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연구 논문

리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide)로 손상된 Caco-2 세포에서 miR-29b-3p 결합을 통한 NEAT1> 매개 장벽 기능 장애

105 조회수

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DOI:

10.3791/71021

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2026년 8월 14일

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1Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, 2Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, 3Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, 4Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구에서는 평가하였습니다 NEAT1 설사형 과민성 대장 증후군에서 장벽 기능 부전의 진단 마커 및 조절제로서. NEAT1 환자의 혈청에서 수치가 상승하였으며, miR-29b-3p와 결합하였고, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)로 손상된 Caco-2 세포에서 해당 마이크로RNA를 넉다운(knockdown)했을 때 장벽 기능, 세포 사멸 및 염증 지표가 개선되었다.

초록

설사형 과민성 대장 증후군(IBS-D)의 병태생리는 명확하지 않으며, 이용 가능한 치료법 또한 제한적인 실정입니다. 본 연구에서는 IBS-D에서 NEAT1의 진단적 가치를 평가하고 잠재적인 조절 기전을 탐색하였습니다. 총 116명의 IBS-D 환자와 116명의 건강한 대조군이 포함되었습니다. 혈청 NEAT1 및 miR-29b-3p 수치는 역전사 정량 실시간 PCR(RT-qPCR)로 검출하였으며, 진단적 가치를 평가하기 위해 수신자 조작 특성(ROC) 곡선을 사용하였습니다. 기전 연구를 위해 리포폴리사카라이드(LPS) 처리된 Caco-2 장 상피 세포 모델을 구축하였습니다. 세포 생존능은 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석으로, 세포 사멸은 유세포 분석으로, 장벽 무결성은 경상피 전기 저항(TEER)으로 평가하였으며, ZO-1, occludin 및 claudin-2의 mRNA 수치는 RT-qPCR로 측정하였습니다. NEAT1과 miR-29b-3p 사이의 결합 관계를 검증하기 위해 듀얼 루시페라제 리포터(DLR) 및 RNA 면역침전(RIP) 분석을 사용하였습니다. IBS-D 환자에서는 NEAT1이 높게 발현되었고 miR-29b-3p는 낮게 발현되었으며, 두 수치는 강한 음의 상관관계를 보였습니다. LPS 처리된 Caco-2 세포에서 NEAT1 넉다운은 miR-29b-3p 수치를 증가시키고 세포 생존능과 TEER을 향상시켰으며, 세포 사멸을 감소시키고 ZO-1 및 occludin mRNA 수치를 증가시키고 claudin-2 mRNA 수치를 감소시켜 장벽 손상 관련 지표를 완화하였습니다. 종합적으로, 이러한 결과는 혈청 NEAT1이 IBS-D의 후보 바이오마커이며, NEAT1/miR-29b-3p 축이 장벽 기능 장애에 관여할 수 있음을 나타냅니다.

서론

설사형 과민성 대장 증후군(IBS-D)은 복통, 복부 팽만감 및 배변 습관의 변화를 특징으로 하는 흔한 기능성 위장관 질환입니다1. 현재 IBS-D의 병태생리학적 기전은 완전히 규명되지 않았습니다2. 치료 방법은 대부분 증상 완화에 집중되어 있어 효능이 제한적이며 재발률이 높습니다3. IBS-D는 일반적으로 뇌-장 축의 조절 장애, 내장 과민성, 저강도 장내 염증 및 장벽 기능 장애와 같은 여러 요인의 상호작용이 관여하는 것으로 알려져 있습니다4,5. 이러한 진단 기준들이 어느 정도 진단을 표준화했으나, 주관적인 성격이 있어 특히 환자의 증상이 염증성 장질환이나 다른 유기적 질환과 겹칠 때 진단 지연이나 오분류를 초래할 수 있습니다. 일반적인 임상 현장에서 현재 IBS-D에 대해 검증된 객관적인 바이오마커는 없는 상태입니다. 따라서 진단 도구로 활용 가능하며 잠재적인 치료 가치를 지닌 새로운 분자 표적을 탐색하는 것이 현재 IBS-D 연구 분야의 시급한 과제가 되었습니다.

