리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide)로 손상된 Caco-2 세포에서 miR-29b-3p 결합을 통한 NEAT1> 매개 장벽 기능 장애

요약

본 연구에서는 평가하였습니다 NEAT1 설사형 과민성 대장 증후군에서 장벽 기능 부전의 진단 마커 및 조절제로서. NEAT1 환자의 혈청에서 수치가 상승하였으며, miR-29b-3p와 결합하였고, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)로 손상된 Caco-2 세포에서 해당 마이크로RNA를 넉다운(knockdown)했을 때 장벽 기능, 세포 사멸 및 염증 지표가 개선되었다.

초록

설사형 과민성 대장 증후군(IBS-D)의 병태생리는 명확하지 않으며, 이용 가능한 치료법 또한 제한적인 실정입니다. 본 연구에서는 IBS-D에서 NEAT1의 진단적 가치를 평가하고 잠재적인 조절 기전을 탐색하였습니다. 총 116명의 IBS-D 환자와 116명의 건강한 대조군이 포함되었습니다. 혈청 NEAT1 및 miR-29b-3p 수치는 역전사 정량 실시간 PCR(RT-qPCR)로 검출하였으며, 진단적 가치를 평가하기 위해 수신자 조작 특성(ROC) 곡선을 사용하였습니다. 기전 연구를 위해 리포폴리사카라이드(LPS) 처리된 Caco-2 장 상피 세포 모델을 구축하였습니다. 세포 생존능은 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석으로, 세포 사멸은 유세포 분석으로, 장벽 무결성은 경상피 전기 저항(TEER)으로 평가하였으며, ZO-1, occludin 및 claudin-2의 mRNA 수치는 RT-qPCR로 측정하였습니다. NEAT1과 miR-29b-3p 사이의 결합 관계를 검증하기 위해 듀얼 루시페라제 리포터(DLR) 및 RNA 면역침전(RIP) 분석을 사용하였습니다. IBS-D 환자에서는 NEAT1이 높게 발현되었고 miR-29b-3p는 낮게 발현되었으며, 두 수치는 강한 음의 상관관계를 보였습니다. LPS 처리된 Caco-2 세포에서 NEAT1 넉다운은 miR-29b-3p 수치를 증가시키고 세포 생존능과 TEER을 향상시켰으며, 세포 사멸을 감소시키고 ZO-1 및 occludin mRNA 수치를 증가시키고 claudin-2 mRNA 수치를 감소시켜 장벽 손상 관련 지표를 완화하였습니다. 종합적으로, 이러한 결과는 혈청 NEAT1이 IBS-D의 후보 바이오마커이며, NEAT1/miR-29b-3p 축이 장벽 기능 장애에 관여할 수 있음을 나타냅니다.

서론

설사형 과민성 대장 증후군(IBS-D)은 복통, 복부 팽만감 및 배변 습관의 변화를 특징으로 하는 흔한 기능성 위장관 질환입니다¹. 현재 IBS-D의 병태생리학적 기전은 완전히 규명되지 않았습니다². 치료 방법은 대부분 증상 완화에 집중되어 있어 효능이 제한적이며 재발률이 높습니다³. IBS-D는 일반적으로 뇌-장 축의 조절 장애, 내장 과민성, 저강도 장내 염증 및 장벽 기능 장애와 같은 여러 요인의 상호작용이 관여하는 것으로 알려져 있습니다^4,5. 이러한 진단 기준들이 어느 정도 진단을 표준화했으나, 주관적인 성격이 있어 특히 환자의 증상이 염증성 장질환이나 다른 유기적 질환과 겹칠 때 진단 지연이나 오분류를 초래할 수 있습니다. 일반적인 임상 현장에서 현재 IBS-D에 대해 검증된 객관적인 바이오마커는 없는 상태입니다. 따라서 진단 도구로 활용 가능하며 잠재적인 치료 가치를 지닌 새로운 분자 표적을 탐색하는 것이 현재 IBS-D 연구 분야의 시급한 과제가 되었습니다.

최근 몇 년 동안, 후성유전학적 조절의 핵심 분자인 긴 비부호화 RNA(long non-coding RNAs)는 다양한 질환에서 진단 마커 및 치료 표적으로서 큰 가능성을 보여주었습니다^6,7. 설사형 과민성 대장 증후군(IBS-D)의 주요 원인은 장벽 기능의 손상입니다⁸. 밀착 연접 단백질의 파괴는 "장 누수(intestinal leakage)"를 유발하며, 이는 다시 점막 면역 반응을 활성화합니다^9,10. 면역 체계의 활성화는 수많은 염증성 인자를 방출하며, 이는 장내 면역-신경계를 활성화하여 장 기능 장애를 일으킬 수 있습니다. 여러 연구에서 일부 lncRNA가 장 상피 장벽을 조절할 수 있음을 시사했습니다^11,12. NEAT1은 결장염 환자의 결장 점막 조직에서 발현이 증가하는 것으로 보고되었습니다¹³. LncRNA NEAT1의 억제는 궤양성 대장염에서 장 상피 세포(IECs)의 기능 장애를 완화할 수 있습니다¹⁴. 그러나 IBS-D에서의 NEAT1 발현 양상과 그 진단적 가치는 아직 연구되지 않았습니다. 또한, NEAT1은 진단 바이오마커로서의 잠재력을 가지고 있을 수 있습니다¹⁵. 만약 IBS-D 환자의 혈청에서 NEAT1이 비정상적으로 발현된다면, 이는 분자 진단 도구를 제공함으로써 현재의 Rome IV 기준을 보완할 수 있을 것입니다. 한편, miRNA 발현 양상 또한 IBS 환자에서 유의미하게 변화했습니다. 예를 들어, miR-29b-3p 발현의 감소는 IBS의 발병 기전과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다¹⁶. 하지만 IBS-D에서 miR-29b-3p 발현을 조절하는 상위 조절 기전은 여전히 전혀 밝혀지지 않은 상태입니다. 특히, 다른 질환에서는 이러한 기전이 잘 확립되어 있음에도 불구하고^17,18, IBS-D 상황에서 miR-29b-3p에 대한 경쟁적 내인성 RNA(ceRNA)로서 NEAT1의 역할은 조사된 바 없습니다. 더욱이, 이전 연구들은 주로 조직 수준의 발현에 집중해 왔기에, IBS-D 진단을 위한 비침습적 혈청 바이오마커로서 순환 NEAT1의 가능성은 완전히 미지로 남아 있습니다.

우리는 lncRNA-NEAT1이 miR-29b-3p를 스펀징하는 ceRNA로 작용함으로써 IBS-D의 장벽 기능 조절에 참여할 것이라는 가설을 세웠습니다. 이러한 연구 배경을 바탕으로, 본 연구의 목적은 다음과 같습니다: (1) IBS-D 환자의 혈청 내 NEAT1 및 miR-29b-3p 수치를 평가하고 그 진단적 가치를 확인합니다. (2) NEAT1과 miR-29b-3p 간의 직접적인 결합 상호작용을 검증합니다. (3) LPS 처리된 Caco-2 세포 모델을 사용하여 장벽 무결성 및 염증 조절에 있어 NEAT1/miR-29b-3p 축의 기능적 역할을 규명합니다.

