친화성 초음파 및 실험적 검증을 이용한 Coptis chinensis 의 AChE 표적 항뇌성마비 성분 확인

요약

본 연구의 목적은 Coptis chinensis 의 주요 활성 성분을 규명하고, 친화성 초음파 및 실험적 검증을 통해 뇌성마비(CP) 중재에 미치는 작용을 밝히는 것이었습니다.

초록

본 연구의 목적은 Coptis chinensis 의 주요 활성 성분을 규명하고, 친화성 초음파 여과를 통해 뇌성마비(CP) 개입에 작용하는 기전을 밝히는 것이었습니다. 아세틸콜린에스터라제(AChE)를 표적으로 사용하여 C. chinensis 추출물에서 결합 능력이 가장 강한 성분으로 선별되었으며, 결합률은 21.9%이고 시험 관 내 억제 활성(IC₅₀ = 3.24 μg/mL)을 보였습니다. 분자 도킹 및 분자 동역학 시뮬레이션을 통해 코프티신이 AChE의 활성 주머니에 안정적으로 결합할 수 있음이 입증되었습니다. 이후 신생아 쥐 모델의 저산소-허혈성 뇌손상(HIBD)을 대상으로 검증 실험이 수행되었습니다. 결과는 코프티신(10 mg/kg) 개입이 모델 동물에서 공간 학습 및 기억 결핍을 유의미하게 개선하고, 손상된 반구의 뇌혈류를 증가시키며, 뇌 조직의 병리적 손상을 완화하고, 뇌 내 AChE의 비정상적인 활성화를 억제함을 보여주었습니다. 요약하자면, 이 연구는 친화성 초음파 과법을 결합하여 C. chinensis 추출물에서 확인된 코프티신이 AChE를 억제하고 신경보호 효과와 뇌혈류 개선 효과를 발휘할 수 있음을 확인했습니다. 이 약물은 C. chinensis 가 CP 유사 신경학적 결손을 완화하는 핵심 물질적 기반으로, 이를 통해 관련 약물 개발을 위한 후보 분자와 과학적 증거를 제공합니다.

서론

뇌성마비(CP)는 태아나 영아의 발달 중인 뇌에 진행성이 없게 손상되어 발생하는 영구적인 증후군으로, 주로 운동 기능 장애와 자세 이상을 특징으로 합니다. 현재 여러 임상 치료법이 존재하지만, 부작용을 최소화하면서 신경학적 결손을 근본적으로 회복할 수 있는 이상적인 약물은 여전히 부족합니다. 일반적으로 단일 표적에 작용하며 상대적으로 높은 잠재적 독성을 가진 화학적으로 합성된 약물과 달리, 전통 중의학(TCM)은 다성분, 다표적, 전체론적 조절의 장점과 장기 임상 실무에서 입증된 유리한 안전성 프로필을 통해 복잡한 뇌 질환 치료를 위한 새로운 통찰과 약물 후보의 저장소를 제공합니다^{. 2, 3, 4, 5, 6}. 따라서 TCM에서 매우 효과적이고 독성이 낮은 화학 성분을 탐구하는 것은 중요한 과학적 의미와 임상적 가치를 지닙니다^.

뇌성마비의 복잡한 병리학적 기전 중에서 콜린성 신경계 기능 장애가 중추적인 역할을 합니다 ^8,9. 아세틸콜린에스터라제(AChE)는 신경전달물질인 아세틸콜린(ACh)을 가수분해하는 핵심 효소입니다. 이 효소의 과도한 활성은 ACh 고갈을 일으키고, 콜린성 신호 전달을 방해하며, 결과적으로 운동 조절과 인지 기능 장애를 악화시킵니다. 따라서 AChE는 신경보호제 개발에 있어 중요하고 잘 확립된 약물 표적으로 부상했습니다. 시냅스 구간열에서 AChE 수치를 높이기 위해 AChE 활동을 억제하는 것은 CP 관련 신경학적 결손을 완화하는 효과적인 전략 중 하나로 인정받고 있습니다. 저산소성 허혈성 뇌손상의 맥락에서 콜린성 신경전달의 교란은 신경 기능 장애를 더욱 악화시켜 CP와 관련된 운동 및 인지 장애에 기여할 수 있습니다. 따라서 AChE는 고전적 신경기능적 표적일 뿐만 아니라, 잠재적 항CP 효과를 가진 생리활성 화합물을 스크리닝하는 기전적으로 중요한 진입점으로도 본 연구에서 선정되었습니다.