최근 몇 년 동안, 후성유전학적 조절의 핵심 분자인 긴 비부호화 RNA(long non-coding RNAs)는 다양한 질환에서 진단 마커 및 치료 표적으로서 큰 가능성을 보여주었습니다6,7. 설사형 과민성 대장 증후군(IBS-D)의 주요 원인은 장벽 기능의 손상입니다8. 밀착 연접 단백질의 파괴는 "장 누수(intestinal leakage)"를 유발하며, 이는 다시 점막 면역 반응을 활성화합니다9,10. 면역 체계의 활성화는 수많은 염증성 인자를 방출하며, 이는 장내 면역-신경계를 활성화하여 장 기능 장애를 일으킬 수 있습니다. 여러 연구에서 일부 lncRNA가 장 상피 장벽을 조절할 수 있음을 시사했습니다11,12. NEAT1은 결장염 환자의 결장 점막 조직에서 발현이 증가하는 것으로 보고되었습니다13. LncRNA NEAT1의 억제는 궤양성 대장염에서 장 상피 세포(IECs)의 기능 장애를 완화할 수 있습니다14. 그러나 IBS-D에서의 NEAT1 발현 양상과 그 진단적 가치는 아직 연구되지 않았습니다. 또한, NEAT1은 진단 바이오마커로서의 잠재력을 가지고 있을 수 있습니다15. 만약 IBS-D 환자의 혈청에서 NEAT1이 비정상적으로 발현된다면, 이는 분자 진단 도구를 제공함으로써 현재의 Rome IV 기준을 보완할 수 있을 것입니다. 한편, miRNA 발현 양상 또한 IBS 환자에서 유의미하게 변화했습니다. 예를 들어, miR-29b-3p 발현의 감소는 IBS의 발병 기전과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다16. 하지만 IBS-D에서 miR-29b-3p 발현을 조절하는 상위 조절 기전은 여전히 전혀 밝혀지지 않은 상태입니다. 특히, 다른 질환에서는 이러한 기전이 잘 확립되어 있음에도 불구하고17,18, IBS-D 상황에서 miR-29b-3p에 대한 경쟁적 내인성 RNA(ceRNA)로서 NEAT1의 역할은 조사된 바 없습니다. 더욱이, 이전 연구들은 주로 조직 수준의 발현에 집중해 왔기에, IBS-D 진단을 위한 비침습적 혈청 바이오마커로서 순환 NEAT1의 가능성은 완전히 미지로 남아 있습니다.

우리는 lncRNA-NEAT1이 miR-29b-3p를 스펀징하는 ceRNA로 작용함으로써 IBS-D의 장벽 기능 조절에 참여할 것이라는 가설을 세웠습니다. 이러한 연구 배경을 바탕으로, 본 연구의 목적은 다음과 같습니다: (1) IBS-D 환자의 혈청 내 NEAT1 및 miR-29b-3p 수치를 평가하고 그 진단적 가치를 확인합니다. (2) NEAT1과 miR-29b-3p 간의 직접적인 결합 상호작용을 검증합니다. (3) LPS 처리된 Caco-2 세포 모델을 사용하여 장벽 무결성 및 염증 조절에 있어 NEAT1/miR-29b-3p 축의 기능적 역할을 규명합니다.

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프로토콜

환자 포함 기준

모든 참여자는 연구 내용을 충분히 이해한 후 서면 동의서를 제출하였습니다. 상하이 푸동 신구 인민병원의 윤리 위원회는 본 연구 프로토콜을 검토하고 승인하였습니다(No. 2024k007). 표본 크기는 G*Power를 사용하여 산출하였습니다. 선택한 검정 방법은 t-검정이며, 통계적 검정은 두 독립 표본 간의 차이를 탐지하도록 설계되었습니다. 효과 크기 d = 0.5, α = 0.05, 검정력(power) = 0.9일 때, 계산 결과 각 그룹당 최소 86명의 피험자가 등록되어야 하는 것으로 나타났습니다. 임상 시험 중 발생할 수 있는 예상치 못한 상황을 고려하여 각 그룹에 116명의 환자를 등록하였습니다. 2024년 7월부터 2025년 7월 사이에 상하이 푸동 신구 인민병원을 방문한 IBS-D 환자 총 116명을 실험군으로 본 연구에 포함하였습니다. 선정 기준은 다음과 같습니다: (1) Rome IV 진단 기준을 충족하는 IBS-D; (2) 대장내시경 결과 점막에 기질적 병변이 없는 경우. 제외 기준은 다음과 같습니다: (1) 염증성 장질환(IBD), 대장암 등의 환자; (2) 당뇨병 환자; (3) 최근 복부 수술 이력이 있는 환자; (4) 심각한 심장, 간 또는 신장 기능 부전 환자. 동시에 연령 및 성별 등 환자의 인구통계학적 특성과 일치하는 건강한 자원봉사자 116명을 대조군으로 모집하였습니다. 건강한 대조군은 만성 위장관 질환의 병력이나 관련 임상 증상이 없음이 확인되었습니다. 모든 피험자로부터 5 mL의 말초 정맥혈을 채취하였습니다. 이후 상층액을 -80 °C의 초저온 냉동고로 옮겨 추후 RNA 추출을 위해 냉동 보존하였습니다.

