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연구 논문

성장 인자 방출을 조절하기 위해 코발라민과 알파-토코펠롤을 이용한 혈소판 풍부 섬유 농축

116 조회수

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DOI:

10.3791/71016

⸱

2026년 5월 22일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology, Faculty of Dentistry, University of Cukurova, 2Department of Biology, Faculty of Medicine, University of Cukurova

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 원심분리 전에 코발라민과 알파-토코페롤 농축을 통해 혈소판 풍부한 섬유브린을 생물학적으로 미세 조정하는 접근법을 설명하며, 시험 관 내에서 성장 인자와 사이토카인 방출을 조절할 수 있게 합니다.

초록

혈소판 풍부 섬유린(PRF)은 생체 적합성과 성장 인자의 지속적인 방출 덕분에 재생 치과에서 널리 사용되는 자가 생체학적 생체재료입니다. 최근 연구는 PRF의 기본 준비 원리를 변경하지 않고 재생 성능을 향상시키기 위해 생물학적으로 조절하는 쪽으로 전환되고 있습니다. 본 연구는 원심분리 전 코발라민과 알파-토코페롤 농축을 통해 PRF를 생물학적으로 미세 조정하는 프로토콜을 제시하고, 시험관 내에서 성장 인자 및 염증성 사이토카인 방출에 미치는 영향을 평가합니다. 건강한 자원봉사자들로부터 채취한 말초혈액 샘플은 고정 원심분리 프로토콜로 처리되었습니다. 코발라민 또는 알파-토코펠롤은 원심분리 전에 전혈에 첨가되어 생체활성 변형 PRF 매트릭스를 얻었습니다. 혈소판유래성장인자(PDGF), 형질전환 성장인자-β1(TGF-β1), 혈관 내피 성장인자(VEGF), 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1), 섬유아세포 성장인자-2(FGF-2), 인터루킨-1β(IL-1β), 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 방출 프로필을 효소 결합 면역흡착 분석법을 통해 24시간과 72시간에 정량하였다. 코발라민 강화 PRF는 TGF-β1 수치의 그룹 간 유의미한 차이와 염증성 사이토카인 방출 감소와 연관되어 재생 미세환경으로의 전환을 시사하였다. 반면, FGF-2와 IGF-1에서 관찰된 증가는 시간에 따라 모든 그룹에서 감지되었으나 코발라민 특이적 효과는 나타나지 않았습니다. 알파-토코페롤 풍부 PRF는 VEGF 방출이 선택적으로 증가하여 잠재적인 조혈관 생성 영향을 시사합니다. 이 발견들은 표적 비타민 풍부화가 PRF 생활성의 조절을 조절하면서도 자가영양 및 항응고제가 없는 특성을 유지할 수 있음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 PRF를 생물학적으로 미세 조정하는 실용적인 틀을 제공하며, 미래의 중개 및 임상 응용을 위한 조정 가능한 재생 플랫폼으로서의 사용을 지원합니다.

서론

혈소판 풍부 피브린(PRF)은 생체 적합성, 조제 용이성, 성장 인자의 지속적 방출 능력 덕분에 치주학, 임플란트 치과, 구강외과에서 널리 채택된 2세대 자가 혈소판 농축체입니다 1,2. PRF는 항응고제나 외인성 활성화제를 사용하지 않고 전혈을 원심분리하여 얻어, 혈소판과 백혈구를 포획하는 3차원 섬유 기질 형태를 만듭니다. 이 세포 구성 요소들은 혈소판유래 성장인자(PDGF), 형질전환 성장인자-β1(TGF-β1), 혈관 내피 성장인자(VEGF), 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1), 섬유아세포 성장인자-2(FGF-2) 등 성장 인자의 내인성 저장소 역할을 하며, 조직 재생 중 혈관신생, 세포 이동, 증식, 세포외기질 재형성을 함께 조절합니다 3,4.

생물학적 조성을 넘어, PRF의 재생 성능은 섬유 네트워크 구조와 세포 구성 요소의 생물학적 활성에 의해 강한 영향을 받습니다. 이러한 이유로 최근 연구들은 기존의 준비 프로토콜을 넘어 PRF를 수동적인 교대가 아닌 생물학적으로 조율 가능한 운반 시스템으로 개념화하기 시작했습니다 5,6. 히알루론산과 콜라겐을 포함한 생체재료의 도입과 같은 구조 변형 전략은 PRF의 물리적·기계적 특성을 변화시킬 수 있음을 입증했으며, 이는 섬유 조직, 기계적 안정성, 성장 인자 방출 반응학의 변화로 이어집니다7. 이러한 발견은 PRF가 특정 재생 요구에 적응할 수 있다는 증거가 점점 늘어나는 데 기여했습니다.