프로토콜

환자 포함 기준

모든 참여자는 연구 내용을 충분히 이해한 후 서면 동의서를 제출하였습니다. 상하이 푸동 신구 인민병원의 윤리 위원회는 본 연구 프로토콜을 검토하고 승인하였습니다(No. 2024k007). 표본 크기는 G*Power를 사용하여 산출하였습니다. 선택한 검정 방법은 t-검정이며, 통계적 검정은 두 독립 표본 간의 차이를 탐지하도록 설계되었습니다. 효과 크기 d = 0.5, α = 0.05, 검정력(power) = 0.9일 때, 계산 결과 각 그룹당 최소 86명의 피험자가 등록되어야 하는 것으로 나타났습니다. 임상 시험 중 발생할 수 있는 예상치 못한 상황을 고려하여 각 그룹에 116명의 환자를 등록하였습니다. 2024년 7월부터 2025년 7월 사이에 상하이 푸동 신구 인민병원을 방문한 IBS-D 환자 총 116명을 실험군으로 본 연구에 포함하였습니다. 선정 기준은 다음과 같습니다: (1) Rome IV 진단 기준을 충족하는 IBS-D; (2) 대장내시경 결과 점막에 기질적 병변이 없는 경우. 제외 기준은 다음과 같습니다: (1) 염증성 장질환(IBD), 대장암 등의 환자; (2) 당뇨병 환자; (3) 최근 복부 수술 이력이 있는 환자; (4) 심각한 심장, 간 또는 신장 기능 부전 환자. 동시에 연령 및 성별 등 환자의 인구통계학적 특성과 일치하는 건강한 자원봉사자 116명을 대조군으로 모집하였습니다. 건강한 대조군은 만성 위장관 질환의 병력이나 관련 임상 증상이 없음이 확인되었습니다. 모든 피험자로부터 5 mL의 말초 정맥혈을 채취하였습니다. 이후 상층액을 -80 °C의 초저온 냉동고로 옮겨 추후 RNA 추출을 위해 냉동 보존하였습니다.

각 참가자는 다음의 임상 증상을 기록하기 위해 10일간의 설문지를 작성하였다: (a) 10점 시각 아날로그 척도를 이용한 복통 심각도 평가; (b) 조사 기간 중 복통 빈도(통증이 있었던 일수); (c) 배변 빈도(일일 최대 배변 횟수); (d) 대변 양상 평가를 위한 Bristol Faecal Traits Scale. 대상자의 정서 상태는 병원 불안 및 우울 척도(HADS)를 사용하여 평가하였다.

세포 배양 및 모델링

Caco-2 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin–streptomycin이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배지에서 37 °C, 5% CO₂ 조건의 배양기 내에서 통상적으로 배양되었습니다. Caco-2 세포주는 tight junction과 microvilli를 가진 극성 단층 세포로 자발적으로 분화하며, 성숙한 장 상피 세포와 유사한 형태적 및 기능적 특성을 나타냅니다. LPS는 염증 반응을 유발하고 장 상피의 tight junction을 파괴하여 장 투과성을 증가시키는데, 이는 IBS-D의 병리학적 특징과 매우 유사한 과정입니다. 또한, LPS 처리된 Caco-2 세포가 IBS 관련 장벽 기능 장애 및 염증 모델링을 위한 이전 연구들^19,20,21에서 널리 사용되어 왔음을 고려하여, 본 연구에서는 IBS-D의 in vitro 모델을 구축하기 위해 Caco-2 세포에 lipopolysaccharide (LPS) 처리를 수행하는 방법을 선택하였습니다. 세포가 약 80% confluence까지 성장하면, 배양액을 5 µg/ml LPS²²가 포함된 완전 배지로 교체하고 24시간 동안 세포를 자극하였습니다. LPS 처리 없이 통상적으로 배양한 세포를 대조군으로 사용하였습니다.

세포 형질전환

Caco-2 세포에서 NEAT1과 miR-29b-3p의 역할을 조사하기 위해 Caco-2 세포를 형질전환하였다. 세포는 다음과 같이 6개 그룹으로 나누었다: 1. 대조군(처리 없음), 2. LPS군, 3. LPS + si-NC군, 4. LPS + si-NEAT1군, 5. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC군, 6. LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p inhibitor군. NEAT1을 표적으로 하는 두 가지 소간섭 RNA(si-NEAT1)를 설계 및 합성하였다: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) 및 si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). 비표적 무작위 서열 siRNA(si-NC)를 음성 대조군으로 사용하였다. 한편, miR-29b-3p inhibitor와 그 음성 대조군 또한 합성하였다. miR-29b-3p inhibitor: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. 음성 대조군: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Caco-2 세포를 24-well 플레이트에 분주하고, 세포 밀도가 60–70%에 도달했을 때 제조사의 프로토콜에 따라 transfection을 수행하였다. 간단히 설명하면, 1.25 µL의 siRNA를 25 µL의 저혈청 배지에 희석하여 최종 siRNA 농도를 50 nM로 맞추었다. miRNA 억제를 위해서는 2 µL의 miR-29b-3p 억제제 또는 음성 대조군을 25 µL의 저혈청 배지에 희석하여 최종 농도를 100 nM로 맞추었다. 이와 별도로, 1.5 µL의 transfection 시약을 25 µL의 저혈청 배지와 혼합하였다. 희석된 siRNA(또는 억제제/음성 대조군)를 희석된 transfection 시약과 혼합하여 transfection complex를 형성한 후, 이를 세포에 한 방울씩 첨가하였다. transfection 6시간 후, transfection 혼합물을 신선한 완전 배지로 교체하였으며, 이후 하위 기능 분석을 위해 세포를 48시간 동안 더 배양하였다. 추가 실험에 앞서 RT-qPCR을 통해 knockdown 또는 억제 효율을 확인하였다.

실시간 정량적 역전사 PCR (RT-qPCR)

표시된 처리를 거친 혈청 샘플과 Caco-2 세포에서 총 RNA를 분리하였다. 간단히 설명하면, 각 샘플을 1 mL의 RNA 추출 시약으로 용해시킨 후 200 µL의 클로로포름과 혼합하였다. 12,000 × g 4 °C에서 15분 동안 유지한 후, 상층 수상층을 새 튜브로 옮겨 500 µL의 이소프로판올과 혼합하고 −20 °C에서 30분 동안 보관하였습니다. 그 다음 샘플을 12,000 × g 4 °C에서 10분 동안 유지하였다. 생성된 RNA 펠렛을 75% 에탄올로 2회 세척하고 공기 건조시킨 후, 20 µL의 RNase-free water에 재현탁하였다. RNA 수율과 순도는 마이크로 분광광도계로 측정하였으며, A₂₆₀/A₂₈₀ 1.8–2.0의 값을 사용하였습니다. RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA로 역전사되었습니다. 검출을 위해 NEAT1, ZO-1, 오클루딘, 클라우딘-2, 그리고 GAPDH1× RT 버퍼, 0.5 mM dNTPs, 0.5 µM oligo(dT) 프라이머, 200 U 역전사효소 및 RNase-free water를 포함하는 20 µL의 역전사 반응당 1 µg의 총 RNA를 사용하였다. 반응은 37 °C에서 15분 동안 수행되었으며, 이어서 85 °C에서 5초 동안 효소를 불활성화하였다.