각 참가자는 다음의 임상 증상을 기록하기 위해 10일간의 설문지를 작성하였다: (a) 10점 시각 아날로그 척도를 이용한 복통 심각도 평가; (b) 조사 기간 중 복통 빈도(통증이 있었던 일수); (c) 배변 빈도(일일 최대 배변 횟수); (d) 대변 양상 평가를 위한 Bristol Faecal Traits Scale. 대상자의 정서 상태는 병원 불안 및 우울 척도(HADS)를 사용하여 평가하였다.

세포 배양 및 모델링

Caco-2 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin–streptomycin이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배지에서 37 °C, 5% CO₂ 조건의 배양기 내에서 통상적으로 배양되었습니다. Caco-2 세포주는 tight junction과 microvilli를 가진 극성 단층 세포로 자발적으로 분화하며, 성숙한 장 상피 세포와 유사한 형태적 및 기능적 특성을 나타냅니다. LPS는 염증 반응을 유발하고 장 상피의 tight junction을 파괴하여 장 투과성을 증가시키는데, 이는 IBS-D의 병리학적 특징과 매우 유사한 과정입니다. 또한, LPS 처리된 Caco-2 세포가 IBS 관련 장벽 기능 장애 및 염증 모델링을 위한 이전 연구들19,20,21에서 널리 사용되어 왔음을 고려하여, 본 연구에서는 IBS-D의 in vitro 모델을 구축하기 위해 Caco-2 세포에 lipopolysaccharide (LPS) 처리를 수행하는 방법을 선택하였습니다. 세포가 약 80% confluence까지 성장하면, 배양액을 5 µg/ml LPS22가 포함된 완전 배지로 교체하고 24시간 동안 세포를 자극하였습니다. LPS 처리 없이 통상적으로 배양한 세포를 대조군으로 사용하였습니다.

세포 형질전환

Caco-2 세포에서 NEAT1과 miR-29b-3p의 역할을 조사하기 위해 Caco-2 세포를 형질전환하였다. 세포는 다음과 같이 6개 그룹으로 나누었다: 1. 대조군(처리 없음), 2. LPS군, 3. LPS + si-NC군, 4. LPS + si-NEAT1군, 5. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC군, 6. LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p inhibitor군. NEAT1을 표적으로 하는 두 가지 소간섭 RNA(si-NEAT1)를 설계 및 합성하였다: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) 및 si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). 비표적 무작위 서열 siRNA(si-NC)를 음성 대조군으로 사용하였다. 한편, miR-29b-3p inhibitor와 그 음성 대조군 또한 합성하였다. miR-29b-3p inhibitor: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. 음성 대조군: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Caco-2 세포를 24-well 플레이트에 분주하고, 세포 밀도가 60–70%에 도달했을 때 제조사의 프로토콜에 따라 transfection을 수행하였다. 간단히 설명하면, 1.25 µL의 siRNA를 25 µL의 저혈청 배지에 희석하여 최종 siRNA 농도를 50 nM로 맞추었다. miRNA 억제를 위해서는 2 µL의 miR-29b-3p 억제제 또는 음성 대조군을 25 µL의 저혈청 배지에 희석하여 최종 농도를 100 nM로 맞추었다. 이와 별도로, 1.5 µL의 transfection 시약을 25 µL의 저혈청 배지와 혼합하였다. 희석된 siRNA(또는 억제제/음성 대조군)를 희석된 transfection 시약과 혼합하여 transfection complex를 형성한 후, 이를 세포에 한 방울씩 첨가하였다. transfection 6시간 후, transfection 혼합물을 신선한 완전 배지로 교체하였으며, 이후 하위 기능 분석을 위해 세포를 48시간 동안 더 배양하였다. 추가 실험에 앞서 RT-qPCR을 통해 knockdown 또는 억제 효율을 확인하였다.