생체재료 기반 접근법과 병행하여, 비타민 기반 농축은 PRF 생활성 조절을 위한 생물학적으로 중요한 전략으로 부상하고 있습니다. 비타민은 신진대사, 산화환원 균형, 콜라겐 합성, 혈관신생, 염증 신호 전달과 같은 기본 세포 과정을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 특히 아스코르빈산, 콜레칼시페롤, 코발라민, 알파-토코페롤과 같은 비타민은 세포 행동과 조직 치유에 뚜렷한 분자 경로를 통해 영향을 미치는 것으로 나타났습니다8. 이전 시험 관 내 연구들은 비타민 강화 PRF 제형이 성장인자 방출 프로필, 염증성 사이토카인 발현, 섬유린 기질의 생체역학적 특성을 조절할 수 있음을 입증했으며, 이는 비타민 보충이 PRF의 자가적 특성을 변경하지 않고 생물학적으로 변형하는 효과적인 방법임을 시사합니다9.

코발라민(비타민 B12)과 알파-토코페롤(비타민 E)은 조직 항상성과 수리와 관련된 주요 생물학적 과정에 관여하는 필수 미량 영양소입니다. 비타민 B12는 핵산 합성, 세포 대사, 적혈구 생성에 중요한 역할을 하며, 비타민 B12 결핍은 구강 점막 변화와 치주 조직 분해와 관련이 있습니다10,11. 비타민 E는 지질 과산화를 제한하고 산화 스트레스를 줄이며 콜라겐 안정화와 염증 반응 조절에 기여하는 강력한 항산화제로 작용합니다12,13. 중요한 점은, 본 연구가 PRF의 다양한 생물학적 및 생리적 조절자를 탐구한 이전 연구를 기반으로 하지만, 원심분리 전에 코발라민과 알파-토코페롤을 농축하기 위한 독특한 프로토콜을 도입했다는 점입니다. 따라서 본 연구의 목적은 코발라민 및 알파-토코페롤 풍부 PRF 제조 프로토콜을 재현 가능하게 설명하고, 이 생체 활성 미세 조정 접근법이 시험관 내에서 성장 인자 및 염증성 사이토카인 방출에 미치는 영향을 평가하는 것입니다.

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프로토콜

이 실험 연구는 헬싱키 선언에 명시된 윤리 원칙에 따라 수행되었으며, 추쿠로바 대학교 임상 연구 윤리 위원회(승인 번호: 139/25)의 승인을 받았습니다. 날짜: 2023년 12월 8일). 참여 전에 모든 참가자는 연구 절차에 대해 안내받았고, 각 참가자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 인간 혈액 샘플이 포함된 모든 절차는 기관 생물안전 규정을 준수하였다. 장갑, 마스크, 실험실 코트 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)가 실험 과정 전반에 걸쳐 사용되었습니다. 생물학적 물질은 무균 처리되었으며, 모든 폐기물은 확립된 생물학적 위험 관리 프로토콜에 따라 처리되었습니다. 이 연구에 사용된 모든 시약, 소모품 및 장비는 재료표에 나열되어 있으며, 제조업체 정보와 재현성을 보장하기 위한 관련 사양도 포함되어 있습니다.

1. 참가자 선발
참가자들은 20세에서 30세 사이의 전신적으로 건강한 성인 중에서 연구 절차를 충분히 준수한 것으로 모집되었습니다. 전신 질환, 혈액학적 질환 또는 혈소판 기능이나 상처 치유에 영향을 미치는 질환이 있는 개인은 자격이 없다고 판단되었습니다. 추가 제외 기준으로는 임신 또는 수유 중, 현재 흡연, 최근 감염, 코발라민 또는 알파-토코페롤에 대한 알려진 과민증, 그리고 최근 6개월 이내에 혈소판 활성에 영향을 줄 수 있는 비타민 보충제나 약물 사용이 포함되었습니다. 생물학적 변동성을 줄이기 위해 정상적인 기초 혈액학 소견을 가진 자원봉사자만 등록했으며, 모든 참가자는 PRF 준비 적합성을 확인하기 위해 포함 전에 평가를 받았습니다. 예비 탐색적 임상 연구로서, 본 연구는 연구 기간 동안 적격 참가자의 가용성과 타당성을 기준으로 표본 크기를 사용했으며, 12명의 참가자 샘플을 분석하였습니다.

