방법 논문

생포유류 세포 및 3차원 세포 모델에서 형광 평생 영상 기초로 리보글로우 프로브를 시험 관 내에서 특성화하기

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DOI:

10.3791/71048

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2026년 8월 4일

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1Department of Chemistry, Georgetown University

* These authors contributed equally

† These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 시험관 내에서, 생체 포유류 세포 및 3차원 세포 모델에서 재현 가능한 RNA 영상 워크플로우를 위해 Riboglow 프로브의 정량적 형광 수명 측정을 가능하게 하는 것입니다. 우리는 편향되지 않은 형광 수명 측정을 추출하기 위한 샘플 준비, 프로브 전달, 데이터 수집 및 정량적 분석 워크플로우를 개괄합니다.

초록

인간 게놈의 거의 80%가 RNA로 전사되며, 단백질을 암호화하는 비율은 2% 미만으로, 대부분의 포유류 전사체가 비암호화적이며 다양한 조절 과정에 참여함을 나타냅니다. 따라서 살아있는 포유류 세포 시스템에서 RNA 분자를 정량적으로 감지하고 시각화하는 것은 RNA 역학과 상호작용을 이해하는 데 매우 중요하지만, 특히 복잡한 세포 환경에서 기술적으로는 여전히 도전적입니다. 리보글로우는 짧은 RNA 압정체가 소분자 프로브에 결합하여 형광 수명 활성화 능력을 정량화하여 형광 수명 활성화 현미경(FLIM)으로 감지하는 유전적으로 암호화된 RNA 바이오센서입니다. 여기서는 샘플 준비, 이미지 획득, FLIM 데이터셋의 정량적 분석을 포함한 Riboglow-FLIM의 상세한 워크플로우를 소개합니다. 이 프로토콜의 목표는 통제된 및 생세포 환경에서 Riboglow를 이용한 정량적 형광 수명 기반 RNA 검출을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 RNA 의존적 수명 변화를 측정하는 시험관 내에서, 그리고 FLIM 획득, 관심 영역 선택, 세포 분석 등이 확립되는 생체 포유류 세포에서 입증됩니다. 성공적인 구현은 실험 및 획득 매개변수의 신중한 제어가 필요합니다. 재현 가능한 구현을 위한 주요 고려사항들이 강조됩니다. 이 프로토콜은 Riboglow-FLIM을 구현하고 생세포에서 RNA 시각화를 정량적으로 평가하는 데 실질적인 참고 자료가 됩니다.

서론

최근 몇 년간 세포 기능에서 RNA의 역할에 대한 이해가 발전하면서 특히 질병 상태에서 살아있는 세포 내 RNA를 시각화해야 할 필요성이 커지고 있습니다. 그러나 자연적으로 형광을 띠는 RNA가 없기 때문에 종종 외인성 형광 생성 프로브와 결합된 설계된 표지 시스템이 필요합니다. 그 결과, 살아있는 시스템 내 RNA 위치, 동역학, 상호작용을 시각화할 수 있도록 다양한 RNA 영상 기법이 개발되었습니다.

RNA 영상 기법의 주요 유형 중 하나는 유전적으로 암호화된 태그에 의존합니다. 플루오로포어-압타머 시스템과 MS2 박테리오파지 코트 단백질(MCP) 시스템과 같은 단백질 기반 태깅 전략은 여전히 널리 사용되고 있습니다 1,2. MS2 시스템에서는 RNA 줄기 고리가 박테리오파지 코트 단백질에 결합되어 형광 단백질과 융합되어 살아있는 세포 내 전사체를 추적합니다. 유용하긴 하지만, 이 방법은 비교적 큰 RNA 태그와 추가 단백질 성분 생성이 필요하며, 이는 네이티브 RNA 행동을 방해할 수 있습니다. 1,2,3. 시금치4와 이후 변형인 브로콜리5, 옥수수6, 망고7, 페퍼8 등 형광 압정어 시스템은 리간드 결합 시 직접 형광 활성화를 가능하게 하며 태그 크기를 줄입니다. 그러나 이러한 시스템은 제한된 신호 강도, 배경 형광, 복잡한 세포 환경에서의 다중화 문제로 어려움을 겪을 수 있습니다.

대안 전략으로는 플루오로포어-소광기 시스템과 하이브리드화 기반 접근법이 있습니다. RhoBAST를 포함한 형광소자 소환기 시스템은 RNA 결합 후 소환이 중단될 때 형광을 발생시키지만, 배경 신호와 프로브 농도에 대한 민감도를 보일 수 있습니다 3,9. smFISH와 분자 비콘과 같은 하이브리다이저 기반 RNA 영상 기법은 높은 특이성을 제공하지만 프로브 전달이 필요하며, 결합 반응학과 오프타겟 상호작용 때문에 장기 생체 세포 영상에 제한이 있는 경우가 많습니다10, 11, 12. 이 방법들을 종합하여 생세포 RNA 영상의 주요 과제들을 부각시킵니다3, 13, 14. 이러한 발전에도 불구하고, 복잡한 생물학적 시스템에서 정량적 형광 수명 기반 RNA 영상을 위한 표준화된 워크플로우가 부족합니다.

리보글로우는 이러한 한계를 극복하려고 시도합니다. 리보글로우는 짧은 리보스위치에서 유래한 RNA 압형성체 '태그'와 합성 소분자 코발라민(Cbl)-형광체 '프로브'를 결합하여 생세포 RNA의 시각화를 가능하게 하는 유전적으로 암호화된 RNA 태깅 시스템입니다. 자연 소광제인 Cbl은 태그 결합 시 형광체와 공간적으로 분리되어 강도15에서 정량화 가능한 형광 '켜짐'을 생성합니다. Riboglow를 형광 수명 현미경(FLIM)으로 확장하면서, 형광체 농도와 여기 강도에 크게 독립적인 수치가 나타났으며, 프로브 전달 변동성과 사용자 간 차이를 완축합니다16,17. 더 중요한 것은, RNA 압정체를 변화시키면 FLIM16을 통해 시각화된 독특한 형광 수명이 생긴다는 점입니다. 이러한 직교 수명은 다중화된 RNA 영상을 가능하게 하여 단일 형광체16으로 두 RNA를 시각화할 수 있습니다. 이 플랫폼은 U-2 OS, HeLa, MDA-MB-231, HOS 세포 등 다양한 포유류 모델에서 검증되었으며, ACTB mRNA와 NORAD lncRNA15, 16, 17의 동시 시각화를 통해 검증되었습니다. 최근에는 리보글로우가 살아있는 동물 배아에서 RNA를 시각화하는 데 사용되고있습니다. 이 연구들을 종합하여 Riboglow는 정량적 다중화 RNA 이미징을 위한 컴팩트하고 다재다능한 시스템임을 확립했습니다.

생물학적 시스템에서 FLIM은 국소 분자 환경에 대한 민감성과 실험적 변이에 대한 상대적 견고성 덕분에 생물 시스템 내 분자 상호작용, 대사 및 세포 역학 연구에 널리 적용되어 왔습니다. FLIM은 일반적으로 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC)를 사용하여 형광 시료에서 여기 상태의 붕괴 속도를 측정합니다. TCSPC는 시료의 레이저 여기와 방출된 광자가 검출기에 도착하는 사이의 시간을 측정하며, 획득된 광자의 수명을 각 측정마다 광자 도착 시간 분포로 합산합니다. 수명 기반 영상은 세포에 적재된 프로브, RNA 발현 수준, 광 경로 변화 등 시스템의 형광 생성 부분에 대한 농도 의존도를 줄여 중요한 장점을 제공합니다. 하지만 FLIM 실험은 개념적, 기술적으로 까다로워서 광자 획득, 모델 적합, 분석 워크플로우를 세심하게 제어해야 합니다.

여기서는 Riboglow-FLIM에 대한 상세한 프로토콜을 제시하며, 샘플 준비, 영상 획득, 형광 수명 데이터셋의 정량적 분석 워크플로우를 설명합니다. 본 연구의 목적은 생물학적 시스템 전반에 걸친 정량적 리보글로우-FLIM 이미징을 위한 재현 가능한 워크플로우를 확립하는 것입니다. Riboglow-FLIM은 정량적 비교에 가장 적합하며, FLIM 하드웨어와 분석 전문성이 필요합니다. 이 프로토콜은 RNA 의존적 생애 변화를 측정하는 시험관 내에서, 그리고 라이보글로우 프로브를 사용하여 FLIM 획득, 관심 영역 선택, 정량적 수명 추출을 확립하는 생체 포유류 세포 및 3D 세포 시스템에서 입증됩니다. 이 프로토콜은 정량적이고 편향 없는 FLIM 데이터 분석을 위한 FLIM 획득 워크플로우와 원칙을 확립하는 중요한 토대를 마련하며, 향후 Riboglow-FLIM 또는 기타 FLIM 기반 시스템의 응용을 가능하게 합니다. 실험 설계 선택, 편향 없는 데이터 수집, FLIM 획득 및 분석 과정에서 흔히 겪는 도전 과제에 중점을 둡니다. 이전에 형질전환된 리보글로우 태그 구조체를 이용한 세포 내 RNA 검출 시연이 보고된 바 있으나, 특히 2D 및 3D 시스템 전반에 걸쳐 단계별 획득 및 분석 워크플로우를 제공하는 곳은 없습니다. 이 연구는 라이보글로우-FLIM을 생세포 RNA 이미징 도구로 구현하는 데 도움이 되는 자료를 제공합니다.

