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방법 논문

초기 혈관 내 감염 중 쥐 폐에서 희석된 위영양성 결핵 균의 생명체 내 영상

96 조회수

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DOI:

10.3791/71019

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2026년 6월 30일

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1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 2Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine, 6Cancer Dormancy Institute, Albert Einstein College of Medicine, 7Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center

이 논문에서

요약

여기서는 BSL-2 승인 마이코박테리움 결핵 증의 감쇠 체내 영상 프로토콜을 제시합니다. 영구 폐 창을 이용한 쥐 폐 내 스트레스. 이 접근법은 동일한 폐 미세환경 내에서 세균 위치, 혈관 역학, 대식세포 흡수 등 초기 숙주-병원체 상호작용의 종단적 단일 세포 분해 분석을 가능하게 합니다.

초록

생명체 내 현미경은 온전한 조직 내에서 동적인 세포 과정을 직접 시각화할 수 있게 합니다. 그러나 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)에 대한 적용은 생물안전 레벨 3(BSL-3) 격리 요건과 고해상도 영상을 위한 폐 안정화의 기술적 도전 과제로 인해 제한을 받았습니다. 여기서는 흉부 고해상도 마우스 폐 영상 창(WHRIL)과 BSL-2 조건에서 사용이 승인된 유전적으로 정의된 삼중영양성 Mtb 균주인 mc27902를 결합한 프로토콜을 제시합니다. 또한 mc27902의 tdTomato 발현 유도체인 mc28471의 생성, 정맥 내 감염 준비, 그리고 리포터 마우스에서의 인체 생체 영상 응용도 설명합니다. 이 시스템은 감염 후 첫 3일 동안 같은 폐 미세환경에서의 신속한 세균 진입, 응집, 폐 실질로의 확산, 대식세포 흡수 등 초기 감염 역학을 실시간으로 시각화할 수 있게 합니다. 이 접근법은 단일 세포 해상도로 균과 숙주-병원체 상호작용을 종단적으로 영상화할 수 있게 함으로써, 기존 영상 및 고격리 모델의 주요 한계를 극복합니다. 이 프로토콜은 폐 내 감쇠된 마이코박테리아의 실시간 인내 생체 영상을 위한 실용적인 BSL-2 호환 플랫폼을 제공하며, 박테리아 생리학, 숙주 인식, 면역 매개 제거에 대한 기전 연구의 기초를 마련합니다.

서론

고해상도 생체 현미경은 세포 이동, 혈관 상호작용, 면역 감시를 단일 세포 해상도 1,2,3,4로 직접 시각화함으로써 온전한 조직 내 동적 세포 행동 연구를 혁신했습니다. 이러한 접근법은암 연구에 널리 사용되고 있지만, 호흡 운동, 조직 취약성, 생물안전성 제약으로 인해 폐 감염에 적용되는 데 한계가 있습니다. 진공 안정화 및 영구 삽입형 광학 창을 포함한 흉부 영상 플랫폼의 최근 발전은 장기간 동안 폐 미세환경을 안정적이고 움직임 없는 영상으로 제공함으로써 이러한 기술적 도전 과제들을 많이 해결했습니다 6,7,8,9,10 . 특히 영구 이식 창문은 혈관 흐름, 면역 세포 역학, 단세포 행동을 수시간에서 몇 주에 걸쳐 반복적으로 시각화할 수 있게 해주며, 암 전이, 혈관 투과성, 면역 감시의 메커니즘 규명에 중요한 역할을 해왔습니다11,12.

이러한 발전에도 불구하고, 생체 내 생체 포유류 폐에서 마이코박테리움 결핵(Mtb) 감염에 단일 세포 해상도로 적용된 적은 이전에 없습니다. 가장 가까운 선례는 다른 환경에서 미코세균 감염의 생체 내 영상 촬영에서 나옵니다. 제브라피시배아 13에서 Mycobacterium marinum 감염의 실시간 영상은 초기 대식세포 상호작용과 육아종 시작을 밝혀냈으며,14,15 마우스 간 내 BCG 유도 육아종의 2광자 영상은 육아종 발달 중 대식세포와 T 세포 역학을 확인했으며, 육아종 병변 내에서 항원 제시와 T 세포 효과기 기능이 제한적임을 보여주었습니다. 이 연구들은 마이코박테리아 숙주-병원체 상호작용에 대한 기초 통찰을 확립했으나, 완전한 포유류 폐에는 접근하지 못했습니다 8,16.

