광혈전성 뇌졸중 모델링과 행동하는 쥐의 신경 및 성상세포 활동의 생체 내 옵트로드 기록을 위한 통합 방법

요약

이 프로토콜은 바이러스 전달, 광혈전 이식, 광혈전 유도, 성상교세포 및 신경세포 활동의 동시 기록, 성상교세포의 광유전학적 자극을 포함하는 통합 방법을 제공합니다. 이 통합 방법은 허혈성 뇌졸중의 급성기부터 만성기까지의 성상교세포-뉴런 관계를 동시 조사하는 것을 목표로 합니다.

초록

허혈성 뇌졸중 이후 성상교세포-뉴런 역학 연구는 뇌졸중 후 회복 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 현재의 방법론은 특정 행동 과제를 수행하는 동물에서 뉴런과 성상교세포 간의 실시간 상호작용을 포착하지 못하는 경우가 많아, 뇌졸중 병리의 급성기 연구가 제한적입니다. 이 프로토콜은 광혈전성 뇌졸중 모델링과 동시에 다중 채널 전기생리학 기록 및 각성 상태에서 행동하는 쥐의 섬유 광도 측정을 결합한 통합 방법을 제시합니다. 프로토콜에는 광혈전증을 통한 국소 허혈 유도와 동시에 신경 스파이크 및 성상세포성 칼슘 과도성 기록이 포함됩니다. 옵트로드는 별도의 수술 없이 광혈전증, 칼슘 신호 기록, 광유전학적 조작을 동시에 전달할 수 있게 합니다. 대표적인 결과는 성상세포 칼슘 신호와 신경 스파이킹의 동시 기록에 성공함을 입증합니다. 성상세포의 광유전학적 조작은 신경세포 발화 패턴에 측정 가능한 변화를 일으킵니다(피라미드 뉴런의 발화 빈도가 1.55 ± 0.45 Hz, 인터뉴런이 3.64± 1.37 Hz로 감소함으로, 광유전학적 자극 이전 시 n=2 대비). 이는 이 시스템이 성상교세포-뉴런 상호작용을 조사할 수 있음을 확인시켜 줍니다. 이 통합 접근법은 행동하는 동물의 급성기부터 만성기까지의 실시간 다중 모달 기록을 제공함으로써 뇌졸중 연구 방법론의 중요한 공백을 해소합니다.

서론

허혈성 뇌졸중은 전 세계적으로 주요 보건 과제로 남아 있으며, 전 세계적으로 사망률과 장기 후천성 장애의 주요 원인 중 하나입니다 ^1,2,3. 허혈성 뇌졸중과 관련된 높은 장애율은 운동 마비, 감각 상실부터 인지 기능 장애에 이르기까지 다양한 임상 증상과 연관되어 ^{있습니다.} 허혈성 뇌졸중의 병리학적 및 회복 메커니즘에 대한 깊은 이해가 시급히 필요합니다. 신경 기능 부전을 넘어, 최근 성상교세포의 치명적인 기능 망전이 부각되었습니다 ^7,8. 가장 풍부한 교세포인 성상교세포는 중추신경계와 삼분 시냅스의 필수 구성 요소입니다. 허혈성 연쇄 과정의 모든 단계에서 성상교세포는 필수적인 역할을 하며 신경 및 기능 회복에 깊은 영향을 미칩니다 ^9,10,11. 건강한 뇌에서는 성상교세포와 뉴런이 삼분형 시냅스를 통해 기능적으로 결합되어 있으며, 이 과정에서 성상세포 과정이 시냅스 전후 말단을 덮고 시냅스 전달에 적극적으로 참여합니다 ^7,8. 성상교세포는 흥분성 아미노산 수송체를 통해 세포외 글루타메이트 농도를 조절하고, Kir4.1 채널을 통해 칼륨 항상성을 유지하며, 칼슘 의존적 엑소사이토시스를 통해 글리오전달물질 방출을 통해 시냅스 강도를 조절합니다 ^7,8. 이 맥락에서 성상세포 내 칼슘 과도성은 성로세포 활동을 나타내며 신경 발화와 밀접하게 연관되어 있습니다^. 허혈성 뇌졸중 동안에는 이 미세하게 조율된 관계가 빠르게 끊깁니다. 에너지 손실 후 이온 구배가 붕괴되면 대량의 글루타메이트 방출과 확산되는 탈분극이 일어나며, 이로 인해 흥분독성 신경 손상과 반응성 성상교세포의 증식이 일어^납니다. 경색 코어 내외의 성상교세포는 칼슘 과부하, 글루타메이트 재흡수 장애, 시냅스 결합 상실, 그리고 글리오전달물질¹³ 분비 실패 등 일련의 병리학적 변화를 겪습니다. 동시에, 뉴런이 생존력과 막 전위 무결성을 잃으면서 뉴런의 스파이킹 활동이 크게 억제된다^14,15. 경막 주위에서는 생존한 뉴런과 반응성 성상교세포가 뇌졸중 후 회복 결과를 결정하는 데 결정적인 역동적 상호작용을 하는 것으로 여겨집니다; 그러나 깨어 있는 행동하는 동물의 실시간 전기생리학적 상관관계와 칼슘 상관관계는 여전히 불완전하게 분석되어 있다^13,16. 따라서 성상세포 활동을 뉴런 신호와 나란히 이해하는 것은 허혈성 손상 후 신경 기능 회복의 초석으로 여겨집니다.

