방법 논문

다공성 매체 내 금속 산화물의 미생물 침전을 조사하는 마이크로유체 플랫폼

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DOI:

10.3791/71047

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2026년 6월 12일

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1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 망간 산화물 광물의 미생물 침전을 연구하기 위한 미세유체 시스템을 제시합니다. 생체광물 형성은 광학 현미경과 영상 분석을 통해 현장에서 측정됩니다. 이 접근법은 다공성 환경에서 다른 독특한 색을 가진 생물 광물의 침전을 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

초록

미생물은 토양, 퇴적물 및 기타 환경적으로 중요한 다공성 매체에서 금속 산화물 나노입자를 침전시키는 경우가 많습니다. 그러나 망간(Mn)과 철(Fe) 산화물의 형성과 반응성은 물리적으로 복잡한 환경에서 아직 잘 알려져 있지 않습니다. 실험실 시스템은 다공성 매체를 기질로 사용할 수 있지만, 파괴적 샘플링이 필요하며 기공 규모 분석에는 쉽게 적합하지 않습니다. 따라서 다공성 매체의 역동적이면서도 접근하기 어려운 특성은 미생물에 의해 매개된 광물 침전을 현장 및 실시간으로 분해할 수 있는 능력을 요구합니다. 이 격차를 메우기 위해 모델 기공 공간 내 금속 산화물의 미생물 침전을 평가하는 마이크로유체 플랫폼이 개발되었습니다. 이 플랫폼은 Mn을 산화하는 박테리아인 Pseudomonas putida GB-1에서 검증되었습니다. 바이오필름 현상과 관련된 Mn 산화물 침전은 타임랩스 컬러 밝방야 현미경을 이용한 연속 흐름 하에서 시각화됩니다. 이후 이미지 뺄셈 알고리즘을 종점 질량 측정과 결합하여 Mn 산화물 침전율을 추정합니다. 이 접근법은 금속 산화물의 미생물 침전량이 변화하는 물리적 및 화학적 조건에 따라 어떻게 변하는지 체계적으로 검증할 수 있는 도구를 제공합니다.

서론

금속 산화물 광물은 생지구화학적 순환에 중요한 역할을 합니다. 망간(Mn)과 철(Fe) 산화물은 원중성 pH에서 음전하를 띤으며, 2,3,4,5,6,7,8 양이온성 금속 2,3,4,5,6,7,8을 쉽게 흡수하여 근권 및 저류층에서 미량 영양소의 가용성과 오염물질 이동성을 조절합니다. 이 광물들은 유기물 9,10,11,12의 안정성과 분해에 영향을 주며, 식물과 토양 미생물의 탄소 흡수를 결정합니다. 공학 시스템(예: 수처리 필터, 인공 습지)에서는 금속 산화물 침전이 직접 활용되어 Mn 또는 Fe를 제거하고 동반 오염물질 13,14,15,16,17을 정화합니다. 이 금속 산화물들은 황토색에서 짙은 갈색, 검은색에 이르기까지 특징적인 색상으로 구별됩니다18,19.

금속 산화물의 침전은 일반적으로 미생물에 의해 촉진되며, 이 과정은 생체광물화 20,21,22로 알려져 있습니다. 수많은 Mn-산화 박테리아와 곰팡이가 다중구리 산화효소와 과산화효소를 합성하여 호기성 조건에서 Mn(II)에서 Mn(III), Mn(IV)로의 전자 전달을 촉매하며, 이로 인해 버네사이트 유사 Mn(III, IV) 산화물광물 2,23,24가 침전됩니다. 또한, 다양한 철 산화 박테리아는 산소가 제한된 중성 또는 산성 환경에서 Fe(II)를 Fe(III)로 효소적으로 산화하여, 페리히드라이트와 마그철석 25,26,27,28 등 Fe(II, III) (산소수소)산화물을 생성합니다. 이 생체 광물들은 세포 표면 인접 지역에 침전되어 세포외 고분자, 외피 및 기타 세포 구조에 축적되어 미생물-광물 집합체 2,23,25,27,29,30을 형성합니다.

복잡한 환경에서 Mn과 Fe의 생체광물화가 널리 퍼져 있음에도 불구하고, 기공 규모의 통찰은 부족합니다. 기공 공간은 구조적으로 이질적이며, 우선 유체 흐름과 비균일한 반응물 수송을 보여 생지구화학 반응의 분포를 결정합니다 31,32,33,34,35. 더 나아가, 미생물 활동은 국부적인 지구화학적 구배를 생성하여 생광물화를 촉진하거나 제한할 수 있으며, 기공 유체 화학 성분의 변동(예: pH, 용존 산소, 산화환원 퍼텐셜)은 광물 침전을 촉진하거나 용해를 촉진할 수 있습니다34,35. Mn과 Fe 생물광물화 연구는 일반적으로 산화 속도론을 정량화하거나 생물광물 침전물을 특성화하기 위해 잘 혼합된 배치 조건 30,36,37,38,39,40 또는 41,42,43,44번 컬럼 41,42,43,44에 의존합니다. 그러나 배치 실험은 다공성 시스템에 내재된 공간적 이질성이 부족합니다. 포장된 과립 매체가 포함된 컬럼은 관련 물리적 구조를 제공하지만, 정적인 시점에서 파괴적 샘플링이 필요해 실험 진행이 멈추고 교란되지 않은 기공 규모 관찰을 방해하기 때문에 유용성은 제한적입니다. 따라서 다공성 매질 내 금속 산화물의 미생물 침전을 조사하기 위한 새로운 실험적 접근법이 필요합니다.

마이크로플루이딕 시스템은 생지구화학 반응을 현장에서 그리고 실시간으로 연구하는 도구입니다. 마이크로유체 반응기는 자연 또는 이상화된 다공성 매체를 시뮬레이션하는 재현 가능하고 맞춤화 가능한 형상으로 빠르고 저렴한 비용으로 제작할 수 있습니다45. 결과적으로 생성된 장치들은 광학적으로 투명하여 바이오필름 형성 46,47,48,49, 핫스팟 발현50,51, 비생물적 금속 침전 52,53, 방해석 생광화(34,54,55,56) 등 기공 규모 과정을 비파괴적으로 시각화하고 정량화할 수 있게 합니다 . 또한, 마이크로플루이딕 시스템은 금속 농도, 용존 산소의 유무, 유체 유량 등 경계 조건을 제어하고 체계적으로 조절할 수 있게 합니다. 마지막으로, 원자로 기판 재료에 따라 X선, 라만 또는 적외선 분광법57을 통해 미생물-광물-유체 상호작용의 직접 측정을 얻을 수 있습니다. 금속 산화물의 미생물 침전을 연구하는 이러한 마이크로유체 기반 플랫폼의 개발은 다공성 환경에서 탄소, 영양분, 오염물질 순환을 촉진하는 Mn 또는 Fe 광물상의 형성과 반응성에 대한 새로운 연구의 길을 제공합니다.

