경혈관, 신경교질, 기능적 변화를 종단적으로 조사할 수 있게 하며, 이는 인간 뇌진탕의 생체역학적 특징에 근접한 조건에서 이루어집니다.

종단 행동 평가, 생체 내 영상, 체외 조직학과 결합하여, 이 모델은 단일 또는 반복적인 영향 이후 신경혈관, 교모 및 행동 변화를 탐구할 수 있는 다재다능하고 접근하기 쉬운 플랫폼을 제공합니다. 따라서 CBI의 미묘한 2차 질환 기전을 연구하고, 중개 대체 매개변수를 규명하며, 임상적으로 중요한 실험 환경에서 잠재적 치료 개입을 평가하는 데 적합합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 독일 동물복지법을 준수했으며, 기관 및 정부 당국(LANUV 노르트라인-베스트팔렌; AZ 81-02.04.2020.A058). 실험은 ARRIVE 지침에 따라 진행되었습니다. 도식 워크플로우는 그림 1에 자세히 나와 있습니다. 이 프로토콜은 구조적, 행동적, 신경혈관 검증 결과의 명확한 패널로 입증되듯 뇌진탕성 손상을 신뢰성 있게 유도합니다(그림 2). 이 연구에 사용된 모든 자료 는 재료표에 자세히 나와 있습니다.

1. 일반적인 고려사항

참고: 쥐들은 표준화된 조건(12시간 밝고 어두운 주기) 사회적으로 수용되었으며, 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 쥐들은 수술 전 최소 7일 동안 실험 시설에 적응시켰습니다. 이 파일럿 연구에는 총 40마리의 쥐가 사용되었으며, 각 실험군(대조군은 Sham, 단일 CBI 그룹, 고빈도 반복 CBI, 저주파 그룹은 반복 CBI)에 10마리씩 배정되었습니다. 고속 카메라 시스템을 눈높이에 설치하고, 마우스 머리가 마우스 앞에 고정된 위치(예: 10cm)에 위치하세요. 시험 간 일관성을 위해 카메라 위치와 방향을 일정하게 유지하세요. 이 연구에서는 GoPro Hero6가 초당 240프레임(fps), 해상도 1080px로 사용되었습니다. 앞서 설명한 운동학 분석에는 오픈 소스 모션 분석 소프트웨어 Kinovea(버전 2025.2.0)가 사용됩니다.

2. 진통 및 마취 유도

1. 설치를 준비하세요, 입체 고정 프레임과 전자기 충돌기 부착부를 포함해서요.
2. 외상 유도 이틀 전에 마시는 물로 트라마돌(1 mg/mL)을 투여하고, (마지막) 수술 후 3일간 계속 투여합니다.
3. 아산화질소/산소 혼합물(O₂ 30%, N₂O 70%)에서 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 4–4.5% 이소플루란을 사용하여 마취를 유도합니다.
4. 발가락 꼬집는 반사를 이용해 수술 내성을 평가하세요. 금단 반응이 없으면 진행하세요.
5. 마우스를 유도 챔버에서 꺼내 입체 고정 프레임 안의 가열 패드 위에 올려놓으세요. 섬유 직장 탐침을 사용해 코어 온도를 37± 1.0 °C로 유지하세요. 안과 연고를 바르며 눈을 건조로부터 보호하세요.
6. 입체 진위 장치에 연결된 코 콘을 통해 2.0–2.5%의 이소플루란을 투여하여 마취를 유지합니다.