현대 연구에 따르면 약용 식물은 다양한 약리학적 활성 가치를 지닌다. 열을 배출하고 습기를 건조시키는 고전적인 전통 중국 의학인 Coptis chinensis 는 다양한 이소퀴놀린 알칼로이드가 풍부한 복잡한 시스템을 구성합니다. 잘 알려진 베르베린 외에도, 콥티신, 에피베르베린, 팔마틴, 자트로리진¹⁰과 같은 유사한 구조와 다양한 약리학적 활성을 가진 성분들을 포함하고 있습니다. 이 알칼로이드들은 C . chinensis의 약리학적 효과의 물질적 기반을 형성합니다. 이전 연구들은 C. chinensis 와 그 알칼로이드가 항염증, 항산화, 그리고 잠재적인 신경 보호 특성을 지니고 있음을 입증했습니다. 그러나 이처럼 복잡한 구성 체계를 고려할 때, 전통적인 연구 방법은 AChE를 직접 표적으로 하는 주요 활성 성분을 빠르고 정확하게 규명하기 어렵기 때문에, C. chinensis가 뇌 손상에 미치는 영향의 기전을 깊이 있게 밝히는 데 큰 제약을 가한다¹¹.

일반적인 활성 유도 분리는 반복적인 분획, 생활성 검사, 정제가 필요하며, 저품도 또는 친화도는 높은 화합물의 손실 또는 소홀할 수 있는 반면, 친화성 초여과는 복잡한 혼합물에서 표적 결합 리간드를 신속히 스크리닝할 수 있게 합니다. 이 기술은 TCM의 다성분 원유 추출물에서 특정 표적(예: AChE)에 결합하는 활성 리간드를 효율적이고 빠르게 '피싱'할 수 있게 합니다. 특히 C. chinensis와 같이 여러 알칼로이드 성분이 포함된 시스템에 적합하며, 복합 혼합물에서 표적과 직접 상호작용하는 효과적인 성분을 정확히 식별할 수^{있습니다.} 분자 도킹 및 분자 동역학 시뮬레이션 등 계산적 접근법과 결합하여, 결합 방식, 상호작용 유형, 원자 수준에서 구성 요소와 표적 단백질 간의 복잡한 안정성을 직관적으로 예측할 수 있어, 실험 스크리닝 결과에 대한 견고한 이론적 증거와 메커니즘적 설명을 제공합니다¹³.

위의 배경을 바탕으로 본 연구는 다음과 같은 과학적 가설을 제안합니다: C. chinensis에 존재하는 다양한 알칼로이드 중에는 AChE를 특이적으로 억제할 수 있는 활성 성분이 존재하며, 이 성분들이 잠재적 항뇌성마비 효과의 물질적 기반이 됩니다. 이 가설을 검증하기 위해 현대 스크리닝 기법과 약리학적 검증 방법을 통합하였습니다: 첫째, AChE를 표적으로 사용하여 친화성 초여과 기술을 사용하여 C. chinensis의 다중 알칼로이드 추출물에서 잠재적 억제제를 신속히 스크리닝했습니다; 또한 분자 도킹 및 분자 동역학 시뮬레이션을 활용해 원자 수준에서 결합 메커니즘을 명확히 했으며; 마지막으로, 선별된 성분이 CP 환자 쥐의 행동, 뇌 조직 병리학, AChE 활성에 미치는 개선 효과를 검증하기 위해 생체 내 동물 실험이 수행되었습니다.

프로토콜

모든 동물 복지 및 실험 절차는 준이 제1인민병원 실험동물복지 윤리 위원회(윤리 번호 2025-2-362)의 승인을 받았습니다. 모델링 및 치료 기간 동안 동물의 신체 상태와 생존 기록이 매일 이루어졌습니다.