이 연구는 Mn 생체광물화를 사례 연구로 사용하여 동적 다공성 환경에서 금속 산화물의 미생물 침전을 정량화합니다. 다음 프로토콜은 성장 단계에서 Mn(II)을 Mn(III, IV)으로 산화시키는 것으로 알려진 모델 박테리아인 Pseudomonas putida GB-1로 마이크로유체 반응기를 제작하고 접종하는 방법을 시연합니다. 압력 기반 유량 제어 시스템을 사용하여 영양분이 풍부한 성장 배지와 최소 염 용액을 순차적으로 주입하여 각각 바이오필름 형성을 촉진하고 산화막 침전을 유도합니다. 미세유체 기공 공간의 고해상도 컬러 밝기장 이미지를 일정 간격으로 수집하여 P. putida GB-1 바이오필름과 축적되는 Mn 산화물 간의 색상 대비를 포착합니다. 각 실험이 끝나면 원자로 내 모든 산화막 금속을 분해하고, 유도 결합 플라즈마 질량분석법(ICP-MS)으로 전체 질량을 측정합니다. Mn 산화물 침전율은 이 종단 질량 측정값을 이미지 뺄셈 알고리즘과 통합하여 시간에 따른 함수로 추정됩니다. 이 워크플로우는 다양한 환경 조건에서 다른 생물이나 금속 산화물 침전 과정을 조사하는 데 쉽게 적응할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜은 사용자의 배경 지식과 사용 가능한 계측 장비에 대해 여러 가정을 합니다. 첫째, 사용자는 클린룸에 접근할 수 있고 마이크로플루이딕 몰드를 제작하기 위한 포토리소그래피 절차에 익숙하거나, 상업용 몰드를 구매해야 합니다. 다음으로, 사용자는 무균 기법, 육즙 혼합, 플레이트 줄무늬 등 기본적인 미생물학 방법에 익숙해야 합니다. 사용자는 또한 오토클레이브, 마이크로 원심분리기, 셰이커 인큐베이터, 질량분석기 접근이 필요합니다. 마지막으로, 사용자는 광학 현미경과 영상 분석에 능숙해야 합니다.

1. 마이크로유체 원자로 제작 및 조립

참고: 이 프로토콜에 사용된 마이크로유체 반응기는 AutoCAD로 설계되었으며, Wang 등55에서 적용된 모래 그레인 형상을 사용합니다. 각 몰드는 15mm × 10mm 기공 공간, 0.41의 공극률, 2.3 μL의 공극 부피를 가진 6개의 복제 채널을 생산합니다. 플라즈마 처리를 제외하고, 저분진 환경을 유지하기 위해 원자로는 층류 캐비닛 내에서 제작됩니다.

  1. 소프트 리소그래피를 사용해 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 마이크로플루이딕 채널을 주조합니다.
    1. 플라스틱 컵에서 엘라스토머 베이스와 경화제를 10:1 비율로 무게를 잰다(여기서는 각각 25g과 2.5g).
    2. 플라스틱 칼을 사용해 엘라스토머 베이스와 경화제를 10분간 충분히 섞습니다.
    3. 진공 건조기를 사용해 컵 안의 PDMS를 1시간 동안 배출하여 기포를 제거합니다.
    4. PDMS를 몰드에 부어 30분간 탈기를 하여 잔여 공기를 제거하세요.
    5. 몰드를 뜨거운 판에 올려놓고 95°C에서 3시간 경화시킵니다.
    6. 경화되고 식으면 메스로 PDMS를 잘라내어 몰드에서 벗겨내세요.
    7. 절단 매트 위에서 6개의 미세유체 채널을 면도날로 잘라내어 각 채널 가장자리에 2–3mm를 남겨둡니다. 각 채널의 입구와 출구 구멍을 조직검사 펀치로 뚫으세요.
    8. 각 마이크로플루이딕 채널 양쪽을 투명 테이프로 덮어 먼지 쌓이를 방지하고 100mm 페트리 접시에 보관하세요.
  2. 실험 하루 전, 최종 마이크로플루이딕 원자로를 공기 플라즈마로 조립하세요.
    1. 한 마이크로플루이딕 채널에서 투명 테이프를 제거한 후 PDMS와 유리 커버 슬립을 70% 에탄올로 헹구고 압축 질소로 건조하세요.
      주의: 에탄올은 인화성입니다. 안전 데이터 시트에 따라 취급 및 보관하세요.
    2. 마이크로플루이딕 채널과 덮개를 플라즈마 클리너에 뒤집어 넣으세요. 챔버를 1분간 진공 상태로 사용한 후 1분간 플라즈마를 적용합니다(18W 및 ~0.5 torr).
    3. 플라즈마 클리너에서 마이크로플루이딕 채널과 커버 슬립을 제거하고 PDMS에 덮어 부드럽게 두드려 결합을 보장합니다. 조립된 원자로는 100mm 페트리 접시에 하룻밤 보관하세요.

2. 마이크로플루이딕 유동 제어 시스템

참고: Elveflow의 모듈식 시스템은 압력과 유량에 최소한의 방해를 주입하여 순차적인 유체 주입을 용이하게 합니다. 시스템 구성 요소에는 공기 압축기, 유량 조절기, 분배 밸브, 유량 센서, 유체 저장소 rack(15mL 원뿔형 튜브용), 그리고 Elveflow 스마트 인터페이스(ESI) 소프트웨어(그림 1)가 포함됩니다. 주사기 펌프와 같은 다른 유량 제어 시스템은 주입 또는 인출 모드로 사용될 수 있으며, 각 유입 용액마다 전용 주사기나 저장소가 있고, 단일 튜빙 라인을 통한 순차적 유체 주입을 용이하게 하는 저용량 분배 밸브가 있습니다. 하지만 바이오필름이 떨어질 수 있는 압력 변동을 최소화하기 위해 주사기 펌프는 주의해야 합니다.

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그림 1: 유동 제어 시스템과 마이크로유체 원자로 형상학. 실험 시스템은 (1) 공압 튜빙을 통해 유체 저장소 랙에 연결된 유량 컨트롤러 (3) 성장 매체(GMMn) 및 염 용액(SSMn) 순차적 주입을 제공하는 분배 밸브 (4) 실시간 피드백 및 유량 조절을 제공하는 유량 컨트롤러에 연결된 유량 센서 (5) 유체 저항을 제공하는 작은 내경의 PEEK 튜빙 (7) 미세유체 반응기 상류에 위치한 버블 트랩 (8) (9) 로 구성됩니다. 시스템 회로도는 스케일링이 안 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