프로토콜

1. RNA 준비 및 정제

  1. 제조사의 시험관 RNA 합성 키트 지침에 따라 무균 1.6mL 마이크로 원심분리관에서 시험관 내 전사 반응 구성 요소를 조립합니다.
    참고: 이 실험에 사용된 RNA는 TranscriptAid T7 고수율 전사 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용해 합성되었습니다. RNA 합성은 이전에 17,20,21에서 입증된 바와 같이 다른 상업적으로 이용 가능한 키트를 포함한 어떤 확립된 프로토콜을 사용해 수행할 수 있습니다.
    1. 간단히 말해, 전사 반응 완충제, NTP, 효소 혼합물, 주형 DNA, 뉴클레아제 없는 물을 총 20 μL로 합치세요.
  2. 튜브와 내용물을 최소 4시간 이상 37°C 인큐베이터에 넣어 하룻밤까지 보관하세요. 제조사의 RNA 정화 키트 설명서에 따라 RNA 정화 컬럼을 사용하여 합성된 RNA를 정제합니다.
    참고: 이 실험에 사용된 RNA 정화 프로토콜은 Monarch RNA 정화 키트(New England Biolabs)였습니다. RNA 정제는 정제된 RNA를 만드는 확립된 프로토콜(여기서는 A260/A230 및 A260/A280 값이 2.0 이상으로 정의됨)을 사용하여 수행할 수 있으며, 이전에 17,20,21에서 입증된 다른 상업용 키트도 포함됩니다. RNA 컬럼 정화를 위한 모든 원심분리기 단계는 별도 명시가 없는 한 16,000 x g에서 1분간 진행됩니다.
    1. 간단히 합성된 RNA의 총 부피를 뉴클레아제가 없는 물로 50 μL까지 올리고, 결합 완충액 100 μL 후 100% 에탄올 150 μL을 추가합니다.
    2. 300 μL 전부를 컬럼에 적재하여 수집관에 삽입합니다. 컬럼을 원심분리하고 플로우 스루를 버립니다.
    3. 컬럼에 500 μL 세척 완충제를 추가하고 원심분리기를 사용합니다. 플로우 스루를 버리세요.
    4. 1.2.3 단계를 한 번 더 반복합니다.
    5. 컬럼에서 수집관을 제거하고 멸균된 1.6mL 마이크로 원심분리관을 부착합니다.
    6. 컬럼에 뉴클레아제가 없는 물 15μL를 추가한 후 실온에서 1분간 방치합니다.
    7. 원심분리로 마이크로 원심분리관에 용출하여 컬럼을 폐기합니다.
  3. 미세부적 분광광도계를 사용해 정제된 RNA의 농도와 순도를 측정합니다.
    1. 분광광도계를 뉴클레아제가 없는 1 μL 물로 빈 상태에 넣습니다.
    2. 정제된 RNA 샘플 1 μL을 샘플 받침대에 적재하고 측정합니다.
    3. 샘플 농도와 순도를 기록하며, A260/A230 및 A260/A280 값으로 표시됩니다.
  4. 정제된 RNA는 -80°C에 보관하세요.

2. 리보글로우 프로브

참고: 이 방법에 포함된 모든 리보글로우 프로브의 합성 절차는 이전에 출판된 문헌21에서 확인할 수 있습니다.

  1. 프로브 스톡(95 μM)은 사용하지 않을 때 RNase가 없는 빛 보호 마이크로튜브에 -20 °C에서 보관합니다.
  2. 사용 직전에 해동한 후 RNA 버퍼(100 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 40 mM HEPES, pH 8.0)에서 4.5 μM으로 희석하여 영상 실험에 사용합니다.

3. 시험관 내 샘플 준비

참고: 정제 RNA와 관련된 모든 단계는 RNase 변성제로 정기적으로 처리된 연기후드와 같이 RNase가 없는 환경에서 수행해야 합니다.

  1. RNA와 리보글로우 프로브의 시험관 내 용액을 준비합니다.
    1. RNase 없는 미세원심분리관에서 정제된 RNA 샘플을 Riboglow 프로브(Cbl-3xGly-ATTO590 또는 Cbl-5xGly-ATTO590)와 결합하여 RNA 완충액 내 최종 농도는 5.0 μM RNA와 4.5 μM Riboglow 프로브(100 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 40 mM HEPES pH 8.0)로 만듭니다. 피펫으로 부드럽게 혼합물을 균질화하세요.
      참고: 탐침이 RNA로 포화되도록 하기 위해 용액 내 RNA 농도가 Riboglow 프로브보다 더 높아야 합니다. RNA 또는 프로브의 농도가 의심스러울 경우, 포화도를 보장하기 위해 RNA 농도를 높이거나 프로브 농도를 낮출 수 있습니다.
  2. 튜브나 튜브 랙을 알루미늄 호일로 감싸고 용액을 실온에서 최소 20분간 배양하세요. 인큐베이션 직후 FLIM 영상 (6단계)으로 진행하세요.

4. 세포 배양

참고: 이 실험에는 HeLa와 U-2 OS 세포주 모두가 사용됩니다. 배양 및 프로브 로딩 프로토콜은 동일합니다. 세포 배양 작업은 BSL-2 실험실 환경의 표준 및 절차에 따라 정의된 표준 무균 기법을 적용한 생물안전 캐비닛(BSC)에서 수행되어야 합니다.

  1. 냉동 세포 알리코트를 37°C의 냉동관에 급속히 녹여 세포 배양 배지를 37°C 물에 넣습니다.
  2. 크라이오튜브에 같은 양의 가열된 세포 배양지를 추가하세요. 피펫을 부드럽게 위아래로 움직여 세포를 고정하세요.
  3. 세포 현탁액을 90mm 조직 배양 접시에 추가하면 총 세포 배양 배지의 부피를 10mL까지 늘립니다. 세포를 37°C, 5%CO2 의 가습 인큐베이터에서 최소 하룻밤 배양하여 세포가 부착되도록 하세요.
    1. 세포를 현미경으로 시각화하여 부착 여부와 수렴도를 확인하세요.
  4. 수합률이 80–90%에 도달하면 통과 세포가 형성됩니다.
    1. 90mm 플레이트에서 세포 배양 배지를 흡인하세요. 세포를 세척하기 위해 4mL의 인산염 완충 식염수(1 X PBS)를 넣고, 접시를 부드럽게 좌우로 흔들어 세포 위에 뿌립니다.
    2. PBS를 흡인하고 해리 시약 2mL를 추가하세요. 플레이트를 다시 가습 인큐베이터에 넣고 세포를 5–10분 동안 분리시키세요.
    3. 세포가 배양되는 동안, 세포 배양 배지 8mL를 추가하여 최소 한 개의 새로운 플레이트를 준비하세요. 플레이트에 날짜, 세포주, 패시지 번호를 적으세요.
    4. 5분에서 10분 후에 광학 현미경으로 박리를 시각화하세요. 분리된 세포는 배지 내에서 움직여야 합니다.
    5. 분리된 세포 플레이트를 제거하고, 대략 같은 부피의 신선한 세포 배양 배지를 플레이트에 옮깁니다. 향후 실험 목표에 따라 1–3mL 정도의 부유 세포를 새로운 접시로 옮깁니다.
      참고: 세포주마다 성장 기간과 민감도가 다릅니다. HeLa 및 U-2 OS 세포의 경우, 완전히 융합된 판에서 새로운 판으로 ~1mL의 세포 현탁액을 옮기는 데 약 4일이 걸리며 완전히 융합이 됩니다.
  5. 세포 영상 촬영을 위해서는 세포를 35mm 이미징 플레이트에 전달하고 위에서 설명한 대로 세척/통과합니다.