생체 내 영상 기법은 일반폐 영상 8, 순찰 중인 폐포 대식세포가 면역계로부터 박테리아를 숨길 수 있음을 밝혀내고 인간 폐에서 SARS-CoV-2 감염에 대한 즉각적인 골수계 반응을 규명하는 연구를 포함한 다른 감염성 및 생물학적 맥락에서도 폐에 적용되었습니다.. 인체 내 영상은 인플루엔자 감염 폐에도 유사하게 적용되어 감염된 폐 조직 내 동적인 면역 세포 행동을 직접 시각화할 수 있게 되었습니다18,19.

섬유광학 미세내시경 흥분20과 리포터 효소 형광 기술21,22를 이용한 전신 광학 영상 접근법은 마우스 폐에서 Mtb의 민감한 검출을 가능하게 했으나, 개별 또는 소규모 박테리아 군집을 검출하거나 박테리아 군집 역학을 추적하거나 온전한 폐 조직 내에서 마이코박테리아와 숙주 세포 간의 직접적인 상호작용을 시각화하는 것은 불가능합니다. 감염된 폐를 대상으로 BSL-3 환경에서 고격리 인내 활력 영상 기법이 도입되었으며, 여기에는 SARS-CoV-2 감염23 및 Mtb 집중24 다광자 영상 플랫폼이 포함됩니다. 이 연구들은 감염된 폐를 격리 상태에서 촬영하는 것이 가능함을 입증하지만, 이러한 장비는 기술적으로 까다롭고 널리 접근 가능하지는 않습니다. 악성 Mtb 연구는 BSL-3 억제가 필요하며, 이는 인체 생체 영상 촬영에 상당한 공학적 및 생물안전 문제를 제기합니다 23,24. 그 결과, 초기 Mtb 감염 연구의 대부분은 폐 내 박테리아 행동의 공간적·시간적 역학을 포착할 수 없는 정적인 종점 분석에 의존합니다.

유전적으로 정의되고 BSL-2 승인된 삼중영양 Mtb 균주 개발은 이러한 한계를 극복할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. mc27902 균주는 H37Rv의 판토텐산-류신-아르기닌 Mtb 보조 유도체로, 완전히 감쇠되어 면역 저하 마우스에서 복제되지 않고, 고전적인 산 순성 염색을 유지하며, 정상 파지 감수성을 보이며, BSL-3시설 외부에서도 안전하게 취급할 수 있습니다. 이러한 특성들은 mc27902를 낮은 생물안전성 봉인 하에서 인트라바이벌 영상 접근법을 확립하고 초기 숙주-병원체 상호작용을 탐구하는 데 이상적인 대체체로 만듭니다.

여기서는 삼중영양형 Mtb 변종 mc27902의 형광 tdTomato 발현 유도체인 mc28471을 이용한 폐 고해상도 영상 창(WHRIL)을 적용하여 온전한 쥐 폐에서 초기 Mtb 감염을 시각화합니다. 면역 저하 Rag2-/- 마우스26과 MacBlue 마우스27을 교배하여 Csf1r 프로모터가 단핵구, 미세아교세포 및 수지상 세포 및 대식세포 하위 집합에서 증강 청록색 형광 단백질(ECFP)의 발현을 유도하는 실험이 수행되었습니다. 맥블루 형질전환유전자는 초기 Mtb 감염 시 단핵 식세포 집단을 명확히 시각화할 수 있게 합니다. 우리는 Rag2 결핍 마우스를 사용하여 가장 초기 선천적 숙주-병원체 상호작용에 시스템을 집중시키고, 여기서 검토한 짧은 영상 시간 동안 적응 면역 반응의 복잡성을 피하기로 결정했습니다. 중요한 점은 이 기술이 Rag2 결핍 마우스에만 국한되지 않고 면역 기능이 있는 동물에서도 시행될 수 있다는 것입니다.