  1. 제조사 지침에 따라 모든 하드웨어를 설정하고 보정하세요.
    참고: 유체 저장소 랙, 분배 밸브, 유량 센서는 실험을 30°C로 유지하기 위해 맞춤 제작된 현미경 인큐베이터 내에 설치됩니다.
  2. 공기 압축기 압력 조절기를 3바로 설정하고, 공기 압축기 출구를 공기 조절기 입구에 공압식 폴리우레탄 튜브로 연결하세요.
  3. 유체 역류를 방지하기 위해 플로우 컨트롤러 출구에 소수성 필터를 부착한 후, 유량 컨트롤러를 공압식 폴리에테르 폴리우레탄 튜브로 유체 저장소 랙의 두 입구 포트에 매니폴드와 바브드 어댑터를 사용해 연결하세요.
  4. 유체 저장소 선반, 분배 밸브, 유량 센서를 다음과 같이 튜빙으로 연결하며, 별도 언급이 없는 한 1/16인치 외경 튜빙에는 플란젤리스 피팅을 사용하세요.
    1. 유체 저장소 랙의 두 출구 포트를 분배 밸브의 첫 두 입구 포트에 80cm 두께의 1/32인치 내경(ID) 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 튜브로 연결합니다.
    2. 분배 밸브의 출구 포트를 15cm 두께의 500 μm 내경 PTFE 튜빙과 어댑터 피팅으로 유량 센서의 입구 포트에 연결합니다.
    3. 어댑터 피팅을 사용해 63.5 μm 내체 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK) 튜브 60cm를 유량 센서의 출구 포트에 연결합니다.
      참고: 다양한 유량이 필요한 실험의 경우, 유동 안정성을 위해 충분한 유체 저항을 제공하도록 PEEK 튜빙 길이를 필요에 따라 조정하십시오.
    4. PEEK 튜빙을 유니언 피팅을 사용해 10cm 길이의 500 μm 내경 PTFE 튜빙에 연결합니다.
    5. PTFE 튜빙을 PTFE 멤브레인 필터(기공 크기 ~10 μm)가 장착된 마이크로플루이딕 버블 트랩의 입구 포트에 연결합니다.
    6. 기포 트랩 출구 포트에 75cm 두께의 200 μm 내경 PTFE 튜브를 부착하여 효과적인 기포 제거를 위한 역압을 만듭니다. 이 튜브는 마이크로플루딕 원자로 입구 구멍에 연결됩니다.
  5. 모든 실험 전에 모든 튜빙과 하드웨어가 연결된 유량 제어 시스템을 시스템 부피의 세 배(튜브 라인당 7.0 μL·min-1 기준 약 4시간)에 1% 표백제 용액을 세척하여 멸균하고, 같은 시간 동안 멸균 초순수수를 사용한다.
  6. 실험 사이에는 다음과 같이 유량 제어 시스템을 청소하세요.
    1. 배전 밸브와 유량 센서는 100% 이소프로판올과 멸균된 초순수수로 세척하여 잔류물이나 침전물이 쌓이지 않도록 하세요.
      주의: 이소프로판올은 인화성입니다. 안전 데이터 시트에 따라 취급 및 보관하세요.
    2. 버블 트랩을 오토클레이브하세요.
    3. 각 실험 후에는 막힘(멤브레인 필터)이나 박테리아 정착(튜브)을 방지하기 위해 기포 트랩 멤브레인 필터와 200 μm 내경 PTFE 튜빙을 교체하세요.

3. 실험용 매체 및 용액

  1. 액체 루리아 육수(LB, 밀러 제형) 매체를 2.5% LB 분말을 121°C의 초순수수에 20분간 오토클레이빙하여 제조합니다. LB 한천 플레이트의 경우, 2.5% LB 분말과 1.5% 한천을 121°C의 초순수수에 20분간 오토클레이브한 후, 100mm 페트리 접시(접시당 ~20mL)에 부어 고체가 될 때까지 식힙니다.
  2. 미국화학회(ACS) 또는 세균학 등급 시약을 초순수수에 담아 필터 멸균 정액을 사용해 다음 성분 각각 30mL를 만듭니다. 염액과 성장 배지 조성은 Gehin 등에서 59편에서 채택되었습니다.
    1. Mn(II) 없는 염액 준비 (SS0): 0.4 mM CaCl 2.2H2O, 0.25 mM MgSO4.7H 2O, 0.25 mM Na2HPO4.2H 2O, 0.15 mM KH2PO4, 1:2 Fe(III) -EDTA (20 μM FeCl3.6H 2O 및 40 μM EDTA, pH 6.5로 조정, 1M NaOH), 멸균 초순수수 내 10 mM HEPES 완충(pH 7.0에 1M NaOH로 조정), 5 mM (NH4)2SO4, 그리고 미량 금속(40 nM CuSO4.5H 2O, 273 nM ZnSO4.7H 2O, 84 nM CoCl2·6H2O, 53.7 nM Na2MoO4.2H 2O)을 사용했습니다.
    2. Mn(II) (SSMn)을 사용한 소금 용액을 준비하기: SS0 과 동일하며 50 μM MnCl2·4H2O를 첨가합니다.
    3. Mn(II) 없이 성장 배지를 준비하세요 (GM0): SS0 와 동일하며 1.5 g· L-1 효모 추출물과 1.5g· L-1 카사미노산 첨가.
    4. Mn(II) (GMMn) 배지를 준비: GM0 과 동일하며 50 μM MnCl2·4H2O를 첨가합니다.
      주의: 염액과 성장 배체에는 건강 및 환경적 위험이 있는 금속이 포함되어 있습니다. 안전 데이터 시트에 따라 취급하고 보관하세요.
  3. 미세유체 반응기 내에서 Mn 산화물을 소화하기 위해 40 mM 옥살산 이수화물과 2% 질산이 포함된 초순수수에 산 용액을 준비합니다.
    주의: 옥살산 이수화물과 질산은 부식성이 있으며, 질산은 강한 산화제입니다. 안전 데이터 시트에 따라 취급하고 보관하세요.
  4. ICP-MS 샘플 희석을 위해 초순수수에 1% 질산 용액을 준비하세요.

4. 박테리아 배양

참고: 박테리아 배양은 벤젠 버너를 사용하여 작업대 위에서 무균 기법으로 수행됩니다. 별도의 표기가 없는 한 재료는 멸균 상태입니다. 잠복 기간은 P. putida GB-1에 특이적이며, 다른 미생물에 맞게 조정이 필요할 수 있습니다.

  1. -80 °C 스톡에서 LB 한천 플레이트에 P . putida GB-1을 스트릭 처리하세요. 박테리아 군락의 성장을 위해 30°C에서 약 20시간 배양합니다.
  2. 실험 전날 저녁, 50mL 원뿔 튜브에 LB 배지 10mL를 추가하고 한 개의 플레이트 콜로니로 접종합니다. LB 전배양을 셰이커 인큐베이터에서 30 °C, 180 rpm에서 16시간 배양하여 정지 단계에 도달합니다.
  3. 16시간 배양 후, 1.5mL 미세원심분리관에 LB 전배양액 1mL를 넣고 8,000 x g에서 1분간 원심분리하여 박테리아를 펠릿으로 만듭니다.
  4. 상원액을 버리고 세포 펠릿을 1 mL SS0에 재현탁한 후 8,000 x g 에서 1분간 원심분리하여 사용한 배지를 제거하기 위해 알리코트를 세 번 세척합니다. 마지막 펠릿을 1 mL SS0에 재현탁합니다.
  5. 비멸균 큐벳에서 세척된 셀 현탁액의 광학 밀도(OD600)를 셀 밀도계로 측정합니다. 이 단계에서 P. putida GB-1의 예상 OD600은 3.6–3.8이므로 SS0의 최소 5배 희석이 필요합니다.
  6. 50mL Erlenmeyer 플라스크에 세척된 세포 부유액과 함께 GM0 20mL를 접종하여 초기 OD600 (0.01)을 투여합니다. 30 °C, 180 rpm에서 6시간 동안 인큐베이팅하여 중간 지수적 단계에 도달합니다.

