생쥐 난자 내 시험관 성숙, 수정 및 착상 전 배아의 배양

요약

이 프로토콜은 마우스 난자의 시험관 내 성숙, 시험관 수정, 그리고 배아를 배반포 단계까지 배아 배양하는 절차를 설명합니다.

초록

마우스 난자 시험 관 내 성숙과 시험 관 내 수정 및 이후 배아 배양을 결합하면 지정된 조건 하에서 착상 전 배아를 생성할 수 있습니다. 이러한 절차는 난자 성숙, 수정, 초기 배아 발달의 생물학적 기능과 분자 메커니즘 연구를 촉진합니다. 그러나 이 접근법의 성공적인 적용은 난자와 정자의 신중한 취급, 적절한 배양 조건, 그리고 각 단계별 발달 진행 평가에 달려 있습니다. 여기서는 쥐 난소에서 미성숙 적적-난자 복합체(COC)를 분리하는 방법, 난자의 시험 관 내 성숙, 시험관 수정, 그리고 배아의 배아를 배반포 단계까지 시험 관 배양하는 방법을 설명합니다. 이 절차에는 배지 및 배양 배지 배지 준비 및 평형화, 난소 박리 후 COC의 분리 및 선별, 정자 채취 및 정액 부여, 표준화된 조건에서의 인공 수정 수행, 그리고 이후 배아 배아 배양 발달 평가 등이 포함됩니다. 발달 진행은 수컷과 암컷 전핵의 형성, 두 세포 단계로의 절단, 배반포 형성 등 형태학적 기준을 사용하여 평가됩니다. 이 프로토콜은 난자 성숙과 모체 인자 기능에 통합될 수 있어 포유류 생식 생물학의 기초 연구에 유용한 도구가 됩니다.

서론

난자의 질과 발달 능력을 이해하는 것은 성공적인 수정과 이후 배아 발달에 필수적입니다 ^1,2. 난자 성숙은 핵 성숙 중 정확한 염색체 분리뿐만 아니라, 세포질 성숙, 소기관 재분포, 모체 mRNA 및 단백질의 축적도 필요^하다. 초기 배아 발달은 모체가 제공하는 mRNA와 단백질에 의존하며, 난자 내 모계 저장은 착상 전 발달을 유지합니다. 그러나 포유류 배아 발생을 좌우하는 많은 모계 조절자의 정체와 기능은 아직 완전히 이해되지 않았습니다⁴. 따라서 난자 성숙, 수정, 배아 발달의 기전을 규명하기 위해서는 추가적인 체계적인 연구가 필요합니다.

마우스는 착상 전 배아 발달을 연구하는 데 널리 사용되는 모델 시스템입니다. 시험관 내 성숙(IVM)은 난소에서 미성숙 난자를 수집하여 통제된^{실험실 조건 하}에서 성숙시키는 것을 의미합니다. 이후 시험 관 수정(IVF)은 성숙한 난자를 감각화된 정자와 공동 배양하여 초기 배아 발달 연구를 위한 접합자를 생성할 수 있게 합니다. 그러나 생 체 내 성숙한 난자를 이용한 기존 IVF에 비해 IVM 유래 난자는 종종 성숙 및 수정률이 낮고 발달 능력이 저하되는 경향이 있습니다^. 이러한 한계는 주로 시험관 내 배양 조건에서 핵과 세포질 성숙의 비동기에 기인합니다. 더불어, 쥐 난모세포의 감수분열 방추 안정성은 IVM 중 pH와 온도 변화에 민감하며, 방추 교란은 성숙 정지에 기여할 수 있습니다⁷. 따라서 IVM 유래 난자세포의 능력 저하는 여전히 주요 장애물로 남아 있어 발생 및 기전 연구를 위한 효율적인 배아 생산을 제한하고 있습니다.

생쥐 착상 전 배아는 생 체 내에서 유래한 접합자를 채취하여 시험관 내에서 배양(IVC)으로도 얻을 수 있습니다. 난관에서 수집된 생체 유래 접합자는 수정 후 사건에 초점을 맞춘 실험의 비교적 동기화된 출발점을 제공합니다⁸. 그러나 난자 성숙과 모체 인자의 축적은 생체 내 수정 이전에 일어납니다; 따라서 생체 내 유래 접합자는 이후 배아 발달에 미치는 영향을 평가하기 위해 성숙 조건이나 모체 저장고를 실험적으로 조작하는 데 덜 적합하다⁴. 따라서 IVM 및 IVF 프로토콜을 최적화하고, 엄격한 품질 관리(예: 온도, pH, 취급 관행의 엄격한 관리)를 갖춘 표준화된 운영 절차를 채택하는 것이 절차 관련 변동성을 최소화하고 난자 및 배아의 발달 능력을 보호하는 데 필수적입니다.

