척수 손상(SCI) 환자에서 CASC11 상향 조절은 손상 중증도와 관련이 있습니다. 시험관 내에서 CASC11 하향 조절은 세포자멸사와 염증을 완화하여 miR-130b-5p/SPP1 축과의 연관성을 시사합니다. 이 결과는 CASC11이 SCI 발병 기전에서 바이오마커 후보로서 잠재적 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
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연구 논문
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척수 손상(SCI) 환자에서 CASC11 상향 조절은 손상 중증도와 관련이 있습니다. 시험관 내에서 CASC11 하향 조절은 세포자멸사와 염증을 완화하여 miR-130b-5p/SPP1 축과의 연관성을 시사합니다. 이 결과는 CASC11이 SCI 발병 기전에서 바이오마커 후보로서 잠재적 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
척수 손상(SCI)은 중추신경계에 심각한 외상을 입히는 질환입니다. 이 단일 기관, 관찰 및 시험관 내 연구는 임상 혈청 샘플과 지다당류 자극 세포 모델을 사용하여 CASC11 의 진단 잠재력과 척수손상 에서의 조절 메커니즘을 조사하였습니다. CASC11, miR-130b-5p, SPP1 수치는 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)으로 측정되었습니다. 세포 기능과 표적 관계는 세포 카운팅 kit-8(CCK-8), 유세포 분석, 웨스턴 블롯, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 이중 루시퍼라제 리포터, RNA 면역침전(RIP) 검사를 통해 평가하였습니다. CASC11 은 SCI에서 매우 많이 발현되었으며, 염증과 잠재적 진단 바이오마커로 연관되어 있습니다. 지지다당류(LPS) 처리된 PC-12 세포에서는 CASC11 을 침묵시키면 억제된 세포 활동, 세포자사멸사, 염증이 완화되었고, 이는 miR-130b-5p 억제제에 의해 되돌렸습니다. 이 결과는 CASC11 이 SCI 중증도와 연관되어 있음을 시사하며, 시험관 내 데이터는 CASC11/miR-130b-5p/SPP1 축을 통한 염증 및 세포자사멸사 반응에 관여함을 나타냅니다. 이 연구는 단일 센터 설계와 생체 내 검증 부족으로 제한을 받고 있습니다.
척수 손상(SCI)은 외부 요인이나 질병에 의해 발생하는 척수 손상으로 인해 발생하는 일시적 또는 영구적인 전신 질환을 의미하며, 이로 인해 운동, 감각, 반사, 자율신경계 기능이 손상된다 1,2. 환자들은 평생 지속되는 신체적 기능 결함과 합병증을 자주 겪으며, 이는 개인과 가족에게 상당한 고통과 부담을 안겨줍니다. SCI의 병인은 크게 외상성 기원과 비외상 기원으로 분류됩니다. 외상성 손상은 주로 교통사고, 고소 추락, 스포츠 관련 사건과 같은 외부 요인으로 인한 척추 골절로 인해 발생하며, SCI4 임상 관리에서 점점 더 큰 도전 과제가 되고 있습니다. 한편, 1차 손상 이후 시작된 2차 손상 연쇄 반응, 특히 염증 반응의 조절 장애와 신경세포자멸사는 신경 기능의 지속적인 악화에 기여하는 중요한 요인으로 간주됩니다. 최근 연구들은 SCI5의 병태생리와 수리에서 신경염증, 재생, 기능 회복이 중요한 역할을 한다는 점을 강조했습니다. 신경염증은 중추 2차 반응으로서 조직 손상과 수리 과정에서 이중 역할을 합니다. 손상된 척수의 재생 능력이 제한적이기 때문에, 항염증 치료, 세포 이식, 재활, 분자 중재를 결합한 시너지 치료가 필요합니다. 척추 손상에 대한 다양한 진단 및 치료 전략이 확립되었지만, 현재 임상 실무는 주로 영상 검사에 의존하고 있습니다. 하지만 이러한 기법들은 첨단 장비에 대한 높은 요구, 엄격한 환자 전제 조건, 그리고 상당한 재정적 비용으로 인해 제한을받습니다. 따라서 편리하고 정확하며 비침습적인 실험실 바이오마커에 대한 긴급하고 충족되지 않은 수요가 존재합니다. 이러한 표지자의 확인은 기존 치료 프로토콜을 방해하지 않고 SCI의 조기 진단을 가능하게 하여 보다 시기적절하고 효과적인 치료 개입 개발을 촉진할 것입니다.