5. 생체광물화 실험

  1. 실험 당일 아침, 흐름 제어 시스템을 준비하세요.
    1. 현미경 인큐베이터를 30 °C로 예열하세요.
    2. GMMn과 SSMn을 10mL를 두 개의 15mL 원뿔형 튜브에 붓고, 튜브들을 유체 저장소 랙에 연결합니다. 시스템 부피의 약 3배(7.0 μL·min-1에서 ~4시간)를 SSMn을 세척한 후 같은 시간 동안 GMMn을 세척합니다.
  2. 중간 지수 배양 접종 후 5시간 후에 준비된 마이크로유체 반응기를 포화 처리합니다.
    참고: 원자로 포화 및 접종은 벤젠 버너를 이용해 벤치 상판에서 무균 기법으로 수행됩니다. 별도의 표기가 없는 한 재료는 멸균 상태입니다.
    1. 진공 건조기에서 20분간 반응로를 탈기합니다.
    2. 반응기가 탈기되는 동안, 3mL 플라스틱 주사기에 SS0 1–2mL를 뽑은 후, 둔한 끝 바늘과 20cm 길이의 0.02인치 ID 타이곤 튜브를 연결합니다. 주사기 플런저를 튜브가 완전히 포화될 때까지 눌러주세요.
    3. 원자로를 건조기에서 분리한 후, 각진 핀셋으로 원자로 출구 구멍에 관을 연결한 후, 주사기로 원자로를 수동으로 적시어 원자로 입구 구멍에 방울이 형성될 때까지 적셔야 합니다.
    4. 원자로 입구 구멍에 0.02인치 내경 타이곤 튜브 20cm를 부착하세요. 모든 기포가 제거될 때까지 SSMn을 반응기에 계속 분사합니다(200–300 μL).
  3. 원자로 접종을 준비하고 마이크로유체 원자로에 접종하세요.
    1. 접종 6시간 후 셰이커 인큐베이터에서 중간 지수 배양을 제거하고 OD600을 측정합니다. 이 단계에서 예상 OD600 은 1.6–1.8이므로 SS0 의 4배 희석이 권장됩니다.
    2. 중간 지수 배양물을 2mL SSMn 에 희석하여 2mL 마이크로 원심분리관에서 초기 OD600 0.005로 만듭니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞으세요.
    3. 원자로 입구 튜빙을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고, 액체 방울이 접종체에 닿도록 하여 튜브 내 공기 유입을 막으세요. 마이크로 원심분리기 튜브를 부분적으로 닫고 뚜껑을 테이프로 고정해 오염을 막으세요.
    4. 4–5 mL의 SSMn 을 5mL 유리 기밀 주사기에 추출하여 배럴을 적신 후, 주사기 내에 0.5mL가 남을 때까지 투여합니다. 주사기를 주사기 펌프에 넣으세요.
    5. 플라스틱 주사기에서 바늘을 빼서 유리 주사기에 연결하세요. 바늘 허브에 공기가 갇히지 않도록 주의하세요.
    6. 주사기 펌프로 반응기에 접종을 접종하여 8.33 μL·min-1 (~70 기공 부피)의 유량으로 20분간 인종을 흡입합니다.
    7. 접종 후에는 주사기 펌프를 끄고 박테리아가 1시간 동안 침착하고 붙어 혈류가 없도록 하세요.
    8. 1시간 후에는 주사기를 펌프에서 분리하되 출구 튜브에 연결한 상태로 두세요.
  4. 접종된 마이크로플루이딕 반응기를 유량 제어 시스템에 연결하세요.
    1. 반응기와 주사기를 작업대 위에서 현미경 인큐베이터로 옮기세요.
    2. 현미경 단계에서 원자로의 입구 튜브를 제거하세요.
    3. 주사기 플런저를 부드럽게 눌러 원자로 입구 구멍에 방울을 만듭니다.
    4. 유량 제어 시스템에서 PTFE 튜빙을 수동으로 휘어 PDMS 표면에 수직으로 접하게 하여 측면 힘과 원자로 입구 구멍으로의 공기 유입을 최소화합니다.
    5. PTFE 튜브 끝을 1% 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEG-DA) 용액에 담가 소수성 튜브 외부를 적셔야 합니다. PTFE 튜브 끝에 GMMn 이 방울되도록 하고, 튜브를 원자로 입구 구멍에 연결하세요.
    6. 주사기를 분리하고 배출 튜브를 비멸균 5mL 마이크로 원심분리관에 넣어 반응기 폐수를 수집합니다.
    7. 유량 제어 시스템 소프트웨어에서 유량을 1.33 μL·min-1 로 설정하세요. 바이오필름 형성을 촉진하기 위해 15시간(~500 기공부피) 동안 GMMn 을 공급하는 프로그램을 구축하고, 이어서 28.5시간(~1,000 기공부피)의 SSMn 을 공급하여 Mn 생체광물화를 유도합니다.
  5. 마이크로플루이딕 원자로를 현미경 단계 삽입물에 장착하세요.
    참고: 현미경 스테이지 인서트에 부착된 맞춤형 자외선-C(UVC) 조사 시스템은 미세유체 공극 공간 외부의 원치 않는 박테리아 증식과 광물 침전을 줄이기 위해 사용됩니다(그림 2). 이 설계는 Ramos 등.60 에서 차용되었으며 자동 프로그램으로 제어할 수 있습니다. 자세한 내용은 Fadely 등 61 을 참조하세요.
    1. 안정성을 위해 반응기 아래에 샘플 프레임을 설치한 후, 프레임과 반응기를 단계 삽입물에 단단히 장착하여 완전히 고정되도록 합니다.
    2. PTFE 튜브를 스테이지 인서트에 테이프로 부착하여 튜빙이 원자로 입구 구멍에서 분리되는 것을 방지하세요.
    3. UVC 암을 입구 쪽 구멍 공간 가장자리에서 3mm, 출구 쪽 2mm 간격으로 정렬하여 자외선과 바이오필름 손상을 최소화하세요.
      참고: 적절한 UVC 정렬은 원자로 입구 영역에 거의 또는 전혀 생체량 축적을 방지합니다(그림 3A). UVC 팔이 공극 공간의 입구 가장자리에서 너무 멀리 정렬되거나(그림 3B) 방사선이 부족하면(그림 3C), 광물 침전이 공극 공간 상류에 발생합니다.
    4. 원자로 조사 프로그램을 설정하세요. 반응로 입구 및 출구 영역을 5분간 t = 0 h에서 처리하여 접종 중 침착된 박테리아를 비활성화하고, 출구 영역은 t = 17.5시간에 5분간 처리하여 남은 바이오필름을 비활성화합니다.