C. chinensis 추출물 제제
본 연구에서는 C . chinensis 의약 재료에서 n-부탄올 분획을 가속화하기 위해 가속 용매 추출기를 사용하였습니다. C . chinensis 건조 분말 1g을 정확히 계량하여 각각 40mL 추출 셀에 넣었습니다. 금속 가스켓과 유리섬유 필터 멤브레인이 추출 셀 위아래를 차례로 배치하여 샘플을 걸러내고, 샘플은 석영 모래로 감쌌습니다. 추출 과정에서 온도와 압력은 각각 90 °C와 100 bar로 설정되었습니다. 가속 추출물을 수집한 후, 추출 용매는 회전 증발기를 이용해 건조할 때까지 증발시켜 다양한 극성 분획의 건조 추출물을 얻었다. 메탄올:물(50:50, v/v)이 재구성 용매로 선택되었습니다. 추출물은 0.45 μm 미세다공성 막을 통해 여과되어 4 °C에서 저장되었습니다. 샘플 검출 전에 AChE 내 빈 재구성 용매의 억제 활성을 조사하였습니다. 결과는 그 억제 효과가 무시할 만한 수준임을 보여주었으며, 이는 이 실험에서 재구성 용매 선택이 실험 결과에 영향을 미치지 않을 것임을 시사했다.

아세틸콜린에스터레이스 억제 분석
이 실험은 96웰 플레이트에서 수행되었습니다. 먼저 PBS를 추가했고, 이어서 AChE(0.1 U/mL)와 C. chinensis 샘플을 순차적으로 채취했습니다. 37°C에서 10분간 인큐베이킹한 후, 5.5′-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB) 염색 용액(2.5 mmol/mL)과 ATChI 기질(10 mmol/mL)을 첨가하였다. 혼합물은 37°C에서 10분간 배양되었고, 반응은 1% 도데실 황산나트륨(SDS) 60 μL을 첨가하여 종료되었다. 흡광도는 405nm에서 측정되었습니다. 각 C. chinensis 샘플은 4개의 그룹으로 구성되었습니다: 대조군 a: PBS(120 μL), AChE 용액(20 μL), DTNB 용액(40 μL), ATChI 용액(40 μL), SDS 용액(60 μL)이 순차적으로 추가되었습니다; 빈 대조군 b: PBS(120 μL), DTNB 용액(40 μL), ATChI 용액(40 μL), SDS 용액(80 μL); 샘플군 c: PBS (80 μL), C. chinensis 추출물(20 μL), AChE 용액(20 μL), DTNB 용액(40 μL), ATChI 용액(40 μL), SDS 용액(60 μL); 샘플 빈 그룹 d: PBS(100 μL), C. chinensis 추출물(20 μL), DTNB 용액(40 μL), ATChI 용액(40 μL), SDS 용액(60 μL). 초기 농도는 약 2.5 mg/mL의 양성 대조군으로 후퍼진 A를 사용했습니다. n-부탄올 분획 추출물의 초기 농도는 약 1 mg/mL였습니다. 후퍼진 A와 샘플 모두 60% 기울기로 희석되었습니다. 억제율은 다음 공식으로 계산되었습니다: 억제율 (%) = [1 - (c - d)/(a - b)] × 100%, 여기서 a, b, c, d는 각각 대조군 a, 빈 대조군 b, 표본 그룹 c, 표본 빈 그룹 d의 흡수도 값을 나타냅니다.

각 검사 농도에서의 억제율은 위에서 설명한 공식으로 계산되었습니다. 그 후 억제율을 화합물 농도의 로그에 대해 그래프로 표시하여 농도-억제 곡선을 구성했습니다. IC20, IC50, IC80 값은 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용한 비선형 회귀 적합으로 적합된 농도-반응 곡선을 기반으로 계산되었으며, 각각 AChE 활성의 20%, 50%, 80% 억제에 필요한 농도로 정의되었습니다.