실시간 정량적 역전사 PCR (RT-qPCR)

표시된 처리를 거친 혈청 샘플과 Caco-2 세포에서 총 RNA를 분리하였다. 간단히 설명하면, 각 샘플을 1 mL의 RNA 추출 시약으로 용해시킨 후 200 µL의 클로로포름과 혼합하였다. 12,000 × g 4 °C에서 15분 동안 유지한 후, 상층 수상층을 새 튜브로 옮겨 500 µL의 이소프로판올과 혼합하고 −20 °C에서 30분 동안 보관하였습니다. 그 다음 샘플을 12,000 × g 4 °C에서 10분 동안 유지하였다. 생성된 RNA 펠렛을 75% 에탄올로 2회 세척하고 공기 건조시킨 후, 20 µL의 RNase-free water에 재현탁하였다. RNA 수율과 순도는 마이크로 분광광도계로 측정하였으며, A260/A280 1.8–2.0의 값을 사용하였습니다. RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA로 역전사되었습니다. 검출을 위해 NEAT1, ZO-1, 오클루딘, 클라우딘-2, 그리고 GAPDH1× RT 버퍼, 0.5 mM dNTPs, 0.5 µM oligo(dT) 프라이머, 200 U 역전사효소 및 RNase-free water를 포함하는 20 µL의 역전사 반응당 1 µg의 총 RNA를 사용하였다. 반응은 37 °C에서 15분 동안 수행되었으며, 이어서 85 °C에서 5초 동안 효소를 불활성화하였다.

SYBR Green 기반의 실시간 PCR 시스템을 사용하여 cDNA를 템플릿으로 정량적 PCR을 수행하였습니다. 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludin, 및 claudin-2의 발현 수준을 측정하였습니다. miR-29b-3p의 참조 유전자로 U6를 사용하였으며, NEAT1 및 밀착 연접 관련 유전자의 정규화를 위해 GAPDH를 사용하였습니다. 상대적 발현량은 2−ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였습니다. 프라이머 서열은 표 1에 나열되어 있습니다.

세포 생존능 분석

대수 성장기(log-phase)의 Caco-2 세포를 96-well 플레이트에 웰당 1 × 104 cells로 분주하였습니다. 공백 대조군(배양액만 포함), 대조군(미처리 세포), 그리고 실험군(다양한 처리 조건의 Caco-2 세포)을 설정하였으며, 각 그룹당 5-6개의 듀플리케이트 웰을 구성하였습니다. 세포는 0, 24, 48, 72 h의 네 가지 시점으로 나누어 배정하였습니다. 측정 중에 인큐베이터를 반복적으로 여는 것을 방지하기 위해 각 시점별로 별도의 배양 플레이트를 준비하였습니다. 배양 기간이 지난 후, 기포가 생기지 않도록 주의하며 각 웰에 10 µL의 CCK-8 용액을 첨가하였습니다. 이어서 배양 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣고 암소에서 2 h 동안 배양하였습니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 흡광도를 450 nm에서 즉시 측정하였습니다. 최종적으로 세포 생존율은 백분율(%)로 나타내었습니다.

세포 사멸 분석

Annexin V-FITC/PI 염색 후 유세포 분석법으로 세포 사멸(apoptosis)을 정량화하였다. 각 처리군의 Caco-2 세포를 회수하여 ice-cold PBS로 2회 세척하였다. 원심분리는 4 °C에서 300 × g로 5분 동안 수행하였다. 세포 펠렛을 100 µL의 1× 결합 버퍼(binding buffer)에 재현탁한 후, Annexin V-FITC 5 µL와 PI 5 µL를 순차적으로 첨가하였다. 조심스럽게 혼합한 후, 샘플을 실온의 암소에서 15분 동안 배양하였다. 다음으로, 1× 결합 버퍼 300 µL를 첨가하고 현탁액을 주의 깊게 혼합한 후 5 mL 유세포 분석 튜브로 옮겼다. 샘플은 1시간 이내에 유세포 분석법으로 분석하였다.