5. 리보글로우 프로브 비드 로딩

  1. 세포가 적절한 영상 융합 지점에 도달하면 35mm 영상 접시를 인큐베이터에서 분리하고 배지를 흡입합니다. 위에서 설명한 대로 1X PBS 1mL로 T-모션으로 세포를 세척한 후 PBS를 흡인합니다.
  2. 30 μM 리보글로우 프로브 3 μL를 세 개의 고르게 분포된 방울로 세포에 추가합니다. 탐침 용액이 세포 표면에 고르게 분포되도록 플레이트를 회전 방향으로 기울이세요.
    참고: 리보글로우 프로브 농도는 5–30 μM 범위가 될 수 있습니다. 여기서 설명한 실험에는 30 μM 스톡이 사용되었습니다. 그러나 5 μM은 형질전환 세포 샘플에 일반적으로 사용됩니다.
  3. 구슬 디스펜서를 사용해 접시에 얇은 유리 구슬 층을 올려주세요.
    참고: 비즈가 세포 위에 단층을 형성하도록 하고, 너무 많이 추가하지 않도록 주의하세요. 너무 많이 추가하면 제거가 어려워질 수 있습니다.
  4. 접시 바닥을 작업대 표면에 8–10번 단단히 두드려 비즈 로딩을 원활하게 하세요.
  5. 플레이트를 빠르게 덮고 신선한 배양지를 넣으세요. 탐침이 세포 안으로 들어가도록 플레이트를 10분간 가습 인큐베이터에 다시 넣으세요.
  6. 10분 후 플레이트를 제거하고 세포 배양 배지를 흡입하여 가능한 한 많은 유리 구슬을 제거하려고 노력합니다.
  7. 남은 유리 구슬을 제거하기 위해 PBS로 접시를 반복해서 세척하세요.
    1. 접시를 비스듬히 들고 접시 상단에 소량의 PBS를 놓아 아래로 흘러내리게 하면서 구슬을 모으세요. 접시 하단에 구슬로 PBS를 흡입하세요. 필요한 만큼 3–5번 반복하여 대부분의 남은 구슬을 제거하세요.
      참고: 이 단계에서 PBS 제트를 너무 세게 사용하지 마세요. 부착 세포가 분리될 수 있습니다. 여러 번 세척해도 일부 구슬이 남아 있다면, 실수로 너무 많은 세포를 씻어내는 것보다 이미징을 시도하는 것이 좋습니다.
  8. 10% FBS를 보충한 투명 영상 배지 1mL를 영상 접시에 추가하고 10분간 인큐베이팅합니다. FLIM 영상 검사(6단계)로 진행하세요. 영상 촬영은 비드 로딩 후 3시간 이내에 완료되어야 합니다.
    참고: 형광 분자를 부착하는 포유류 세포에 도입하는 구슬 적재 절차는 다른 곳에서 설명된 프로토콜에서 수정된 것입니다22.

6. FLIM 이미징

참고: 이 프로토콜은 FLIM/FCS 하드웨어와 NIS-Elements 소프트웨어가 장착된 니콘 Ti2 Eclipse AX 공초점 현미경에 맞게 조정되었습니다(자세한 내용은 재료표 참조).

  1. 현미경을 다음 순서로 전원을 켭니다: 공초점 레이저 주사 현미경, 현미경 제어 장치, 그리고 레이저 결합 장치, 광증배관 검출기, 이벤트 타이머를 포함하는 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC) 기반 FLIM 시스템.
  2. 현미경 부팅 후 데스크톱 컴퓨터를 켜고 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 엽니다.
  3. 부팅 옵션에서 "AX with PicoQuant"를 선택하세요. 이미지 수집 및 분석 소프트웨어가 부팅될 때까지 기다리세요.
  4. 부팅 후 "AX FLIM and FCS"를 선택하세요.
  5. 형광 수명 데이터 수집을 위한 현미경 설치.
    1. AX 패드 구간에서:
      1. 갈바노가 선택되었는지 확인하세요.
      2. 평균 1로 설정하세요.
      3. Dwell Time을 2로 설정하세요.
    2. 레이저 파워 섹션에 대해:
      1. 개별 레이저 슬라이더를 3–4%로 낮춰 주세요.
      2. All Laser 슬라이더를 0으로 설정하세요.
    3. TI2 패드에서:
      1. 20배 목표가 선택되어 있는지 확인하세요.
    4. 스캔 영역에서 512 x 512를 선택하세요.
    5. 올바른 감지기가 켜져 있는지 확인하세요. 2레이저 시스템 예시:
      1. 560 nm 레이저용 검출기 1.
      2. 640nm 레이저용 검출기 2.
        참고: 실험에 따라 하나 이상의 레이저가 사용될 수 있습니다. 감지기를 켜고 끄려면 우클릭하세요.
    6. 데이터 파일 경로를 정의하세요.
      1. 컨트롤러 섹션 하단으로 가서 "Configure"를 클릭하세요.
      2. PicoQuant/FLIM FCS 탭으로 가세요.
      3. "Workspace path" 아래에서 오른쪽 폴더 기호를 클릭하세요.
      4. 장소를 선택하고 그날의 실험을 위한 새 폴더를 만드세요.
      5. 구성 섹션을 종료하세요.
  6. 이미지 획득 창이 뜰 때까지 "라이브"를 선택한 후 다시 "라이브"를 선택하여 광자 수집을 일시정지하세요.
  7. FLIM 데이터 수집 창을 설정하기 시작하세요.
    1. 라이브 이미지 창을 우클릭하고 "PicoQuant Plugin"을 클릭하세요.
    2. 가능:
      1. 쇼 디케이 커브
      2. 시간 추적 표시
      3. FLIM 통계 보기
        참고: 이 세 창 모두에서 라이브 이미지를 우클릭해야 합니다.
    3. 이미징하는 샘플 유형에 따라 적절한 프로토콜 하위 섹션으로 진행하세요.

7. 시험관 내 데이터 수집

  1. 시험관 내 FLIM 샘플을 로드하세요.
    1. 검은색 슬라이드 패드와 커버 슬립을 준비하세요. 슬라이드 패드 위에 커버 슬립을 깔아주세요.
    2. 시험 관 내 샘플의 5–20 μL 방울을 커버 슬립에 놓습니다.
    3. 슬라이드 패드를 현미경 스테이지에 올려.
      참고: 증발하는 데 시간이 더 오래 걸리기 때문에 작은 방울 ~20 μL의 큰 방울이 선호됩니다. 증발 속도를 더 늦추려면 작은 캡이나 비슷한 모양의 물체로 물론을 덮을 수 있습니다.
    4. 조이스틱을 사용해 대물렌즈를 시각적으로 빗방울 중앙으로 조작하세요.
  2. "Live"를 선택하고 타임 트레이스 패드를 보세요. 이 장치는 특정 시점에 검출기가 수신하는 광자 수를 표시합니다.
  3. 샘플 방울의 올바른 Z 높이를 찾으세요.
    1. 시간 추적 신호가 최대값에 도달할 때까지 Z 높이를 계속 조정하세요.
    2. 검출기 슬라이더 아래에서 카운트 속도를 관찰하면서 레이저 출력을 높이기 시작하세요. 초당 표적 수(CPS)는 다양하지만, 프레임당 1,000-10,000개의 광자를 획득하는 것이 바람직합니다.
    3. Z 높이를 아래로 움직이기 시작했다가 다시 올려서 최대 시간 추적을 다시 확인하세요. 이는 슬라이드-드롭렛 인터페이스를 나타냅니다.
    4. 오른쪽 하단 모서리의 절대 Z 높이를 보고 ~20 μm 증가시켜 초점을 드롭 중심으로 옮기세요. 시간 추적 신호는 약간 감소했다가 정체되어야 합니다.
      참고: 올바른 Z 높이에 있을 때, Z 높이를 약간 올리거나 줄여도 실시간 이미지의 타임 트레이스나 평균 색상에 큰 변화가 없습니다. 또한, 라이브 창 상단의 "마우스 XY" 버튼을 선택하고 이미지를 이동시키면 드롭릿의 테두리를 찾을 수 있습니다.
  4. 획득 설정을 결정하세요.
    1. 붕괴 곡선을 보고 광자가 어느 지점에서 피크되는지 확인하세요. 이는 세 프레임 동안 획득된 총 광자의 수를 나타냅니다. 이 숫자를 사용해 획득당 필요한 프레임 수를 결정하세요. 시험 관 내 FLIM 분석에서는 총 10개의5 광자가 필요합니다. 획득당 10–15프레임이면 충분할 것입니다.
    2. 정해진 프레임 수를 기준으로 "캡처" 값을 설정합니다.
  5. 각 캡처마다 라이브 이미지를 일시정지하고 "캡처"를 선택한 후 데이터를 수집한 후 다시 "라이브"를 누르고 "마우스 XY" 버튼을 눌러 새로운 위치로 이동하세요.
  6. 충분한 데이터가 수집될 때까지 기술 복제는 7.5단계를 반복합니다.
    참고: 각 개별 포획은 결국 해당 샘플에 대해 하나의 형광 수명 값을 생성합니다. 15개의 평생 데이터 포인트를 수집하려면 7.5단계를 총 15번 완료합니다.
  7. 모든 데이터가 수집된 후에는 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 닫고 형광 수명 현미경(FLIM) 데이터를 전송합니다.
    1. 파일 탐색기를 열고 이전에 정의한 데이터 위치로 이동하세요.
      참고: 모든 FLIM 데이터 수집 세션은 해당 세션의 모든 데이터를 찾을 수 있는 단일 .sptw 폴더로 생성됩니다. NIS Elements는 실험 날짜를 기준으로 폴더 이름을 자동으로 지정하고, 개별 획득 항목은 획득 시점을 기준으로 이름을 붙입니다.
    2. .sptw 폴더를 내보내고 FLIM 처리로 넘어가세요.