친화성 초여과 분석법
친화성 초음파 여과를 통해 C. chinensis 추출물에서 AChE 결합 화합물을 선별하였습니다. 간단히 말해, 활성 효소로 AChE 용액(0.1 U/mL in PBS, pH 7.4)이 사용되었습니다. 불활성화 효소 조절은 동일한 AChE 용액을 끓는 물에 10분간 가열하여 준비했습니다. 각 반응마다 200 μL C. chinensis 추출액과 200 μL 활성 또는 불활성화 AChE 용액을 혼합하여 37 °C에서 30분간 배큐했습니다. 배양 후 혼합물을 30 kDa 초여과 원심분리관으로 옮겨 12,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리했습니다. 잔류된 효소-리간드 복합체는 동일한 원심분리 조건에서 200 μL PBS로 세 차례 세척하여 결합되지 않은 성분을 제거하였습니다. 그 후 90% 메탄올 200 μL을 첨가하여 AChE에 결합된 리간드를 해리 및 용출시키고, 10분간 배양한 뒤 12,000 × g 에서 10분간 원심분리했습니다. 용액은 수집, 여과 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석되었습니다. 활성 효소 그룹에 농축된 화합물은 비활성화된 효소 조절 물질에 비해 잠재적 AChE 결합 성분으로 간주되었다¹⁴.

주요 알칼로이드 대사산물의 HPLC 분석
크로마토그래피 분석은 4차 펌프, 오토샘플러, 컬럼 오븐, 자외선-가시광선(UV-Vis) 검출기가 장착된 HPLC 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 분리는 25°C에서 유지된 C18 크로마토그래피 컬럼(250 × 4.6 mm, 5 μm)에서 이루어졌습니다. 이동상은 아세토니트릴(A)과 암모니아 0.7% 및 트리에틸아민(B) 0.25% 트라이에틸아민(B)을 포함한 30 mmol/L 암모늄 중탄산염 용액으로 구성되었으며, 분당 1.0 mL의 유량으로 공급되었습니다. 기울기 용출 프로그램은 다음과 같았습니다: 0–15분, 90%–75% B; 15–25분, 75%–70% B; 25–50분, 70%–55% B. 주입 용량은 5 μL였으며, 자외선 검출은 270 nm 거리에서 수행되었습니다.

C. chinensis의 주요 알칼로이드에 대한 정량 분석을 위해 각 샘플(0.02g)은 정확히 무게를 재고 10mL의 염산-메탄올 용액(1:100, v/v)으로 30분간 초음파 추출하였습니다. 여과 후에는 동일한 추출 용매로 원래의 무게에 맞게 무게 손실을 보상하였고, 최종 용액은 HPLC 분석 전에 0.45 μm 막을 거쳐 필터링되었습니다. 마그노플로린, 글라우신, 자트로리진, 콜럼바민, 에피베르베린, 콥티신, 팔마틴, 베르베린 등 8가지 진짜 기준이 동일한 크로마토그래피 조건에서 분석되었습니다. 이 분석물들에 대한 보정 곡선은 기준 용액을 사용하여 구성되었습니다. 8가지 알칼로이드의 존재 수준과 검출기 반응이 상당히 달랐기 때문에, 각 분석물의 보정 범위는 모든 화합물에 동일한 폴드 희석 방식을 적용하는 대신 문헌 보고서와 예비 실험을 기반으로 개별적으로 최적화되었습니다. 따라서 선형 범위의 고농도-저농도 비율은 8개 분석 대상 간에 동일할 것으로 예상되지 않았다. 검출 한계(LOD)와 정량화 한계(LOQ)는 각각 약 3과 10의 신호 대 잡음비로 추정되었습니다.

친화성 초여과 용출물 분석의 경우, 초음파 여과 후 AChE에서 해리된 리간드를 반복 실험에서 수집하여 HPLC 분석 전에 농축하여 검출에 필요한 충분한 신호 세기를 확보하였습니다. 농축된 용출액은 위에서 설명한 동일한 HPLC 조건으로 분석되었습니다. 용출액의 크로마토그래피 피크는 8개의 진짜 기준 기준과 동일한 분석 조건에서 얻은 C. chinensis 추출물의 크로마토그래피 프로파일과의 표적 비교를 통해 할당되었습니다. 따라서 본 분석은 미지의 화합물에 대한 새로운 구조적 규명을 위한 것이 아니라, C. chinensis 의 알려진 주요 알칼로이드가 활성 효소 용액에 대해 비활성화된 효소 조절에 비해 농축되어 있는지 표적으로 규명하기 위한 것이었습니다.