경상피 전기 저항 (TEER)

Caco-2 세포23의 TEER 값을 측정하여 투과성을 평가하였다. Caco-2 세포를 Transwell 챔버에 접종하고 21일 동안 배양하여 조밀한 단일층을 형성하도록 하였다. 각 실험 조건당 6개의 독립적인 생물학적 반복 실험을 수행하였으며, 각 조건에서 5개의 기술적 반복 실험 또한 수행하였다. 실험 처리 전후에 에탄올로 멸균하고 PBS로 평형을 맞춘 전극과 transmembrane resistance meter를 사용하여 각 그룹의 TEER 값을 측정하였다. 간단히 설명하면, 필터 막과의 접촉을 피하기 위해 전극의 긴 막대는 기저측(basolateral) 배양액에, 짧은 막대는 정단측(apical) 배양액에 담갔다. 안정화 후 저항값(Ω)을 읽었으며, 세 번의 일관된 측정값이 얻어질 때까지 측정을 반복하였다. 세포가 없는 공백 Transwell 필터의 저항을 동일한 조건에서 측정하였으며, 이 값을 모든 실험 측정값에서 차감하였다. TEER (Ω·cm2) = (시료 저항 – 공백 저항) × 유효 막 면적으로 계산하였다. 데이터는 다음과 같이 제시하였다: (실험군/대조군) × 100%.

효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)

배양 24시간 후, 서로 다른 처리군의 Caco-2 세포 상층액을 수집하였습니다. tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8) 및 interleukin-1β (IL-1β)를 포함한 염증성 사이토카인의 수치를 제조사의 지침에 따라 상용 ELISA 시약을 사용하여 측정하였습니다. 분석은 지침을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 항체가 미리 코팅된 웰에 시료와 표준 물질을 첨가한 후, 배양 및 세척 과정을 거쳤습니다. 이어서 비오틴화된 검출 항체를 첨가하였습니다. 다시 한번 배양 및 세척을 수행한 후, horseradish peroxidase가 표지된 streptavidin을 첨가하였습니다. 마지막으로, 발색을 위해 TMB 기질을 첨가하였으며, 정지 용액(stop solution)으로 반응을 종결시켰습니다. 각 웰의 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 즉시 측정하였습니다.

웨스턴 블롯

표시된 처리를 거친 Caco-2 세포로부터 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 버퍼를 사용하여 단백질을 분리하였다. 단백질 농도는 bicinchoninic acid (BCA) 분석법으로 측정하였다. 각 시료당 30 µg의 단백질을 레인별로 로딩하여 10% SDS-PAGE 겔에서 분리한 후 PVDF 막으로 전사하였다. 막을 5% 탈지분유에서 실온으로 1시간 동안 블로킹한 후, ZO-1 (1:1,000), occludin (1:500), claudin-2 (1:1,000) 및 GAPDH (1:5,000)에 대한 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 세척 후, 막을 HRP 결합 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 밴드는 화학발광법 (ECL)으로 검출하였으며, 밴드 강도는 ImageJ를 사용하여 분석하였다. GAPDH를 로딩 컨트롤로 사용하였다.

이중 루시퍼레이스 리포터(DLR) 분석

ENCORI 데이터베이스(https://rnasysu.com/encori/)를 통해 NEAT1 서열에 대한 miR-29b-3p의 잠재적 결합 부위를 예측하였습니다. 이어서 야생형(WT) 또는 돌연변이형(MUT) 결합 부위를 포함하는 NEAT1 단편을 pmirGLO 리포터 벡터에 클로닝하였습니다. 구축된 재조합 플라스미드를 miR-29b-3p mimic(Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) 또는 억제제, 그리고 각각의 음성 대조군(mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’)과 함께 세포에 공동 형질전환하였습니다. 형질전환 48시간 후 세포를 수집하고, 듀얼 루시퍼레이스 검출 시약을 사용하여 반딧불이 루시퍼레이스(firefly luciferase)와 레닐라 루시퍼레이스(renilla luciferase)의 활성을 측정하였습니다. 레닐라 루시퍼레이스 활성은 표준화를 위한 내부 참조로 사용되었습니다.