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그림 2: 마이크로유체 반응기용 맞춤 제작 자외선(UVC) 방사선 시스템. (A). 현미경 스테이지 인서트에 장착된 시스템의 상단 모습으로, 포즈블 암(파란색)과 부착된 UVC 발광 다이오드(LED) 배열(노란색 직사각형), 샘플 프레임에 장착된 마이크로플루이딕 리액터(작은 회색 직사각형)가 보입니다. (B). 포즈블 팔에 내장된 UVC LED(황갈색 정사각형)를 보여주는 시스템 하단 모습. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 3: UVC 조사가 마이크로유체 원자로 입구 영역에 미치는 영향. (A). 원자로 입구 영역에서 5분간 UVC 처리를 수행한 t = 0 h에서 원치 않는 바이오필름 완전 제거를 위한 적절한 정렬을 보입니다. (B). 부적절하게 정렬된 UVC 배열이 있는 원자로 입구 영역으로, 이로 인해 입구 구멍과 기공 공간 외부에 잔류 바이오필름이 남아 Mn 산화물이 상류로 침전할 수 있었습니다. (C). UVC 처리가 없는 원자로 입구 구역으로 인해 광범위한 바이오필름 성장과 광물 침전이 발생함. 회색 음영이 기공 공간을 구분합니다. 스케일 바는 2mm입니다. 이 도표의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

6. 광학 타임랩스 현미경

참고: 디지털 카메라(시야당 2304 x 2304 픽셀), 백색광 엔진, 4배 대물렌즈(1.62 μm·픽셀-1), NIS Elements 소프트웨어가 장착된 니콘 Ti2 Eclipse 역형 에피형광 현미경이 컬러 밝시야 이미징에 사용됩니다. 컬러 이미징이 가능한 다른 광학 현미경들도 적합합니다. 컬러 이미징의 사용은 낮은 Mn 산화물 질량에 대한 감도를 향상시킵니다. 타임랩스 자동화가 불가능할 경우, 사용자는 이미지를 수동으로 수집하여 시계열 형식으로 후처리할 수 있습니다.

  1. 고품질 이미지를 위해 다음과 같은 정렬 및 보정 단계를 수행하세요:
    1. 고르게 조명을 맞추기 위해서는 제조사의 지침에 따라 Köhler 정렬을 수동으로 조정하세요.
    2. 이미지의 과포화 또는 과포화 방지를 위해 밝은 필드 조명을 최적화하세요(Fusion Pad > 컬러 > 자동 밝기 , Fusion Pad > 컬러 > 자동 백색).
      참고: 이미 바이오필름과 Mn 산화물을 포함하는 원자로에서는 밝기장 조명을 한 번만 최적화한 후, 동일한 노출 시간과 색상 균형을 모든 후속 실험에 적용하여 일관된 조명을 유지하는 것이 가장 좋습니다. 여기서는 빨간색 97.58%, 초록색 44.76%, 파란색 100% 등 5ms 조명이 사용됩니다.
    3. 미세유체 공극 공간의 스티치 이미지를 획득할 때 퀼팅 아티팩트를 방지하기 위해 음영 보정(Acquire > Shading Correction Panel)을 적용하세요.
  2. 스티치된 이미지의 중심 좌표를 설정하세요(ND 획득 > XY).
  3. 스티치된 이미지 스캔 영역(여기서는 5 x 4 시야각)을 설정하고 1% 오버래핑(ND Acquisition > Large Image)을 적용하세요.
  4. 4배 대물렌즈(ND 획득 > λ)로 컬러 밝방야 이미지 획득을 설정하세요.
  5. 영상 촬영 주파수를 1시간(성장기) 15시간, 광물화 단계(광물화 단계) 0.5시간(ND 획득 > 시간)으로 설정한 후 타임랩스 프로그램을 실행하세요.
    참고: 성장 및 광화의 지속 시간은 P. putida GB-1에 특이하며, 다른 미생물에 따라 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
  6. 실험이 완료되면 이미지를 태그된 이미지 파일 형식(TIFF) (매크로 패널 > TIFF로 내보내기)로 내보내세요.

7. 산 소화 및 Mn의 질량 측정

참고: ICP-MS는 마이크로유체 원자로에 저장된 Mn 질량을 측정하는 데 사용되지만, 광학 방출 분광기(ICP-OES)와 같은 다른 기기도 허용됩니다. 분석 장비가 없으면 산으로 분해된 샘플을 상업 실험실로 보내기도 합니다.

  1. 실험이 끝나면 원자로를 현미경 단계 삽입물에서 분리하고 입구 및 출구 튜빙을 분리합니다.
  2. 1.5mL의 산성 용액을 5mL 유리 가스 밀폐 주사기(접종 주사기와 분리)에 빼냅니다. 무딘 끝 바늘과 1/32인치 두께의 PTFE 튜브 20cm를 주사기에 연결하고, 수동으로 산을 분사하여 튜브 끝에 방울이 생길 때까지 조절하세요.
  3. 작업대 위에서 주사기를 주사기 펌프에 넣고 튜브를 반응기 입구 구멍에 연결하되, 산성 용액이 모든 기공에 스며들지 않도록 주의하세요. 1/32인치 내경 PTFE 튜브 30cm를 반응기 출구 구멍에 연결하고, 출구 튜브 끝을 2mL 마이크로 원심분리관에 넣습니다.
  4. 산성 용액을 10분간 100 μL·min-1의 유량으로 주입합니다.
  5. 산성 용액 주입 후에는 무딘 끝 바늘을 유리 주사기에서 분리하세요. 10mL 플라스틱 주사기에 공기를 채우고 둔끝 바늘에 연결한 후, 주사기 안의 모든 공기를 수동으로 분사하여 반응기와 튜빙에서 남은 산을 2mL 마이크로 원심분리관으로 배출합니다.
    참고: 공기 주입 후 소량의 산 용액이 공극 공간에 남아 있을 수 있지만, 총 주입 부피에 비해 무시할 만합니다. 저공극성 기하학을 사용하는 사용자는 부실한 기공에서 유체 막과 잔류 산을 제거하기 위해 추가 부피의 공기를 세척하는 것을 고려할 수 있습니다.
  6. ICP-MS 교정 범위에 따라 소화 시료를 1% 질산으로 희석하세요. 여기서 15mL 원뿔형 튜브에 100배 희석액(총 5mL)을 준비합니다.
  7. 희석된 샘플의 Mn 농도를 ICP-MS로 측정합니다. 측정된 농도를 희석 계수와 전체 샘플 부피로 보정하여 반응기에 남아 있는 Mn의 질량을 결정합니다.

8. 이미지 분석

참고: MATLAB은 텍스트에 포함된 이미지 분석 내장 기능 때문에 추천됩니다. 하지만 ImageJ나 Python의 이미지 분석 라이브러리와 같은 다른 도구들도 비교 가능한 분석을 수행할 수 있습니다. 주요 이미지 분석 단계는 그림 4에 나와 있습니다. 모든 이미지 분석 스크립트는 보조 파일 형태로 제공됩니다(보조 파일 1, 보조 파일 2, 보조 파일 3).