2. 혈액 채취 및 그룹 배분
각 참가자로부터 무첨가제 10 mL 유리관을 무균 조건에서 말초정맥혈을 채취하였습니다. 참가자 한 명당 총 5개의 튜브가 확보되었습니다. 한 튜브는 완전 혈구 수치 분석에 할당되었고, 한 튜브는 혈청 코발라민과 알파-토코페롤 수치를 측정하는 데 사용되었습니다. 나머지 세 개의 튜브는 혈소판 풍부 섬유빈(PRF) 준비에 할당되었습니다. 이 중 한 튜브는 첨가물 없이 대조군 PRF로 사용되었고, 한 튜브는 원심분리 전에 코발라민(1 mL)을 투여하여 코발라민 농축 PRF를 얻었으며, 한 튜브는 원심분리 전에 알파-토코페롤(0.5 mL)을 투여하여 알파-토코페롤 강화 PRF를 얻었습니다. 코발라민은 멸균 주사 용액(1000 μg/mL)으로, 알파-토코펠롤은 앰풀 형태(2 mL)로 투여되었습니다. 모든 샘플은 조기 응고를 방지하기 위해 혈액 채취 직후 즉시 처리되었습니다.

3. PRF 준비
각 참가자로부터 멸균되고 항응고제가 없는 유리관을 사용하여 말초 정맥 혈액 샘플을 채취하였습니다. 채취 직후 튜브는 원심분리기에 넣어 지체 없이 처리하여 조기 응고를 방지했습니다. 원심분리는 고정 각도 로터 시스템을 사용하여 2700 rpm(708 × g)에서 12분간 실온에서 수행되었습니다. 원심분리가 완료된 후, 세 개의 뚜렷한 층이 관찰되었습니다: 하부 적혈구 분획, 상부 혈소판 부족층, 그리고 중간 피브린 혈전인 혈소판 풍부 피브린(PRF)입니다. PRF 혈전은 멸균 기구를 사용해 적혈구층에서 신중히 분리하여 추가 처리를 위해 분리했습니다. 농축된 PRF 그룹을 준비하기 위해, 표준화된 조건에서 원심분리 직전에 지정된 첨가제를 혈액 샘플에 주입했습니다. 이 접근법은 혈전 형성 과정에서 생체 활성 화합물을 발달 중인 피브린 기질에 포함시키는 것을 가능하게 했습니다(그림 1).

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그림 1: PRF 샘플 획득 방법론적 절차를 보여주는 플로우차트. 원심분리 전에 혈액 샘플에 코발라민(A) 1mL와 알파-토코페롤(B) 0.5mL가 첨가되었습니다. 결과적으로 PRF 샘플은 튜브(C) 내에서 적혈구층(D)에서 분리된 후 채취됩니다. 최종 코발라민 강화 PRF (E) 및 알파 토코페롤 강화 PRF (F). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. PRF 샘플의 시험관 내 배양
각 PRF 혈전은 멸균 튜브로 옮겨졌고, 모든 샘플 전반에 일관된 확산 환경을 보장하기 위해 혈전 1g당 1 mL(1:1, v/w)의 표준 비율로 세포 배양 배지를 첨가했습니다. 튜브들은 궤도 셰이커에 올려져 37°C에서 총 72시간 동안 배양하여 PRF 매트릭스에서 성장 인자와 사이토카인이 점진적으로 방출되도록 했습니다. 상청액은 24시간과 72시간에 채취되어 멸균 마이크로튜브에 옮겨 −80 °C에서 저장하여 추가 분석을 기다렸습니다. 세포 배양지는 외부 성장 인자의 간섭을 피하고 모든 측정된 생체분자가 오직 PRF 기질에서만 유래하도록 하기 위해 혈청 보충 없이 사용되었습니다.

5. 성장 인자 ELISA 분석
수집된 상청액 내 혈소판유래 성장인자(PDGF), 형질전환 성장인자-β1(TGF-β1), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2), 인터루킨-1β(IL-1β), 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 농도는 제조사 지침에 따라 효소 결합 면역흡착 검사 키트를 사용해 정량하였습니다. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450 nm에서 흡광도 값을 측정했고, 분석 농도는 표준 보정 곡선을 기반으로 계산되었습니다.