여기서는 배지 준비, COC 분리 및 선택, IVM 및 IVF 절차, 시험관 내 배아 배양 과정을 상세히 설명하는 IVM–IVF–IVC 프로토콜을 설명합니다(그림 1). 프로토콜은 일상적인 품질 관리를 위한 실용적이고 단계별 체크포인트를 포함하며, 여기에는 첫 극체(PB1) 돌출, 수컷 및 암컷 전핵(2PN) 형성, 두 세포 절단, 배반포 형성 등이 포함됩니다. 이 프로토콜은 지정된 조건 하에서 착상 전 배아의 재현 가능하고 효율적인 생성을 가능하게 하며, 기전 연구, 배양 최적화, 그리고 발생 및 생식생물학에서의 후속 응용을 지원합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 중국 서북 A&F 대학교 기관 동물 관리 및 이용 위원회(허가 번호: 20230503)의 승인을 받았습니다.

1. 동물 관리

1. 야생형 암컷 C57BL/6와 수컷 DBA/2 마우스를 구해, 20–22°C, 습도 55%± 10%에서 12시간 동안 밝고 어두운 주기를 가진 특정 병원균 없는 조건에서 보관하세요. 번식용 식단과 물을 자유롭게 제공하세요. 수컷 쥐는 한 마리씩 집에 있습니다(한 우리당 수컷 한 마리).

2. 매체 준비

1. 50 IU/mL PMSG 작업 용액을 만들기 위해 5,000 IU 임신 암말 혈청 생식선자극 세포(PMSG)를 100 mL의 멸균 인산염수 완충 생리식염수(PBS)에 용해합니다.
   참고: 용액을 1mL 1회 사용 용량으로 나누어 –20°C에서 보관하세요. 각 알리코트는 사용 직전에 실온에서 해동하세요.
2. IVM 배양지를 준비할 때, 표 1 에 명시된 성분을 100mL 199(M199) 베이스 배지를 첨가합니다. pH를 7.3–7.4로 조절한 후, 0.22 μm 필터를 통해 멸균 여과하여 멸균 배지 병에 넣습니다. 병에 이니셜, 제작 날짜, 유통기한을 적어 'IVM'이라고 라벨을 붙이고, 최대 1개월간 4°C에서 보관하세요.
3. 0.1% (w/v) 히알루로니다제 용액을 제조하기 위해 10 mg 히알루로니다제를 10 mL M2 배지에 용해합니다.
   참고: 1 mL 한 번에 담아 –20 °C에서 37 °C까지 데워 보관하세요.

3. 요리 준비 (그림 2)

참고: IVM과 IVF의 경우 100 μL 낙하당 20–30개의 COC, 배아 배양의 경우 100 μL 낙하당 20–30개의 배아 수를 사용하여 IVM, IVF, IVC 낙하 수를 조정하십시오.