3. 두개골 준비

1. 특정 귀 막대를 사용해 마우스를 입체 정찰 프레임 안에 고정하세요.
2. 두피를 면도하고 알코올 기반 소독제로 수술 부위를 철저히 소독하세요.
3. 부피바카인 0.1 mg/kg을 피하 주사하여 국소 마취를 시행합니다.
4. 피부 절개 전에 발가락 꼬집는 반사를 다시 평가하세요. 마취의 깊이가 일정하게 유지되도록 금단 반응이 없는 상태에서만 진행하세요.
5. 약 7mm 중앙 피부 절개를 하여 두개골을 노출시킵니다.
6. 브레그마와 람다 사이 오른쪽 두정골 위의 두개골을 조심스럽게 노출하세요.
7. 입체 정위 프레임이 두개골에 수직으로 배치되고, 수직축은 머리 표면에 대해 90° 각도로 위치하도록 하세요.
8. 입체 고정 홀더에 마커 핀을 장착하고 브레그마 중심에 직접 맞추세요.
9. 모든 입체 위치 좌표를 0으로 하고, 마커 핀을 미리 정의된 전후(AP)와 중측(ML) 좌표(우리 모델에서는 AP 0.5, ML -2.5)로 이동시킵니다. 방수 펠트펜으로 목표 지점을 표시하세요.

4. 진통 조절

1. 귀걸이에서 쥐를 놓아줘.
2. 메데토미딘을 피하(0.5 mg/kg) 주사하고 점차 이소플루란을 <0.5%로 줄이세요.
3. 호흡과 체온을 지속적으로 모니터링하면서 마취를 0.5% 이소플루란<으로 유지하세요.
4. 이러한 조건에서 10분간 평형을 유지하여 신경망 활동을 유지하면서 마취의 안정 상태에 도달할 수 있도록 하세요. 호흡 수, 반사 반응 부재, 안정적인 체온(37 ± 1.0 °C)을 표준화된 지표로 사용하여 동물 간 마취 깊이를 비교할 수 있도록 했습니다.

5. 충격 유도

참고: 실험 전에 상용 폴리에틸렌(PE) 폼 파이프 절연체로 동물 모델용 헤드 홀더를 제작하세요. 이 단열재는 폐쇄 셀, 비가교 폴리머 폼으로, 하강 가속을 제한하면서도 회전 움직임을 허용합니다. 추가로, 실푸란으로 만든 맞춤형 5mm 구형 임팩터 팁(비율 1:1; 강성 830 kPa)을 제작하세요.

1. 직장 체온 탐침을 제거하고 아이소플루란 투여를 중단한 후, 마우스를 머리 받침대에 엎드린 자세로 눕히세요.
2. 맞춤형 실리콘 캡을 시판 중인 임팩터 팁에 부착하세요.
3. 전자기 충격기를 입체정관 홀더에 장착하고, 장치가 두개골 표면에 대해 10° 각도로 정렬되도록 하세요.
4. 충격기 팁을 두개골의 미리 정의된 목표 영역 위에 정렬하세요.
5. 임팩터 팁을 길게 뻗은 자세로 내리면서 두개골 표면에 가볍게 닿게 합니다.
6. 충격기 팁을 당기고 두개골 표면 쪽으로 원하는 움푹 들어간 깊이(즉, 이 실험에서는 3mm)까지 전진시킵니다. 대조군 동물의 경우, 내려놓는 동작을 생략하고 끝을 같은 양만큼 올리세요.
7. 영상 녹화 시작해. 제어 스위치를 통해 전자기 볼트를 5 mm/s, 펄스 지속 시간 0.1 ms로 촉발하여 단일 회전 충격을 가합니다.
8. 충돌이 끝나자마자 즉시 충격기를 철수하세요.
9. 길항제 아티파마졸(0.5 mg/kg, S.C.)을 사용하여 메데토미딘 마취를 길항합니다.