분자 도킹 분석
본 연구에서는 코피신이 친화성 초음파 여과에서 AChE 결합 성분으로 가장 높은 순위로 확인되었고, 주요 알칼로이드 중 시험관 내 억제 활성이 가장 강했기 때문에 도킹 분석이 집중되었습니다. 단백질 결정은 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 수집되었습니다. 최종 도킹 수용체로 공동 결정화된 리간드를 가진 단백질 결정이 선택되었으며, 모든 표적 단백질 결정은 인간에서 유래했습니다. 수용체 파일은 PyMOL 소프트웨어를 사용해 열었고, 수용체와 리간드 파일을 분리하여 저장했습니다; 수용체는 MGLTools 소프트웨어로 개방된 후, 물 분자를 제거하고 수소 원자와 전하를 추가하고, 비극성 수소 원자를 병합하며, 국소 원자 전하를 계산하는 등 여러 작업을 거쳐 pdbqt 형식으로 저장했습니다; 리간드 파일은 MGLTools 소프트웨어로 열렸고, 수소 원자와 전하가 추가되어 pdbqt 형식 파일로 저장되었습니다; 그리드 박스를 열고, 간격을 1.000으로 설정했으며, 그리드 포인트 수를 설정하고, 박스의 중심 지점 좌표를 공동결정화된 리간드에 따라 선택하여 GPF 파일^15,16으로 저장했습니다.

화학 성분 구조는 먼저 SciFinder 데이터베이스에서 수집되어 cdx 형식으로 저장되었으며; 각 분자 3차원 구조는 ChemBio3D Ultra 모듈을 사용해 표시되었고, 에너지 최적화는 MM2 힘장으로 수행되었으며, mol2 형식으로 저장되었고 전하 매개변수는 제거되었습니다. AutoDock을 사용해 mol2 형식 파일을 MGLTools 소프트웨어로 열고, 수소 원자와 전하를 리간드에 추가했으며, 회전 가능한 화학 결합을 관찰하고 pdbqt 형식 파일로 저장했습니다. AutoDock Vina(버전 1.2.5) 모델이 분자 도킹 평가를 수행하기 위해 적용되었습니다.

분자 역학 시뮬레이션 분석
가우시안 16과 가우스뷰 6 소프트웨어가 리간드 구조 최적화를 위해 사용되었습니다. 리간드 구조의 mol2 파일을 GaussView 6에 가져오자, 작업 유형은 최적화(Optimization)로 설정되었고, 표적 분자의 상태는 바닥 상태(Ground State)로 선택되었으며, 계산 방법은 밀도 함수 이론(DFT)이었고, 스핀 중복도는 기본값 스핀(Default Spin)으로 설정되었으며, 사용된 함수는 B3LYP, 용매 모델은 IEFPCM이었습니다. 용매는 물이었어요. 분자 구조 최적화가 완료된 후, Gaussian 16을 사용해 생성된 chk 파일을 fch 파일로 변환하고, 이를 Multiwfn 소프트웨어로 가져와 리간드의 RESP 전하를 계산했습니다.