RNA 면역침강(RIP) 분석

RIP 분석을 위해, Caco-2 세포를 수확하고 PBS로 헹군 후, 프로테아제 및 RNase 억제제가 첨가된 200 µL의 RIP 용해 버퍼(lysis buffer) 내에서 얼음 위에서 15분 동안 배양하였습니다. 세포 용해물을 4 °C에서 16,000 × g로 10분 동안 원심 분리하였으며, 각 상층액 10 µL를 입력 대조군(input control)으로 보관하였습니다. 면역침전(immunoprecipitation)을 위해, 40 µL의 Protein A/G 자성 비즈를 200 µL의 RIP 세척 버퍼 내에서 5 µg의 anti-Ago2 항체 또는 일반 IgG와 함께 실온에서 30분 동안 회전 혼합하였습니다. 500 µL의 RIP 세척 버퍼로 3회 세척한 후, 비즈 현탁액 100 µL를 용해물 100 µL와 혼합하고, RIP 세척 버퍼를 사용하여 최종 부피를 1 mL로 맞춘 다음 4 °C에서 하룻밤 동안 회전시키며 배양하였습니다. 이후 비즈를 500 µL의 RIP 세척 버퍼로 5회 세척하고 동일한 버퍼 150 µL에 재현탁하였습니다. 단백질 분해는 15 µL의 proteinase K (20 mg/mL)와 15 µL의 10% SDS를 첨가한 후, 55 °C에서 30분 동안 흔들어주며 배양하여 수행하였습니다. 상층액을 수집하고 추출 시약을 통해 RNA를 분리한 후 하룻밤 동안 침전시켰습니다. 그 후 RT-qPCR을 통해 NEAT1 및 miR-29b-3p의 농축 정도를 평가하였습니다.

세포 내 위치 분석

제조사의 지침에 따라 시판되는 핵-세포질 분리 시약을 사용하여 Caco-2 세포를 핵 분획과 세포질 분획으로 분리하였습니다. 이 두 성분으로부터 총 RNA를 추출하였으며, RT-qPCR을 통해 핵과 세포질 내 NEAT1의 분포를 검출하였습니다. 분리 효율의 지표로 U6(주로 핵에 존재)와 GAPDH mRNA(주로 세포질에 존재)를 사용하여 보정 작업을 수행하였습니다.

통계 분석

임상 혈청 샘플의 경우, 검정력 분석(t-test, d = 0.5, α = 0.05, power = 0.9) 결과 그룹당 최소 86명의 피험자가 필요한 것으로 나타났다. 임상적으로 유의미한 차이를 검출하기 위해, 시험 중 발생할 수 있는 예기치 못한 상황을 고려하여 각 그룹에 116명의 환자를 등록하였다. 연속형 변수의 데이터 정규성은 Shapiro-Wilk 검정을 통해 평가하였다. 모든 연속형 데이터가 정규 분포를 보였으므로(P > 0.05), 모수적 분석을 적용하였다. 범주형 변수는 카이제곱 검정을 사용하여 분석하였다. 세포 기반 실험은 6회의 독립적인 생물학적 반복 실험을 수행하였으며, 각 생물학적 반복 실험당 5회의 기술적 반복 실험을 실시하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시하였다. 두 연속형 변수 그룹 간의 비교는 Student’s t-test를 사용하여 수행하였으며, 다중 그룹 간의 비교는 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey의 사후 검정(post hoc test)으로 분석하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 정의하였다.

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결과

NEAT1의 발현 및 진단적 가치

건강한 대조군(HC) 그룹과 비교했을 때, IBS-D 환자의 NEAT1 발현 수준은 현저히 더 높았습니다(P < 0.0001; 그림 1A). 수신자 조작 특성(ROC) 곡선으로 나타낸 NEAT1의 곡선 아래 면적(AUC)은 0.867(95% CI: 0.821–0.913)이었습니다. 특이도는 75.9%였으며, 민감도는 84.5%였습니다(그림 1B). 이는 IBS-D 환자의 혈청 내 비정상적인 NEAT1 발현이 해당 질환의 새로운 진단 바이오마커로 활용될 수 있음을 시사합니다.

또한, 건강 대조군과 IBS-D 환자군의 임상 데이터를 비교하였다. 분석 결과, 연령, 성별 및 기타 특...

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토론

IBS-D는 흔한 기능성 위장관 장애입니다. 그 병리 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 최근 몇 년 동안 후성유전학적 조절의 핵심 분자인 lncRNA는 질병의 진단 및 치료 분야에서 큰 가능성을 보여주었습니다. LncRNA NEAT1은 대장암24, 신경교종25, 심근경색26과 같은 다양한 질환에서 연구되어 왔습니다. 여러 연구를 통해 NEAT1이 염증 반응13, 세포 증식27 및 장벽 통합성28 조절에 관여한다는 것이 밝혀졌습니다. 하지만 IBS-D에서의 NEAT1의 구체적인 발현, 임상적 가치 및 IBS-D의 기저에 있는 조절 기전은 아직 충분히 탐구되지 않았습니다.