광혈전증은 널리 사용되는 허혈 모델입니다; 광감성 염료와 국소 광을 이용해 특정 표적 부위에 허혈성 병변을 유도합니다¹⁷. 현재의 뇌졸중 모델링 및 기록 프로토콜은 세 가지 주요 기술적 병목 현상에 의해 뇌졸중 후 성상교세포-뉴런 상호작용 연구를 방해하고 있습니다:^{17, 18, 19}. 모델링과 기록의 분리는 대부분의 현재 프로토콜에서 흔히 발생하는 단점으로, 모델 구축과 실시간 신호 기록 사이에 시간 간격이 발생합니다^20,21. 그러나 허혈성 뇌졸중 후 몇 분에서 몇 시간 사이에는 뉴런과 성상교세포가 극심한 변동을 겪는 필수적인 시기입니다^12,22. 허혈성 사건 직후 성상교세포-뉴런 상호작용을 동시에 모니터링하지 않으면 허혈성 뇌졸중의 효과적인 조기 개입 연구가 크게 지연될 것입니다. 현재 프로토콜의 추가적인 한계는 기록 방식의 격리에 있습니다; 대부분의 현재 방법론은 단일 신호 유형에 최적화되어 있습니다. 예를 들어, 다채널 전기생리학은 신경세포 발화와 국소 필드 전위(LFP)를 감지하지만, 교세포의 신호 전달 상태에는 무시되어 있습니다^15,16. 반대로, 생체 내에서 성상세포 역학을 모니터링하는 방법도 있습니다. 칼슘 영상은 성상세포 변동을 포착하지만 신경 발화 데이터는 없습니다. 현재 프로토콜의 마지막 병목 현상은 동물의 기록 상태인 것으로 보입니다; 대부분의 프로토콜에서는 동물이 마취되거나 자유롭게 움직이는 상태입니다. 하지만 운동 기능 장애는 뇌졸중 후유증 중 가장 골치 아픈 후유증 중 하나로 간주됩니다; 특정 행동과 성상교세포-뉴런 사건 간의 연관성을 이해하는 것이 필수적입니다. 따라서 특정 행동 검사를 수행하는 깨어 있는 쥐에서 성상교세포와 신경세포 신호를 동시에 포착하면서 광혈전성 뇌졸중 모델을 수행할 수 있는 통합 방법이 시급히 필요합니다. 기존 방법론은 각각 이러한 요구사항 중 일부만 다룹니다. 2광자 칼슘 영상은 온전한 뇌 내 성상세포 미세도메인 역학을 탁월한 공간 해상도로 제공하지만, 동물을 고정하거나 마취해야 하므로 자연주의적 행동 평가가 불가능하며, 동시에 다채널 신경 스파이^{크 데이터를 포}착할 수 없다. 독립형 섬유 광도측정은 자유롭게 행동하는 동물에서 성상산성 칼슘 모니터링을 가능하게 하지만, 신경 발화 패턴에는 무감각하여 회로 기능¹⁶의 전기생리학적 판독을 제공하지 않습니다. 다채널 세포외전기생리학은 뉴런 단위와 국소 필드 전위의 급증 활동을 높은 시간 해상도로 해결하지만, 성상교세포의 신호 전달 상태에 대한 정보는 제공하지 않습니다¹⁵. 그러나 이러한 접근법 중 어느 것도 정확히 국소화된 광혈전성 뇌졸중을 유도하면서 동일한 해부학적 부위에서 중단 없이 다중 모달 기록을 수행할 수는 없습니다.