1. 적절한 수의 35mm 난자 수집 배지에 2mL의 M2 배지에 0.2 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX)을 보충하여 준비하세요. 난소 천공과 COC 수집에는 한 그릇(암컷 두 명당 한 그릇)과 COC 세척에는 다른 한 그릇을 사용하세요. 사용 전에 37°C로 미리 예열하세요.
2. IVM 요리를 준비하세요.
   1. 60mm 접시에 100 μL IVM 미디지 5방울을 준비해 세척용으로 사용하세요(접시를 "IVM 워시"라고 표기하세요).
   2. 별도의 60mm 접시에서 100 μL IVM 배지를 여러 방울 준비하여 숙성시키고(접시에 "IVM"라고 표기).
   3. 드롭을 덮을 만큼 충분한 미네랄 오일을 조심스럽게 넣고, 5%_CO2 인큐베이터에서 최소 2시간 동안 37°C에서 접시를 평형으로 유지한 후 난자 채취를 시작하세요.
3. IVF 요리를 준비하세요.
   1. 60mm 접시에서 정자 방출과 정액 형성(접시를 '정자 감각'으로 표기)을 위해 300 μL 전평형 배양지 1방울 또는 2방울을 준비합니다.
      참고: 두 번째 정액 방적은 첫 번째 정자 점검의 운동성이 부족하거나, 새로운 부고고체 정자 샘플을 채취해 정액화해야 하거나, 수정 전에 정자 농도를 조절해야 하는 경우를 대비해 예비 상태로 준비됩니다.
   2. 세척용으로 각각 100 μL 100 μL 전평형 배양지 5방울을 담은 60mm 접시 두 개를 준비합니다(접시를 "IVF 워시"로 표기).
      참고: 수정 전에 IVM 성숙한 COC를 세척할 때 한 "IVF 세척" 접시를, 공동 인큐베이션 후 추정 접합자를 세척할 때 다른 "IVF 세척" 접시를 사용해 적운과 잔류 정자를 제거하세요.
   3. 별도의 60mm 접시에서 여러 방울의 100 μL 전평형 배아 배양지를 준비하여 수정(접시에 "IVF"라고 표기).
      참고: 정자 준비 및 수정 과정에서 일관된 조건을 유지하기 위해 정자 능력 형성과 수정 모두에 사전 평형 배아 배양 배양 배양지를 사용합니다.
   4. 정자 가동 과정을 시작하기 전에 드롭을 덮을 만큼 충분한 미네랄 오일을 조심스럽게 넣고, 5%_CO2 인큐베이터에서 최소 12시간 동안 접시를 37°C에서 평형으로 유지한 후 정자 가석 배출 절차를 시작하세요.
4. IVC 요리를 준비하세요.
   1. 60mm 접시에 100 μL 전평형 배아 배양지 5방울을 준비하여 배아를 세척합니다(접시를 "IVC 워시"라고 표기).
   2. 별도의 60mm 접시에서 여러 방울의 100μL 전평형 배아 배양지를 준비하여 배아 배양을 위해 (접시를 "IVC"로 표기).
   3. 배아 배양을 시작하기 전에 방울을 덮을 만큼 충분한 미네랄 오일을 조심스럽게 넣고, 5%_CO2 인큐베이터에서 최소 12시간 동안 37°C에서 배아 배양을 시작하세요.

4. 난소 채집

1. 8주에서 10주 된 암컷 C57BL/6 마우스에게 복강내 10 IU PMSG를 투여합니다.
2. PMSG 주사 후 48시간쯤에 경추 탈구로 쥐를 안락사시키고 누운 자세로 눕히세요. 복부에 70% 에탄올을 뿌려 털을 적시고 복강 안으로 들어가지 못하게 하세요.
3. 미세 해리 가위를 사용해 하복부 피부에 작은 절개를 내고, 장갑 낀 손으로 부드럽게 피부를 벌려 복막을 노출시킵니다.
4. 복막을 열고 장을 부드럽게 옆으로 밀어내세요. 자궁 뿔을 찾아 난소 쪽으로 따라가세요. 신장 근처의 난소를 확인하는데, 보통 지방 패드로 둘러싸여 있습니다.
5. 가위를 사용해 난소와 자궁 뿔을 분리하고, 과도한 결합 조직과 지방을 다듬으세요.
6. 즉시 난소를 IBMX를 보조한 미리 가열된 M2 배지로 옮기세요. 반대쪽 난소를 채취해 같은 접시로 옮기는 과정을 반복하세요.
7. 접시를 입체현미경 아래에 두고 난포 천공과 COC 채취를 진행하세요.

