연구 논문

태반 유래 엑소좀이 SASH1을 통해 저산소증으로 유도된 영양막 세포 사멸 및 염증 진행을 완화함

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DOI:

10.3791/71083

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2026년 8월 18일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, The Fourth Hospital of Shijiazhuang

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

SAM 및 SH3 도메인 함유 단백질 1(SASH1)은 전자간증(PE)에서 영양막 세포의 세포 사멸과 염증의 주요 조절 인자로 확인되었습니다. 태반 유래 엑소좀(P-EXOS)은 SASH1 발현을 억제함으로써 저산소증으로 인한 손상을 완화합니다. 이러한 발견은 전자간증 발병 기저의 새로운 메커니즘을 밝히며, SASH1이 잠재적인 치료 표적이 될 수 있음을 시사합니다.

초록

SASH1은 세포 성장, 세포 사멸 및 면역 조절에 관여하는 신호 어댑터 단백질로, 종양 및 면역 세포에서 점점 더 많이 연구되고 있습니다. 최근의 증거들은 SASH1이 자간전증(PE)의 발생과 밀접하게 연관된 과정인 염증 반응과 세포 항상성 유지에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 본 연구의 목적은 SASH1이 PE에서 영양막 세포 사멸과 염증 반응에 기여하는지, 그리고 P-EXOS가 SASH1 조절을 통해 보호 효과를 나타내는지 확인하는 것입니다. 본 연구에서는 세 가지 PE 관련 전사체 데이터셋(GSE75010, GSE10588, GSE60438)을 분석하여 공통적으로 차별 발현되는 유전자(DEGs)를 식별하였고, 이어서 유전자 온톨로지(GO) 및 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 농축 분석을 수행하였습니다. 또한 머신러닝 알고리즘을 적용하여 주요 후보 유전자를 선별하였으며, 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터를 사용하여 태반 조직의 세포 이질성을 특성화하고 세포 유형별 발현 패턴을 결정하였습니다. 분석 결과, SASH1이 공통 후보 유전자로 식별되었으며 PE 샘플의 영양막 세포에서 유의하게 상향 조절된 것으로 나타났습니다. In vitro 실험에서는 저산소 처리된 HTR-8/SVneo 영양막 세포 모델을 구축하고, SASH1 넉다운, SASH1 과발현 및 P-EXOS와의 공배양을 병행하였습니다. 기능 실험 결과, SASH1의 넉다운은 저산소 유도 영양막 세포 사멸을 유의하게 억제하고 IL-6, IL-1β, TNF-α를 포함한 전염증성 사이토카인의 분비를 감소시킨 반면, SASH1의 과발현은 세포 사멸과 염증 반응을 촉진하였습니다. 또한, P-EXOS 처리는 mRNA와 단백질 수준 모두에서 SASH1 발현을 현저히 감소시키고 저산소 유도 영양막 손상을 완화시켰으나, SASH1 과발현은 이러한 보호 효과를 대부분 소실시켰습니다. 종합하면, 이러한 결과들은 SASH1이 PE의 영양막 세포 사멸과 염증 반응에서 결정적인 역할을 한다는 것을 나타냅니다. P-EXOS는 SASH1 발현을 억제함으로써 저산소 유도 영양막 손상을 완화할 수 있으며, 이는 PE의 분자적 기전과 잠재적인 치료 표적에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

서론

자간전증(PE)은 일반적으로 임신 20주 이후에 발생하는 임신 특이적 다기관 장애로, 임상적으로 고혈압, 단백뇨 및 다기관 기능 장애를 특징으로 합니다. 이는 전 세계적으로 모체 및 주변기 사망률과 이환율의 주요 원인으로 남아 있습니다1. 임상 관리의 지속적인 발전에도 불구하고, PE의 결정적인 치료법은 여전히 태반의 분만이며, 이는 PE의 병인에 대한 이해가 불충분하며 새로운 분자 및 세포 메커니즘뿐만 아니라 잠재적인 치료 표적을 식별하는 것이 시급함을 강조합니다2,3.