6. 충격 후 평가 및 상처 봉합

1. 쥐를 엎드린 자세로 돌리세요.
2. 동물이 엎드린 자세로 돌아오는 데 걸리는 시간을 기록하여 올바른 자세를 평가합니다.
3. 이소플루란으로 아산화질소/산소 혼합물(O₂ 30%, N₂O 70%)에 4% 이소플루란으로 마취를 재유도합니다.
4. 마우스를 유도 챔버에서 빼서 입체 전술 프레임 옆 가열 패드 위에 올려놓으세요. 섬유 직장 탐침을 사용해 코어 온도를 37± 1.0 °C로 유지하세요.
5. 귀 막대를 이용해 마우스를 입체정위 프레임에 고정하세요.
6. 자기 흡수 섬유를 사용하는 중단 봉합사(예: Polyglactin 910, 6-0)를 사용하여 피부 절개를 봉합합니다.
7. 마우스를 온열 상자로 옮기고 의식이 완전히 회복될 때까지 관찰하세요.
8. 동물을 집 우리로 돌려보내세요.

7. 반복 영향 패러다임

1. 실험 설계에 따라 쥐를 가짜, 단일 또는 반복 CBI 그룹에 배정합니다.
2. 반복 부상 그룹의 경우, 정해진 간격(예: 48시간마다)에 CBI 세션을 예약하세요.
3. 이후 CBI 전에는 3.1절에 설명된 대로 트라마돌을 이용한 음용수 진통을 투여합니다.
4. 3–6절에 명시된 동일한 절차를 따라 반복 마취, 입체 마법 표시 및 충돌 수행, 여기에는 부피바카인(0.1 mg/kg, S.C.), 메데토미딘 투여(0.5 mg/kg, S.C.)와 이소플루란 유지 및 < 0.5%, 입체 위치 표적 조정(AP 0.5, ML −2.5 대비 브레그마), 그리고 전자기 충격체(움푹 들어가는 깊이 3 mm, 속도 5 mm/s, 펄스 지속 시간 0.1 ms, 두개골 표면에 대해 10° 각도).
5. 일관된 자세(회전 움직임이 가능한 폴리에틸렌 폼 헤드 홀더에 엎드린 자세), 동일한 충격 매개변수(각도, 깊이, 속도, 지속 시간), 그리고 아티파마졸(0.5 mg/kg, S.c)으로 인한 메데토미딘 자극, 마취 재유도(O₂ 30%/N₂O 70%), 37± 1.0°C에서의 온도 조절을 포함한 표준 시술 및 시술 전 조건을 유지하여 동물과 시간대에 걸쳐 재현성을 유지하도록 해야 합니다.
6. 반복 세션에서 일관된 위치, 충격 매개변수, 회복 조건을 유지하여 동물과 시간대에 걸쳐 재현성을 유지하세요.
7. 반복적인 충격 후 누적 행동 결함이 있는지 지속적으로 모니터링하세요.

8. 운동학적 해석

1. 분석을 위해 영상을 표준 형식(예: MP4)으로 내보내 Kinovea 소프트웨어에 불러와야 합니다.
2. 충돌 전후 프레임(예: -0.025초에서 0.3초)을 포함하는 관련 시간 창으로 이동하세요. 소프트웨어 설정에서 적절한 프레임 레이트(예: 240fps)를 설정하세요. 스케일링 기준(예: 눈 간 거리)을 정의하세요.
3. Kinovea의 추적 도구를 사용해 3점 추적 세팅(예: 오른쪽 눈, 왼쪽 눈, 코; 그림 3A). 각 지점을 추적하기 시작하고, 특히 빠른 움직임이나 가림 시 추적 오류를 수동으로 수정하세요.
4. 추적된 좌표를 CSV 또는 엑셀 파일로 내보내세요.
   참고: 추가 운동학 분석은 맞춤형 MATLAB 스크립트를 사용하여 수행되었습니다. Kinovea에서 내보내진 시간 해석 추적 데이터는 불필요한 항목을 제거하고 일관된 시간 확장을 보장하기 위해 불필요한 기록을 가져오고 전처리되었습니다. 머리 이동은 세 개의 추적 랜드마크(오른쪽 눈, 왼쪽 눈, 코)의 중심점으로 정의되었으며, 이로부터 수치 미분을 통해 선형 변위, 속도, 가속도를 도출했습니다. 머리 회전은 눈-코 축의 방향을 바탕으로 추정되었으며, 각 변위는 충돌 전 기준선에 대해 계산되었고, 각속도는 1차 미분으로 얻어졌습니다. 잡음 증폭을 줄이기 위해 모든 위치 및 각도 신호는 미분 전에 Savitzky–Golay 필터를 사용해 부활화되었습니다. 주요 결과 매개변수는 최대 각도 변위였으며, 속도와 가속도 프로파일은 시험 간 머리 운동 역학의 상대적 척도로 분석되었습니다.