영구적인 폐 창과 BSL-2 호환 형광 감쇠 Mtb 균주를 결합함으로써, 이 플랫폼은 동일한 폐 미세환경에서 단일 세포 해상도로 여러 날에 걸쳐 박균-숙주 세포 상호작용의 연속 생체 영상을 가능하게 합니다. 초기 감염에 대해 여기서 입증되었지만, 이 플랫폼 자체는 본질적으로 초기 시점에만 제한되지 않으며, 실험 모델과 연구 설계에 따라 이후에도 적용될 수 있습니다. 이 영상 플랫폼의 성공적인 적용은 여기서 설명된 특정 형광 세균 제제의 사용에 달려 있으므로, 해당 시약을 생성하고 준비하는 데 필요한 필수 단계를 전체 프로토콜의 일부로 포함시켰습니다. 이 플랫폼은 생체 내 Mtb 행동을 직접 실시간 영상화하며, 박테리아 생리학, 숙주 인식, 면역 매개 제거에 관한 향후 기전 연구의 기반을 마련합니다.

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프로토콜

모든 절차는 기관의 생물안전 및 동물 관리 지침에 따라 수행되었으며, 알버트 아인슈타인 의과대학 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 균주 mc28471은 bcl-2 사용이 승인된 삼중 영양성 Mtb 균주인 mc27902의 pYUB1169 변형체입니다. 살아있는 박테리아를 대상으로 한 모든 작업은 마이코박테리아 취급에 대한 표준 예방 조치를 취하였습니다.