8. 2D 셀 데이터 수집

  1. 아직 하지 않았다면, 세포 실험에 맞는 올바른 레이저 배열을 설정하세요.
    1. 페이지 오른쪽 상단, 레이저 옆에 있는 "실험 설정"으로 가세요.
    2. 멀티채널 염료 박스 옆에 있는 "추가"를 클릭하세요.
    3. 원하는 염료를 추가하세요.
      참고: 대부분의 리보글로우 프로브는 ATTO 590 형광체를 사용하므로 대부분의 리보글로우 실험에 이 염료를 첨가해야 합니다.
    4. 전문가 모드를 클릭하세요.
      1. 여기서 어떤 검출기가 어떤 방출 스펙트럼을 받는지 조정하세요. 이상적으로는 여기/방출이 겹치는 방출 스펙트럼은 서로 다른 검출기로 라우팅되어야 합니다. MA 검출기는 조준 불가능하기 때문에 GaAsP 검출기가 MA 검출기보다 선호됩니다.
    5. 왼쪽에서는 여기/방출이 겹치는 염료 간 교차 토크를 최소화하기 위해 통과 순서를 변경하세요.
    6. 설정을 저장하고 새 레이저 설정을 지정하세요. 실험용으로 선택하세요.
      참고: 이 단계는 프로필당 한 번만 완료해야 하며, 향후 실험을 위해 사용자 프로필에 저장해야 합니다.
  2. XYZ 개요 창을 열어 XYZ 개요 > 획득 통제 보기> 탐색하세요. 이 뷰는 각 이미지가 무대 내 촬영된 위치를 보여주어 실수로 중복되는 것을 방지합니다.
  3. 샘플 로딩으로 진행하세요.
    1. 영상 접시를 넣기 전에 반드시 생세포 핵염색이 추가되었는지 확인하세요. 염료는 세포에 침투하는 데 ~30초가 걸리며, 핵을 시각화할 수 있게 합니다.
  4. 이미징 접시를 현미경에 올려놓으세요. 현미경 스테이지에서 접시를 가능한 한 왼쪽 아래로 밀어주세요. 비공기 대물렌즈를 사용할 경우 샘플을 스테이지에 테이프로 고정해 XY 드리프트를 방지하세요.
    참고: 비공기 대물렌즈를 사용할 때 접시가 움직이지 않도록 샘플을 현미경 스테이지에 테이프로 고정하는 것이 필요합니다.
  5. DAPI 채널로 전환하고 컨트롤러 옆에 있는 노브를 이용해 Z 높이를 올리기 시작하세요. 세포 핵이 선명해질 때까지 천천히 진행하세요.
    1. 현미경 컨트롤러의 '당근'을 조절해 Z 높이 노브의 감도를 조절하세요.
    2. 세포가 보이지 않을 경우, 핵이 있는 판의 영역에 맞게 XY 좌표를 조정해야 할 수도 있습니다.
  6. 현미경 제어판에서 PFS 자동 초점을 "켜짐"으로 설정하세요.
    1. AX 패널 오른쪽에서 PFS 버튼 옆에 있는 돋보기 를 선택하세요. 현미경은 Z 높이를 정규화하기 위해 조정을 시작합니다. 완료되면 PFS 버튼이 켜지면서 "포커스됨"이라고 표시되어 PFS가 켜졌음을 알 수 있습니다.
      참고: 퍼펙트 포커스 시스템(PFS)은 XY 단계 이동이나 장시간 실험으로 인한 Z 드리프트를 최소화합니다. PFS가 선택되면 Z 높이 조정에 2 속도를 사용하세요. PFS가 작은 조정을 자동으로 상쇄합니다.
  7. 셀 데이터 수집을 시작하기 전에 AX 검출기가 셀 탐색에 사용되고 있는지 확인하며, FLIM/FCS 검출기가 사용되지 않는지 확인하십시오.
  8. 셀을 찾을 때는 DAPI 채널을 사용해 셀 영역을 찾고, ATTO 590 채널로 전환하여 효과적으로 비드 부하가 이루어진 셀을 찾으세요.
    참고: 비드 로딩 효율은 핵 염색 효율보다 현저히 낮으며(저희 손에서는 ~30% 셀이 비드 로드 상태), 따라서 모든 형광 핵을 가진 셀에 ATTO 590이 포함된 것은 아닙니다.
  9. 셀을 식별하면 더블 클릭해 프레임 중앙에 맞추세요. 또는 획득 창을 우클릭한 후 "이 점을 중앙으로 이동"을 클릭하세요.
  10. 셀이 중앙에 맞춰지면 "AX FLIM and FCS"로 전환하세요.
  11. 화면 오른쪽 하단에서 "512 x 512"가 선택되었는지 확인하세요.
  12. 오른쪽 하단의 작은 창에서 모서리를 클릭하고 드래그하여 프레임을 셀에 맞게 조정하세요. 새로 커진 프레임이 빨간색으로 변하게 하세요. 프레임 안에서 우클릭하거나 "Live"를 선택해 프레임이 초록색으로 변할 때까지 누르면 조정이 완료되었음을 알 수 있습니다.
  13. 포획 횟수를 원하는 값으로 조정하세요.
    참고: 세포 실험에는 최소 10개의4 광자가 이상적입니다. 아세포 실험에서는 관심 영역(ROI)이 정의될 때 많은 광자가 제외되므로 총 광자 수가 10개,5 개 이상 이상입니다. 512 x 512 프레임의 경우, 일반적으로 ~30 프레임이면 셀룰러 획득에 충분합니다. 캡처 수를 늘리거나 적을수록 각각 해상도나 캡처 속도가 증가합니다.
  14. "포획"을 선택하세요. 캡처 시 새 창이 나타날 것입니다. 화면 오른쪽에 있는 캡처 진행 상자는 캡처 입력 박스 근처에 나타날 것입니다.
  15. 그동안 형광 수명 현미경(FLIM) 분석 소프트웨어를 열고 올바른 파일 경로로 이동하세요. FLIM 획득 항목은 자동으로 FLIM 분석 소프트웨어 창에 저장되며, 획득 시 이름을 변경할 수 있습니다.
  16. 캡처가 완료된 후에는 다시 AX 검출기로 전환하여 "Live"를 선택하여 새로운 셀을 찾습니다. AX FLIM/FCS 윈도우의 크기는 언제든지 더 크거나 작은 셀을 고려해 조정할 수 있습니다.
  17. 3시간 영상 촬영 기간 내에 새로운 세포를 계속 획득하세요.
  18. 완료 후에는 "In Vitro Data Collection"의 7단계를 따라 생성된 .sptw 파일을 내보내세요.
  19. 완료되면 FLIM 처리 로 넘어가세요.

9. 3D Z-스택 셀룰러 FLIM 데이터 수집

  1. 2D 셀 데이터 수집 8.1 - 8.12단계에 설명된 완전한 레이저 설정, Z 높이 조정 및 셀 탐색.
  2. 설정 영역 상단에서 "ND 획득" 탭으로 전환하세요.
  3. "XY" 체크박스를 클릭하면 표가 나타날 것입니다.
    1. 표에 좌표가 있으면 표 오른쪽 상단의 "값 지우기"를 클릭하세요.
  4. 테이블 상단의 "추가"를 클릭하면 셀을 추가하세요.
    1. 이렇게 하면 스테이지의 현재 XY 좌표와 Z-값/PFS 값이 채워집니다.
  5. 표 위의 "Z" 체크박스를 클릭하세요.
  6. 라이브 캡처와 현미경 컨트롤러를 사용해 플레이트 근처 셀의 맨 아래까지 스크롤하세요. 셀 하단을 찾으면 큐브 옆에 있는 노란색 "Bottom" 버튼을 눌러 이 Z 높이를 셀의 하단으로 사용하세요.
  7. 이 과정을 셀 상단으로 반복하며, 현미경 컨트롤러를 사용해 셀 상단으로 이동한 후 '탑' 버튼을 클릭하세요.
  8. 큐브 아래에서 "Step" 박스 옆에 있는 버튼을 클릭하세요. 이렇게 하면 정의된 Z 높이에 맞는 권장 단계가 입력됩니다.
    참고: 단계 수를 늘리면 Z축의 최종 해상도와 획득 시간이 증가합니다. 셀의 각 단면은 개별 분석하여 전체 셀의 수명 지형을 결정해야 하므로, 이 이미지 분석 시간도 셀당 단계 수를 결정할 때 고려해야 합니다. Z-스택 실험의 단계 수를 결정하기 전에 FLIM 적합 과정에 대한 자세한 내용은 "하위 섹션: 셀룰러 FLIM 처리"를 참조하십시오.
  9. "획득" 탭에서 프레임 수를 평소의 대략 절반으로 바꿉니다.
    참고: 이는 주로 시간을 절약하기 위한 조치입니다. 개별 Z-스택 슬라이스의 품질은 최종 이미지 품질에 덜 중요하기 때문입니다. 엄격한 이미지 품질을 유지하려면 슬라이스당 정상 또는 더 많은 캡처 수를 선택하세요. 이로 인해 획득 시간이 길어집니다.
  10. "ND 획득" 테이블로 돌아가 "지금 실행 중"을 선택하세요.
  11. 현미경이 세포의 모든 조각을 획득할 수 있도록 허용한다; 획득 시간은 선택된 슬라이스 수와 슬라이스당 캡처 횟수에 따라 달라집니다.
  12. 이미지를 수집한 후에는 .nd2 파일로 저장한 후 획득 창 상단의 "볼륨 뷰 표시" 버튼을 사용해 3D로 시각화하세요.
  13. 셀룰러 Z-스택용 공초점 이미지를 획득해야 한다면, AX 검출기를 사용해 셀의 동일한 이미지를 촬영하세요.
    1. 제어판 상단 근처에서 "AX"를 선택하여 AX 감지기로 전환하세요.
    2. "ND 획득" 테이블로 돌아가서 "지금 실행 중"을 선택하세요. 공초점 이미지는 FLIM 이미지에 비해 획득하는 데 매우 짧은 시간이 소요됩니다.
  14. 완료 후에는 "In Vitro FLIM 데이터 수집" 섹션의 7단계를 따라 생성된 .sptw 파일을 내보내세요.
  15. 공초점 이미지는 .nd2 파일로 내보내 컴퓨터의 알려진 위치에 저장할 수 있습니다.
  16. 완료되면 "FLIM 처리" 로 넘어가세요.