5. COC 수집 및 배양

1. 입체 현미경 아래, 멸균 주사기 바늘로 보이는 제골 난포를 부드럽게 찔러 M2 배지에서 COC를 방출합니다.
   참고: 쥐 GV 단계 난자를 채집할 때는 난소 표면에 눈에 띄는 큰 난포를 우선적으로 찔러 보며, 이 난포는 일반적으로 돌출되고 반투명하며 명확한 제골 공동을 가지고 있습니다.
2. 미세하게 당겨진 유리 파스퇴르 피펫을 사용해 방출된 COC를 수집하여 IBMX가 보충된 미리 예열된 M2 배지를 포함한 깨끗한 35mm 접시로 옮깁니다.
3. 필요에 따라 35mm 접시의 깨끗한 영역에 COC를 순차적으로 옮겨 분리된 과립 세포와 조직 이물질을 제거하고, 각 이송 시 이물질을 남기세요(그림 3).
   참고: 이후^{단계 9,10}에서는 세 개 이상의 조밀한 적운 세포층과 균일한 과립된 세포질 세포질 중에서 명확한 공간이 없는 COC만 사용하십시오. 탈모된 GV 난자와 부분적으로 적선에 둘러싸인 GV 난자는 이 프로토콜에서 제외됩니다. 실험 조건 하에서 암컷 쥐 한 마리당 평균 26개의 미성숙 COC가 얻어졌습니다.
4. 이물질 제거 후 COC를 IVM 세척 접시로 옮기고, 100 μL IVM 세척 매체 5방울에 순차적으로 세척합니다.
   참고: 전송 중에는 방울 간 교차 오염을 방지하기 위해 이승 부피를 최소화하세요.
5. 세척된 COC를 100 μL IVM 배지(한 방울당 20–30 COCs)에 옮겨 37°C에서 5%_CO2 에서 14시간 배양합니다.
   참고: COC를 최소한의 지연으로 IVM 배지로 채취, 세척, 옮겨 발달 잠재력을 유지하는 데 도움이 됩니다.
6. (선택 사항) IVM 후에는 COC를 1 mg/mL 히알루로니다제 소액에 잠시 배양한 후 적운 세포가 완전히 제거될 때까지 마이크로피펫으로 부드럽게 피펫팅합니다.
   참고: 히알루로니다제 노출은 3분 이내로 제한하세요. 장기간 노출하면 난자에 손상이 갈 수 있습니다.
7. (선택 사항) 탈모된 난자를 가열된 신선한 M2 배지로 세척한 후, 입체현미경으로 난자 성숙을 평가합니다.
8. (선택 사항) 첫 극체가 돌출된 난자세포는 성숙하여 중기 II(MII) 단계에 있는 것으로 간주됩니다. 첫 번째 극체가 돌출된 난자를 가진 난자 수를 배양한 난자 총수로 성숙 속도를 계산합니다.
   참고: 5.6–5.8단계는 지정된 평가 코호트를 제거하여 IVM 후 난자 성숙을 평가하는 데 사용됩니다. 이러한 절차는 IVF로 바로 진행되는 COC에는 필요하지 않습니다.

6. 정자 채취 및 준비

참고: 이 섹션은 신선한 정자의 수집과 감동에 대해 설명합니다. 수정 전에 갓 방출된 정자는 37°C의 예평형 배아 배양 배양지에서 1시간 동안 배양하여 능력 발생을 허용해야 합니다.

1. 성숙한 수컷 DBA/2 쥐 한 마리(10주에서 16주)를 안락사시키고, 그 尾부고를 제거하여 지방, 혈액, 조직액을 최대한 피하세요(그림 4).
2. 각 남성에 대해 두 개의 꼬리 부고리를 300 μL 전평형 G-IVF 배지에 옮겨 정자 방출과 감동력을 부여합니다.
3. 겸자로 꼬리부고를 고정하고, 멸균 주사기로 5에서 7번 정도 절개한 뒤 조직을 부드럽게 눌러 농축된 정자를 배출합니다.
   참고: 정자의 운동성을 평가하고, 대부분의 정자가 진행성 운동성(PR)을 보일 때만 진행할 수 있으며, 이는 능동적 전진으로 정의되며, 비진행적 운동성(NP)이나^{운동성 저하}가 아님을 의미합니다.
4. 정자 능력 발생을 위해 37°C에서 5% CO₂에 1시간 동안 배양하세요.

7. 체외 수정

1. IVM 후 14시간 후, COC를 100 μL IVF 세척 매체 5방울에 순차적으로 전달한 후, 세척된 COC를 IVF 인공수정 방울(100 μL 방울당 20–30 COC)로 옮깁니다.
2. 수정 전에 COC가 포함된 수정 접시를 37°C, 5%_CO2 에서 30분간 부양하세요.
3. 정액 후 혈구계를 사용해 정자 농도를 측정합니다.
4. 정자 농도를 바탕으로 필요한 접종량을 계산하고, 각 IVF 방적에 용량이 있는 정자를 추가하여 최종 농도는 4 × 10^{5 –1} × 10⁶ 정자/mL를 달성합니다.
   참고: 정자 추가 후에는 각 수정 드롭에 운동성 정자가 존재하는지 확인하세요.
5. COC와 정자가 포함된 IVF 접시는 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에 4–6시간 배양합니다.