기존의 기술적 한계를 해결하기 위해 이 통합 시스템을 제안합니다. 이 시스템은 만성 이식 장치 내에서 세 가지 제한을 모두 해결하여, 동시에 광혈전증 유도, 섬유 광도계에 의한 성상세포 칼슘 기록, 그리고 뇌졸중 발병 순간부터 만성 단계까지 깨어 있는 자유롭게 행동하는 쥐에서 다채널 신경 전기생리학을 가능하게 합니다. 이 방법의 실현 가능성은 성상교세포 특이적 칼슘 지표와 광유전학적 바이러스 벡터를 발현하는 맞춤형 옵트로드를 쥐 뇌에 만성적으로 이식함으로써 검증되었습니다. 이 방법을 사용하면 성상산성 칼슘 과도기와 신경 발화 활동이 행동 과제와 광유전학적 조절 하에서 동시에 기록되고 분석됩니다.

프로토콜

이 프로토콜은 광저우 중의약대학(00379474) 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며, 국립보건원(NIH)의 실험동물 관리 및 사용 가이드가 설계한 지침과 규정에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용되는 동물 수를 최소화하기 위해 가능한 모든 조치를 취했습니다.

1. 바이러스 벡터 전달

참고: 이 절에서는 성상교세포 특이적 AAV 벡터를 운동 피질(M1FL)에 입체주입하는 과정을 설명합니다. 목적은 옵트로드 이식 전에 GCaMP6s 칼슘 지표와 옵토-vTRAP 광유전학적 구조물을 안정적이고 성상교세포 특이적으로 발현하는 데 있습니다. 주요 장비: 입체 프레임, 디지털 버니어 시스템, 유리 마이크로피펫, 마이크로 주입 펌프.

1. 마우스를 유도실에 넣으세요; 마취 유도 시 3%–4% 이소플루란으로 시작하며, 이소플루란 농도를 첫 1분 동안 최대 5%까지 올려 쥐가 반응하지 않을 때까지 조절할 수 있습니다.
   주의: 이소플루란은 휘발성 마취제입니다. 모든 시술은 능동 환기 상태에서 수행하세요. 장기간 개인 노출을 피하세요.
2. 마우스를 마취 마스크가 장착된 입체 프레임으로 옮기고, 1–2% 이소플루란을 사용해 깊은 마취면을 유지합니다.
3. 호흡 리듬, 손 반사, 발가락 집힘 등을 통해 10분마다 마취 깊이를 확인하세요. 피드백 제어 가열 패드로 마우스 체온을 36–37.5 °C로 유지하세요.
4. 수술 중 각막 손상을 예방하기 위해 눈에 안과 연고를 바르세요.
5. 마우스를 귀 막대와 입 모양 프레임에 고정하세요. 귀 모양 막대를 조정해 마우스 머리가 대칭적으로 고정되도록 하세요. 머리를 부드럽게 고정해 고정하세요.
6. 제모 크림으로 머리카락을 철저히 제거하고, 수술용 가위로 중앙선 절개를 하여 두개골을 노출하세요. 식염수와 면봉으로 골막을 청소하여 브레그마와 람다를 노출시키세요.
7. 유리 마이크로피펫을 내리고 Bregma와 Lambda를 차례로 만지게 합니다; 디지털 버니어의 Z좌표를 주목하세요. 마우스 바를 조정해서 차이가 <0.04mm가 되도록 하세요.
8. 유리 마이크로피펫을 내리고 브레그마에 닿게 한 후 디지털 버니어를 0으로 재설정하세요. 마이크로피펫을 브레그마 좌우로 2.3mm 차례로 이동시키고; 디지털 버니어의 Z좌표를 주목하세요. 양쪽 차이가 <.04 mm가 되도록 귀 막대를 조정하세요.
9. 브레그마에서 디지털 버니어를 0으로 재설정하고 운동 피질(M1FL; AP: +1.5 mm, ML: +0.74 mm). 0.5mm 드릴 비트(둥근 팁)가 장착된 마이크로드릴을 사용해 표시된 위치에 약 0.5mm 직경의 작은 구멍을 뚫습니다. 뇌 조직 출혈과 손상을 피하기 위해 조심스럽게 드릴을 진행하세요; 시추 과정에서 발생하는 열을 보상하기 위해 얼음처럼 차가운 식염수를 떨어뜨립니다.
10. 마이크로 주입 펌프에 부착된 유리 마이크로피펫을 목표 부위(뇌 표면에서 -0.94 mm 떨어진 곳)로 내립니다. 로딩 전에 AAV9-GfaABC1D-GCaMP6s와 AAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP을 같은 양으로 혼합하여 바이러스 혼합물을 준비합니다. 혼합물의 400 nL(각 벡터당 200 nL)을 분당 50 nL의 속도로 주입합니다.
    참고: 바이러스 칵테일에는 200 nL 성상교세포 특이적 칼슘 지표(AAV-GfaABC1D-GCaMP6s, 1.0 × 10¹³ vg/mL)와 200 nL 성상교세포 특이적 광유전적 바이러스 벡터(AAV-GfaABC1D-opto-vTrap, 1 ×^{10 13}vg/mL)가 포함되어 있습니다. GFAP에 대한 면역형광 염색을 통해 일부 동물에서 성공적인 성상교세포 특이적 전도가 확인되었으며, GFAP 양성 세포와 형광 리포터의 공동 위치와 GFAP 음성 세포에서는 발현이 없음이 확인되었습니다.
    주의: AAV 벡터는 재조합 생물학적 제제입니다; 기관의 생물안전 지침에 따라 모든 바이러스 매개체와 폐기물을 처리합니다.
11. 주입이 끝난 후 피펫을 10분간 그대로 두어 바이러스 확산을 개선하고 역류를 방지하세요. 피펫을 천천히 빼내고, 두피를 봉합하세요(4-0, 20mm, 3/8 원), 마우스를 온열 패드 위에 올려놓아 완전히 회복하세요.
    참고: 최적의 바이러스 발현을 위해서는 3주에서 4주 사이의 기간이 필요합니다. 프로토콜의 상세 연대표는 그림 1A에 나와 있습니다.