1. BSL-2 승인 tdTomato 발현 MTB 품종 mc28471 건조

  1. 플라스미드 형질전환을 통한 tdTomato 발현 BSL-2-safe mc28471 생성
    1. BSL-2 승인 삼중영양 균주 mc27902를 g13 프로모터에서 발현된 tdTomato 유전자를 포함하는 episomal 균세균 플라스미드 pYUB1169와 형광 유도체 mc28471을 생성합니다.
    2. 멸균된 Middlebrook 7H9 100 mL에 MC27902 100 μL 접종(광학 밀도 600 nm 0.7-1.0)에 OADC 농축제(10% (v/v)), 글리세롤(0.2% (v/v)), D-판토텐산염(24 mg/L), L-류신(50 mg/L), L-아르기닌(200 mg/L), 프로피오네이트 나트륨(0.1 mM), 틸록사폴(0.05% (v/v))을 보조하여 30 mL 잉크병에 접종합니다.
    3. 배양을 37°C에서 천천히 흔들며(100rpm) 배양하여 OD600 nm 0.7-1.0에 도달할 때까지 진행합니다.
    4. 세포를 15mL 원뿔형 원심분리관에 옮겨 3,000 x g 의 실온에서 10분간 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포를 0.05% (v/v) 틸록사폴 함유 10mL의 멸균 10% 글리세롤에 재현탁합니다(세척 #1). 원심분리와 세척을 2번 반복하세요. 세포 펠릿을 0.175mL 10% 글리세롤에 재현탁하고, 0.05% (v/v) 틸록사폴을 포함하고, pYUB1169 DNA 2 μL(100-200 ng DNA)을 추가합니다.
    5. mc27902와 pYUB1169를 0.2cm 전기천공 쿠벳에 옮깁니다. 10분만 기다려. 큐벳을 2회에서 3번 두드려 기포를 제거하고, 실온에서 2,500 mV, 1,000 Ω, 25 μF, 시간 상수 20 ms로 전기공공합니다.
    6. 멸균 미들브룩 7H9 1mL에 OADC 농축제(10% (v/v)), 글리세롤(0.2% (v/v)), D-판토텐산염(24 mg/L), L-류신(50 mg/L), L-아르기닌(200 mg/L), 프로피오네이트 나트륨(0.1 mM), 틸록사폴(0.05% (v/v))을 첨가한 후 쿠벳 내용물을 15 mL 원뿔형 원심분리관으로 옮깁니다. 튜브를 37°C에서 흔들면서 하룻밤 동안 부양하세요.
    7. 변형 혼합물 0.1mL를 OADC 농축제(10% (v/v)), 글리세롤(0.2% (v/v)), D-판토테네이트(24 mg/L), L-류신(50 mg/L), L-아르기닌(200 mg/L), 프로피오네이트 나트륨(0.1 mM), 카나마이신(20 mg/L)을 첨가한 Middlebrook 7H10 한천 플레이트에 플레이트 부착합니다. 남은 형질 혼합물을 원심분리하여 상청액 0.9mL를 버린 후, 세포 펠릿을 잔류 상정액에 재현탁합니다. 재현탁된 세포를 동일한 보충제와 항생제가 포함된 두 번째 Middlebrook 7H10 한천 플레이트에 판을 부착합니다. 플레이트를 37°C에서 3–4주간 배양하세요. 분홍색 군집은 성공적인 변형체를 나타냅니다.
    8. 분리된 분홍색 군락 하나를 골라 37°C에서 천천히 흔들며, 멸균된 미들브룩 7H9 5mL에 OADC 농축제(10% (v/v)), 글리세롤(0.2% (v/v)), D-판토테네이트(24 mg/L), L-류신(50 mg/L), L-아르기닌(200 mg/L), 나트륨 프로피오네이트(0.1 mM), 틸록사폴(0.05% (v/v)), 20 mg/L 카나마이신을 보충하여 30 mL 잉크병에 배양합니다.
  2. 정맥 감염을 위한 mc28471 준비
    1. 멸균된 Middlebrook 7H9에서 37°C에서 MC28471 10mL를 천천히 흔들며, OADC 농축제(10% (v/v)), 글리세롤(0.2% (v/v)), D-판토테네이트(24 mg/L), L-류신(50 mg/L), L-아르기닌(200 mg/L), 프로피오네이트 나트륨(0.1 mM), 틸록사폴(0.05% (v/v)), 20 mg/L 카나마이신을 30 mL 잉크병에서 중간 로그 단계까지 배양합니다(OD600 nm는 0.7에서 1.0 사이).
    2. 세포를 15mL 원뿔형 원심분리관에 옮기고, 상온에서 3,000 x g에서 10분간 원심분리합니다. 상원액을 버리고 세포를 0.05% (v/v) 틸록사폴(PBS-T, 세척 #1)이 포함된 멸균 인산염 완충 생리식염수 10mL에 재현탁합니다. 원심분리와 세척을 2번 반복하세요. 세포 펠릿을 PBS-T 4mL에 재현탁한 후, 100W, 2x1,000J로 세포를 초음파 처리합니다.
    3. 배양물의 광학 밀도를 측정하고 PBS-T로 희석하여 최종 농도는 주입당 5 x 106 CFUs로 만들고, OD600 nm 1이 1 x 108 CFU/mL에 해당하는 대략적인 변환을 사용합니다. 이 관계는 변형률과 성장 조건에 따라 달라질 수 있으므로, OD600 nm는 정확성과 재현성을 보장하기 위해 도금 CFU 값에 대해 경험적으로 보정되어야 합니다.