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그림 4: Mn 산화물 침전물을 분리하는 이미지 빼기 작업 흐름. 타임랩스 컬러 밝방야 이미지에서 기준 이미지(tref)(1)가 확인되어 이후 모든 시간대 이미지에서 기저 정지 상 생체막의 강도를 제거했습니다(tn). (2) 모든 TN의 이진 마스크를 생성하고(3), tref(4)와 해당 TN(5)을 곱하여 바이오필름-바이오미네랄 범위를 포착하였습니다. 마지막으로, 마스크 tn을 마스크 tref에서 빼었다(6). 생성된 강도 보정 행렬은 각 픽셀에서 산화물(Mn oxide) 축적로 인한 강도 감소(a.u.)를 정량화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

  1. AutoCAD에서 내보낸 마이크로플루이딕 기공 공간 기하학의 고해상도 TIFF를 작업 공간에 불러와 그레인 마스크 (imread)로 사용합니다.
  2. 컬러 밝은 필드 이미지를 곧게 펴고 등록하여 그레인 마스크를 효과적으로 적용하세요.
    1. 첫 번째 시간점 이미지(t = 0 h)의 등록 이진법을 생성합니다.
      1. 컬러 브라이트필드 TIFF를 작업 공간에 불러와(imread) 하세요.
      2. 이미지를 기공 공간보다 약간 크게 잘라내세요(임크롭).
      3. 이미지를 선명하게 하여 입자 경계의 해상도를 높이세요(선명한 선명).
      4. 어두운 특징을 우선시하는 적응 임계값(rgb2gray, adaptthresh , 전경 극성 = "어두운" 감도 및 필요에 따라 감도는 조정, 비비나리화, 비보완)을 사용하여 이미지를 이나라이즈합니다.
      5. 결과 등록 이진법의 입자를 채워 고체 특징을 만듭니다(명시된 '구멍'으로 채우 기). 모든 알갱이가 채워질 수 있는 것은 아닙니다.
      6. 배경 잡음을 제거하기 위해 필요에 따라 등록 이진수를 침식시키고, 결 가장자리에서 손실된 픽셀을 보충하기 위해 확장합니다(imerode, imdilate).
    2. 스케일 불변 특징 변환(SIFT) 등록 알고리즘을 사용하여 등록 이분수를 그레인 마스크에 정렬하는 변환 행렬을 계산합니다(detectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d with transform type = "affine").
    3. 이 변환 행렬을 등록 이진법과 첫 번째 시간점 이미지에 적용한 후, 그레인 마스크와 겹쳐 적합도를 평가합니다(imwarp, imshowpair).
    4. SIFT 등록 후에도 정렬이 불량이 계속된다면, 필요에 따라 로컬 등록을 적용하세요 (cpselect, fitgeotform2d transform type = "lwm", imwarp).
    5. 필요에 따라 등록된 이미지와 그레인 마스크를 자르어 매트릭스 가장자리의 등록 아티팩트를 제거한 후, 기공 공간 치수(15mm x 10mm)로 크기 조정(작정, 크기 조절).
    6. 모든 컬러 밝은 필드 이미지를 루프하여 동일한 등록(임워프)을 적용하세요.
  3. 생물필름이 처음으로 정지기에 들어갈 때 참조 이미지(tref, 그림 4의 패널 1)를 시각적으로 식별하라. 이 상태는 지속적인 움직임이나 성장이 없다는 신호로 판단된다(여기서는 t = 18.5시간).
  4. 각 시간점 이미지(tn, 그림 4의 패널 2) (rgb2gray, adaptthresh , 전경 극성 = "어둡음" 및 감도 필요에 따라 조정, 비비나리화, 비보완)하여 바이오필름-바이오미네랄 집합체 = 1, 입자와 빈 기공 = 0이 되도록 합니다. 각 타임포인트 마스크에 역결정 입자 마스크(임보완)를 곱하여 잔류 입자 경계를 제거한다.
  5. t를 해당 시간점마스크(그림 4의 패널 3)로 곱하여 관심 있는 바이오필름-바이오미네랄 영역(그림 4의 패널 5)을 분리하고, 그 다음 t에 각 시간점마스크를 곱하여 같은 영역을 분리합니다(그림 4의 패널 4).
  6. 마스크된 tn 을 마스크된 t참조 에서 빼서 각 시점에서 Mn 산화물 축적과 관련된 픽셀 강도 감소를 정량화한 후(imsubtract), 합성 강도 보정 행렬(rgb2gray, 그림 4의 패널 6)으로 변환합니다.
  7. 기공 공간(a.u.)에 걸친 광물 공간 분포를 평가하기 위해, 각 강도 보정 행렬의 열들을 따라 합(차원 = 1의 합 )을 산출합니다.
  8. 시간에 따른 Mn 산화물 침전 속도(μg·h-1)를 추정하려면:
    1. 각 강도 보정 행렬을 합산(차원 = "전체"인 합 )하여 각 시점에서의 총 보정 강도를 정량화합니다.
    2. 각 시점에서의 총 보정 강도를 최종 시점의 총 보정 강도로 나누어 최종 시점 = 1이 되고 앞선 값들은 모두 소수가 되도록 합니다. ICP-MS로 측정한 Mn 질량을 곱하여 μg로 재조정합니다.
    3. 시간에 대한 미분을 계산하면, 연속된 시간점(diff) 간 질량 증가(μg)를 이미지 간 시간 간격(0.5시간)으로 나누어 계산합니다.

결과

이 프로토콜은 바이오필름 형성과 Mn 생광물질화의 시공간적 해상도 영상을 위한 실험적 플랫폼을 제공합니다. 컬러 밝은 영역 이미지는 Mn 산화물 침전이 시작되기 전 t = 18.5시간에 P . putida GB-1 바이오필름이 미세유체 공 공간 전체에 균일하게 분포함을 보여주었다(그림 5A). 그 결과, Mn 산화물은 유입 Mn(II) 원천에 가장 가까운 공극 공간의 입구 쪽에 우선적으로 축적되었습니다(그림 5B). 참조 이미지와 이후 영상 시점 간의 차이는 Mn 산화물 침전이 전체 이미지 강도에 고립적으로 기여한다는 점을 밝혀냈고(그림 5C), 광물 축적에서 관측된 원자로 규모 기울기를 정량화할 수 있게 했습니다(그림 5D). 바이오필름 규모에서 이 이미지 감산 방식은 바이오필름 표면에 Mn 산화물이 점진적으로 침전되고 기공 유체와 접촉하는 바이오필름 가장자리에 미네랄이 축적되는 과정을 포착했습니다(그림 6).

이 프로토콜은 이미지 감산 및 ICP-MS 측정을 통해 Mn 산화물 침전의 동역학을 추정하는 워크플로우를 추가로 제공합니다. 삼중유체 원자로는 최종 실험 시점에서 4.29 ± 0.22 μg Mn을 포함하고 있었습니다. 원자로 내용물의 산 소화는 이전에 싱크로트론 기반 Mn 산화물 질량 측정을 통해 검증되었으며, 오차 18% 미만으로 나타났다61. 따라서 강도 보정 행렬은 이 최종 질량으로 재조정되었습니다. 이로 인해 추정되는 Mn 산화물 강전율은 비단조적이었으며, t = 19.5h에서 t = 21h 사이에 급격히 증가하다가 0.29± 0.04 μg·h-1 에서 정점에 달한 후 점차 감속되어 t = 43.5h까지 이어졌다(그림 7). 이 속도 계산은 광학 현미경 해상도 이하의 나노입자 Mn 산화물이나 실험 기간 동안 이동으로 인한 산화물 손실을 고려하지 않는다는 점에 유의해야 하며, 이는 최소한으로 예상됩니다. 따라서 이 접근법은 접근 가능한 현미경 기법을 활용하여 생체광물화 동역학의 시간적 추세를 반정량적으로 평가합니다.