적절한 영양막 세포 침습과 정상적인 태반 발달의 촉진은 자간전증(PE)의 발병 기전에 있어 핵심적인 메커니즘입니다4. 정상 임신 과정에서 영양막 세포는 자궁 탈락막으로 침습하여 나선동맥을 재형성함으로써 저저항 및 고용량 순환 체계를 구축합니다. 영양막 세포의 침습 및 이동 장애는 태반 관류 감소로 이어지며, 이는 지속적인 저산소 및 산화 스트레스 환경을 초래합니다. 저산소증은 세포 사멸에 직접적인 영향을 미치며, 염증성 매개체의 비정상적인 방출은 모체-태아 접점의 항상성을 파괴하여 태반 기능 부전을 더욱 악화시킵니다5. 염증 또한 PE의 중요한 유발 요인입니다. PE 환자의 태반과 말초 혈액에서 IL-17, IL-6 및 TNF-α가 현저하게 증가되어 있음이 밝혀졌습니다6. 저산소증과 염증은 서로를 강화하며 악순환을 형성하여 전신 염증을 증폭시키고 내피 세포 손상을 유발하며 태반 이상에 기여합니다. 영양막 세포 사멸과 염증 반응을 조절하는 근본적인 분자 네트워크는 여전히 상당 부분 알려지지 않은 상태입니다.

SASH1은 신호 전달 어댑터로 기능하는 세포 내 스캐폴드 단백질인 SLy/SASH1 가문의 구성원입니다7. SASH1은 주로 CRKL 및 PI3K-Akt-mTOR 경로와 같은 신호 전달 파트너와의 상호작용을 통해 상피-간엽 이행(EMT), 세포 이동 및 침윤을 억제하는 종양 억제 인자로 특성화되어 왔습니다8,9. 종양 억제 역할 외에도, SASH1이 염증 신호 전달 및 면역 조절에 참여한다는 증거들이 나타나고 있습니다7. 그러나 태반, 특히 영양막 세포 생물학 및 PE(자간전증)의 맥락에서 SASH1의 발현과 기능은 아직 조사되지 않았습니다.

엑소좀은 중요한 세포 매개체로 부상하였으며, 임신과 관련하여 점점 더 많이 연구되고 있습니다10. 엑소좀은 단백질, 지질, 비코딩 RNA를 포함한 다양한 생물학적 활성 화물을 운송하여 수신 세포의 기능을 조절합니다. 여러 증거에 따르면 P-EXOS는 임신 중 면역 조절에 결정적인 역할을 하며, 자간전증(PE)에서는 이들의 활성과 화물이 상당히 변화하여 잠재적으로 염증 상태를 심화시키는 것으로 나타납니다11. 또한 엑소좀은 산화 스트레스12 및 혈관 신생13 조절에 관여하여 임신 관련 합병증에서 잠재적으로 유익한 효과를 나타낼 수 있습니다. 하지만 자간전증에서의 분자 표적과 작용 기전은 여전히 완전히 밝혀지지 않았습니다.

SASH1이 전자간증(PE) 태반에서 조절 장애를 일으켜 영양막 세포의 세포 사멸과 염증 반응의 핵심 동인으로 작용하며, P-EXOS가 SASH1 발현을 조절함으로써 영양막 세포 손상에 대해 보호 효과를 나타낼 것이라는 가설을 세웠습니다. 이 가설을 검증하기 위해, 다수의 PE 전사체 데이터셋을 통합하고 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터에 다중 알고리즘 머신러닝을 적용하여 핵심 후보 유전자를 식별하였습니다. 저산소 처리된 HTR-8/SVneo 영양막 세포 모델과 엑소좀 기반의 중재 실험을 통해, 영양막 세포 기능 장애에서 SASH1의 기능적 역할과 PE에서 P-EXOS의 치료 가능성을 조사하였습니다.