2. 생체 내 영상을 위한 마우스의 영구 폐 창 이식

  1. 인체 영상 촬영을 위해 Rag2KO 맥블루 마우스를 준비하세요. 이 연구에서는 10주 된 수컷 쥐, 몸무게 30g을 사용했습니다. 하지만 생후 8-12주 사이의 생쥐와 예상 체중 범위 내에 있는 생쥐는 이 수술에 적합하다. 이 균주는 Rag2 노크아웃 배경에서 대식세포에서 증강 청록 형광 단백질(ECFP)을 발현하며, B6.129S6-Rag2tm1FwaN12 마우스(Rag2, 모델 RAGN12)와 Tg(Csf1r-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J 마우스(Stock No. 026051)를 교배하여 생성되었습니다.
  2. 박테리아 감염 24시간 전에 폐 고해상도 영상 촬영 창(WHRIL)을 이식하여 폐에 안정적인 광학적 접근을 제공하고 영상 촬영 전 회복을 돕습니다.
  3. 유도 챔버에서 5% 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 시술을 시작하기 전에 충분한 마취 깊이를 확인하고, 수술 및 영상 촬영 내내 동물을 관찰하여 통증, 고통, 호흡 장애를 예방하세요.
  4. 수술 전 진통제 투여: 무균 PBS 90 μL에 희석된 부프레노르핀 10 μL(0.1 mg/kg)을 피하 주사합니다.
  5. 마취 중 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르세요.
  6. 22G 카테터 밑부분에 2-0 실크 봉합사를 묶어 ~2인치 꼬리를 남겨 카테터를 고정하세요.
  7. 봉합 카테터로 쥐를 삽관하세요. 환광으로 기관 개구를 시각화하고, 양측 가슴 상승기(팽창 전구)로 위치를 확인하세요.
    참고: 부적절한 삽관은 기도 손상이나 환기 부족을 일으킬 수 있습니다. 양측 흉부 확장술로 올바른 위치가 확인된 후에만 진행하세요.
  8. 삽관 성공 후 2-0 실크 봉합사를 주둥이에 묶어 삽관 카테터를 고정하세요. 카테터를 인공호흡기에 연결하세요.
  9. 마우스를 오른쪽 측면 직정 자세로 가열된 수술 플랫폼 위에 올려 왼쪽 흉부를 노출시키고, 앞다리, 뒷다리, 등을 테이프로 고정하여 시술 내내 안정적인 위치를 유지하세요.
  10. 수술 기간 동안 이소플루란을 3%로 줄이세요. 제모 크림을 사용해 왼쪽 상흉부의 털을 제거합니다.
  11. 수술 부위를 소독 용액으로 준비하세요. 피부를 들어 올리고 생검 펀치(33-35-SH)로 흉골 왼쪽 약 7mm, 늑하 가장자리 위 7mm 지점에 5-10mm 원형 절개를 하며, 6번째 에서 7번째 늑간공간 중앙에 위치합니다.
  12. 노출된 부위를 점검하여 표면 혈관이 있는지 확인하세요. 눈에 보이는 혈관을 분할해야 할 경우, 양쪽 끝을 지져서 지혈을 유지하세요. 흉강으로 들어가기 전에 위에 덮인 연조직을 제거하여 갈비뼈를 명확히 노출시키세요.
  13. 6번 또는 7번 갈비뼈를 겸자로 잡고 들어 올린 후, 무딘 미세 해리 가위(둥근 면을 폐를 향해 있음)로 그 사이의 늑간근을 부드럽게 찔러 흉강 안으로 들어가세요.
    참고: 폐, 늑간혈관 또는 주변 조직을 찢지 않도록 흉강 안으로 부드럽고 직접 시야를 바라보며 들어가야 합니다.
  14. 늑간구에 짧고 부드러운 압축 공기를 가해 인접한 폐 표면을 일시적으로 공기를 빼고 흉벽에서 분리시키고 창문 개구부를 만듭니다.
  15. 생검 펀치를 절단 도구에 위치시키고, 흉벽과 평행하게 유지하여 가슴 사이 구멍을 통과하도록 유도합니다. 갈비뼈에 5mm 원형 결손을 뚫어.