RESP 전하 계산 후, 생성된 chg 파일은 분자 역학 시뮬레이션에 필요한 리간드 위상수 파일을 생성하기 위해 sobtop_1.0(개발5) 소프트웨어로 가져왔습니다. 분자 역학 시뮬레이션은 AMBER99 힘장을 이용한 GROMACS 2019.6 소프트웨어를 사용해 수행되었습니다. 단백질 분자와 소분자의 구조 파일이 소프트웨어로 가져왔고, 주기 경계가 1.0 nm인 삼사계 박스가 설정되었으며, TIP3P 수분 모델이 채워짐에 사용되었습니다. 장거리 정전기 상호작용을 계산하기 위해 입자 메쉬 에발트(PME) 방법을 사용했으며, gmx geion 명령어를 사용해 적절한 수의 나트륨 이온과 염화물 이온을 도입하여 전체 시스템의 전하를 중화시켰습니다. 시뮬레이션은 일정한 온도인 298 K와 표준 대기압 100 kPa에서 수행되었습니다. 에너지 최소화를 위해 가장 가파른 하강법(steep)이 도입되었습니다. gmx grompp와 gmx mdrun 명령어는 NVT(등온-등경 앙상블) 평형 및 NPT(등온-등압 앙상블) 평형 상태를 10,000단계 수행하는 데 사용되었으며, 온도 결합 상수와 압력 결합 상수는 각각 0.1ps와 0.5ps로 설정되었고, 평형 시뮬레이션 시간은 100ps였습니다. 시스템이 평형에 도달한 후 시간 단계는 2 fs로 설정되었고, 복합체에 대해 10 ns 분자 동역학 시뮬레이션이 수행되었으며, 궤적 데이터는 2 ps마다 저장되었습니다. 10 ns 생산 런은 포괄적인 구조 샘플링이 아닌 도킹된 코프티신-AChE 복합체의 단기 시간 동적 평가를 제공하기 위해 탐색적 시뮬레이션 길이로 선택되었습니다. 이 설정은 도킹된 복합체가 시간이 지남에 따라 비교적 안정적인 결합 모드를 유지할 수 있는지 평가하는 데 사용되었습니다. gmx rms, gmx rmsf, gmx 자이레이트, gmx hbonds 명령어를 사용하여 평균평균근편차(RMSD), 평균제곱근 요동(RMSF), 단백질의 회전 반경, 수소 결합, 용매 접근 가능한 표면적을 계산했습니다. 결과 시각화에는 QTgrace가 사용되었습니다.

동물 실험 검증
건강한 신생아 Sprague-Dawley(SD) 쥐 새끼(출생 후 7일)를 선정하였으며, 성별 상관없이 18마리가 선정되었습니다. 모든 실험 동물은 특정 병원체가 없는 동물 실험 시설에 수용되었습니다. 이 시설은 미생물과 기생충의 침입을 효과적으로 막을 수 있는 엄격한 장벽 시스템을 갖추고 있었습니다. 주거실의 환경 매개변수는 중앙 제어 시스템에 의해 자동으로 모니터링 및 조절되었습니다: 온도 22 ± 2 °C, 상대 습도 55% ± 10%, 빛 주기는 12시간 빛/12시간 어둠 주기였습니다. 신생아 쥐 모델을 고전적인 Rice-Vannucci 방법으로 변형하여 CP의 병리학적 및 행동적 특성을 시뮬레이션하는 데 사용되었습니다.

간단히 말해, 출생 후 7일째 쥐 새끼들은 유도 시 2–3% 이소플루란, 유지 시 1–2%를 마취했습니다. 적절한 마취 후 경추 중앙 절개를 하고, 좌측 총경동맥을 신중하게 분리하여 영구 결찰하였습니다. 절개 부위를 봉합한 후, 강아지들은 1시간 동안 온열 패드 위에서 회복할 수 있도록 했습니다. 이후 모델 그룹과 코프티신 그룹의 새끼들은 8% O₂와 92% N₂가 균형 있게 포함된 챔버에서 37°C에서 2시간 동안 저산소증 허혈성 뇌손상을 유도했습니다. 가짜 수술을 한 동물들은 경동맥 결찰이나 저산소 치료 없이 동일한 마취와 외과적 노출을 받았다. 저산소증 후에는 새끼들을 암컷으로 돌려보내 실험 기간 내내 전반적인 상태, 생존 및 먹이 행동을 매일 모니터링했습니다.

실험 쥐들은 무작위로 3그룹으로 나뉘었습니다: 샴 그룹: 왼쪽 총경동맥만 결찰 또는 저산소 치료 없이 분리하고, 수술 후 동일한 양의 용매를 투여했습니다; 모델 그룹: 저산소-허혈성 뇌손상 모델링 수술이 시행되었고, 수술 후 동일한 양의 용매가 투여되었습니다; 코티신 그룹: 모델링 후 코프티신(10 mg/kg)을 가베지로 투여하였다. 코티신 용량(10 mg/kg)은 이전에 보고된 생체 내 약물동학 연구를 바탕으로 생체 내 용량으로 선정^{되었습니다.} 약물은 14일 연속 개입 기간 동안 하루 한 번, 정해진 시간에 투여되었습니다.