10. FLIM 현상

  1. 일반/시험관 내 FLIM 처리
    ​    참고: ROI 선택과 같은 셀룰러 FLIM 데이터에 특화된 프로토콜 수정에 대해서는 셀룰러 FLIM 처리(Step 10.2)를 참조하세요.
    1. FLIM 분석 소프트웨어를 실행하세요.
      참고: FLIM 분석 소프트웨어 키가 현미경과 동일한 컴퓨터에 연결되어 있을 경우, 소프트웨어가 실행되려면 현미경이 완전히 켜져 있어야 합니다. 소프트웨어 키가 별도의 컴퓨터에 저장되어 있다면, 소프트웨어가 "장치 부팅 실패"라는 오류 메시지를 표시할 수 있습니다. "TCSPC"를 연결할 수 없다"는 말은 안전하게 무너져도 됩니다.
    2. FLIM 분석 소프트웨어에서 다음 방법 중 하나를 사용하여 FLIM .sptw 파일을 엽니다:
      1. 화면 상단에서 파일 > 오픈 워크스> [.sptw 파일 위치 선택]로 이동하세요.
      2. .sptw 파일을 저장된 위치에서 클릭해서 드래그한 뒤, 창 왼쪽의 큰 흰색 상자에 있는 FLIM 분석 소프트웨어 창에 넣으세요.
        참고: FLIM 분석 소프트웨어가 FLIM 폴더를 인식하려면, 폴더가 ".sptw"로 끝나고 WSLogfile을 포함해야 합니다. 데이터 폴더 이름 변경이나 이동 시 이 식별자가 제거되지 않도록 주의하세요. 성공적으로 로드되면, 왼쪽 창에 작은 녹색 사각형이 표시되어 개별 데이터 수집을 나타냅니다.
    3. 녹색 획득 중 하나를 한 번 클릭하세요.
    4. FLIM> 분석 > 이미징으로 이동하여 "시작"을 선택하세요. FLIM 파일이 로딩을 시작합니다.
    5. 로드가 완료되면, 샘플 창을 우클릭하고 "스케일바 표시" 옵션을 해제하면 자동으로 생성된 스케일바를 제거할 수 있습니다.
    6. 부패 피팅 탭에서 다음 드롭다운 옵션을 선택하세요:
      1. 적합 모델: N-지수 재합성
      2. 부패: 전반적인 붕괴
      3. IRF: 계산된 IRF
        참고: 시험관 내 FLIM 이미지는 보통 동질적이며 ROI가 필요하지 않습니다. 하지만 생략해야 할 바람직하지 않은 이미지 특징이 있을 수 있습니다. 그렇다면 샘플 창을 우클릭하고 다양한 ROI 도면 옵션 중 하나를 선택하여 ROI를 정의하세요. 영역을 정의하려면 클릭하고 길게 누르세요. 제외된 값은 단색으로 변하고, 선택된 값은 다채로운 상태로 유지되어야 합니다. 일관성을 위해 계산된 IRF가 사용됩니다; 그러나 측정된 IRF는 특정 실험 조건에서 정확도를 향상시킬 수있으므로 가능한 경우 고려되어야 합니다.
    7. 하단에서 주황색 "초기 맞춤" 버튼을 선택하세요. 소프트웨어는 최적의 적합 선을 계산해 녹색 감쇠 곡선 옆에 검은색으로 표시합니다.
    8. 적합도와 그 결과 잔차를 분석하고 적합의 품질을 판단하세요.
      1. 감쇠 곡선 아래에서 생성된 잔차를 보고 적합 품질을 판단합니다. 무작위적이고 노이즈 같은 잔차는 적합도가 양질임을 나타내며, 뚜렷한 선형 특징과 부드러운 경사는 적합이 좋지 않음을 나타냅니다.
      2. 적합 품질을 평가하는 χ2 값은 피팅 테이블 오른쪽 아래에 있습니다. 피팅이 개선됨에 따라 χ2 는 1에 가까워집니다.
        참고: 잔차 그래프는 계산된 감쇠 곡선(검은색 선)과 측정된 감쇠 곡선(녹색) 사이의 겹침을 선형적으로 표현한 것입니다. 즉, 두 곡선이 얼마나 잘 맞아떨어지는지 보고 적합 품질을 판단할 수 있습니다. FLIM 데이터 적합에 관한 자세한 내용은 최근 출판물23호에서 제공되었습니다.
    9. 필요에 따라 맞춤 품질을 높이기 위해 매개변수 수를 조정하세요.
      1. "모델 매개변수" 옆에서 n값을 1로 늘리고 "초기 적합"을 선택하세요. 새로운 곡선이 계산되고, 새로운 잔차와 χ2 값이 표시됩니다.
      2. 이 새로운 맞춤의 품질을 평가하고 추가 매개변수가 필요한지 판단하세요.
      3. 10.1.9.1 단계를 반복합니다. to 10.1.9.2. 모델링된 붕괴가 최적의 품질에 도달할 때까지.
        참고: 매개변수 수는 최소화하되 가능한 최고의 적합 품질을 달성해야 합니다. 두 매개변수가 거의 동일한 적합 특성을 생성한다면, 더 적은 매개변수 수를 사용해야 합니다. 이론적으로 모델 매개변수의 수는 샘플 내 평생 생산하는 종의 수에 해당합니다. 실제로는 시각화하는 시스템의 복잡성이 증가할수록 이상적인 매개변수 수가 증가합니다.
      4. 최종 매개변수 수가 결정된 후, 붕괴 피팅 표에서 τAvAmp 가중 수명(τ AvAmp [ns])을 기록할 수 있습니다.
        참고: 타우 평균 진폭(τAvAmp)과 타우 평균 강도(τAvInt)는 모두 샘플의 평균 형광 수명을 나타내는 지표입니다. 하지만 각 값을 결정하는 데 사용되는 계산은 다르며, 두 값을 상호 교환할 수 없습니다. 일반적으로 τAvAmp 는생물학적 시스템에 더 정확한 지표입니다.
      5. 적합 FLIM 샘플 이미지를 얻기 위해 적합 데이터를 이용한 배경 뺄셈을 수행하고 FLIM Fit을 수행합니다.
        1. Decay Fitting 테이블의 흰색 체크박스는 τn[ns] 박스를 제외한 모든 박스를 체크 해제하세요. τn[ns] 박스의 수는 결정된 적합 매개변수의 수에 해당합니다.
        2. BkgrDec[Cnts]의 값을 0으로 변경하세요.
        3. 샘플 창 바로 왼쪽에서 "FLIM Fit"을 선택하세요. 소프트웨어가 샘플을 맞추기 시작할 것입니다.
      6. 피팅 후에는 샘플 창 오른쪽의 범례를 수정하여 가짜 색상 척도와 강도 표시 설정을 조정할 수 있습니다.
      7. 샘플 이미지는 비트맵으로 내보내 추가 이미지 처리를 위해 비트맵으로 내보낼 수 있습니다. 오른쪽 클릭 > > 비트맵 또는 색상 척도가 포함된 비트맵을 선택해 처리할 수 있습니다.
  2. 셀룰러 FLIM 처리
    1. 일반/시험 관 내 FLIM 처리 과정 완료 10.1.1 - 10.1.5.
    2. 샘플 디스플레이 창에서 우클릭하여 ROI 그리기 옵션 중 하나를 선택하여 셀룰러 ROI를 정의하세요.
      참고: 불규칙한 형태 때문에 Free ROI 옵션을 사용하는 것이 셀 정의에 가장 좋은 경우가 많습니다. ROI에서 제외되는 영역은 영역을 정의할 때 CTRL을 누르고 있으면 제외될 수 있습니다. 이미 선택된 ROI에 SHIFT를 누르고 있으면 추가 면적을 추가할 수 있습니다. 세포 내 구획을 분석할 때, 공초점 이미지에서 보이는 형광 염색이 이후 FLIM 영상에서는 보이지 않을 수 있습니다. 이러한 경우에는 공초점 이미지를 FLIM 이미지에서 ROI를 그리는 기준으로 사용하는 것이 권장됩니다.
    3. 부패 피팅 탭에서 다음 드롭다운 옵션을 선택하세요:
      1. 적합 모델: N-지수 재합성
      2. 붕괴: 투자 수익률(ROI)
      3. IRF: 계산된 IRF
  3. 일반/시험 관 내 FLIM 처리의 나머지 절차를 완료하라, 7단계부터 13단계까지.