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그림 5: 바이오필름과 Mn 산화물의 원자로 규모 분포. (A). 정지 단계 시작 시 미세유체 기공 공간 내 P. putida GB-1 바이오필름의 컬러 밝기장 이미지(t = 18.5 h,t 참조). (B). 최종 실험 시점(t = 43.5시간)에 P . putida GB-1 생물막 주변과 그 주변에 침전된 Mn 산화물의 컬러 밝기장 이미지. (C). 최종 실험 시점(t = 43.5h)에서 광물 축적의 강도 보정 매트릭스로, 입자는 회색, 기공은 흰색으로 표시됨. 스케일 바는 1 mm(D)입니다. 흡입구(왼쪽)에서 구멍 공간의 출구(오른쪽)까지의 총 보정 강도의 1차원 공간 분포(t = 43.5h). 실선은 입구에서 출구까지 기공 공간을 따라 3중 실험을 평균한 1mm 이동 평균을 나타내며, 음영은 표준편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 6: 바이오필름 규모의 산화물(Mn oxide) 축적. (A). 대표적인 P. putida GB-1 생물필름의 컬러 밝시야 이미지 선별. 망간 산화물은 처음에 바이오필름 표면에서 회색에서 갈색으로 변하는 색으로 검출되었고(t = 20h, t = 21h에서 나타남), 이후 바이오필름 가장자리에 짙은 갈색 침전물이 축적되어 t=33h, t = 43h에서 나타났습니다. (B). 입자는 짙은 회색, 기공은 흰색, 기공은 연한 회색으로 표시된 광물 축적의 강도 보정 매트릭스입니다. 스케일 바는 150 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 7: 시간에 따른 Mn 산화물 침전률 추정. 속도(μg·h-1)는 각 시점에서 총 보정 강도를 ICP-MS로 측정한 최종 Mn(Mn) 질량에 재척도한 후, 시간에 대한 미분을 계산하여 정량화하였다. 마커는 삼중 실험의 평균을 나타내고, 음영은 표준편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 1: Step1_ImageRegistration.m.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 2: Step2_ImageSubtraction.m.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 3: Step3_Figures.m.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 실험 플랫폼은 고충실도 데이터 획득을 방해하는 인공물이 없는 다공성 환경에서 생지구화학 과정의 시공간 역학을 조사할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 이 접근법은 특히 Mn 및 Fe 생체광물화에 적합하며, 이들은 특징적인 황토색, 갈색, 검은색 계열을 가진 광물 침전물을 생성하여 광학 현미경과 영상 분석으로 쉽게 분할할 수 있습니다. Mn(광물 생물광물화)을 사례 연구로 사용하여 현장 내 광물 침전 패턴과 속도를 높은 공간적·시간적 해상도로 평가할 수 있습니다.

이 프로토콜의 여러 측면은 생지화학 변환의 재현 가능한 측정값을 수집할 수 있게 했습니다. 첫째, 죽음 부피가 낮은 순차 주입 밸브를 사용하여 미세유체 공 공간 내 바이오필름을 교란하지 않고 여러 유체를 실험할 수 있었습니다. 이 장치는 주입액을 교체할 때 생기는 압력 급증을 방지하여 초기 바이오필름 공간 분포를 유지했으며, 이는 주입액 교체 시 생기는 압력 급증과 같은 다른 기기(주사기 펌프 등)에서 발생할 수 있습니다. 이 구성 요소는 사용자가 거주하는 미생물에 부과되는 지구화학적 조건을 맞춤화할 수 있는 유연성을 제공합니다. 마지막으로, 초기 바이오필름 분포를 보존하기 때문에 사용자는 다양한 바이오필름 형태나 바이오매스 양이 산화물의 분포와 침전 속도에 어떤 영향을 미치는지 체계적으로 테스트할 수 있습니다.

둘째, 미세유체 공극 공간에서 기포의 형성과 침입을 완화함으로써 Mn 생체광물화의 환경적으로 중요한 시간 척도를 포착하는 다일간의 실험이 가능해졌습니다. 기포는 상온62,63 이상의 장시간 실험에서 흔하고 종종 불가피한 문제로, 개별 기공을 파손하고 막으며, 유체 흐름을 우회시키고 반응 진행을 방해할 수 있습니다. 기포 공간 내 기포 가두기를 방지하기 위해 반응기는 접종 전에 완전히 포화 상태였습니다. 유량 제어 시스템을 통한 기포 유입을 최소화하기 위해, 현미경 인큐베이터는 실험 전에 30 °C로 설정되었고, 접종된 반응기를 부착하기 전에 여러 용량의 유입 용액을 세척했습니다. 이 단계는 튜빙과 피팅에 갇힌 공기를 제거하고 실험 중 유체 배출 위험을 최소화했습니다. 기포 트랩도 유량 제어 시스템에 통합되어 잔류 기포를 포획했으며, 트랩 출구에는 길이 200 μm 내경 PTFE 튜브가 부착되어 저항을 높이고 기포 제거 효율을 높였습니다. 마지막으로, 유입 튜빙과 원자로 입구 구멍 사이의 경계에서 공기 포집이나 누수를 방지하기 위해, 모든 연결은 튜빙 양 끝과 천공 구멍에 액체 방울로 이루어졌고, 소수성 PTFE 튜빙은 1% PEG-DA로 코팅되었으며, 삽입된 튜빙 끝은 실험 내내 PDMS 표면에 수직으로 유지되었습니다.

셋째, 맞춤형 UVC 조사 시스템을 실험 플랫폼에 통합함으로써 명확한 지구화학적 경계 조건을 유지하고 미세유체 공극 공간 내에서 Mn의 생체광물화를 재현 가능하게 제한했습니다. 파일럿 실험에서는 원자로 입구 영역의 불필요한 바이오필름이 기공 공간 상류에 Mn 산화물을 침전시켜 Mn(II)의 하류 가용성을 제한하는 것으로 나타났습니다. 무유동 침전 후 원자로 입구와 출구 영역을 적절한 정렬로 잠시 방사선하면, 초기 침착된 박테리아의 바이오필름 발생을 방지했습니다. 지속적인 단방향 유체 흐름은 초기 UVC 처리 후 원자로 입구 영역의 재정착을 방지했습니다. 정지상 시작 전 t = 17.5시간에 원자로 출구 영역을 조사하고 Mn 산화물 침전이 발생하기 전, 기공 공간 하류의 광물 축적량을 최소화했습니다. 이를 통해 ICP-MS로 분해 및 측정된 Mn 질량과 컬러 밝부야 이미지 데이터를 직접 비교할 수 있었습니다.

이미지 빼기와 종단 질량 측정의 결합은 Mn 산화물 침전의 현장 반응 동역학을 반정량적으로 평가하는 방법을 제공 했습니다. 하지만 카메라 감도가 어두운 색에 제한되어 매우 높은 광물 밀도에서는 픽셀 강도가 산화물의 질량에 직접적으로 비례하지 않는다는 점을 주목해야합니다. 이 비선형 거동의 평가는 정해진 시점에 시료를 산을 소화하고 최종 실험 시점에 따라 스케일링된 원래 질량과 비교함으로써 개선될 수 있습니다. 광물 질량의 정확한 정량화가 필요하다면, 사용자는 Fadely 등에서 이미 입증된 밝은 강도와 질량의 광물 샘플을 사용하여 보정 곡선을 개발하거나, 싱크로트론 기반 X선 형광으로 직접 측정할 수 있습니다.