2. 옵트로드 검사 및 기능 검증

참고: 이식 전에 맞춤 제작된 옵트로드는 물리적 검사와 광학 검사를 거쳐 광혈전증, 광유전자극, 섬유 광도계 등 세 가지 기능 모드 모두에서 빛을 전달할 수 있는지 확인해야 합니다. 주요 장비: 현미경, 광출력 계, 532 nm, 488 nm, 470 nm, 405 nm 레이저 광원.

1. 오프트로드의 물리적 검사:
   1. 제작된 오프트로드를 현미경 아래에 두어 기록 부위의 배치를 점검하세요.
   2. 16개의 텅스텐 마이크로와이어가 균일하게 묶여 중앙 광섬유를 둘러싸도록 하세요. 전기 단락을 일으킬 수 있는 구부러지거나 교차하는 전선이 있는지 확인하세요.
   3. 광섬유 끝이 텅스텐 마이크로와이어보다 짧은지 확인하세요(그림 1B).
      참고: 광섬유 팁은 전^{극 팁에서} 100-200 μm 정도 후퇴해야 합니다. 이 오프셋은 Lee et ^al.22에서 채택하여, 광원이 녹음 영역을 충분히 덮으면서도 과도한 광전 잡음을 방지하도록 보장합니다. 연구자들은 자신의 오프트로드 하에서 적절한 오프셋을 실증적으로 검증하도록 권장됩니다.
2. 광섬유를 레이저 모델링 소스와 기록 소스에 연결합니다. 광 파워 미터를 사용해 다음 세 가지 기능 모드에 대해 광섬유 팁의 출력을 측정합니다(그림 1B):
   1. 광혈전 모델링 모드: 시스템이 고강도 연속파(CW) 빛(532 nm)을 전달할 수 있는지 검증합니다.
      참고: 이 실험에는 NA 0.22가 포함된 섬유가 사용됩니다. 섬유 끝 아래 100–200 μm 지점의 추정 조명 점 직경은 약 200–400 μm입니다. 끝부분의 전력이 >20 mW에 도달하도록 하여 로즈 벵갈의 성공적인 활성화와 혈전 형성을 보장하세요.
   2. 광유전학적 조작 모드: 펄스 레이저 출력(예: 광-vTrap의 488nm 레이저)을 테스트합니다.
      참고: 끝부분에서 전력을 10 mW로 보정하세요; 이는 운동 피질 0.94mm 깊이에서 OPTO-vTRAP 활성화에 최적화되어 있습니다. 다른 뇌 영역의 경우에는 행동 또는 전기생리학적 검증이 권장됩니다.
   3. 광섬유 광도측정(칼슘 기록) 모드: 저출력 여기광(예: 470 nm 및 405 nm)을 테스트합니다.
      참고: 장기 기록 시 칼슘 지표(예: GCaMP6s)의 광독성과 광표백을 최소화하기 위해 출력이 매우 낮은 수준(<50 μW)으로 안정적으로 유지되도록 하십시오.