8. 배아 배양

1. 4–6시간 배양 후, 난자보다 약간 큰 내경의 미세하게 당겨진 유리 파스퇴르 피펫을 사용해 추정 접합자를 최소한의 부피로 흡인하여 IVF 세척 방울로 옮깁니다.
2. 추정되는 접합자를 다섯 개의 IVF 세척 방울로 순차적으로 옮기며, 각 방울 안에 부드럽게 피펫을 넣어 과도한 정자와 이물질을 제거합니다(그림 5).
3. 세척된 추정 접합자를 IVC 세척 접시로 옮기고, 다섯 번의 예열된 배아 배양 배양 세척액을 순차적으로 세척하여 IVF 배지 이월을 최소화합니다.
4. 추정 접합자를 배아 배양 배양지 배양액에 넣고 37°C에서 5% CO₂(100 μL 방울당 20–30개의 배아)에서 배양합니다.
5. 수정 후 6–8시간에는 입체현미경으로 수컷과 암컷 전핵의 존재를 평가하고, 한쪽 극체만 유지하고 보이는 전핵이 없는 난자는 버립니다.
6. 수정 후 24시간에 2세포 배아 수를 세고 2세포 배아율을 (2세포 배아 / 수정된 난자)로 계산합니다.
7. 세어본 후에는 절단되지 않은 배아를 제거해 버리고, 남은 절단된 배아는 계속 배양합니다.
   참고: 이 단계에서 배아는 유리체화되거나, 수혜자 암컷에게 이식되거나, 배반포 단계까지 배양 상태로 유지될 수 있습니다.
8. 수정 후 96시간(hpi)까지 동일한 배양 조건에서 배양을 계속하세요. 형태학적 기준을 바탕으로 96 hpi 시점의 배반포 형성을 평가합니다.
   참고: 이 기간 동안 추가 매체 변경은 필요하지 않습니다. 정상 배아낭포는 눈에 띄는 배반구, 뚜렷한 내부 세포 덩어리, 그리고 온전한 영양배엽층의 존재로 구별됩니다.

결과

이 프로토콜을 사용하여 마우스 COC는 시험 관 내 성숙, 시험관 수정, 그리고 이후 시험 관 배아 배양을 순차적으로 처리하여, 설명된 조건 하에서 착상 전 배아의 재현 가능한 생성과 배반포 단계로 발달하는 결과를 이끌어냈습니다. IVM 14시간 후 COC는 일반적으로 적운 확장과 난자 형태가 온전함을 보였습니다. 난자 감수분열 성숙은 IVM 후 지정된 평가 코호트를 탈모하고 PB1 돌출을 점수 차림하여 정량화하였다(그림 6A). 세 개의 독립 복제 종합에서 PB1 압출률은 80.4%(41/51), 79.5%(70/88), 83.9%(47/56)로, 평균 성숙률은 81.3%±± 1.3%(평균 SEM; n = 3복제)에 해당한다. 이 프로토콜에서는 60% 미만의 성숙률이 최적이 아닌 것으로 간주됩니다. 이러한 조건에서 성숙하지 못한 난자는 일반적으로 PB1 발출이 부족하...

토론

이 프로토콜은 미성숙 COC를 이용한 마우스 난자 체외 성숙, 시험관 수정, 시험관 배양을 표준화하여, 정의된 시험관 조건 하에서 배반포 단계까지 착상 전 배아의 재현 가능한 생성 및 평가를 가능하게 합니다. 많은 연구에서 IVM 결과는 배지, 잠복 시간, 취급 방식의 실험실별 차이에 민감하게 작용하며, 이는^{IVM 이후} 발달 능력을 저하시킬 수 ^{있습니다.} 미성숙 COC를 이용한 이 IVM–IVF–IVC 프로토콜 적용은 높은 PB1 배출률(81.3%)과 2세포 비율(87.6%)을 기록했으며, 배반포 형성(52.6%)을 지원하였습니다. 이 데이터를 종합해 보면, 프로토콜이 IVM 이후 착상 전 발달을 효율적이고 재현 가능하게 지원한다는 것을 알 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150255
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150270
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8806
Breeding diet (rodent breeder chow)	Keao Xieli (Beijing,China)	N/A
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Disposable Pasteur Pipet	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
Epidermal growth factor	Gibco	PHG0313
Fine dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
Fine-tip forceps	Rhino	SW14
Follicle-stimulating hormone	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	(preequilibriated) 배양 배지
Hemocytometer	Millicell	MDH-4N1
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine)	Selleck	S5836
KnockOut Serum Replacement	Gibco	A3181501
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Luteinizing hormone	Millipore	869003
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Medium 199	Gibco	11150-059
Micropipette	Gilson	F167350
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012027
Pregnant Mare Serum Gonadotropin	Ningbo Second hormone factory (Ningbo, China)	N/A
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P4562
Stereo microscope	Olympus	SZX10
Sterile medium bottles	Nalgene	46600-586
Sterile syringe needle	BD Biosciences	309623	1 mL, 27G1/2
Syringe Filter Unit	Millipore	SLGP033R
Thermo Plate	Tokai Hit	TPi-SZX2X