롱 비암호화 RNA(lncRNA)는 단백질 코딩 잠재력은 부족하지만 염증 조절과 세포자사멸사 조절 등 다양한 생물학적 기능에 필수적인 기능적 RNA 분자 중 주요 범주를 대표합니다. LncRNA는 미세RNA(miRNA)의 분자 스펀지 역할을 하여 이 miRNA가 표적 mRNA에 결합하고 침묵시키는 것을 효과적으로 방해합니다10. 예를 들어, lncRNA MAGI2-AS3는 골절 치유를 가속화하기 위해 miR-223-3p를 매개합니다. lncRNA OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2 네트워크를 표적으로 삼는 것은 SCI12 회복 개선에 유망한 치료 접근법을 제시합니다. CASC11은 872-bp 전사체가 염색체 8q24.21에 위치하며, 다양한 인간 암에서 발현 조절 이상을 보이는 분자로 인식됩니다13. CASC11은 폐경 후 골다공증 환자에서 양성 발현을 보이며, 환자와 건강한 대조군을 구분할 수 있는 능력을 가지고 있습니다14. 더불어 CASC11도 골절 환자에서도 유사한 상향 조절 패턴과 치료 잠재력을 보입니다15. 이 보고에 따르면 CASC11은 염증 반응과 세포 활동을 조절할 수 있습니다. 이러한 통찰에도 불구하고, SCI에서 CASC11의 발현 패턴과 생물학적 역할은 여전히 완전히 알려지지 않았습니다. 과염증과 세포자사멸사가 2차 SCI의 주요 원인임을 고려할 때, CASC11이 SCI의 후보 바이오마커이자 조절 인자일 수 있다고 가설을 세웠습니다. 본 연구는 환자 코호트와 시험관 내 세포 모델을 분석하여 SCI에서 CASC11의 임상 연관성 및 바이오마커 잠재력을 조사하였습니다(그림 1). 더 나아가, CASC11의 분자적 기전과 SCI 이후 염증 반응 조절에 대한 잠재적 역할도 탐구했습니다.
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과목 등록
2023년 1월부터 2025년 5월까지 병원에서 치료받은 급성 척수 외상(n = 300) 환자들은 미국 척수손상 협회 장애 척도(AIS 분류)에 따라 완전 척수 손상(CSCI) 그룹(등급 A, n = 98), 불완전 척수 손상(ISCI) 그룹(등급 B, C, D; n = 95), 정상 신경 기능(NNF) 그룹(등급 E, n = 107)으로 선정되어 분류되었습니다. NNF 그룹 환자에서는 부종, 타박상, 압박과 같은 척추손상의 방사선학적 증거가 자기공명영상(MRI)으로 확인되었으나, 감각 또는 운동 결손은 발견되지 않았습니다. 같은 기간 동안 모집된 건강한 참가자 90명이 대조군으로 선정되었습니다. 포함 기준은 다음과 같았습니다: (1) 확립된 임상 관리 지침에 따라 영상(MRI 또는 CT)으로 확인된 척추 손상진단 16; (2) 입원 24시간 전 외상; 그리고 (3) 완전한 임상 데이터를 가진 성인 참가자. 제외 기준은 다음과 같았습니다: (1) 골절 또는 척수손상과 관련된 이전 수술 이력; (2) 중증 관상동맥질환 또는 중대한 심폐질환; (3) 급성 중증 두개뇌손상; 그리고 (4) 악성 종양, 심혈관/뇌혈관 질환 또는 면역 질환. 이 연구는 선전 제4인민병원 윤리위원회로부터 승인을 받았으며, 피험자들의 사전 동의를 받았습니다. 이 연구에서 사용된 절차는 헬싱키 선언의 원칙을 준수했다.