3. 만성 옵트로드 이식

참고: 이 섹션은 바이러스 주사 부위에 옵트로드를 만성적으로 이식하는 수술 절차를 다룹니다. 주입 좌표의 정확한 위치는 기록 전극과 광섬유가 GCaMP6 영역과 광-vTRAP 발현을 측정하도록 보장하는 데 매우 중요합니다. 주요 장비: 입체 프레임, 마이크로드릴, 겸자, 두개골성형 나사, 아가로스 젤, 치아 시멘트.

1. 마취, 입체고정, 두개골 준비, 균형 잡기 시 1절에서 설명한 동일한 절차를 따르지만, 두피 절개 시 두피 주변 피부가 충분한 부분을 유지하면서 두피의 1.5 cm × 1.5cm를 제거합니다.
2. 두개골을 과산화수소와 0.9% 식염수로 세척하세요. 브레그마를 식별하고 디지털 버니어를 0으로 재설정하세요.
3. 드릴(0.8mm, 둥근 팁)을 사용해 두개골 표면을 가볍게 거칠게 만들어 치과 시멘트의 접착력을 높이세요.
4. 운동 피질에 마커(M1FL; AP: 1.5 mm, ML: 0.74 mm), 그 후 이를 중심점으로 사용해 5 mm × 5 mm 정사각형을 그립니다(그림 1C).
   1. 마이크로드릴을 적절한 속도(약 10000rpm)로 사용해 정사각형을 따라 그려보세요. 고속 시추에서 발생하는 열을 상쇄하고 뇌 조직 손상을 방지하기 위해 드릴 경로에 얼음처럼 차가운 식염수를 지속적으로 투하하세요. 뼈판이 느슨해지면 즉시 중단하세요(그림 1C).
5. 반대쪽 반구와 소뇌 위에 직경 0.5mm의 작은 구멍 세 개를 뚫고, 그 구멍에 두개골성형 나사를 삽입하세요. 각 나사가 경막에 도달하도록 하되, 추가 삽입과 뇌 조직에 추가적인 손상을 방지하세요(그림 1C).
6. 이전에 느슨해진 뼈 판을 핀셋으로 제거하세요. 뇌 조직 손상을 막고 경막을 온전하게 유지하기 위해 제거 시 추가 하향 힘을 피하세요.
   참고: 출혈이 있을 경우, 지혈 스펀지를 사용해 신속하게 출혈을 멈출 수 있습니다.
7. 초가운 팁(<0.03mm ×0.01mm)을 가진 겸자를 사용해 두개골 창문에서 경막을 제거합니다. 이 과정에서 겸자 끝이 뇌 조직에 직접 눌리지 않도록 주의하세요.
   참고: 뼈를 제거한 후에는 뇌 조직을 촉촉하게 유지하는 것이 매우 중요합니다. 시술이 진행되지 않을 때는 건조로 인한 부기와 신경 손상을 피하기 위해 멸균된 식염수에 적신 면봉을 사용하는 것이 권장됩니다.
8. 옵트로드를 입체 프레임의 미세조작 팔에 고정하고 두개창 위로 옮긴다. 옵트로드의 은색 접지선과 기준선을 세 개의 두개골성형 나사에 단단히 얽으세요(그림 1C).
9. 전극 삽입을 방해할 수 없는 출혈이나 혈전이 없는지 확인하기 위해 멸균 생리식염수로 두개골 창문 표면을 청소하세요. 옵트로드를 원하는 깊이(DV: -0.94 mm)로 천천히 1 μm/s 속도로 낮춥니다.
   참고: 노출된 피질 조직은 착상 시 멸균 식염수로 적셔야 합니다.
10. 이식 후 두개골 창문 위에 아가로스 층을 발라서 치과 시멘트로부터 피질 조직을 보호하세요.
11. 노출된 두개골을 덮기 위해 3–4겹의 치과 시멘트를 발라, 옵트로드 전체가 고정되도록 하세요. 치아 시멘트가 단단해지면 마우스를 입체주격 프레임에서 제거하세요(그림 1C).
12. 3–5일간 진통을 투여하고 1–2주간 회복할 시간을 준 후 기록 및 모델링을 진행하세요.