결과

일반적인 고려사항:

이 프로토콜의 적용은 구조적, 행동적, 신경혈관 검증 판출량 집합으로 입증된 것처럼 뇌진탕성 뇌손상을 재현성 있게 유도합니다( 그림 2 참조). 부상 후에도 구조적 완전성이 유지되었습니다. 명백한 거시적 조직 파열이나 출혈은 발견되지 않아 프로토콜이 타박상성 뇌손상이 아닌 뇌 충격을 유발함을 시사합니다. 조직학적 평가 결과, 조직 구조가 온전함을 확인했으며, 심한 세포 손실이나 공동화 증거가 없음을 확인하였습니다. 또한, 구조 영상 및 조직학적 분석은 적용된 충격 매개변수에서 동물 간 타박상이나 미세 출혈을 지속적으로 발견하지 못했습니다.

충격 유도

헤드 운동학 분석(

토론

가속-감속 손상을 기반으로 한 폐쇄형 두부 CBI의 새로운 마우스 모델이 특징지어졌으며, BBB의 경미하지만 광범위한 손상과 임상 뇌진탕과 유사한 독특한 신경정신학적 표현형을 특징으로 합니다. 구조적 완전성을 유지하면서 CBI의 주요 특징을 통제되고 일관되게 재현함으로써, 이 모델은 CBI의 기전과 그 신경정신의학 및 인지적 후유증을 연구하는 데 유용하고 잘 규명된 실험적 틀을 제공합니다.

프로토콜 내에서 중요한 단계는 헤드의 유효 기계적 하중을 결정하는 단계입니다. 특히, 동물 전반에 걸쳐 일관된 회전 손상 벡터를 보장하기 위해서는 정확한 입체 위치 정렬과 충돌체에 대한 반복 가능한 머리 위치가 필요합니다. 위치, 각도, 설정 등 충격체 매개변수의 표준화와 실험 전 정기적인 보정은 변동성을 최소화하는 데 필수적입니다. 충격 위치나 회전각의 작은 편차가 부상의 심각도에 불균형적으로 영향을 미칠 수 있으므로, 엄격한 조작...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
약물
Antipamezole	Vetoquinol	VM 06043/4004	메데토미딘 길항제(α2-아드레노접수체 길항제), 피하 주사(0.5 mg/kg)
Bepanthen 안과용 연고	Bayer	11809917	마취 중 눈 보호, 국소 적용
부피바카인	Sigma-Aldrich	B1160000	국소 마취, 피하 주사(0.1 mg/kg)
아이소플루란	CP pharma	1214CN	마취, 흡입(유도 및 유지)
메데토미딘	Vetoquinol	VM 06043/4003	진정제/마취 보조제(α2-아드레노접수체 작용제), 피하 주사(0.5 mg/kg)
트라마돌 염산염(100 mg/mL)	Grünenthal	6867645	마우스에 대한 마시는 물을 통한 진통제, 수술 전 2일부터 수술 후 3일까지 최종 농도 1 mg/mL
장비
폴리에틸렌 목 쿠션	주문		충격 중 엎드린 자세 지지
Sterotaxic Impactor Silupran Cover	주문		기계적 하중 분산, 충격기 끝부분에 부착, 830 kPa, 두개골 국소 손상 방지
Streotaxic Impactor	Leica Biosystems	39463923/IM10131	제어된 충격 전달을 위한 전자기 충격 장치
도구
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, USA
Kinovea		(버전 2025.2.0)
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, USA	NA