SYBR Green 기반의 실시간 PCR 시스템을 사용하여 cDNA를 템플릿으로 정량적 PCR을 수행하였습니다. 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludin, 및 claudin-2의 발현 수준을 측정하였습니다. miR-29b-3p의 참조 유전자로 U6를 사용하였으며, NEAT1 및 밀착 연접 관련 유전자의 정규화를 위해 GAPDH를 사용하였습니다. 상대적 발현량은 2−ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였습니다. 프라이머 서열은 표 1에 나열되어 있습니다.

세포 생존능 분석

대수 성장기(log-phase)의 Caco-2 세포를 96-well 플레이트에 웰당 1 × 10⁴ cells로 분주하였습니다. 공백 대조군(배양액만 포함), 대조군(미처리 세포), 그리고 실험군(다양한 처리 조건의 Caco-2 세포)을 설정하였으며, 각 그룹당 5-6개의 듀플리케이트 웰을 구성하였습니다. 세포는 0, 24, 48, 72 h의 네 가지 시점으로 나누어 배정하였습니다. 측정 중에 인큐베이터를 반복적으로 여는 것을 방지하기 위해 각 시점별로 별도의 배양 플레이트를 준비하였습니다. 배양 기간이 지난 후, 기포가 생기지 않도록 주의하며 각 웰에 10 µL의 CCK-8 용액을 첨가하였습니다. 이어서 배양 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣고 암소에서 2 h 동안 배양하였습니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 흡광도를 450 nm에서 즉시 측정하였습니다. 최종적으로 세포 생존율은 백분율(%)로 나타내었습니다.

세포 사멸 분석

Annexin V-FITC/PI 염색 후 유세포 분석법으로 세포 사멸(apoptosis)을 정량화하였다. 각 처리군의 Caco-2 세포를 회수하여 ice-cold PBS로 2회 세척하였다. 원심분리는 4 °C에서 300 × g로 5분 동안 수행하였다. 세포 펠렛을 100 µL의 1× 결합 버퍼(binding buffer)에 재현탁한 후, Annexin V-FITC 5 µL와 PI 5 µL를 순차적으로 첨가하였다. 조심스럽게 혼합한 후, 샘플을 실온의 암소에서 15분 동안 배양하였다. 다음으로, 1× 결합 버퍼 300 µL를 첨가하고 현탁액을 주의 깊게 혼합한 후 5 mL 유세포 분석 튜브로 옮겼다. 샘플은 1시간 이내에 유세포 분석법으로 분석하였다.

경상피 전기 저항 (TEER)

Caco-2 세포²³의 TEER 값을 측정하여 투과성을 평가하였다. Caco-2 세포를 Transwell 챔버에 접종하고 21일 동안 배양하여 조밀한 단일층을 형성하도록 하였다. 각 실험 조건당 6개의 독립적인 생물학적 반복 실험을 수행하였으며, 각 조건에서 5개의 기술적 반복 실험 또한 수행하였다. 실험 처리 전후에 에탄올로 멸균하고 PBS로 평형을 맞춘 전극과 transmembrane resistance meter를 사용하여 각 그룹의 TEER 값을 측정하였다. 간단히 설명하면, 필터 막과의 접촉을 피하기 위해 전극의 긴 막대는 기저측(basolateral) 배양액에, 짧은 막대는 정단측(apical) 배양액에 담갔다. 안정화 후 저항값(Ω)을 읽었으며, 세 번의 일관된 측정값이 얻어질 때까지 측정을 반복하였다. 세포가 없는 공백 Transwell 필터의 저항을 동일한 조건에서 측정하였으며, 이 값을 모든 실험 측정값에서 차감하였다. TEER (Ω·cm²) = (시료 저항 – 공백 저항) × 유효 막 면적으로 계산하였다. 데이터는 다음과 같이 제시하였다: (실험군/대조군) × 100%.

효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)

배양 24시간 후, 서로 다른 처리군의 Caco-2 세포 상층액을 수집하였습니다. tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8) 및 interleukin-1β (IL-1β)를 포함한 염증성 사이토카인의 수치를 제조사의 지침에 따라 상용 ELISA 시약을 사용하여 측정하였습니다. 분석은 지침을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 항체가 미리 코팅된 웰에 시료와 표준 물질을 첨가한 후, 배양 및 세척 과정을 거쳤습니다. 이어서 비오틴화된 검출 항체를 첨가하였습니다. 다시 한번 배양 및 세척을 수행한 후, horseradish peroxidase가 표지된 streptavidin을 첨가하였습니다. 마지막으로, 발색을 위해 TMB 기질을 첨가하였으며, 정지 용액(stop solution)으로 반응을 종결시켰습니다. 각 웰의 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 즉시 측정하였습니다.

웨스턴 블롯

표시된 처리를 거친 Caco-2 세포로부터 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 버퍼를 사용하여 단백질을 분리하였다. 단백질 농도는 bicinchoninic acid (BCA) 분석법으로 측정하였다. 각 시료당 30 µg의 단백질을 레인별로 로딩하여 10% SDS-PAGE 겔에서 분리한 후 PVDF 막으로 전사하였다. 막을 5% 탈지분유에서 실온으로 1시간 동안 블로킹한 후, ZO-1 (1:1,000), occludin (1:500), claudin-2 (1:1,000) 및 GAPDH (1:5,000)에 대한 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 세척 후, 막을 HRP 결합 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 밴드는 화학발광법 (ECL)으로 검출하였으며, 밴드 강도는 ImageJ를 사용하여 분석하였다. GAPDH를 로딩 컨트롤로 사용하였다.

이중 루시퍼레이스 리포터(DLR) 분석

ENCORI 데이터베이스(https://rnasysu.com/encori/)를 통해 NEAT1 서열에 대한 miR-29b-3p의 잠재적 결합 부위를 예측하였습니다. 이어서 야생형(WT) 또는 돌연변이형(MUT) 결합 부위를 포함하는 NEAT1 단편을 pmirGLO 리포터 벡터에 클로닝하였습니다. 구축된 재조합 플라스미드를 miR-29b-3p mimic(Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) 또는 억제제, 그리고 각각의 음성 대조군(mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’)과 함께 세포에 공동 형질전환하였습니다. 형질전환 48시간 후 세포를 수집하고, 듀얼 루시퍼레이스 검출 시약을 사용하여 반딧불이 루시퍼레이스(firefly luciferase)와 레닐라 루시퍼레이스(renilla luciferase)의 활성을 측정하였습니다. 레닐라 루시퍼레이스 활성은 표준화를 위한 내부 참조로 사용되었습니다.