4. 광혈전 모델링 및 동시 기록

참고: 이 절에서는 행동 습관화, 기초 기록, 광혈전증에 의한 뇌졸중 유도, 뇌졸중 후 종단 기록 절차를 설명합니다. 광혈전증은 이식된 옵트로드를 통해 전달되며, 동시에 전기생리학과 섬유 광도 측정 기록이 유지됩니다. 주요 장비: 로타로드 장치, 그립 강도 측정기, 광섬유 광도 측정 시스템, 다중 채널 신경 기록 시스템, 로즈 벵갈 염료, 530nm 레이저 광원.

1. 마우스가 모델링하기 전에 행동 훈련을 받게 하세요.
   참고: 모든 동물은 표준화된 실험실 조건에서 수용 및 검사를 받았습니다. 주거 환경: 실내 온도 20–25 °C, 상대 습도 50%–60%, 12시간 빛/어둠 주기 (조명은 07:00에 켜짐). 연구 기간 내내 동물들은 자유롭게 음식과 물을 섭취할 수 있었습니다. 모든 검사와 수술 절차는 라이트 단계에서 수행되었습니다. 행동 기록 세션은 빛 위상 동안 매일 일정한 시간에 수행되어 신경 활동과 성상산성 칼슘 역학의 생체 변동을 최소화하였습니다. 녹음 구역도 20–25°C의 주변 온도로 유지되었습니다.
   1. 로타로드 테스트에서는 마우스가 회전하는 막대 위에서 3번 연속 5분간 계속 달리게 하고, 로타로드가 5분 동안 4RPM에서 40RPM으로 가속하게 합니다.
   2. 그립 강도 테스트에서는 쥐가 앞발로 테스트 바를 당기는 법을 배우게 하고, 결과가 10% 미만으로 변동하는 세 번의 연속 시도를 완료하게 하세요.
2. 광섬유 광도 측정을 위한 데이터 수집 매개변수를 설정하세요.
   1. 칼슘 지시자를 여기시키기 위해 이중 또는 3파장 광섬유 광도 측정 시스템(예: GCaMP6s)을 사용하세요. GCaMP6의 경우, 신호 채널을 470nm, 제어 채널을 405nm로 설정하여 운동 아티팩트와 자가형광을 보정하세요.
      참고: 광표백과 광독성을 방지하기 위해 광섬유 끝의 출력이 20–40 μW 사이인지 확인하기 위해 기록 레이저 출력을 다시 테스트하는 것이 매우 중요합니다.
   2. 데이터 수집 샘플링 속도를 60–100 Hz로 설정하면, 성상세포성 칼슘 과도기를 포착하기에 충분합니다.
3. 다중 채널 전기생리학의 데이터 수집 매개변수를 설정하세요.
   1. 녹음 시스템 내 모든 부품(그립 강도 테스트 장치와 케이지 포함)이 잡음을 줄이기 위해 제대로 접지되었는지 확인하세요. 녹화 시 공통 중앙값(CMR)을 사용하여 전역 아티팩트를 제거하세요.
      참고: 전력선 간섭이 없고 움직임 아티팩트로 인한 잡음이 최소화되는지 확인하기 위해 기록 시스템의 신호 스펙트로그램 뷰를 확인하는 것이 매우 중요합니다. 큰 움직임 아티팩트는 이식 수술 중 나사와 접지선 고정의 고장을 나타낼 수 있습니다.
   2. 녹음 소프트웨어에서 광대역 신호와 LFP 신호가 선택되었는지 확인하고, 녹음 세션 중 발생하는 노이즈를 모니터링하세요.
4. 기초 기록을 수행하세요.
   1. 60초 이내에 이소플루란으로 잠시 마취; 어댑터를 통해 오프트로드를 녹음 라인에 연결합니다.
   2. 쥐를 집 케이지 같은 환경에 두어 녹화하고, 깨어난 후 10분간 적응을 기다려 주세요.
   3. 그립 강도 테스트와 동시에 녹화를 수행하면, 마우스는 5분간 1분마다 테스트 바를 당겨야 합니다.
   4. 데이터 정렬을 위해 다중 채널 및 광섬유 광도 측정 시스템 모두에서 동작 테스트가 정확히 타임스탬프를 찍도록 해야 합니다(그림 1D).
5. 광혈전 모델을 구축하세요.
   1. 1.5% 로즈 벵갈 염료 용액을 복막 내 10–20 mg/kg의 용량으로 투여하고, 조영제가 피질 혈관을 통해 순환할 때까지 5분간 기다립니다.
      주의: 로즈 벵갈은 광감성 염료입니다. 시약을 밝은 주변 빛으로부터 보호하세요. 다룰 때는 장갑과 눈 보호구를 착용하세요.
   2. 앞서 설명한 유도 및 유지 매개변수에 따라 아이소플루란으로 마취합니다.
   3. 마우스가 깊은 마취면에 있고 마취 마스크로 유지되면, 옵트로드의 광학 프로브를 레이저 소스에 연결합니다.
   4. 이식된 옵트로드를 통해 15 mW 530 nm 레이저 빔을 5–8분간 전달하여 국소 허혈을 유도합니다.
      주의: 15 mW에서 530 nm 레이저는 위험합니다. 모든 연구자는 레이저 안전 안구 보호구를 착용해야 합니다. 광혈전증 중에는 절대 섬유 끝을 직접 들여다보지 마세요.
6. 뇌졸중 후 기록을 수행하세요.
   1. 마우스를 가열된 패드 위에 올려놓아 회복하세요. 쥐가 완전히 깨어나면(보통 10분 이내), 첫 번째 뇌졸중 후 급성 기록을 시작하세요.
   2. 질병 진행 상황을 면밀히 모니터링하기 위해 매일 반복 기록하세요.
7. 광유전학적 조작을 수행하세요.
   1. 칼슘 신호 기록과 허혈성 유도를 위한 레이저 빔 방출 외에도, 옵트로드는 대표적인 결과에서 알 수 있듯이 광유전학적 자극도 제공할 수 있습니다(그림 4).
   2. 옵트로드를 적절한 레이저 파장과 파워(이 경우 488 nm, 10 mW, Opto-vTrap 5분)를 가진 옵토제네틱 레이저 자극기에 연결하고, 자극기를 켜서 옵토제네틱 조작을 수행합니다.