6. 통계 분석
통계 분석은 IBM SPSS Statistics for Windows(버전 20.0)를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 해당 ± 표준편차와 중앙값(최소-최대값)으로 표현되었습니다. 데이터 분포의 정규성은 Shapiro–Wilk 검정을 사용하여 평가하였다. 그룹 내 비교는 쌍 t-검정 또는 Wilcoxon 부호 순위 검정을 사용했으며, 그룹 간 비교는 분산 반복 측정 분석 또는 Friedman 검정을 사용하였습니다. p-값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

모든 참가자에서 대조군, 코발라민 및 알파-토코페롤 풍부 혈소판 풍부 피브린(PRF)의 성공적인 제제가 이루어졌습니다. 거시적 검사 결과, 잘 구조화된 PRF 혈전이 형성되었고, 섬유균 완전성이 보존되어 충분한 기계적 안정성을 지니어 표준화된 취급, 배양, 이후 생화학적 분석이 가능해졌습니다(표 1).

...
변수들시간그룹집단 간 비교그룹(시간)
방제코발라민

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토론

본 연구는 혈소판 풍부 피브린(PRF)이 원심분리 전에 코발라민과 알파-토코페롤을 대상으로 한 표적 농축을 통해 생물학적으로 미세 조정될 수 있음을 입증하여, 성장 인자와 사이토카인 방출 프로필의 뚜렷하고 재현 가능한 조절을 가능하게 합니다. 이러한 발견은 PRF가 단순한 수동적 자가적 비계가 아니라, 재생 특성을 신중하게 선택한 생체 활성 개입을 통해 기본 준비 원리를 바꾸지 않고 조절할 수 있는 생물학적으로 반응하는 매트릭스라는 진화하는 개념을 강화합니다.

PRF는 주로 3차원 섬유 구조 내에 내장된 혈소판 및 백혈구 유래 성장 인자의 지속적 방출을 통해 재생 잠재력을 발휘합니다. 이 섬유 네트워크의 구조와 포획된 세포 구성 요소의 생물학적 활성은 성장 인자 방출의 크기와 시간적 역학을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 맥락에서 섬유 중합 전 생체 활성 농축은 PRF<...

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알파-토코페롤 (비타민 E)AKSU 파르마, 이스탄불, 터키A11HA03앰플 EVIGEN 2 mL
원심분리기 (40° 고정 각도 로터)프랑스 니스, PRF 절차913023410238듀오 원심분리기
코발라민 (비타민 B12)데바 홀딩, 이스탄불, 터키  B03BA01앰플 DODEX 1000 mcg/mL 
에펜도르프 튜브악시겐PCR-02-C200개짜리
유리 혈액 채취관헤마 & 지하철 (터키 이스탄불)HNM8080그리고 nbsp; (10 mL) 항응고제 없음
HRP 솔루션ELISA 키트에 포함되어 있습니다
인간 ELISA 키트 - FGF우한 파인 바이오텍EH0541파인 테스트
인간 ELISA 키트 - IGF-1우한 파인 바이오텍ER0030정식 테스트 
인간 ELISA 키트 - PDGF우한 파인 바이오텍ER1240정식 테스트 
인간 ELISA 키트 - TGFβ-1우한 파인 바이오텍EH0287파인 테스트
인간 ELISA 키트 - VEGF우한 파인 바이오텍EH0327파인 테스트
인간 IL-1&베타; 엘리사 키트우한 파인 바이오텍EH0185파인 테스트
인간 TNF-&α; 엘리사 키트우한 파인 바이오텍EH0302파인 테스트
마이크로피펫 및 팁에펜도르프31230000631세트
마이크로플레이트 리더바이오크롬EZ 리드 400450 nm
궤도 셰이커스튜어트 SSM3미니 자이로-록
정밀 스케일사르토리우스H51-D1조각
RPMI-1640 세포 배양 배지하이클론, 시티바, 미국SH30027.01500 mL
멸균 가위ASA 덴탈 (이스탄불, 터키)0305-11조각
해결책 중단ELISA 키트에 포함되어 있습니다
기질 솔루션ELISA 키트에 포함되어 있습니다
워시 버퍼ELISA 키트에 포함되어 있습니다

참고문헌

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