RNA 면역침강(RIP) 분석

RIP 분석을 위해, Caco-2 세포를 수확하고 PBS로 헹군 후, 프로테아제 및 RNase 억제제가 첨가된 200 µL의 RIP 용해 버퍼(lysis buffer) 내에서 얼음 위에서 15분 동안 배양하였습니다. 세포 용해물을 4 °C에서 16,000 × g로 10분 동안 원심 분리하였으며, 각 상층액 10 µL를 입력 대조군(input control)으로 보관하였습니다. 면역침전(immunoprecipitation)을 위해, 40 µL의 Protein A/G 자성 비즈를 200 µL의 RIP 세척 버퍼 내에서 5 µg의 anti-Ago2 항체 또는 일반 IgG와 함께 실온에서 30분 동안 회전 혼합하였습니다. 500 µL의 RIP 세척 버퍼로 3회 세척한 후, 비즈 현탁액 100 µL를 용해물 100 µL와 혼합하고, RIP 세척 버퍼를 사용하여 최종 부피를 1 mL로 맞춘 다음 4 °C에서 하룻밤 동안 회전시키며 배양하였습니다. 이후 비즈를 500 µL의 RIP 세척 버퍼로 5회 세척하고 동일한 버퍼 150 µL에 재현탁하였습니다. 단백질 분해는 15 µL의 proteinase K (20 mg/mL)와 15 µL의 10% SDS를 첨가한 후, 55 °C에서 30분 동안 흔들어주며 배양하여 수행하였습니다. 상층액을 수집하고 추출 시약을 통해 RNA를 분리한 후 하룻밤 동안 침전시켰습니다. 그 후 RT-qPCR을 통해 NEAT1 및 miR-29b-3p의 농축 정도를 평가하였습니다.

세포 내 위치 분석

제조사의 지침에 따라 시판되는 핵-세포질 분리 시약을 사용하여 Caco-2 세포를 핵 분획과 세포질 분획으로 분리하였습니다. 이 두 성분으로부터 총 RNA를 추출하였으며, RT-qPCR을 통해 핵과 세포질 내 NEAT1의 분포를 검출하였습니다. 분리 효율의 지표로 U6(주로 핵에 존재)와 GAPDH mRNA(주로 세포질에 존재)를 사용하여 보정 작업을 수행하였습니다.

통계 분석

임상 혈청 샘플의 경우, 검정력 분석(t-test, d = 0.5, α = 0.05, power = 0.9) 결과 그룹당 최소 86명의 피험자가 필요한 것으로 나타났다. 임상적으로 유의미한 차이를 검출하기 위해, 시험 중 발생할 수 있는 예기치 못한 상황을 고려하여 각 그룹에 116명의 환자를 등록하였다. 연속형 변수의 데이터 정규성은 Shapiro-Wilk 검정을 통해 평가하였다. 모든 연속형 데이터가 정규 분포를 보였으므로(P > 0.05), 모수적 분석을 적용하였다. 범주형 변수는 카이제곱 검정을 사용하여 분석하였다. 세포 기반 실험은 6회의 독립적인 생물학적 반복 실험을 수행하였으며, 각 생물학적 반복 실험당 5회의 기술적 반복 실험을 실시하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시하였다. 두 연속형 변수 그룹 간의 비교는 Student’s t-test를 사용하여 수행하였으며, 다중 그룹 간의 비교는 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey의 사후 검정(post hoc test)으로 분석하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 정의하였다.

결과

NEAT1의 발현 및 진단적 가치

건강한 대조군(HC) 그룹과 비교했을 때, IBS-D 환자의 NEAT1 발현 수준은 현저히 더 높았습니다 (P < 0.0001; 그림 1A). 수신자 조작 특성(ROC) 곡선으로 나타낸 NEAT1의 곡선 아래 면적(AUC)은 0.867 (95% CI: 0.821–0.913)이었습니다. 특이도는 75.9%였으며, 민감도는 84.5%였습니다 (그림 1B). 이는 IBS-D 환자의 혈청 내 비정상적인 NEAT1 발현이 해당 질환의 새로운 진단 바이오마커로 활용될 수 있음을 시사합니다.

또한, 건강 대조군과 IBS-D 군 환자의 임상 데이터를 비교하였습니다. 분석 결과, 연령, 성별 및 기타 특성에서 두 그룹 간의 유의미한 차이는 나타나지 않았습니다 (P > 0.05). 하지만 HADS, 배변 횟수 및 대변 형태에서는 유의미한 차이가 있었습니다 (P < 0.0001, Table 2). 복통 빈도의 경우, 69명의 환자가 5일 이상 증상을 경험하여 전체의 59.48%를 차지하였습니다. 복통의 중증도는 72명의 환자가 5점 이상의 점수를 기록하여 62.07%를 차지하였습니다 (Table 2). 이는 IBS-D 환자가 증상을 통해 대조군과 명확히 구별됨을 의미합니다. NEAT1의 발현 증가와 IBS-D 증상 간의 임상적 연관성을 고려하여, 다음으로 LPS 처리된 Caco-2 세포 모델을 사용하여 NEAT1이 장벽 무결성에 미치는 기능적 영향을 조사하였습니다.

LPS 처리된 Caco-2 세포에서 NEAT1의 낮은 수준이 장벽 손상 및 염증 반응에 미치는 영향

IBS-D에서 관찰되는 장벽 기능 장애와 저강도 염증을 모델링하기 위해, Caco-2 세포를 LPS로 처리하였습니다. 세포에 LPS를 첨가했을 때, 대조군에 비해 NEAT1 수준이 상향 조절되었습니다. si-NEAT1을 통한 형질전환 후, LPS + si-NC 군과 비교하여 NEAT1 수준이 현저히 감소하였습니다(P < 0.0001, 그림 2A). LPS 처리는 대조군 대비 세포 생존력을 감소시키고 세포 사멸을 증가시켰습니다. NEAT1을 넉다운시킨 후에는 LPS + si-NC 군과 비교하여 세포 생존력이 증가하고 세포 사멸률이 감소하였습니다(P < 0.001; 그림 2B,C). NEAT1을 넉다운시킨 후, LPS로 인해 감소했던 TEER이 유의하게 회복되었습니다(P < 0.0001, 그림 2D). LPS는 대조군에 비해 ZO-1과 occludin의 mRNA 발현을 감소시키고 claudin-2 발현을 증가시켰으나, NEAT1 넉다운은 이러한 변화를 역전시켰습니다(P < 0.001, 그림 2E-G). LPS 처리는 세포 내 염증 반응을 유발할 수 있습니다. 세포 내 염증성 인자인 TNF-α, IL-6, IL-8 및 IL-1β의 수준이 대조군보다 높게 나타났습니다. NEAT1 넉다운 후, 세포 내 염증성 인자의 함량은 si-NC 군과 비교하여 유의하게 감소하였습니다(P < 0.0001, 그림 3A-D). 이는 NEAT1 수준이 낮아지면 LPS로 유도된 장벽 기능 장애와 염증 반응이 감소하며, NEAT1이 IBS-D의 진행에 기여할 수 있음을 시사합니다.