결과

실험 워크플로우의 완전한 그래픽 개요는 그림 1에서 확인할 수 있습니다. 실험 편향을 최소화하기 위해 데이터셋은 블라인드 분석이 가능합니다. 이를 위한 예로, 모든 표본 신원은 데이터 수집 및 처리 과정에서 연구자들에게 숨겨졌습니다. 따라서 실험 그룹은 할당된 식별자(그룹 A, 그룹 B 등)로 표시되며, 실제 정체성은 텍스트와 그림 캡션에 정의됩니다.

RNA A 태그 정제 후, RNA A 태그의 유무와 관계없이 두 개의 리보글로우 프로브인 Cbl-3xGly-ATTO590(3xGly)와 Cbl-5xGly-ATTO590(5xGly)의 시험관 내 형광 수명을 측정하였습니다. 프로브 3xGly와 5xGly는 링크 구간에 글리신 단량체 반복 횟수가 다르다는 점을 제외하면 동일하며, 3xGly는 3개, 5xGly는 5개입니다(그림 2D). 시험관 내 형광 수명을 위에서 설명한 방법으로 수집 및 분석했으며, 전체 붕괴는 ROI 선택 없이 분석하였습니다(그림 2E-2G). n-지수 리컨볼루션 후, 실험 그룹별로 τAvAmp 값을 추출하고 그래프로 표시하였습니다(그림 3B). 각 그룹별로 정규화된 거짓 색상 척도를 가진 대표적인 FLIM 획득 창이 생성되었으며, 해당 그룹의 특정 샘플 유형에 대응하는 τAvAmp 값과 일치하는 것으로 나타났다(그림 3A 및 3B). 예상대로, RNA A 태그가 포함된 시험관 내 수명 샘플(그룹 B와 C)은 RNA A 태그가 없는 샘플(그룹 A 및 D)보다 유의하게 높은 형광 수명 값을 보였습니다. 각 실험군의 대표성 붕괴 곡선은 RNA A 태그의 존재가 시험관 내에서 추출된 수명을 증가시킨다는 것을 보여줍니다(그림 3C). RNA A 태그가 없는 샘플의 경우 붕괴 곡선이 왼쪽으로 이동되어 RNA A 태그가 있는 샘플에 비해 평균 수명이 짧음을 나타냅니다.

살아있는 세포에서 형광 수명을 조사하기 위해, Riboglow 3xGly와 5xGly 프로브를 사용해 위에서 설명한 대로 부착된 HeLa 세포의 비드 로딩이 수행되었습니다(그림 4A). FLIM 분석을 통해 다양한 리보글로우 프로브가 살아있는 세포에서 고유한 평생 신호를 생성하는지 확인하였습니다. FLIM 측정 대상은 부하된 리보글로우 프로브의 존재와 세포의 전반적인 건강 상태를 바탕으로 선정되었습니다. 세포는 형광 수명 결과 결과와 무관하게 검증된 프로브 부하와 정상적인 형태를 기준으로 생애 분석 전에 선정되었습니다. 수집된 FLIM 데이터는 ROI를 사용하여 표적 외 형광 신호를 제한하는 방식으로 분석되었습니다(그림 2H, 그림 4B). 결과는 3xGly를 비드로 적재한 세포(E그룹)의 세포 형광 수명이 5xGly를 적재한 세포(그룹 F, 그림 4D) 보다 유의하게 짧다는 것을 보여주었다. 이 추세는 두 샘플 그룹의 대표 붕괴 곡선을 통해 더 자세히 시각화할 수 있는데, 3xGly를 적재한 세포는 5xGly를 적재한 세포에 비해 왼쪽으로 이동한 붕괴 곡선을 가지며, 평균 형광 수명이 더 낮음을 나타냅니다(그림 4C). 이 결과는 2D 세포 이미지에서 리보글로우 프로브의 세포 수명을 추출하는 데 기술된 프로토콜의 유용성을 입증합니다.

그 후 세포 내 구획에서 리보글로우-FLIM을 분리하는 것을 목표로 했습니다. 예를 들어, 우리는 핵 FLIM 신호 와 세포질 FLIM 신호를 선택했습니다. 세포 핵의 수명을 수집하여 세포 구획 간 수명 변동을 조사했습니다(그림 5). 청색 핵 염색이 있는 세포의 공초점 이미지를 FLIM 이미지와 함께 수집하여 핵 및 세포질 ROI를 결정하는 데 사용되었습니다(그림 2J, 그림 5C). 3xGly와 5xGly를 적재한 세포 핵과 세포질에 대한 FLIM 분석 결과, 두 그룹의 세포 내 아세포 구획 간에 유의미한 수명 차이가 나타났다(그림 5F). 이전 관찰과 일치하여, 리보글로우 프로브가 적재된 세포의 핵은 동일한 세포의 세포질보다 일관되게 더 긴 형광 수명을 보입니다. 핵 수명은 각각 3xGly와 5xGly의 세포질보다 평균 0.18ns와 0.13ns가 더 길었습니다. 중요한 점은, 가짜 색상 척도 획득 창, 붕괴 곡선, 추출된 τAvAmp 값 모두 동일한 형광 수명 추세를 보인다는 것입니다(그림 5C-그림 5F). 핵과 세포질 수명의 차이는 작았지만 견고한 데이터 분석 워크플로우를 통해 일관되게 감지되었습니다.

점점 더 복잡해지는 시스템에서 FLIM의 유용성을 입증하기 위해 3D 셀룰러 Z-스택을 수집하고 분석했습니다. 총 4개의 셀이 Z-스택 슬라이스를 사용해 3차원에서 촬영되었으며, 셀당 슬라이스 수는 10개에서 15개까지 다양했습니다. 각 세포 절편에 대해 핵과 세포질의 ROI를 수집하고, 추출된 τAvAmp 값은 쌍 t-검정을 통해 그래프 및 분석되었다(그림 5A 및 5B, 5G). 모든 실험 결과는 이 세포들에서 핵과 세포질의 수명 사이에 유의미한 차이가 없음을 보여주었다. 이는 Z-슬라이스당 광자 수가 줄고 표본 크기가 제한되어 3D 분석에서 통계적 검정력과 수명 해상도가 떨어질 수 있기 때문일 수 있습니다. 이 데이터는 FLIM 데이터 수집에서 샘플 크기와 광자 수가 중요함을 강조합니다. 여러 세포 분석에서 한 번당 더 높은 광자 수가 측정되면, 단일 세포의 저광자 실험에서는 보이지 않는 수명 차이가 드러납니다(그림 5F 및 5G).

이 결과들은 여러 관련 생체분자 맥락에서 Riboglow 시스템이 생성한 FLIM 데이터를 수집하고 분석하는 데 기술된 프로토콜의 유용성을 입증합니다.