동물 징후 탐지
모리스 워터 미로(MWM) 시험 장비는 직경 약 150cm의 대형 원형 물웅덩이로, 수영장 벽에 뚜렷한 시각적 단서가 표시되어 있었습니다. 수영장 물은 불투명한 우유빛 흰색으로 층층화되었고, 수온은 23 ± 1 °C로 조절되었습니다. 투명한 플랫폼이 목표 사분면에 설치되어 수면 아래 1–2cm 깊이에 잠겼다. 훈련은 하루 4회 진행되었으며, 동물들은 수영장 벽을 향해 네 개의 서로 다른 진입 지점에서 물에 들어가게 했고, 동물들이 물에 들어간 후 숨겨진 플랫폼을 찾아 올라가는 데 걸리는 시간, 즉 '탈출 잠시'가 기록되었습니다. 각 훈련 세션은 60초로 제한되었습니다. 동물이 60초 이내에 플랫폼을 찾으면, 기억을 통합하기 위해 15초 동안 플랫폼에 머무를 수 있었습니다. 만약 발견되지 않으면, 동물은 부드럽게 플랫폼으로 안내되어 15초 동안 머무르도록 허용되었습니다. 7일간의 훈련 후, 숨겨진 플랫폼이 제거되었습니다. 동물들은 원래 플랫폼 맞은편 입구에서 물에 들어가 60초 동안 자유롭게 헤엄칠 수 있었고, 동물들의 헤엄치는 경로는 비디오 시스템으로 기록되었습니다. MWM 테스트를 통해 평균 탈출 지연, 목표 사분면에서 머무는 시간, 원래 플랫폼 위치를 넘는 통과 횟수 등의 지표가 기록되었습니다.

레이저 스펙클 조영 영상(LSCI) 검출을 위해: 마취 후 쥐를 입체 정체 기기에 고정시키고, 두개골을 노출시키고 촉촉하게 유지했습니다. 레이저 스펙클 혈류 영상 시스템을 사용해 두개골 바로 위 30초 동안 원시 스펙클 이미지를 지속적으로 수집했습니다. 전문 소프트웨어를 사용해 시공간적으로 변하는 스펙클 대비를 뇌혈류 관류 단위(PU) 분포 지도로 변환했습니다. 정량적 분석을 위해, 각 이미지에서 노출된 동측 반구 내에서 병변 관련 피질 관류 영역과 가시적 해부학적 랜드마크에 따라 수작업으로 구분한 피질 ROI를 선택하였고, 이 ROI 내의 평균 관류 값을 집단 간 비교에 사용하였다.

뇌 조직을 채취하고, 무게-부피 비율에 따라 미리 냉각된 PBS를 첨가했습니다. 얼음에서 기계적 균질화가 수행된 후, 4°C에서 8000 × g 에서 10–15분간 원심분리한 후 상청액을 수집하여 검사를 진행했습니다. 뇌 조직은 조직 형태를 유지하기 위해 4% 파라포름알데히드에 신속히 24시간 이상 고정되었습니다. 헤마톡실린-에오신(HE) 염색은 탈수, 투명화, 파라핀 삽입과 같은 수술을 통해 수행되었으며, 뇌손상 정도는 광학 현미경으로 관찰되었습니다.

AChE 활동 측정을 위해 손상된 (동측) 반구의 대뇌 피질을 수집하여 제조사 지침에 따라 균질화했습니다. 조직 샘플은 추출 완충제에서 균질화되고 8000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리한 후 상청액을 수집하여 분석했습니다. AChE 활성은 상업용 아세틸콜린에스터라제 활성 검사 키트(마이크로플레이트/색도 방법)를 사용하여 측정하였습니다. 이 분석법은 AChE에 의한 아세틸콜린의 가수분해 후 DTNB와의 반응으로 염색 생성물을 생성하는 방식을 기반으로 하며, 효소 활성 계산을 위해 412nm 깊이에서 흡광도를 측정했습니다. 이 키트는 기존의 항원 정량 효소 결합 면역흡착 검사(ELISA) 키트가 아닌 효소 활성 기반 색도 측정법이기 때문에, 제조사는 표준 검출 범위와 분석 감도를 제공하지 않았습니다. 본 연구에서 피질 조직에서 측정된 AChE 활성 값은 대략 25–80 nmol/min/mg 단백질 범위 내에 있었습니다.