Caco-2 세포에서 NEAT1의 직접 결합 및 miR-29b-3p에 미치는 영향

Caco-2 세포에서 NEAT1은 주로 세포질에서 발견됩니다(그림 4A). NEAT1과 miR-29b-3p의 결합 부위는 ENCORI 데이터베이스를 통해 예측되었습니다. 이를 바탕으로 WT-NEAT1 및 MUT-NEAT1 서열을 설계하였습니다(그림 4B). DLR 실험 결과, miR-29b-3p mimic은 mimic NC와 비교하여 WT-NEAT1의 효소 활성을 감소시킨 반면, miR-29b-3p inhibitor는 inhibitor NC와 비교하여 이를 증가시켰습니다. 반대로, 두 처리 모두 MUT-NEAT1에는 아무런 영향을 미치지 않았습니다(P < 0.0001, 그림 4C). RIP 분석 결과, NEAT1과 miR-29b-3p는 anti-IgG 군에 비해 anti-Ago2 분획에서 현저하게 풍부하게 나타났으며, 이는 두 인자 사이의 특이적 상호작용을 나타냅니다(P < 0.0001, 그림 4D). 이러한 결과는 NEAT1이 miR-29b-3p에 특이적으로 결합함을 시사합니다. 한편, IBS-D 환자의 miR-29b-3p 수준은 HC 군에 비해 현저히 감소되어 있었습니다(P < 0.0001, 그림 4E). 해당 ROC 곡선의 AUC는 0.856(95% CI: 0.808–0.905)이었으며, 민감도는 89.7%, 특이도는 71.6%였습니다(그림 4F). Pearson 상관관계 분석 결과, NEAT1 수준과 miR-29b-3p 발현 사이에 역상관 관계가 있음이 밝혀졌습니다(r = -0.744, P < 0.0001, 그림 4G).

LPS 처리된 Caco-2 세포에서 낮은 NEAT1 발현이 장벽 손상 및 miR-29b-3p 수준에 미치는 영향

LPS 처리된 Caco-2 세포에서 miR-29b-3p 발현은 대조군에 비해 현저하게 감소하였습니다. si-를 이용한 형질전환을 통해NEAT1 miR-29b-3p 수준이 증가한 반면, miR-29b-3p 억제제를 이용한 형질전환은 miR-29b-3p 수준을 다시 감소시켰다 (P < 0.0001, 그림 5A). ~의 넉다운(knockdown) NEAT1 세포 생존능은 증가하고 세포자멸사는 감소하였으며, 이러한 효과는 miR-29b-3p 억제제에 의해 소실되었다 (P < 0.01, 그림 5B,C). LPS로 인해 감소된 TEER은 ~에 의해 회복되었습니다. NEAT1 넉다운시켰으며, 이러한 회복은 miR-29b-3p 억제제에 의해 다시 방해되었습니다 (P < 0.0001, 그림 5D). LPS 처리는 ~의 발현 감소를 유도하였다. ZO-1 및 occludin mRNA가 감소하였으며, 대조군과 비교하여 claudin-2 mRNA의 발현은 증가하였다. 이후 NEAT1 넉다운, miR-29b-3p 수치 증가, ZO-1 그리고 occludin mRNA 수준은 증가하였으며, claudin-2 mRNA 수준은 LPS + si-NC 군과 비교하여 감소하였습니다. miR-29b-3p 억제 후, ZO-1 또한 LPS + si-군과 비교하여 occludin mRNA 수준은 감소하였고, claudin-2 mRNA 수준은 증가하였습니다.NEAT1 + 억제제 NC 군 (P < 0.001, 그림 5E-G). NEAT1 (주로 세포질 하위 유형) NEAT1_1)은 miR-29b-3p의 스펀지 역할을 합니다. 다음의 녹다운(knockdown)은 NEAT1 miR-29b-3p를 방출하여, 이를 통해 간접적으로 상향 조절합니다. ZO-1 그리고 occludin을 상향 조절하며 claudin-2를 하향 조절하여, LPS로 유도된 장벽 붕괴를 완화합니다. 이러한 결과는 본 모델에서 miR-29b-3p가 긍정적으로 조절함을 시사합니다. ZO-1 및 occludin 발현을 유도하고 claudin-2를 부정적으로 조절하며, 이러한 효과가 NEAT1 넉다운은 적어도 부분적으로 miR-29b-3p에 의해 매개됩니다.

우리는 western blot 분석을 사용하여 밀착 연접 단백질의 발현 수준을 추가로 조사했습니다. 그림 5H에 나타난 바와 같이, NEAT1 넉다운은 LPS + si-NC 그룹과 비교했을 때 LPS에 의해 감소된 ZO-1 및 occludin의 발현을 증가시켰으며, claudin-2의 발현은 억제했습니다. 그러나 miR-29b-3p 억제제를 함께 전이시키자 LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC 그룹과 비교하여 NEAT1 넉다운의 보호 효과가 약화되었습니다. 이러한 결과는 NEAT1 넉다운이 최소한 부분적으로는 miR-29b-3p를 상향 조절함으로써 밀착 연접 단백질의 발현을 회복시키고, 이를 통해 장벽 기능을 개선한다는 결론을 뒷받침합니다.

LPS 처리된 Caco-2 세포의 장 염증 및 miR-29b-3p 발현에 낮은 NEAT1 수준이 미치는 영향

LPS 처리된 Caco-2 세포에서 LPS는 염증 반응을 유발했습니다. 전염증 인자인 TNF-α, IL-6, IL-8 및 IL-1β의 수치는 대조군보다 유의하게 높았습니다. NEAT1 넉다운 후, miR-29b-3p 수치는 증가한 반면 전염증 인자의 수치는 si-NC와 비교하여 유의하게 감소했습니다. miR-29b-3p 억제 후에는 염증 인자의 수치가 다시 증가했습니다 (P < 0.0001, 그림 6A-D). 따라서 NEAT1 넉다운은 적어도 부분적으로 miR-29b-3p를 상향 조절함으로써 염증성 사이토카인의 방출을 억제합니다.

이러한 결과는 IBS-D 환자의 혈청에서 NEAT1 수치가 비정상적으로 상승되어 있으며, NEAT1이 IBS-D 환자와 건강한 대조군을 구분하는 데 있어 높은 AUC 값을 가진다는 것을 나타냅니다. 기전적으로 NEAT1은 세포질에서 miR-29b-3p와 직접 결합하여 이를 격리합니다. 세포 모델 및 기능적 회복 실험에서 NEAT1 넉다운은 miR-29b-3p 발현을 증가시키고, 세포 생존력과 TEER을 개선하며, 세포 사멸을 감소시키고, 전염증성 사이토카인의 방출을 완화하였습니다. 이러한 발견은 NEAT1이 miR-29b-3p를 억제함으로써 장벽 무결성을 부정적으로 조절한다는 가설을 뒷받침하며, NEAT1을 표적으로 하는 것이 IBS-D의 잠재적인 진단 및 치료 전략이 될 수 있음을 시사합니다.

데이터 가용성:

그림과 표의 근거가 되는 원시 데이터는 Supplemental File 1(원시 데이터 스프레드시트) 및 Supplemental File 2(편집되지 않은 웨스턴 블롯 이미지)로 제공됩니다.