프로토콜

윤리 성명서

본 연구는 스자좡 제4병원 윤리위원회(승인 번호 20200031)의 승인을 받았습니다. 샘플 수집 전 모든 태반 조직 기증자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 인간 대상자를 포함한 모든 절차는 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 본 프로토콜에 사용된 시약, 소모품, 장비 및 소프트웨어의 전체 목록은 재료 표에 제공되어 있습니다.

데이터 수집

RNA-seq 데이터는 GEO 데이터베이스에서 수집되었습니다. 데이터세트에는 157개의 PE 태반과 173개의 non-PE 태반의 유전자 발현 데이터가 포함된 GSE75010(N = 330)이 포함되었습니다. GSE10588에는 26개의 정상 태반과 17개의 중증 PE 태반의 유전자 발현 데이터가 포함되어 있습니다(N = 43). GSE60438에는 자간전증 환자와 정상 혈압 임신부의 기저 탈락막 전사체 프로파일링 데이터가 포함되어 있습니다(N = 125). 단일 세포 전사체 데이터는 GEO 데이터세트 GSE183338에서 수집되었습니다. 여기에는 PE 및 건강한 임신부의 융모막 융모/모체-태아 접합부에서 얻은 단일 핵 샘플이 포함되어 있습니다.

DEG 분석

PE와 관련된 DEG인 GSE75010, GSE10588 및 GSE60438 데이터셋을 먼저 전처리하고 정규화하였습니다. 그 후, 샘플 그룹화 정보를 바탕으로 R 패키지 “limma”14를 사용하여 차이 분석을 수행하였습니다. p < 0.05 및 |log2FC| > 0.5인 유전자를 선택하였습니다. DEG의 화산 플롯(volcano plot)은 R 패키지 ggplot2를 사용하여 생성하였습니다. 상위 20개 DEG의 히트맵은 R 패키지 pheatmap을 사용하여 그렸습니다. 이어서 세 데이터셋에서 선택된 DEG의 교집합을 구하였고, 상호작용 점수(interaction score) ≥0.15를 기준으로 온라인 플랫폼 STRING을 사용하여 후보 유전자에 대한 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 구축하였습니다. 이 PPI 네트워크에서 연결 정도(degree of connectivity)를 기반으로 상위 20개 허브 유전자를 추가로 식별하였으며, Cytoscape 소프트웨어를 사용하여 순위를 매겼습니다. PPI 네트워크 결과는 Cytoscape 소프트웨어 또는 STRING을 사용하여 시각화하였습니다.

농축 분석

유전자 농축 분석은 Metascape 웹사이트와 함께 ClusterProfiler 및 DOSE 패키지를 사용하여 수행되었습니다. 데이터베이스는 GO 및 KEGG에서 가져왔습니다. 농축 분석은 “EnrichGO” 함수를 사용하여 수행되었습니다. p < 0.05인 경로는 유의미하게 농축된 것으로 간주되었습니다. 농축 결과는 “ggplot2” 및 “ggpubr” 패키지를 사용하여 시각화하였습니다.

머신러닝

PE와 관련된 견고하고 생물학적으로 의미 있는 DEG를 식별하기 위해, 공개 transcriptome 데이터셋인 GSE60438(플랫폼: GPL6884)을 기반으로 다중 모델 머신러닝 특성 선택 분석을 수행하였다. 이 데이터셋은 제왕절개술 시 수집된 자간전증 및 정상 혈압 임신부의 decidua basalis 샘플에 대한 발현 프로파일링을 포함하고 있다. 사전 필터링된 DEG를 표준화하였으며, 모델 편향을 줄이고 특성 선택의 안정성을 높이기 위해 발현 매트릭스와 그에 해당하는 임상 그룹 정보를 네 가지 서로 다른 머신러닝 알고리즘의 입력값으로 사용하였다.