여기서 제시된 마이크로플루이딕 플랫폼은 다양한 환경 조건에서 생체광물화 과정을 조사하는 데 적용될 수 있습니다. 대표적인 실험들은 P. putida GB-1에 최적화되었지만, 이 장치는 다양한 유입 용액 화학물질(예: Mn 또는 Fe 농도, 탄소원, 공존 금속 존재), 유량, 온도, 또는 미생물 컨소시엄의 존재를 체계적으로 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. Fe 산화성 박테리아에 유리한 특정 산성 또는 설폭성 조건은 유입 pH를 감소시키거나 PDMS에 산소 불투과성 폴리머를 코팅함으로써 시뮬레이션할 수 있습니다. 생물 광물화에 대한 미생물 조절에 대한 통찰은 리포터 유전자 융합 균주를 구현하고 그 결과 광학 형광을 추적함으로써 얻을 수 있습니다59,64. 마이크로유체 원자로는 입자 크기 분포, 입자 형태 또는 다공성을 변경하거나, 점토 입자나 천연 유기물의 표면 전하를 모방하도록 PDMS를 기능화하여 다양한 다공성 환경을 시뮬레이션하도록 재설계할 수 있습니다. 추가 개조(예: 유리 원자로 기판을 플라스틱으로 교체하는 등)를 통해 원자로는 금속 산화 상태, 광물학, 유기-광물 결합, 또는 2차 금속의 흡수 또는 공침전의 직접 분광 측정을 지원할 수 있습니다. 마지막으로, 이 실험 플랫폼은 광학 특성이 충분히 구분되어 이미지 분할이 가능할 경우 다른 금속 생체광물(예: 인산염, 탄산염, 황화물)의 침전을 조사하는 데도 확장될 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 관련 다공성 환경에서 생물광물화 및 미생물-광물-유체 상호작용을 포괄적으로 조사할 수 있는 틀을 제공합니다.

공개 사항

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 프로젝트는 미국 국립과학재단 생물매체 및 생체 모방 지반공학 센터(ERC-1449501), 스위스 국립과학재단(200021_188546), 미국 국립과학재단(MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849)의 지원을 받았습니다. 이 연구의 일부는 UC 데이비스 나노 및 마이크로 제조 센터(CNM2)에서 수행되었습니다. 우리는 현미경 인큐베이터와 UVC 방사선 시스템의 설계 및 제작을 위해 스티븐 루세로와 UC 데이비스 테크 파운드리에 감사드립니다. 또한 마이크로유체 원자로 제작에 사용되는 다공성 매질 기하학을 제공해 주신 Yuze Wang 박사와 Jason DeJong 박사님께 감사드리며, Arunima Bhattacharjee 박사, Noah Goshi 박사, Gregory Girardi 박사, 김혜현 박사님께도 포토리소그래피 및 소프트 리소그래피에 관한 유용한 토론과 교육을 제공해 주셨습니다. 마지막으로, 실험 설계와 영상 분석에 관한 귀중한 논의를 해주신 Gaitan Gehin 박사, Tonya Kuhl 박사, Filippo Miele 박사, Charles Graddy 박사에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
어셉터 피팅(Elveflow, 6-40 to 1/4-28)Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08플로우 센서와 플랜지 없는 피팅 사이의 인터페이스에 사용됩니다.
아가(Fisher BioReagents)Fisher ScientificBP9744냉동 스톡을 스트레이킹하기 위한 플레이트를 부을 때 사용됩니다.
공기 압축기(Jun-Air)ElveflowKCP-110플로우 컨트롤러를 압력화하는 데 사용됩니다.
암모늄 설페이트((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)Sigma-AldrichA4915실험용 배지 및 용액에 사용됩니다.
각진 핀셋TDI International7-SA마이크로플루이딕 반응기에 튜빙을 부착하는 데 사용됩니다.
AutoCAD 소프트웨어Autodesk--마이크로플루이딕 반응기 기하학을 설계하는 데 사용됩니다.
오토클레이브Steris--재료 및 액체를 살균하는 데 사용됩니다.
저울Mettler ToledoME2002TPDMS 엘라스토머 베이스와 경화제의 무게를 재는 데 사용됩니다.
바브 어셉터(1/4-28 스위블 to 3/32-in 바브)ElveflowKFI-06폴리에테르 폴리우레탄 튜빙을 매니폴드 및 유체 저장소 랙에 연결하는 데 사용됩니다.
생검 펀치(Rapid-Core, 1.2-mm 직경)Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25PDMS 마이크로플루이딕 채널에 입구/출구 구멍을 펀치하는 데 사용됩니다.
표백제(Chlorox)ULINES-19719플로우 제어 시스템을 살균하는 데 사용됩니다. 초순수에 1%로 희석합니다.
블런트 팁 바늘(Jensen Global, 21-게이지)QSourceJG21-10HPX-J004튜빙을 주사기에 연결하는 데 사용됩니다. 30분 동안 오토클레이브로 살균합니다.
번센 버너HumboldtH-5970무균 실험 작업 공간을 유지하는 데 사용됩니다.
칼슘 클로라이드 이수화물(CaCl2·2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)Fisher ScientificC79실험용 배지 및 용액에 사용됩니다.
카사미노 산(Fisher BioReagents, 산 카제인 펩톤)Fisher ScientificBP1424실험용 배지에 사용됩니다.
세포 밀도 미터(WPA Biowave CO8000)Avantor490005-906박테리아 배양의 OD600를 측정하는 데 사용됩니다.
클리어 테이프(Scotch Magic)ULINES-10223PDMS 마이크로플루이딕 채널에 먼지가 달라붙는 것을 방지하는 데 사용됩니다.
코발트(II) 염화물 6수화물(CoCl2·6H2O, CAS: 7791-13-1)Sigma-Aldrich255599실험용 배지 및 용액에 사용됩니다.
압축 질소AirgasNIUHP300마이크로플루이딕 반응기 구성 요소를 건조하는 데 사용됩니다.
원추형 튜브(Falcon, 15-mL 부피, 폴리프로필렌)Fisher Scientific14-959-49B유입 용액 및 ICP-MS 샘플에 사용됩니다. 사전 살균됨.
원추형 튜브(Falcon, 50-mL 부피, 폴리프로필렌)Fisher Scientific14-432-22LB 사전 배양에 사용됩니다. 사전 살균됨.
구리(II) 황산염 5수화물(CuSO4·5H2O, CAS: 7758-99-8)Sigma-AldrichC8027실험용 배지 및 용액에 사용됩니다.
커팅 매트ULINES-18543PDMS 마이크로플루이딕 채널을 잘라내고 입구/출구 구멍을 펀치하는 데 사용됩니다.
큐벳(Fisherbrand, 1.5-mL 부피, 폴리스티렌)Fisher Scientific14-955-127박테리아 배양의 OD600를 측정하는 데

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