그림 1. IBS-D 환자에서 NEAT1의 발현 및 진단 가치. (A) RT-qPCR로 검출한 건강 대조군(HC, n = 116)과 IBS-D 환자(n = 116)의 혈청 내 NEAT1 발현 수준; (B) 건강 대조군과 IBS-D 환자를 구분하기 위한 NEAT1의 ROC 곡선 분석. 데이터는 평균 ± SD로 표시됨 (그룹당 n = 116). **** P < 0.0001. 약어: IBS-D = 설사형 과민성 대장 증후군; ROC = 수신자 조작 특성 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. Caco-2 세포에서 LPS로 유도된 장벽 손상에 미치는 NEAT1의 영향. (A) si-NEAT1 형질전환은 LPS로 유도된 NEAT1 수준을 감소시킴; (B) 0, 24, 48, 72 h에서 CCK-8 분석으로 측정한 세포 생존율. NEAT1 넉다운은 세포 생존율을 향상시킴; (C) Annexin V-FITC/PI 염색 및 유세포 분석으로 결정한 세포사멸률. NEAT1 억제는 세포사멸률을 감소시킴; (D) Caco-2 단일층에서 측정한 경상피 전기저항(TEER). NEAT1 억제는 세포 TEER를 증가시킴; (E-G) RT-qPCR로 측정한 (E) ZO-1, (F) occludin, (G) claudin-2의 mRNA 발현 수준. NEAT1 억제는 ZO-1 및 occludin mRNA 발현을 높이고, claudin-2 mRNA 수준을 감소시킴. 데이터는 6회의 독립적인 실험(그룹당 n = 6)의 평균 ± SD로 나타냄. *** P < 0.001; **** P < 0.0001, 대조군 대비 LPS, LPS + si-NC 대비 LPS + si-NEAT1. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. Caco-2 세포에서 LPS로 유도된 염증성 사이토카인 방출에 미치는 NEAT1 넉다운의 효과. (A-D) ELISA로 측정한 세포 배양 상층액 내의 (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 및 (D) IL-1β 농도. NEAT1 넉다운은 LPS로 유도된 TNF-α, IL-6, IL-8 및 IL-1β 수준을 감소시킨다. 데이터는 6회의 독립적인 실험(그룹당 n = 6)의 평균 ± SD로 나타냈다. **** P < 0.0001, LPS vs. 대조군, LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. NEAT1의 직접 결합 및 miR-29b-3p와의 연관성. (A) 핵-세포질 분획법으로 결정한 Caco-2 세포 내 NEAT1의 세포 내 국소화(U6: 핵 대조군, GAPDH: 세포질 대조군). NEAT1은 주로 세포질에 위치함; (B) ENCORI 데이터베이스를 통해 예측한 miR-29b-3p에 대한 NEAT1의 WT 및 MUT 결합 서열; (C) DLR 분석을 통해 검증한 NEAT1과 miR-29b-3p 사이의 결합 관계; (D) RIP를 통해 검증한 NEAT1과 miR-29b-3p 사이의 결합 관계. A, C, D의 데이터는 6회의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± SD임(그룹당 n = 6). (E) 건강한 대조군(HC, n = 116)과 IBS-D 환자(n = 116)의 혈청 miR-29b-3p 발현 수준; (F) 건강한 대조군으로부터 IBS-D 환자를 판별하기 위한 miR-29b-3p의 ROC 곡선; (G) IBS-D 환자의 NEAT1 및 miR-29b-3p 수준 간의 Pearson 상관 분석. NEAT1은 miR-29b-3p의 발현과 음의 상관관계를 보임(r = -0.744, P < 0.0001). E의 데이터는 평균 ± SD임(그룹당 n = 116). **** P < 0.0001. 약어: WT = 야생형; MUT = 변이형; DLR = 이중 루시퍼라제 리포터; RIP = RNA 면역침강. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.

그림 5. LPS 처리된 Caco-2 세포 및 miR-29b-3p에서 NEAT1 넉다운이 장벽 기능에 미치는 영향. (A) NEAT1 넉다운은 miR-29b-3p 수치를 증가시키며, miR-29b-3p 억제제 전이(transfection)는 miR-29b-3p 발현을 감소시킨다. (B) CCK-8 분석으로 측정한 세포 생존율. 낮은 수치의 NEAT1은 miR-29b-3p를 증가시켜 세포 생존율을 향상시킨다; (C) 유세포 분석으로 결정한 세포 사멸률. 낮은 수치의 NEAT1은 miR-29b-3p를 증가시켜 세포 사멸률을 감소시킨다; (D) 낮은 수치의 NEAT1은 miR-29b-3p 수치를 높여 세포의 TEER를 증가시킨다; (E-G) (E) ZO-1, (F) occludin, 및 (G) claudin-2의 mRNA 발현. 낮은 수치의 NEAT1은 miR-29b-3p를 강화하여 ZO-1 및 occludin의 발현을 증가시키고 claudin-2 mRNA의 발현을 감소시킨다. (H) 표시된 처리 조건 하에서의 ZO-1, occludin, claudin-2 및 GAPDH 단백질 발현을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯 이미지. 데이터는 6회의 독립적인 실험(그룹당 n = 6)의 평균 ± SD로 표시되었다. ** P < 0.01; *** P < 0.001; **** P < 0.0001, LPS vs. 대조군, LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-억제제 vs. LPS + si-NEAT1 + 억제제 NC. 약어: miR-inhibitor = miR-29b-3p 억제제; TEER = 경상피 전기 저항. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6. LPS 처리된 Caco-2 세포의 염증 및 miR-29b-3p에 미치는 NEAT1 넉다운의 효과. (A-D) ELISA로 측정한 세포 배양 상청액 내의 (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 및 (D) IL-1β 농도. NEAT1의 낮은 수준은 miR-29b-3p를 증가시켜 세포 상청액 내의 TNF-α, IL-6, IL-8 및 IL-1β 함량을 감소시킨다. 데이터는 6회의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± SD로 표시되었다 (그룹당 n = 6). **** P < 0.0001, LPS vs. 대조군, LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inhibitor vs. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC. 약어: miR-inhibitor = miR-29b-3p 억제제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유전자	프라이머 서열
NEAT1 정방향	5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
NEAT1 역방향	5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
ZO-1 정방향	5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′
ZO-1 역방향	5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Occludin 정방향	5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Occludin 역방향	5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Claudin-2 정방향	5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Claudin-2 역방향	5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
miR-29b-3p 정방향	5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
miR-29b-3p 역방향	5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
GAPDH 정방향	5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
GAPDH 역방향	5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
U6 정방향	5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 역방향	5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

표 1: 프라이머 서열.

지시약	대조군 (N=116)	IBS-D군 (N=116)	P
연령, 세
< 40	63	54	0.293
≥ 40	53	62
성별
수컷	64	66	0.895
여성	52	50
흡연
없음	58	53	0.599
예	58	63
음수
없음	63	58	0.599
예	53	58
병원불안 및 우울 척도(HADS), 점수
< 8	96	26	< 0.0001
≥ 8	20	90
배변 횟수/일
< 4	103	51	< 0.0001
≥ 4	13	65
대변 형태, 브리스톨 척도
< 5	87	25	< 0.0001
≥ 5	29	91
복통 빈도, 일수
< 5	/	47	/
≥ 5	/	69
복통의 중증도 점수
< 5	/	44	/
≥ 5	/	72

표 2: 건강한 대조군과 IBS-D 환자 간의 인구통계학적 및 임상적 특성 비교. 수치는 각 그룹의 참가자 수(그룹당 n = 116)로 보고되었습니다. 그룹 간 차이는 카이제곱 검정을 사용하여 평가되었습니다. 약어: HADS = 병원 불안 및 우울 척도; IBS-D = 설사형 과민성 대장 증후군.