표본 수집
입원 후 24시간 이내에 혈청 분리관을 사용해 참가자들로부터 정맥 혈액 샘플(5mL)을 채취하였습니다. 혈액은 실온에서 30분간 응고시키고, 이후 3,000 × g 에서 4°C에서 10분간 원심분리했다. 상정액 혈청은 신중하게 분리되어 RNase 없는 마이크로튜브로 분리되어 -80 °C에서 추가 분석을 기다리며 보관했습니다.
세포 배양 및 LPS 유도
쥐 갈색세포세포(PC-12)와 쥐 미세아세포(BV-2)는 37°C에서 10% 태아 소 혈청을 보충한 Dulbecco의 변형 Eagle 배지에서 배양하였다. 시험 관 내 염증성 손상 모델을 확립하기 위해 PC-12와 BV-2 세포를 0, 1, 5, 10 μg/mL 농도의 지포다당류(LPS)에 12시간17분간 노출시켰습니다. 각 농도는 세 개의 독립적인 생물학적 복제체에서 검사되었다.
RT-qPCR
총 RNA는 페놀-클로로포름 추출 프로토콜을 사용해 샘플에서 분리한 후 이소프로판올로 침전하였습니다. RNA 순도는 분광광도계로 평가되었으며, 1.8–2.1 범위 내의 A260/280 nm 비율을 가진 샘플을 사용해 후속 분석에 사용하였습니다. RNA는 역전사 키트 프로토콜에 따라 cDNA로 역전사되었고, 결과된 cDNA는 PCR 기기에서 SYBR Green 프리믹스와 함께 RT-qPCR 반응의 템플릿으로 사용되었습니다. 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(GAPDH)는 CASC11 과 SPP1 mRNA의 기준 유전자로, 소규모 핵 RNA(U6)는 miR-130b-5p의 참조 유전자로 사용되었습니다. 혈청 샘플의 경우, RNA 추출 전에 합성 cel-miR-39를 혈청에 스파이크하여 RNA 회수의 변동을 조절했습니다. 프라이머는 다음과 같다: CASC11 전진 5'-ACCCTATGGAACCAGAGAC-3' 및 역방향 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAT-3'; miR-130B-5p 전진 5'-ATCCATGGGTGGTCCG-3' 및 후진 5'-TAGTGCAACCTCGTCAGC-3'; 그리고 SPP1 mRNA는 순방향 5'-GTTAAACAGGCTGATTGG-3', 역방향 5'-CATGGTCATCATCATTCTTCA-3'입니다. 발현은 2-ΔΔCt 방법으로 계산되었습니다. 각 RT-qPCR 반응은 세 개의 생물학적 복제를 이용한 3개의 기술 복제로 수행되었습니다.
형질전환
침묵화 CASC11 (si-CASC11), miR-130b-5p 모방/억제제, SPP1 과발현 플라스미드(ov-SPP1), 그리고 이들의 음성 대조군(NC)을 합성하여 형질전환 시약을 사용해 PC-12와 BV-2 세포에 형질전환하였습니다. 형질전환 효율은 3중 생물학적 복제체에서 48시간 후 평가하였다.
증식 및 세포자사멸사 분석
세포 생존 측정을 위해 세포는 웰당 5×3 개의 세포에 96웰 플레이트에 시딩되어 24시간 배양하여 부착을 가능하게 했습니다. 이 배양 후에는 각 웰에 10 μL CCK-8 시약을 투여한 후, 37 °C에서 2시간 배양했습니다. 이후 마이크로플레이트 리더기로 450 nm 광 밀도를 기록했습니다. 세포자멸사 검출을 위해 세포를 트립신으로 분리하고, 인산 완충 생리식염수(PBS)로 두 번 세척한 후, 결합 완충제에 1 ×6 세포/웰 농도로 현탁했습니다. 다음으로 100 μL 현탁액을 5 mL 유동 세포검사 튜브에 넣고, 5 μL Annexin V-FITC 및 5 μL 프로피디움 요오화물(PI) 염색액을 첨가했습니다. 샘플은 부드럽게 혼합되어 실온에서 15분간 빛을 차단한 상태로 보관했습니다. 그 후 결합 버퍼를 튜브당 400 μL의 최종 추가 부피로 추가하고, 세포세포 세포를 유동 세포분석으로 정량화하였습니다. 모든 조건은 세 번의 독립적인 생물학적 실험에서 세 번의 기술적 복제를 통해 분석되었습니다.