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공개 사항

저자들은 선언할 이해관계 충돌이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
24-웰 플레이트CorningCLS3524세포 분주용
96-웰 플레이트CorningCLS3599CCK-8 분석용 세포 분주용
Annexin V-FITC/PI apoptosis 키트InvitrogenV13242세포 사멸률 검출용
Anti-AGO2 단클론 항체Proteintech67934-1-IgAgo2 결합 RNA 복합체의 면역침전용
Anti-Claudin-2 항체Invitrogen32-56001차 항체, 희석 배수 1:1000
Anti-GAPDH 항체Cell Signaling Technology51741차 항체, 희석 배수 1:5000; 로딩 컨트롤
Anti-Human IgG 항체Proteintech10284-1-APRIP 분석의 음성 대조군으로 사용
Anti-Occludin 항체Abcamab317211차 항체, 희석 배수 1:500
Anti-ZO-1 항체Proteintech21773-1-AP1차 항체, 희석 배수 1:1000
Caco-2 세포SUNNCELLSNL-068장 상피 장벽 모델 구축용
CCK-8 키트SolarbioCA1210세포 증식 분석 키트
클로로포름Sigma-AldrichC2432RNA 추출 시 상분리용
DMEM 배지Gibco11965092세포 배양용
Dual-Luciferase Reporter 분석 키트ThermoFisher16186루시퍼라제 활성 검출용
ELISA 키트 (IL-1β용)R&D SystemsDY201세포 배양 상층액 내 표적 단백질 검출용
ELISA 키트 (IL-6용)R&D SystemsD6050B세포 배양 상층액 내 표적 단백질 검출용
ELISA 키트 (IL-8용)R&D SystemsNBP3-28022세포 배양 상층액 내 표적 단백질 검출용
ELISA 키트 (TNF-α용)R&D SystemsDTA00D세포 배양 상층액 내 표적 단백질 검출용
강화 화학 발광(ECL) 기질Thermo Fisher32106단백질 밴드 시각화용
에탄올 (75%)Sigma-Aldrich459844RNA 펠릿 세척용
FBS (태아 송아지 혈청)Gibco10099141세포 배양용
유세포 분석기Beckman CoulterB53002세포 사멸률 검출용
HRP 결합 2차 항체Cell Signaling Technology7074ECL 기질로부터 화학 발광 신호 생성 촉매
이소프로판올Sigma-Aldrich1133502500RNA 침전용
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015형질전환 시약
리포폴리사카라이드 (LPS)Sigma-AldrichL2880세포 모델 구축 유도용
마이크로플레이트 리더BioTekEpoch 296-웰 플레이트 내 샘플의 흡광도 측정용
Nanodrop 마이크로 분광광도계Thermo ScientificND-2000CRNA 농도 및 순도 결정용
무지방 건조 우유CoolaberCN7861멤브레인 블로킹용 (5% 용액)
PARIS 키트Thermo FisherAM1921핵-세포질 분획용
Penicillin–StreptomycinGibco15140122세포 성장 시 오염 방지용
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo Fisher23225단백질 농도 결정용
pmirGLO Dual-Luciferase 벡터PromegaE1330듀얼 루시퍼라제 리포터 유전자 벡터
PrimeScript RT 시약 키트TakaraRR047ARNA의 cDNA 역전사용
PVDF 멤브레인MilliporeIPVH00010SDS-PAGE 후 단백질 전사용
실시간 형광 정량 PCR 장비Applied Biosystems4365464표적 유전자 검출용
RIPA 용해 버퍼 (단백질 분해 효소 억제제 포함)Thermo Fisher89901세포 내 총 단백질 추출용
RNA 결합 단백질 면역침전 키트Sigma-Aldrich17-701Protein A/G 자기 비드를 이용한 RNA 결합 단백질 면역침전(RIP) 분석용
SDS-PAGE 시약 (10% 겔)TargetMolC0189분자량별 단백질 분리용
SYBR Green 마스터 믹스Thermo Fisher4309155PCR 테스트용
TEER 측정기 (전압-전류계)MilliporeMERS00002단일층 무결성 측정을 위한 경세포막 저항 측정기
Transwell 챔버Corning CostarCLS3413세포 단일층 배양 및 TEER 측정용
TRIzol 시약Invitrogen15596026CN총 RNA 추출용

참고문헌

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