5. 다중 모달 데이터 분석 파이프라인

참고: 이 섹션에서는 다중 채널 전기생리학 데이터(스파이크 분류), 성상세포 칼슘 신호(ΔF/F 계산), 그리고 두 데이터 스트림의 교차 모달 정렬 처리 작업 흐름을 개괄합니다. 필요한 소프트웨어: Plexon 오프라인 분류기(오프라인 스파이크 분류 소프트웨어), NeuroExplorer(신경 데이터 분석 소프트웨어), RWD OFRs(광섬유 광도 측정) 분석 소프트웨어.

1. 신경 스파이크 분류 (플렉슨 시스템):
   1. 원시 .pl2 파일을 오프라인 스파이크 정렬 소프트웨어에 가져오세요. 디지털 고대역폭 통과 필터(<300 Hz)를 적용하여 고주파 스파이크 활동을 분리합니다.
   2. 전압 임계값(일반적으로 노이즈의 -5 표준편차)을 설정하여 잠재적 스파이크를 감지합니다.
   3. 수동 스크리닝과 노이즈 파형의 검증 후, 오프라인 스파이크 분류 소프트웨어의 스캔 기능을 사용하여 주성분 분석(PCA)을 수행하여 파형을 그룹화하고 서로 다른 뉴런 클러스터를 스캔^합니다.
   4. 스파이크 간격(ISI) 히스토그램을 검사하세요. 각 '단일 유닛'의 ISI 위반률이 <1%(회복 기간을 반영)로 설정하도록 하세요. ISI 위반률은 오프라인 스파이크 분류 소프트웨어의 각 유닛 왼쪽 상단에 표시됩니다.
   5. 정렬된 타임스탬프를 신경 데이터 분석 소프트웨어로 내보내세요. 신경 데이터 분석 소프트웨어에서 속도 히스토그램과 사건 주점 히스토그램 대 시간 함수를 사용하여 속도 히스토그램과 자극 주점 시간 히스토그램(PSTH)을 생성합니다.
   6. 신경 데이터 분석 소프트웨어의 통계 섹션에서 각 단위의 평균 파형 길이와 평균 발화율을 출력하여 추가 분석을 수행합니다.
2. 성상산성 칼슘 신호 처리 (광섬유 광도 분석 소프트웨어)
   1. 분석 소프트웨어에서 원시 형광 데이터(신호용 470nm 채널, 모션 제어용 410nm 채널)를 엽니다.
   2. 광도 측정 시스템의 전처리 섹션에서 모션 보정을 위해 410 nm를 제어하고, 평활화 계수를 8로 설정하며, PLS Fit 을 기준선 보정으로 선택합니다.
   3. 형광 변화(ΔF/F)를 공식²⁵를 사용하여 계산합니다:
      