  16. 원형 결손 가장자리에서 ~1mm 떨어진 곳에 5-0 실크 가방 끈 봉합사를 끼워 인접한 갈비뼈 사이를 통과해 구멍을 감싸세요.
  17. 창틀을 가슴벽 결함의 가장자리가 틀의 홈에 맞게 맞춰 고정한 후, 가방 끈 봉합을 조이고 고정해 프레임을 고정하세요.
  18. 시아노아크릴레이트 젤 접착제를 1mL 주사기에 주입하세요. 프레임을 부드럽게 들어 폐에서 분리한 후, 프레임 하단에 얇은 시아노아크릴레이트 접착제를 발라주세요.
  19. 폐 표면을 연속적이고 부드러운 압축 공기 흐름으로 건조시켜 표면이 무광처럼 보일 때까지 유지합니다.
    참고: 부드러운 공기 흐름만 사용하고 장기간 건조는 피하세요. 과도한 힘이나 과도한 건조는 폐 표면을 손상시키고 창문 접착력을 방해할 수 있습니다.
  20. 양압 호기압(PEEP)을 사용하여 폐를 팽창시키고 창문을 프레임에 부착합니다. PEEP를 놓고 창틀에 20-30초 정도 압력을 유지하세요.
    참고: 팽창 또는 프레임 배치 시 과도한 압력은 폐를 손상시키거나 밀봉을 손상시킬 수 있습니다. 부드러운 압착을 얻기 위해 필요한 최소한의 압력만 가하세요.
  21. 피부 절개 가장자리에서 <1mm 지점에 5-0 실크 가방끈 봉합사를 두 번째 넣으세요. 피부를 창틀 아래에 넣고, 남은 피부가 창틀 아래에 갇히거나 다듬어지도록 한 뒤, 가방 끈 봉합을 단단히 조이고 단단히 묶으세요.
  22. 진공 픽업을 사용해 5mm 커버슬립 밑면에 아주 얇은 접착제층을 발라서 직사각형 커버 유리 가장자리에 남은 접착제를 긁어내세요. 다시 한 번, 압축 공기를 연속적이고 부드러운 공기 흐름으로 폐 표면을 건조시킵니다.
  23. 원형 커버슬립을 창틀 움푹 들어간 곳에 폐 표면에서 얕은 각도(~15°)로 위치시킵니다. 폐를 부풀리기 위해 기도 압력을 잠시 높인 후, 커버슬립을 평행한 위치로 회전시켜 폐 표면이 유리 밑면과 맞닿도록 합니다. 접착제가 굳는 동안 약 25초간 부드러운 압력을 유지한 후 진공 픽업을 커버슬립에서 분리하세요.
    참고: 커버슬립 설치 시 기포를 가두거나 과도한 접착제를 바르는 것은 이미지 품질을 떨어뜨리거나 밀봉을 방해하거나 폐 표면을 손상시킬 수 있으므로 피해야 합니다.
  24. 커버슬립과 금속 프레임 사이의 접면부에 소량의 액체 시아노아크릴레이트를 발라하여 밀폐를 강화합니다.
  25. 멸균 바늘을 1mL 인슐린 주사기에 연결하세요. 바늘을 상골 돌기 바로 아래에 삽입하고 횡격막을 통해 왼쪽 어깨 쪽으로 흉강 쪽으로 이동시킵니다. 잔여 흉부 공기를 제거하기 위해 부드럽게 흡입하세요.
    참고: 바늘을 조심스럽게 밀어 폐, 심장 또는 주요 혈관을 뚫지 않도록 주의하세요. 잔여 공기가 제거될 때까지 부드럽게 흡입하세요.
  26. 이소플루란을 끄고 100% 산소로 환기를 계속하여 거의 정상 깨어 있을 때까지 유지하세요. 회복 중에는 동물을 혼자 두지 마세요. 정상적인 자연호흡이 즉시 재개되지 않으면 적절한 지지 치료를 제공하거나 기관 지침에 따라 안락사하십시오.
  27. 봉합선을 제거하고 쥐를 기관 내 삽관으로 제거한 뒤, 깨끗하고 따뜻한 우리에 넣어 회복하세요. 동물이 완전히 보행할 때까지 관찰; 정상적인 호흡을 회복하지 못한 쥐는 기관 지침에 따라 안락사되어야 합니다.
  28. 수술 후 진통제 투여: 무균 PBS 90 μL에 희석된 부프레노르핀 10 μL(0.1 mg/kg)을 피하 주사합니다.