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그림 1: 실험 워크플로우 개요. A-B) 시험관 내 (A) 및 포유류 세포(B) 샘플의 샘플 준비 워크플로우. C) FLIM 데이터 수집 워크플로우. D) FLIM 데이터 처리 워크플로우. 수집된 데이터는 n-지수 리컨볼루션을 이용해 적합되며, 각 획득에 맞는 적합 매개변수 수를 결정하고 최종 수명 값을 결정하여 내보냅니다. E-F) FLIM 데이터 디스플레이. 시험관 내 데이터(E)는 가짜 색상 FLIM 이미지나 평생 도트 플롯으로 제시되며, 셀룰러 데이터(F)는 2D 또는 3D 셀 FLIM 이미지로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2: Riboglow 플랫폼, 링커 시리즈, FLIM 피팅 워크플로우. A-B) 리보글로우 프로브와 RNA A 태그 만화. C) RNA 압정체 태그(A Tag)에 리보글로우 프로브가 결합하는 모습을 보여주며, 이는 복합체 형성 시 형광 강도와 수명을 증가시킵니다. D) 본 연구를 위한 리보글로우 링커 시리즈. Cbl(자두)은 가변 화학 연결 물질을 통해 형광체(파란색)와 공유 결합됩니다. 5xGly는 노란색으로 강조된 두 가지 추가적인 글리신 잔기(glycine redus)를 포함하고 있습니다. E-J) SymPhoTime 64를 통한 FLIM 데이터 처리. E-G) FLIM 데이터는 SymPhoTime 64 (E)에 가져옵니다. 깨끗한 관심 영역(ROI)을 선택하고(F), 그 후 n-지수 재합성곱 모형(G)을 사용하여 감쇠 곡선을 적합시킵니다. 최적 적합을 사용하여 진폭 가중 평균 수명(τAvAmp)을 산출합니다. H) U-2 OS 셀에서 소환된 3xGly의 2D 셀룰러 FLIM 분석, n = 3에서의 적합 성과를 보여줌. I) 5xGly와 DAPI로 표시된 HeLa 셀의 3D 볼륨 렌더링. J) 핵과 세포질 FLIM 분석을 위한 Z-스택 워크플로우, 해당 공초점 z-슬라이스가 구획별 수명 적합을 위한 정확한 ROI 배치를 어떻게 안내하는지 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 3: 시험관 내에서 두 개의 프로브 변이체 +/- RNA의 형광 수명 평가. A) RNA A 태그의 유무와 관계없이 형광 수명 영상 현미경(FLIM)을 통한 시험관 내 리보글로우 프로브의 정량적 시각화. Scale bar = 50 μm. B) 3xGly와 5xGly in vitro 샘플에 대해 τ AvAmp 값을 그래프로 표시했으며, RNA A 태그가 있든 없든 포함되었습니다. 각 포인트는 FLIM 획득 1회를 의미합니다. 오차 막대는 평균과 단기만족(SD)을 나타냅니다. 사후 Tukey HSD를 이용한 일원 ANOVA는 생애 기간에 유의미한 차이를 보여줍니다(****p < 0.0001). C) RNA-A 유무 5xGly 및 3xGly 프로브의 대표적인 시험관 내 붕괴 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 4: 3xGly(그룹 E) 및 5xGly(그룹 F) 리보글로우 프로브를 사용한 HeLa 세포의 형광 평생 영상. (A) 프로브 로딩 과정 개요. (B) 그룹 E(왼쪽)와 F그룹(오른쪽)의 세포 획득 이미지. 스케일 바 = 10 μm. (C) 그룹 E와 F에서 추출한 적합한 수명 감쇠 곡선을 IRF로 그래프 그립니다. (D) HeLa 세포에서 E 그룹(n=18 세포)과 F 그룹(n=18 세포)의 형광 수명, 평균 및 95% CI 오차 바가 표시됨. 비쌍 t-검정은 3xGly와 5xGly를 적재한 세포 간 수명에 유의미한 차이를 보여줍니다,*** p < 0.0005. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 5: 3xGly(그룹 L)와 5xGly(그룹 M) 리보글로우 프로브를 이용한 아세포 구획의 FLIM 분석. (A) Z-스택 이미징의 회로 표현. (B) 공초점 Z-스택 이미지를 통해 획득한 HeLa 셀의 3D 렌더링 이미지. HeLa 세포는 청색 핵 염색(청록색)을 포함하고 있으며, 리보글로우 프로브(주황색)가 적재되어 있었습니다. (C) 비드 로드 헬라 셀의 FLIM 분석. 공초점 이미지(왼쪽 열)는 ROI 선택의 기준으로 사용되었습니다(가운데, 오른쪽 열). 스케일 바 = 10 μm. (D-E) (D) 3xGly 또는 (E) 5xGly 중 하나로 적재된 HeLa 세포의 핵 및 세포질 ROI에서 추출한 대표적인 형광 붕괴 곡선. 곡선은 정규화된 광자 수와 붕괴 시간을 나타내며, 각 붕괴는 기기 응답 함수(IRF, 검은색)와 겹쳐집니다. (F) 두 실험군 간 핵 및 세포질 ROI의 형광 수명을 정량화한 점플롯. 각 포인트는 단일 셀룰러 ROI를 나타냅니다. 사후 Tukey HSD를 이용한 일방향 ANOVA는 두 그룹 내에서 핵과 세포질 간 수명에 유의미한 차이를 보여줍니다(****p < 0.0001). (G) 4개 세포의 형광 수명 Z-스택 점플롯. 각 점은 셀룰러 Z-스택의 한 슬라이스에서 단일 ROI를 나타냅니다. 동일한 세포에서 유래한 여러 ROI는 완전히 독립적인 생물학적 복제가 아니기 때문에 주의 깊게 다뤄졌습니다. 모든 ROI는 공초점 이미지를 기준으로 정의되었습니다. 쌍 t-검정은 모든 세포 Z-스택에서 핵과 세포질 간 수명에 유의미한 차이가 없음을 보여줍니다(ns p > 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

리보글로우-FLIM은 형광 수명 측정값을 활용하여 정량적 RNA 영상 촬영을 위한 틀을 제공합니다. 이 프로토콜의 성공적인 적용은 광자 획득, 붕괴 적합, 편향 없는 샘플링의 세밀한 제어에 매우 중요합니다. 광자 수는 신뢰할 수 있는 n-지수 재합성곱을 위한 충분한 통계를 확보하면서도 검출기 포화, 누적 효과, 그리고 추출된 수명을 인위적으로 감소시키는 광표백을 피하기 위해 균형을 맞춰야 합니다. 실제로는 광자 수가 부족하면 특히 세포 영상에서 작은 세포 구획을 해석하려는 시도에서 소규모 ROI를 사용할 때 적합 실패로 이어지며, 과도한 광자 플럭스는 TCSPC 검출의 빈 한계로 인해 붕괴 곡선을 압축합니다. 따라서 실험 목표에 따라 적절한 거주 시간, 프레임 번호, 레이저 출력을 선택하는 것이 필수적입니다. 거주 시간과 프레임 수는 각 픽셀의 샘플링 시간과 시야각을 재방문하는 횟수를 각각 제어하여 총 광자 예산을 결정합니다. 반면 레이저 전력은 여기율을 결정하여 거주 주기당 광자 수량을 결정하며, 이는 신호 대 잡음, 광표백, 누적 손실에 직접적인 영향을 미칩니다. 동등하게 중요한 것은 모델 매개변수를 최소화하고 무작위 잔차를 확인함으로써 붕괴 곡선의 과적합을 방지하는 것입니다. 과도파라미터화는 체계적으로 수명 값을 하향적으로 편향시키기 때문입니다. 수명 지표의 선택은 중요한 분석적 고려사항으로, 진폭 가중치(τAvAmp)와 강도 가중치(τAvInt) 평균은 다중 지수 감쇠의 서로 다른 측면을 반영하며 상호 교환 가능하지 않습니다. 이전 지침과 일치하여, τAvAmp 는 생애 구성 요소의 분수 기여를 보다 직접적으로 나타내며 이질적인 생물학적 환경 해석에 더 적합하기 때문에 여기서 사용됩니다23. 특히 짧은 수명 구성 요소를 해결할 때 신뢰할 수 있는 재합성 피팅을 위해 기기 응답 함수(IRF)의 정확한 결정이 필요합니다. 계산된 IRF는 시간에 따른 실험 적합 일관성을 유지하기 위해 사용되지만, 실제 기기 응답에서 벗어날 경우 체계적 오차를 초래할 수 있습니다. 측정된 IRF와 계산된 IRF 간의 일치를 확인하기 위해 요오화칼륨 표준을 사용한 IRF의 주기적 측정이 필요합니다. 세포 실험의 경우, 편향 없는 샘플링은 평생 추출 전에 세포 건강과 프로브 부하를 평가해야 하며, 평생 결과에 기반한 사후 배제는 선택 편향을 유발합니다. 비드 로딩은 세포 생존력에 추가적인 변동성을 도입하며, 밝은 영역 또는 공초점 영상으로 결정된 정상적인 형태와 안정적인 형광 신호를 가진 세포만 분석에 포함되어야 합니다. 둥글게 변하거나, 블리빙이 있거나, 음미한 세포와 같은 불규칙한 구조는 제외해야합니다. 우리의 경험상, 영상 촬영은 세포 스트레스를 최소화하기 위해 약 3시간 이내에 완료하는 것이 가장 좋습니다. 이는 시간이 지남에 따라 형광 수명 측정에 영향을 줄 수 있습니다.

붕괴 곡선 적합은 Riboglow-FLIM 실험에서 가장 흔한 문제 해결 과제입니다. 실패한 적합은 음의 적합 진폭(FLIM 분석 맞춤에서n < 0), 적합과 측정된 감쇠 간의 불량 겹침, 구조화된 잔차와 같은 비물리적 매개변수로 식별할 수 있습니다. 많은 경우, 시간 적합 경계를 조정하여 저신호나 늦은 시간 잡음을 배제하고 감쇠의 선형 영역은 로그 척도로 유지함으로써 적합 품질을 향상시킬 수 있습니다. 이 방법은 수명 해상도를 약간 낮추지만, 추출된 평균 수명에는 최소한의 영향을 미치며, 사용 가능한 데이터셋을 유지할 수 있게 합니다. 충분한 광자 수와 경계 최적화에도 불구하고 피팅 실패가 계속될 경우, 획득 제외가 정당합니다. 대규모 세포 연구에서는 공초점 영상을 통한 세포 사전 선택과 다중 지점 FLIM 획득 자동화와 같은 프로토콜 수정이 처리량을 크게 높일 수 있지만, 장시간 영상 세션 중 Z-드리프트를 최소화하기 위해 현미경의 완벽한 초점 시스템을 이용한 안정적인 초점 제어가 필요합니다. 이 프로토콜은 PicoQuant TCSPC 하드웨어가 탑재된 니콘 Ti2 Eclipse AX 시스템에서 시연되지만, 광자 계수, 타이밍 해상도, 검출기 구성에 대한 동등한 제어가 유지된다면 일반적인 획득 및 분석 원리는 라이카 SP8이나 Abberior STEDYCON 시스템 등 다른 FLIM 플랫폼에도 적용 가능합니다. 분석에는 SymPhoTime 64가 사용되지만, 내보낸 FLIM 데이터셋은 TCSPC 기반 형식을 지원하는 다른 분석 소프트웨어 패키지와 호환되며, 사용자는 이에 따라 워크플로우를 조정할 수 있습니다.