통계 분석
모든 실험 데이터는 평균 ±표준편차(SD)로 표현되었으며 GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용해 분석되었습니다. 그룹 간 비교는 일방향 분산분석(ANOVA)을 사용한 후 Tukey의 다중 비교 검정을 사용했습니다. 모리스 워터 미로 테스트에서는 최종 훈련 결과와 탐침 실험 매개변수가 일원 ANOVA를 사용한 후 튜키의 다중 비교 테스트를 통해 분석되었습니다. P < 0.05 값은 통계적으로 유의미한¹⁸로 간주되었습니다. ROI에서 뇌 혈류 관류와 동측 대뇌 피질의 AChE 활성 간의 상관관계를 Pearson 상관분석을 통해 분석하였다. P < 0.05 값은 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다.

결과

C. chinensis 추출물 내 화학 성분 분석
알칼로이드는 C. chinensis 약재의 주요 축적 성분이자 주요 활성 성분입니다. 본 연구에서는 크로마토그래피 기술을 사용해 C. chinensis 의 주요 화학 성분을 분석하였습니다(그림 1A). 표 1에 나타난 것처럼, 8개 분석 대상 모두 각자의 보정 범위 내에서 우수한 선형성을 보였습니다. 이 알칼로이드들의 내용물과 검출기 반응이 상당히 달랐기 때문에, 각 분석물별로 보정 범위가 개별적으로 최적화되었습니다. (그림 1B). 표 1에 나타난 바와 같이, 각 화학 성분의 선형 관계, 선형 범위 및 기타 매개변수는 양호하여 C. chinensis의 화...

토론

현재 뇌 질환의 예방과 치료를 위한 다양한 방법과 기술이 개발되었습니다^{20, 21, 22}. 본 연구에서는 시험관 내 선별, 계산 시뮬레이션, 생체 내 검증의 통합 전략을 채택하여 HIBD로 인한 뇌성마비 유사 증상 개선에 있어 C. chinensis의 물질적 기초와 다중 표적 기전을 체계적으로 명확히 하였습니다. 핵심 발견은 C. chinensis에서 가장 높은 함량을 가진 베르베린 대신 특징적인 알칼로이드인 콥티신이 AChE를 강력하게 억제하여 신경보호 및 기능 개선 효과를 발휘하는 핵심 활성 성분이라는 점입니다. 이 발견은 C. chinensis가 중추신경계의 콜린성 표적에 작용하여 '열을 정화하고 화염을 배출'하는 전통...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)	CATO Research Chemicals Inc.	416046844	아세틸콜린에스터라제 억제 분석
Acetylcholinesterase (AChE)	Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd	C1682	아세틸콜린에스터라제 억제 분석
Acetylthiocholine iodide (ATChI)	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	1037408	아세틸콜린에스터라제 억제 분석
Aetonitrile	Thermo Fisher Scientific Inc	1162577	액체 크로마토그래피 이동상
AutoDock Vina	AutoDock	버전 1.2.5
Berberine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	110713-201814	화학 성분 분석
Columbamine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180712	화학 성분 분석
Coptisine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180309	화학 성분 분석
E-916 accelerated solvent extractor	Büchi Labortechnik AG, Switzerland	E916-008	n-부탄올 분획 추출
Epiberberine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180309	화학 성분 분석
Formic acid	Thermo Fisher Scientific Inc	1270563	액체 크로마토그래피 이동상
GaussView 6	Gaussian	https://gaussian.com/gaussview6/
Glaucine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180615	화학 성분 분석
Jatrorrhizine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180607	화학 성분 분석
Magnoflorine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180205	화학 성분 분석
Methanol	Thermo Fisher Scientific Inc	1162578	액체 크로마토그래피 이동상
Microporous membrane	Millipore Filter Company	2139547	추출물 여과
Palmatine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180226	화학 성분 분석
Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
PyMOL	PyMOL	https://pymol.org/
Sodium carbonate	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	15138805	아세틸콜린에스터라제 억제 분석
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	11019349	아세틸콜린에스터라제 억제 분석

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