3. 활체 내 영상

  1. 영상 촬영 전에 생쥐가 창문 이식 후 회복할 시간을 주세요. 수술 후 1일에서 5일 사이에 영상 검사를 하세요.
  2. 3% 이소플루란으로 마취를 유도한 후 영상 촬영 기간 동안 1.5% 유지 마취.
  3. 맞춤형 스테이지 플레이트-윈도우 프레임 어댑터를 피부와 폐 창틀 프레임 외곽 가장자리 사이에 삽입하고, 표준 현미경 스테이지 플레이트를 접착 테이프로 고정합니다.
  4. 마우스를 현미경 변환 단계에 맞춤형 스테이지 플레이트-윈도우 프레임 어댑터가 부착된 상태로 배치하세요. 온도 센서 피드백 루프가 있는 강제 공기 가열 챔버를 사용해 체온을 ~37 °C로 유지하세요.
  5. 마우스를 스테이지 플레이트에 올린 상태에서 주입 쪽 눈 주변 피부를 부드럽게 뒤로 젖혀 내안각을 노출시키고, FITC-덱스트란(150 kDa; 20 mg/mL, 100 μL)을 역안과 주입하여 혈관을 표지합니다.
  6. 다음 매개변수를 사용하여 박테리아 주입 전 폐 혈관의 스냅샷, z-스택 또는 타임랩스 이미지를 획득할 수 있습니다.
    1. 공초점 현미경 설정: 비트 깊이: 12비트, 프레임 속도: 2 fps, 이미지 크기: 512 × 512 픽셀, 픽셀 크기: 0.497 μm/pixel, 0.994 μm/픽셀, Z-단계 크기: 2 μm, 총 z-깊이: 50–70 μm, 프레임 평균 3, 스캔 속도: 2 μs/픽셀 (977 라인/초), 레이저 여기 파장: 405 nm, 488 nm, 559 nm, 시료 내 레이저 파워: 230 μW (405 nm), 75 μW (488 nm), 40 μW (559 nm), 검출 필터: 430-470 nm (청색), 505-540 nm (녹색), 575-675 nm (적색), 검출기 이득: 청색 800 V, 녹색 650 V, 적색 700 V, 핀홀 직경: 60 μm 또는 559 nm 1 에어리 단위
    2. 다광자 현미경에서는 공초점 현미경과 동일한 영상 파라미터를 사용하지만, 시료에는 25 mW 레이저 출력의 920 nm 여기 레이저가 사용되었습니다.
  7. 역방향 주입 5 x 106 CFU tdTomato-발현 mc28471.
    참고: 후안과 주사는 적절한 훈련과 자제가 있어야 하며, 부적절한 기술은 안구 손상, 출혈 또는 접종 실패를 초래할 수 있습니다.
  8. 3.6.1 및 3.6.2의 영상 매개변수를 사용하여 결핵 및 형광 표지 세포 및 혈관의 스냅샷, z-스택, 타임랩스 이미지를 획득합니다. 모든 검출기의 이득을 조정하여 신호를 극대화하면서도 검파기 포화를 피하세요.
  9. 영상 촬영 후에는 이소플루란을 끄고 마우스를 현미경에서 제거하세요. 마우스를 따뜻하게 유지하고 완전히 회복할 때까지 모니터링하세요.
  10. mc28471 주사 후 0-60분, 6시간, 3일에 영상 검사를 반복하세요. 각 영상 촬영 시에는 혈관을 시각화하기 위해 FITC-덱스트란(100 μL, 역안도 투여)을 재주입한 후, 3.8-3.9단계에서 설명한 대로 영상을 획득합니다.

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결과

전기천공과 카나마이신 선택 후, 분리된 mc28471 집락에서 밝은 붉은 형광을 보여 안정적인 tdTomato 발현을 확인하였습니다. MC28471 박새를 증식하여 단일 세포 현탁액으로 준비한 후 수술로 이식된 WHRIL을 가진 쥐에게 정맥 주사로 투여하였습니다. 폐 미세환경에서 초기 Mtb 감염 역학을 시각화하기 위해 활력 내 영상을 수행하였습니다. 본 연구에서는 감염 전 폐혈관의 기초 영상을 촬영한 후(그림 1A), 60분 이내, 6시간, 그리고 MC28471 주입 후 3일 이내에 Rag2-× MacBlue 마우스에 촬영했습니다(그림 1B-D, 그림 2A-B, 그림 ...