   4. 이벤트 타임스탬프를 기반으로 한 성상교세포 칼슘 신호 분석을 수행하고, 시각화를 위한 이벤트 전 전 데이터를 추출하며(예: 히트맵 및 평균 추적), 곡선 아래 면적(AUC)을 계산합니다.
3. 동기화된 성상교세포-뉴런 상관관계
   1. 공유된 행동 사건 타임스탬프를 시간 0으로 사용하여 뉴런 스파이크와 성상교세포 칼슘 신호를 정렬합니다.
   2. 주점 사건 데이터를 추출한 후, 두 데이터 스트림을 이 공유 시간 0점에 정렬하고 성상교세포-뉴런 상관관계를 시각화합니다(그림 3).

결과

실험 연대표

그림 1 은 실험 일정과 주요 수술 기준점을 요약합니다. 바이러스 주입과 optrode 이식 사이에 3주간의 간격이 적절한 GCaMP6s 발현을 달성하는 데 매우 중요하며, 뇌졸중 유도 전 기초 기록 기간 동안 섬유 광도 측정 흔적을 검사하여 강력한 성상산성 칼슘 신호를 확인해야 합니다.

광혈전 모델링의 다차원 검증

국소 허혈의 유도는 생체 내 증거, 조직학적, 행동학적 증거로 뒷받침됩니다.

레이저 스펙클 영상은 조명 영역 내에서 뇌혈 관류 감소의 실시간 증거를 제공합니다. 뇌졸중 후 혈류 확인을 위한 레이저 스펙클 조영 영상(LS...

토론

여기서 설명하는 통합 프로토콜은 허혈성 뇌졸중 진행 중 성상교세포-뉴런 상호작용 연구에 중요한 진전을 가져왔습니다. 광혈전 유도와 실시간 광전기생리학적 모니터링 및 광유전학적 조작을 결합함으로써, 이 방법론은 뇌졸중 발병과 신경세포 및 성상교세포의 회로 수준 재조직 관찰 사이의 간극을 효과적으로 메운다. Boyce 등의 최근 연구는 자유롭게 행동하는 쥐에서 뇌졸중 중 섬유 광도계와 전기생리학 기록을 결합하는 것이 가능함을 입증하여, 이 맥락에서 다중 모달 접근법의 가치를 확인시켜 주었습니다. 현재의 통합 옵트로드 시스템은 동일한 이식 장치 내에 성상교세포의 광유전학적 조작을 통합하여 기록 방식으로는 불가능한 성상교세포-뉴런 상호작용의 인과적 조사를 가능하게 하여 이 개념을 확장^합니다.

그림 1에 표시된 기록 설정은 기록과 행동 과제를 결합할 수 있는 샘플 설정을 제공하는데, o...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2% TTC 염색 용액	Solarbio	G3005
Agorose	Biosharp	BS081
체온 유지 시스템 / 체온 모니터	RWD life Science	69002
두개골 나사	Zhongke Huida	23092007
데이터 수집 및 분석 소프트웨어(파이버 광도계)	RWD life Science	ORFs
데이터 수집 및 분석 소프트웨어(다중 채널 전기생리학)	Plexon	PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer
디지털 실험실 스테레오탁틱 프레임	RWD life Science	68804
핀셋	FST	11252-00	핀셋 직경 0.005 mm ´ 0.025 mm
레이저 전력 미터	Sanwa	LP10
레이저 스펙클 혈류 이미징 시스템	Pericam AB	Pericam PSI NR
마우스	Risemice	C57BL/6J
소형 휴대용 두개골 드릴	RWD life Science	78001
마우스 바이러스 마이크로 인젝터	RWD life Science	68025
옵트로드	사용자 정의	Kedou	16개의 텅스텐 전극과 1개의 광섬유로 구성된 사용자 정의
Prism	GraphPad	5.01 버전
R studio	Posit	버전 4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s	BrainVTA	PT-2560	성상교세포 특이적 칼슘 표지자
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap	BrainCase	BC-2446	성상교세포 특이적 광유전학 바이러스 벡터
로즈 벤갈 염료	Sigma-Aldrich	198250	혈전 유도용 광민감 염료/Sigma-Aldrich
트롤리 장착형 마취 워크스테이션	RWD life Science	R520	마우스용 제어 가능한 흡입 마취를 위한 마취기