실험 설계 시 이 방법의 여러 한계를 고려해야 합니다. 첫째, 공초점 영상 중 정의된 관심 영역은 FLIM 분석 소프트웨어로 직접 전송할 수 없으며, 각 FLIM 데이터셋별로 수동으로 다시 그려야 하므로 추가 분석 시간과 사용자 의존적 변동성이 발생할 수 있습니다. 또한, 현재 FLIM 처리 워크플로우는 SymPhoTime 64에서 체적 수명 적합을 지원하지 않아 Z-스택 슬라이스에 대한 개별 분석이 필요하며, 분석 시간이 증가하고 슬라이스 간 광자 통계가 단편화됩니다. 이러한 단편화는 측정당 유효 광자 수를 감소시키고, 어두운 영역이나 작은 구획에서 적합 정밀도를 낮출 수 있습니다. 이 한계는 3D 세포 영상에서 영향을 미치는데, 슬라이스당 광자 수가 감소하고 시스템 복잡성이 증가하여 수명 해상도가 떨어지기 때문입니다. 여러 ROI가 동일 세포에서 여러 슬라이스에서 추출되는 경우가 많기 때문에, 이러한 측정값은 완전히 독립적이지 않아 유효 생물학적 반복 횟수가 줄어들고 통계적 해석에 고려되어야 합니다. 이 제약과 일치하여, 3D 실험에서 작은 표본 크기는 정의된 ROI에서 광자 수가 감소하여 단일 세포 또는 2D 분석에서 명확히 나타나는 생물학적으로 의미 있는 평생 차이를 가릴 수 있습니다. 또한, 매우 작거나 희미한 세포 내 위치 지정은 공간 해상도나 광자 밀도가 부족할 때 신뢰성 있게 맞추기 어렵으며, 시료 복잡성이 증가함에 따라 공간적 세부와 수명 정밀도 간의 균형을 더욱 강조합니다.

이러한 한계에도 불구하고, 이 프로토콜은 샘플 유형 전반에 걸쳐 Riboglow-FLIM 구현을 위한 상세하고 표준화된 워크플로우를 제공함으로써 충족되지 않은 필요를 해결합니다. 리보글로우는 이전에 강도 기반 측정을 통해 적용된 바 있지만, 리보글로우-FLIM은 프로브 농도와 RNA 발현 수준에 크게 의존하지 않는 정량적이고 환경에 민감한 판독을 가능하게 합니다. 형광 수명은 강도 기반 접근법에 비해 프로브 농도, 광표백, 광 경로 차이에 대한 감도 감소 등 장점으로 이전 연구에서 보고되었습니다. 중요한 점은, 리보글로우-FLIM 획득 및 분석을 위한 표준화된 프로토콜이 이전에 발표된 적이 없다는 점이며, 여기서 제시된 상세한 워크플로우는 공정한 데이터 수집, 학문 분야 적합성 및 인 비트로, 셀룰러, 3D 시스템 전반에 걸친 실험적 고려사항을 확립합니다.

검증된 Riboglow-FLIM 프로토콜의 제공은 살아있는 세포에서 RNA 역학, 위치 및 조절을 연구하는 실험 도구 상자를 확장시켰습니다. 이 접근법은 세포 내 구획, 시간점 또는 실험 조건 간의 정량적 비교가 필요한 실험과, 직교 수명 서명을 이용한 다중화 RNA 영상에 적합합니다. 기초 RNA 생물학을 넘어, 이 프로토콜은 점점 더 복잡해지는 생물학적 모델에서 RNA 처리, 수송, 스트레스 반응 및 전사 조절 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다. FLIM 계측 및 분석 소프트웨어가 계속 발전함에 따라, 여기서 확립된 방법론은 수명 기반 RNA 이미징을 고차원 및 생체 내 시스템으로 확장하는 기초를 제공합니다.

공개 사항

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

브라젤만 연구실의 연구는 국립보건원(R35GM150823 E.B.), 루스 재단(E.B.), 조지타운 대학교 화학과(L.K.S. 에스펜샤이드 펠로우십)의 지원을 받고 있습니다. 이 연구는 조지타운 대학교의 CHEM 4505 실험 강좌의 일부였습니다. CHEM 4505에 등록한 모든 학생은 이 원고의 데이터 수집, 분석 및 개발에 참여했으며 공동 저자로 등재되어 있습니다. 모든 저자는 이 원고 개발 과정에서 도움을 준 사누자 모하나라즈와 로드리고 마이야르 박사에게 감사를 표합니다. 저자들은 또한 기술적 피드백을 준 에머슨 보그스와 클레이튼 헤이즐렛 박사에게 감사를 표합니다.

데이터 이용 가능

모든 데이터셋과 분석 파일은 출판 시 저장소(이 원고를 참조한 공개된 Box 폴더)에 제공될 예정입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 mL 원심 분리기 튜브AbdosP10402세포 배양 및 비드 로더 구축에 사용
Cbl-3xGly-ATTO590N/AN/ARiboglow 시스템에서 RNA 검출에 사용, 합성 정보는 여기에서 확인 가능: https://doi.org/10.1021/acschembio.5c00917
Cbl-5xGly-ATTO590N/AN/ARiboglow 시스템에서 RNA 검출에 사용, 합성 정보는 여기에서 확인 가능: https://doi.org/10.1021/acschembio.5c00918
세포 분리 배지Gibco12605-28세포 분할 및 이동에 사용
세포 이미징 접시Ibidi81218-200생체 내 세포 이미징에 사용
세포 현미경 DMEMGibcoA1896701생체 내 세포 이미징에 사용
콘포컬 현미경 시스템Nikon AX세포 콘포컬 이미징에 사용
DMEMGibco1195-092포유류 세포 배양에 사용
FBSCytivaSH30910.03DMEM에 혈청 보충에 사용
형광 수명 이미징(FLIM) 분석 소프트웨어PicoQuantSymPhoTime 64, version 2.9, build 5818FLIM 분석에 사용
유리 비드Millipore SigmaG4649라이브 세포에 Riboglow 프로브를 비드 로드하는 데 사용
유리 커버슬립VWR48368 062체외 이미징에 사용
HEPESSigmaH3375RNA 버퍼 제조에 사용
고수율 RNA 합성 키트Thermo ScientificK0441RNA 전사 키트
하이브리드 광전관 검출기PicoQuantPMA 하이브리드 시리즈형광 수명 측정을 위한 광자 검출에 사용
KClFisher ScientificBP366RNA 버퍼 제조에 사용
라이브 세포 핵 염색InvitrogenR37605생체 내 세포 이미징 중 세포 핵 염색에 사용
포유류 세포 냉동 튜브Fisher Scientific12-567-501포유류 세포 저장에 사용
MgCl2SigmaM8266RNA 버퍼 제조에 사용
마이크로 원심 분리기 튜브Thermo Scientific90410일반적으로 체외 및 세포 배양 작업에 사용
현미경 베이스Nikon Ti2 Eclipse체외 및 세포 이미징에 사용
현미경 렌즈NikonN Plan Apochromat체외 및 세포 이미징에 사용
현미경 운영 소프트웨어/이미지 획득 및 분석 소프트웨어NikonNIS-Elements, version 6.20.02. 
마이크로 볼륨 분광 광도계Thermo ScientificND-2000DNA 및 RNA 농도 및 순도 결정에 사용
다채널 이벤트 타이머PicoQuantMultiHarp 150체외 및 세포 샘플에서 형광 수명을 추출하기 위한 TCSPC에 사용
NaClFisher ScientificBP358RNA 버퍼 제조에 사용
PBS, 1XCorning21-040-CV세포 세척 및 비드 제거에 사용
펄스 다이오드 레이저 및 레이저 결합 장치PicoQuantSepia PDL 828, PicoQuant LCU체외 및 세포 샘플의 레이저 흥분에 사용
RNA 정제 키트New England BiolabsT2050LRNA 정제 키트
RNAse 변성제InvitrogenAM9780RNAse 프리 환경 준비에 사용
조직 배양 접시Fisher ScientificFB012923일반 세포 배양 및 유지에 사용

참고문헌

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생화학제234호Riboglow-FLIMRNA 현미경 검사TCSPC비드 로딩RNA 태깅살아있는 RNA 이미징3D RNA 시각화
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