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토론

이 플랫폼은 BSL-2 조건에서 온전한 포유류 폐 내에서 박테리아와 숙주-세포 상호작용을 직접 시각화함으로써 결핵 연구의 진정한 공백을 해소합니다. 이전의 생체 내 영상 전략들, 예를 들어 광섬유 미세내시경 여기20, 리포터 효소 형광 영상21, 근적외선 형광 단백질 발현 Mtb22 등이 있어 세균 부하와 약물 반응의 민감한 종단 모니터링을 가능하게 했으나, 이는 집집된 박테리아 부하만 측정하며 개별 및 소규모 박테리아 군집을 해소하거나 집적 역학을 추적하거나 공간적 특성을 밝히지 못합니다 온전한 조직 구조 내에서 마이코박테리아와 숙주 세포 간의 관계. BSL-3 호환 다광자 시스템은 폐24에서 독성이 강한 Mtb 영상화에 대한 원리 증명을 입증했지만, 이러한 구현은 대부분의 실험실에...

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공개 사항

저자들은 상충하는 재정적 이해관계나 기타 이해 충돌이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 다음과 같은 보조금으로 지원받았습니다: AI26170; 에블린-리퍼 가족 재단과 그루스 리퍼 바이오포토닉스 센터. NCI 암센터 보조금 P30 CA013330의 지원을 받은 분석 영상 시설의 지원을 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 ml conical tubeCorning430790
2-0 silk tie Ethicon, IncLA55G
5 mm coverslipElectron Microscopy Sciences72296-05
5 mm disposable biopsy punchIntegra33-35-SH
5-0 silk purse-string suture Ethicon, Inc640G
Blunt micro-dissecting scissorsRobozRS-5980
BuprenorphineHospira0409-2012-32주사 10 μL 부프레노르핀 (0.3 mg/mL 주식 용액) 90 μL 무균 PBS (최종 용량 = 0.1 mg/kg)로 희석 
Compressed air canisterFalconDPSJB-12
Cyanoacrylate adhesiveLoctite234790
D-calcium pantothenateAcros243305000
ECM 630 Electroporation System Complete, with Safety standBTX Harvard Apparatus45-0051
Electroporation cuvetteFisher ScientificFB102
FITC-DextranSigma-AldrichFD150S-1G150 kDa
GlycerolFisher ChemicalsG33-1
Graefe forcepsRobozRS-5135폐 창 임플란트 수술 절차 중 갈비뼈를 잡고 들어 올리기 위해
Isoflurane Pivetal78949580
Isoflurane vaporizerSurgiVetVCT302
KanamycinGoldbio.comK-120-25
L-arginine monohydrochlorideSigma-AldrichA5131-100G
L-leucineSigma-AldrichL8000
MacBlue miceJackson LabsStrain #: 026051
Middlebrook 7H10 AgarDifco262710
Middlebrook 7H9 brothDifco271310
Middlebrook OADC EnrichmentBecton Dickinson 212351
Murine ventilatorKent ScientificPS-02PhysioSuite
NairChurch & Dwight Co., Inc.40002957
PBSCorning21-031-CV
PETG media inkwell bottleThermo Scientific342020
PhysioSuiteKent ScientificPS-5623수술 중 삽관을 통해 마우스의 호흡량을 모니터링
Plasmid pYUB1169Custom made plasmid
Rag2 KO miceJackson LabsStrain #: 008449
Small animal lung inflation bulbHarvard Apparatus72-9083
Sodium propionateThermo ScientificA17440.36
SonicatorFisher ScientificFB705
Sorval Centrifuge X pro seriesThermo Scientific75009020
Spectrophotometer Genesys 10 UVThermo Spectronic335903
SurgiSuiteKent ScientificSURGI-M02마우스용 다기능 수술 플랫폼, 온난화 기능 포함
Tracheal catheterExelint International2674622G
TyloxapolSigma-AldrichT0307-50G
Vacuum pickup system metal probe Ted Pella, Inc.528-112

참고문헌

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