이중 루시퍼라제 활성 분석
CASC11과 miR-130b-5p의 하위 표적은 생물정보학 웹사이트(lncRNASNP2 및 TargetScan)를 통해 예측되었습니다. 야생형(wt) 또는 돌연변이(mut) 상보 서열을 포함한 조각을 합성하여 이중 루시퍼레이스 리포터 벡터로 클론하여 wt 및 mut 리포터 플라스미드를 구성하였습니다. PC-12 세포는 지질 기반 형질염화 시약을 사용해 miR-130b-5p 모방/억제제 및 wt/mut 플라스미드와 함께 시딩되고 공동 형질전환되었습니다. 48시간 후에는 루시퍼라제 활성을 정량하여 상호작용을 평가하였습니다. 각 그룹은 세 개의 기술적 복제와 세 개의 생물학적 복제로 구성되었다.
RNA 면역침전(RIP) 분석법
RIP는 RNA 결합 단백질 면역침전 키트를 사용하여 수행되었습니다. 세포는 용해 완충제로 용해하고 항Ago2 항체 또는 정상 IgG 항체로 배열하였습니다. RNA-단백질 복합체는 자기 구슬을 이용해 농축되었습니다. 세척 후 결합된 단백질을 제거하고 면역침전된 RNA를 분리했습니다. CASC11 과 miR-130b-5p의 농축 수준은 RT-qPCR로 정량화하였습니다. 각 그룹은 세 개의 기술적 복제와 세 개의 생물학적 복제로 구성되었다.
서부 블롯
PC-12 및 BV-2 세포에서 세포 용해 완충제를 사용해 단백질 용해액을 제조하고, 총 단백질 함량은 BCA 분석법으로 측정하였습니다. 각 샘플마다 30 μg의 단백질을 12% SDS-PAGE 겔에 적재하여 전기영동 분리 후 PVDF 막으로 전달하였습니다. 막은 TBST에 희석된 5% 탈지유에 실온에서 2시간 동안 차단한 후, 4°C에서 Bcl-2, Bax, 절단된 카스파제-3, GAPDH에 대한 1차 항체와 함께 1:1,000 희석 상태로 배양하였습니다. 세척 후, 막은 HRP 결합된 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 인큐베이팅되었습니다. 단백질 신호는 이미지 분석 소프트웨어로 분석되었고, 밴드 밀도를 이용해 세포자멸사 관련 단백질의 발현을 평가하였습니다. 서부 블롯 실험에는 세 번의 생물학적 복제가 포함되었으며, 각 그룹마다 세 가지 기술적 복제가 있었습니다.
엘리사
환자 혈청 내 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6 농도와 PC-12 및 BV-2 세포 상원액 농도는 제조사 지침에 따라 ELISA 키트를 사용해 정량화하였습니다. 샘플은 미리 코팅된 웰에서 배양되었고, 추가 배양을 위해 검출 항체가 추가되었습니다. 효소 결합체가 첨가되어 배양되었다. 세척 후에는 색 현상을 위한 기질을 추가하고 반응을 종료했습니다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450nm 거리에서 측정되었고, 제공된 표준 곡선에 따라 염증 인자 농도로 변환되었습니다. 각 ELISA 분석은 세 개의 독립적인 생물학적 복제체에 걸쳐 세 개의 기술적 복제로 수행되었습니다.
통계 분석
연속 변수는 평균 ± 표준편차(SD)로 보고되었고, 범주 변수는 숫자와 백분율(n, %)로 제시되었습니다. 두 그룹 간 비교는 학생 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. 두 그룹 이상이 포함된 비교에는 일방향 분산분석(ANOVA)을 적용한 후 Tukey의 사후 검정이 적용되었습니다. CASC11이 임상 그룹 간 구별 능력은 수신자 운영 특성(ROC) 곡선 분석을 통해 평가되었습니다. 두 변수 간의 연관성은 피어슨 상관분석으로 조사되었습니다. 세포 기반 실험의 경우, 각 그룹은 세 개의 독립적인 생물학적 복제를 포함했고, 각 측정은 세 개의 기술적 복제로 나누어 반복되었습니다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 정의되었습니다.