보충 파일 1: 그림 및 표의 기초가 되는 원시 데이터. 이 파일에는 그림 1, 그림 2, 그림 3, 그림 4, 그림 5 및 그림 6에 표시된 정량적 결과를 생성하는 데 사용된 원시 수치 데이터와 표 2에 요약된 인구통계학적/임상적 데이터가 포함되어 있습니다.이 파일을 다운로드하시려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 편집되지 않은 웨스턴 블롯 이미지. 이 파일에는 그림 5H에 표시된 대표 웨스턴 블롯 패널에 해당하는 ZO-1, occludin, claudin-2 및 GAPDH의 편집되지 않은 웨스턴 블롯 이미지가 포함되어 있습니다.여기를 클릭하여 이 파일을 다운로드하십시오.

토론

IBS-D는 흔한 기능성 위장관 장애입니다. 그 병리 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 최근 몇 년 동안 후성유전학적 조절의 핵심 분자인 lncRNA는 질병의 진단 및 치료 분야에서 큰 가능성을 보여주었습니다. LncRNA NEAT1은 대장암²⁴, 신경교종²⁵, 심근경색²⁶과 같은 다양한 질환에서 연구되어 왔습니다. 여러 연구를 통해 NEAT1이 염증 반응¹³, 세포 증식²⁷ 및 장벽 통합성²⁸ 조절에 관여한다는 것이 밝혀졌습니다. 하지만 IBS-D에서의 NEAT1의 구체적인 발현, 임상적 가치 및 IBS-D의 기저에 있는 조절 기전은 아직 충분히 탐구되지 않았습니다.

NEAT1 폐렴과 같은 다양한 염증성 질환에서 발현이 증가합니다²⁹, 골관절염³⁰, 비염³¹및 패혈증³²본 연구의 결과는 앞선 연구들에서 보고된 결과와 일치합니다. NEAT1 발현이 IBS-D 환자에게서 유의하게 상향 조절되었습니다. 이는 해당 인자가 IBS-D의 발병과 관련이 있을 수 있음을 시사합니다. 현재 IBS-D의 진단은 주로 Rome IV 증상 기준에 의존하고 있으며, 객관적인 실험실적 바이오마커는 없는 실정입니다. 이러한 기준들은 연구 및 많은 임상 환경에서 효과적임이 입증되었으나, 주관성, 타 질환과의 증상 중첩, 진단 지연 등의 한계가 여전히 존재합니다. 추가적인 ROC 곡선 분석 결과에 따르면 NEAT1 IBS-D 환자에게서 상대적으로 좋은 진단적 가치를 가집니다. 혈청 NEAT1 발현 수준은 0.867의 AUC와 높은 민감도 및 특이도를 보이며 IBS-D 환자와 건강한 대조군을 효과적으로 구분합니다. 이는 다음을 시사합니다. NEAT1 Rome IV 진단 기준을 보완하는 도구 또는 설사형 과민성 장 증후군(IBS-D)의 새로운 진단 마커로서의 가능성을 가지고 있습니다. 예를 들어, 만성 복통과 배변 습관의 변화를 보이며 [특정 수치가] 상승한 환자의 경우 NEAT1 바이오마커 결과와 Rome IV 기준을 함께 고려하면 더욱 확신을 가지고 수치를 평가할 수 있습니다. 이는 증상 맞춤형 치료의 조기 시작을 용이하게 하며 불필요한 침습적 검사를 피하게 해줍니다. 반대로, 바이오마커 결과는 정상이지만 Rome IV 기준을 충족하는 환자의 경우, 다른 기질적 질환을 배제하기 위해 더욱 면밀한 모니터링이 필요합니다. 따라서 이러한 바이오마커를 임상 현장에 통합함으로써 진단 정확도와 효율성을 높일 수 있을 것으로 기대되나, 임상 환경에서의 전향적 검증이 여전히 요구됩니다.

IBS-D 환자가 경험하는 임상 증상은 손상된 장벽 기능과 관련이 있을 수 있습니다³³. 이 기능은 주로 장 상피 세포 사이의 밀착 연접(tight junction, TJ) 구조에 의해 매개되며, ZO-1 및 occludin 단백질이 중요한 역할을 합니다^34,35. ZO-1은 점막 상피의 기계적 장벽과 투과성을 유지하는 데 관여합니다³⁶. Occludin은 주로 세포 간 밀착 연접을 형성하며, 이는 장벽 기능을 유지하는 데 필수적입니다³⁷. 밀착 연접 단백질인 claudin-2는 다른 기능 외에도 세포 우회 기공 채널을 형성하는 데 중요한 역할을 합니다³⁸. IBS-D 환자의 경우 일반적으로 ZO-1과 occludin은 감소하고 claudin-2는 증가하며, 이로 인해 장벽이 손상되고 투과성이 증가합니다. 본 연구에서는 NEAT1 넉다운이 in vitro 세포 모델의 TEER을 증가시켰으며, 이는 해당 모델에서 NEAT1이 장벽에 손상을 주는 효과가 있음을 뒷받침합니다. 분자 수준에서 NEAT1 발현을 억제하면 주요 밀착 연접 단백질인 ZO-1 및 occludin의 mRNA 발현 수준이 유의미하게 반등한 반면, claudin-2 발현은 감소했습니다. 이는 NEAT1이 밀착 연접 단백질의 발현을 부정적으로 조절하여 장 상피의 물리적 장벽을 파괴하고 투과성을 높일 수 있음을 시사합니다. 결과적으로 이는 '장 누수(leaky gut)' 현상으로 이어질 수 있습니다. 또한, IBS-D에서 광범위하게 나타나는 저강도 염증은 장벽 손상을 악화시키는 중요한 요인입니다³⁹. 수많은 연구를 통해 lncRNA가 염증 신호 전달 경로에서 핵심 조절 노드로 작용할 수 있음이 확인되었습니다⁴⁰. 우리의 연구 결과도 이와 일치합니다. NEAT1 넉다운은 LPS에 의해 유도된 전염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, IL-8 및 IL-1β의 방출을 유의미하게 감소시킵니다. 이는 다른 염증 모델에서 전염증성 lncRNA로서 NEAT1이 수행하는 역할과 매우 유사하며, IBS-D에서 NEAT1이 중요한 역할을 하는 '염증-장벽 손상-염증'의 악순환이 존재할 수 있음을 나타냅니다.

마이크로RNA(miRNA)는 질환 조절에 관여하는 또 다른 중요한 인자군입니다. miR-29b-3p는 다양한 LPS 유도 세포 염증 반응에서 낮게 발현됩니다^41,42. 대부분의 연구와 일치하게, 우리는 IBS-D 환자의 혈청에서 miR-29b-3p 수준이 현저히 감소되어 있으며, NEAT1의 상향 조절과 강한 음의 상관관계를 보인다는 것을 발견했습니다. 또한, 본 모델의 세포질 내에서 NEAT1이 miR-29b-3p에 직접 결합하여 이를 스펀징(sponging)한다는 것을 입증했습니다. 기능 회복 실험을 통해 NEAT1이 적어도 부분적으로는 miR-29b-3p를 통해 Caco-2 세포의 생존율과 세포 사멸뿐만 아니라 ZO-1, occludin, and claudin-2 mRNA 수준에 영향을 미치며, 최종적으로 장벽 무결성에 영향을 준다는 것을 확인했습니다. 특히, 우리의 데이터는 IBS 관련 장벽 기능 장애 상황에서 miR-29b-3p 수준이 ZO-1 및 occludin 수준과 양의 상관관계가 있음을 나타냅니다. 이러한 양성 조절은 간접적일 수 있습니다. 예를 들어, miR-29b-3p가 밀착 연접 단백질의 전사 억제자를 표적하여 전사를 억제함으로써 억제를 해제하고 ZO-1과 occludin의 발현을 촉진할 수 있습니다. 이러한 가설은 miR-29b-3p가 장벽 기능의 음성 조절자를 표적으로 하여 염증 상태에서 보호 역할을 한다는 이전 연구들에 의해서도 뒷받침됩니다⁴².

그러나 miR-29b-3p가 ZO-1 및 occludin mRNA 발현을 조절하는 표적 유전자는 ceRNA 네트워크를 완성하기 위해 추가적인 조사가 필요하며, 이는 본 연구의 한계점입니다. 또한, 본 연구에는 다음과 같은 다른 한계점들이 있습니다. 첫째, 본 연구는 상대적으로 적은 표본 크기(IBS-D 환자 116명만 포함)를 가진 단일 센터 연구였습니다. NEAT1의 임상적 진단 가치는 대규모, 다기관 전향적 코호트 연구를 통해 추가적인 검증이 필요합니다. 둘째, 본 연구는 주로 임상적 연관성 분석과 in vitro 세포 모델을 기반으로 하였습니다. 향후 이 축의 in vivo 역할을 검증하기 위해 동물 모델이 필요할 것입니다. 셋째, IBS-D의 발병 기전에 관여하는 miR-29b-3p의 구체적인 하위 표적 유전자 네트워크가 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 향후 연구는 다음 사항에 집중해야 합니다: (1) IBS-C 및 IBS-M 환자에서 NEAT1과 miR-29b-3p의 진단 가치 검증, (2) 동물 모델에서 NEAT1 표적 중재법의 치료 효능 테스트, (3) miR-29b-3p가 밀착 연접 단백질을 조절하는 정확한 분자적 기전 규명. 이러한 노력은 본 연구 결과의 임상적 적용을 촉진할 것입니다.

결론적으로, NEAT1은 IBS-D 환자에서 높게 발현되며 이 코호트에서 우수한 진단 가치를 가집니다. 낮은 NEAT1 수치는 LPS 처리된 Caco-2 세포에서 miR-29b-3p 수치를 증가시킴으로써 세포 생존력을 촉진하고, 세포 사멸을 감소시키며, 장벽 손상을 완화하고, 염증 반응을 억제할 수 있습니다. NEAT1/miR-29b-3p 축은 IBS-D의 복잡한 병태생리학적 기전에 대한 새로운 관점을 제공합니다. NEAT1은 IBS-D의 잠재적인 진단 바이오마커로 활용될 수 있으며, NEAT1/miR-29b-3p 축은 해당 질환의 잠재적인 치료 표적이 될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24-웰 플레이트	Corning	CLS3524	세포 분주용
96-웰 플레이트	Corning	CLS3599	CCK-8 분석용 세포 분주용
Annexin V-FITC/PI apoptosis 키트	Invitrogen	V13242	세포 사멸률 검출용
Anti-AGO2 단클론 항체	Proteintech	67934-1-Ig	Ago2 결합 RNA 복합체의 면역침전용
Anti-Claudin-2 항체	Invitrogen	32-5600	1차 항체, 희석 배수 1:1000
Anti-GAPDH 항체	Cell Signaling Technology	5174	1차 항체, 희석 배수 1:5000; 로딩 컨트롤
Anti-Human IgG 항체	Proteintech	10284-1-AP	RIP 분석의 음성 대조군으로 사용
Anti-Occludin 항체	Abcam	ab31721	1차 항체, 희석 배수 1:500
Anti-ZO-1 항체	Proteintech	21773-1-AP	1차 항체, 희석 배수 1:1000
Caco-2 세포	SUNNCELL	SNL-068	장 상피 장벽 모델 구축용
CCK-8 키트	Solarbio	CA1210	세포 증식 분석 키트
클로로포름	Sigma-Aldrich	C2432	RNA 추출 시 상분리용
DMEM 배지	Gibco	11965092	세포 배양용
Dual-Luciferase Reporter 분석 키트	ThermoFisher	16186	루시퍼라제 활성 검출용
ELISA 키트 (IL-1β용)	R&D Systems	DY201	세포 배양 상층액 내 표적 단백질 검출용
ELISA 키트 (IL-6용)	R&D Systems	D6050B	세포 배양 상층액 내 표적 단백질 검출용
ELISA 키트 (IL-8용)	R&D Systems	NBP3-28022	세포 배양 상층액 내 표적 단백질 검출용
ELISA 키트 (TNF-α용)	R&D Systems	DTA00D	세포 배양 상층액 내 표적 단백질 검출용
강화 화학 발광(ECL) 기질	Thermo Fisher	32106	단백질 밴드 시각화용
에탄올 (75%)	Sigma-Aldrich	459844	RNA 펠릿 세척용
FBS (태아 송아지 혈청)	Gibco	10099141	세포 배양용
유세포 분석기	Beckman Coulter	B53002	세포 사멸률 검출용
HRP 결합 2차 항체	Cell Signaling Technology	7074	ECL 기질로부터 화학 발광 신호 생성 촉매
이소프로판올	Sigma-Aldrich	1133502500	RNA 침전용
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	형질전환 시약
리포폴리사카라이드 (LPS)	Sigma-Aldrich	L2880	세포 모델 구축 유도용
마이크로플레이트 리더	BioTek	Epoch 2	96-웰 플레이트 내 샘플의 흡광도 측정용
Nanodrop 마이크로 분광광도계	Thermo Scientific	ND-2000C	RNA 농도 및 순도 결정용
무지방 건조 우유	Coolaber	CN7861	멤브레인 블로킹용 (5% 용액)
PARIS 키트	Thermo Fisher	AM1921	핵-세포질 분획용
Penicillin–Streptomycin	Gibco	15140122	세포 성장 시 오염 방지용
Pierce BCA 단백질 분석 키트	Thermo Fisher	23225	단백질 농도 결정용
pmirGLO Dual-Luciferase 벡터	Promega	E1330	듀얼 루시퍼라제 리포터 유전자 벡터
PrimeScript RT 시약 키트	Takara	RR047A	RNA의 cDNA 역전사용
PVDF 멤브레인	Millipore	IPVH00010	SDS-PAGE 후 단백질 전사용
실시간 형광 정량 PCR 장비	Applied Biosystems	4365464	표적 유전자 검출용
RIPA 용해 버퍼 (단백질 분해 효소 억제제 포함)	Thermo Fisher	89901	세포 내 총 단백질 추출용
RNA 결합 단백질 면역침전 키트	Sigma-Aldrich	17-701	Protein A/G 자기 비드를 이용한 RNA 결합 단백질 면역침전(RIP) 분석용
SDS-PAGE 시약 (10% 겔)	TargetMol	C0189	분자량별 단백질 분리용
SYBR Green 마스터 믹스	Thermo Fisher	4309155	PCR 테스트용
TEER 측정기 (전압-전류계)	Millipore	MERS00002	단일층 무결성 측정을 위한 경세포막 저항 측정기
Transwell 챔버	Corning Costar	CLS3413	세포 단일층 배양 및 TEER 측정용
TRIzol 시약	Invitrogen	15596026CN	총 RNA 추출용