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피실험자들의 기본 정보
대조군, NNF, ISCI, CSCI 그룹의 기초 특성은 표 1에 제시되어 있습니다. 통계 분석 결과 성별, 연령, 체질량지수(BMI), 부상 원인, 부상 시기 등 변수에서 유의미한 그룹 간 차이가 없음을 확인했습니다(P > 0.05). 네 그룹 간 체류 기간, ASIA 등급, 염증성 세포작용 세포인 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 인터루킨-1베타(IL-1β), 인터루킨-6(IL-6) 농도에서 유의한 차이가 관찰되었습니다(P < 0.001).
SCI에서 CASC11 상승의 진단 가능성
혈청 내 CASC11 수치는 모든 SCI 환자군에서 대조군...
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SCI는 중추신경계에 심각한 질환으로, 감각, 운동 조절, 자율신경 기능에 상당한 장애를 자주 초래하여 환자의 삶의 질과 장기 예후를 크게 저하시킵니다18. 척추 외상 후 기능 장애와 감각 상실을 보일 수 있으며, MRI와 같은 영상 검사를 통해 SCI19의 발생 여부를 평가할 수 있습니다. 척추 손상의 발병은 심각한 신경염증, 부종, 염증 세포 침윤을 특징으로 하는 해로운 2차 손상 연쇄 반응을 유발합니다. 이 연쇄 반응은 외상성 통증의 스트레스와 함께 점차 신경 기능을 방해합니다20,21. 부상 후 초기 단계는 임상 악화의 높은 위험이 특징이며, 이는 질병 진행을 멈추는 데 있어 적시한 의료 개입의 필수적 역할을 강조합니다.
척...
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BCA 단백질 분석 키트 | Yeasen, 중국 | P0010 | |
| CCK-8 용액 | Sigma-Aldrich, 미국 | 96992 | |
| Dual-luciferase 리포터 벡터 | Promega, 미국 | E133A | pmirGLO 벡터 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | ATCC, 매나살, VA, 미국 | 30-2002 | |
| IL-1β 용 ELISA 키트 | R&D Systems, 미국 | DY401 | |
| IL-6 용 ELISA 키트 | R&D Systems, 미국 | HS600B | |
| TNF-α 용 ELISA 키트 | R&D Systems, 미국 | DTA00C | |
| 모유 소 보빈 혈청 | Gibco, 그랜드 아일랜드, NY, 미국 | 10099141 | |
| 유세포 분석기 | BD FACSCalibur, 미국 | FACS101 | |
| 이미지 분석 소프트웨어 | NIH, 베데스다, MD, 미국 | version 1.44p | ImageJ 소프트웨어 |
| 아이소프로판올 | 베이징 화학 공장, 중국 | 32064 | |
| 지질 기반 형질 전환제 | Invitrogen, 칼즈배드, CA, 미국 | L3000008 | Lipofectamine 3000 |
| 리포폴리사카라이드 | Sigma-Aldrich, 미국 | L2880 | |
| 용해 완충액 | Beyotime, 중국 | P0013D | RIPA 용해 완충액 |
| 마이크로 플레이트 판독기 | Reagen, 중국 | RNE90002 | |
| PC-12 및 BV-2 세포 | ATCC, 매나살, 미국 | ||
| 페놀-클로로포름 시약 | Thermo, 미국 | 15596026 | Trizol 시약 |
| 역전사 키트 | Takara, 일본 | RR047A | PrimeScript RT 키트 |
| RNA 결합 단백질 면역 침전 키트 | Millipore, 미국 | 17-700 | Magna RIP 키트 |
| RNase-free 마이크로튜브 | Axygen, 코닝, NY, 미국 | MCT-150-C-S | |
| 혈청 분리 튜브 | Terumo, 도쿄, 일본 | VP-AS109K60 | |
| 통계 분석 소프트웨어 | 샌디에고, 미국 | version 9.0 | GraphPad Prism |
| SYBR Green 프리믹스 | Takara, 일본 | RR420A | SYBR Premix Ex Taq |