네 가지 알고리즘이 특정 순서 없이 동시에 적용되었습니다. LASSO는 “glmnet” 패키지를 사용하여 회귀 분석을 수행하고 중요한 특징 유전자를 선택하는 데 사용되었습니다. 손실 함수에 L1 정규화 항을 추가하여 덜 중요한 특징의 계수를 0으로 축소함으로써 특징 선택을 구현하였습니다. SVM-RFE는 “e1071” 패키지를 사용하여 재귀적 특징 제거 기능이 포함된 서포트 벡터 머신을 구축하였습니다. 먼저 SVM을 사용하여 분류기를 학습시킨 후, 특징 가중치를 기반으로 정보량이 가장 적은 특징들을 반복적으로 제거하여 최적의 특징 서브셋을 도출하였습니다. XGBoost는 “xgboost” 패키지를 사용하여 여러 개의 결정 트리를 구축하는 데 적용되었습니다. 각 트리는 이전 트리의 잔차를 적합시켰으며, 가중치가 적용된 출력값들을 누적하여 최종 예측값을 얻었습니다. Boruta는 “randomForest” 패키지를 사용하여 수행되었으며, 랜덤 포레스트 학습 과정에서 실제 특징과 경쟁하는 섀도우 특징(shadow features)을 생성하였습니다. 무작위 노이즈보다 중요도 값이 유의하게 높은 특징들만이 유지되었습니다.

단일 세포 전사체 데이터 분석

단일 세포 전사체 데이터는 GEO 데이터베이스에서 얻었으며, GSE183338에서 raw count matrix를 추출하였다. count matrix는 Seurat 패키지의 “Read10X” 함수를 사용하여 가져온 후 dgCMatrix 형식으로 변환하였다. 개별 객체들은 “merge” 함수를 사용하여 하나의 통합 객체로 병합하였으며, “RenameCells”를 통해 세포 라벨을 고유하게 설정하였다. 저품질 세포는 다음과 같은 기준으로 필터링하였다: 3개 미만의 세포에서 발현된 유전자는 제거하였고, 200개 미만의 유전자를 발현하는 세포는 제외하였다. 품질 관리를 거친 세포를 정규화하고 고변동성 유전자를 식별하였다. “LogNormalize”(scale factor = 10,000)를 사용하여 전역 스케일링 정규화를 적용하였고, “FindVariableFeatures”를 통해 고변동성 유전자(n = 2,000)를 선택하였으며, “ScaleData”를 사용하여 데이터를 스케일링하였다. 고변동성 특성에 대해 주성분 분석을 수행하였으며, 상위 30개의 주성분을 유지하였다. 샘플 간의 배치 효과는 Harmony 방법을 사용하여 보정하였다. UMAP을 사용하여 세포를 시각화하고 차원을 축소하였다. Louvain 알고리즘 기반의 “FindNeighbors”와 “FindClusters”를 사용하여 공유 최근접 이웃 그래프를 구축하였다. “FindClusters”의 resolution 파라미터는 0.1에서 1 사이에서 최적화하였다. “clustree” 함수를 사용하여 클러스터링 트리를 시각화하였으며, 세포 클러스터를 정의하기 위해 0.9의 resolution을 선택하였다. Scrublet 알고리즘을 사용하여 잠재적 더블릿(doublets)을 제거하였다. “FindAllMarkers” 함수를 사용하여 차등 발현 마커 유전자를 식별함으로써 세포 클러스터의 주석을 달았다. Bonferroni 보정을 적용한 비모수적 Wilcoxon 순위합 검정을 사용하였다. 세포 정체성은 표면 마커, 관련 문헌 및 Cell Classification Database15를 기반으로 할당하였다.

세포 배양

영양막 세포주 HTR-8/SVneo 세포를 10% fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 저산소 조건은 세포를 1% O₂, 5% CO₂, 94% N₂ 환경에서 24 h 동안 배양하여 조성하였으며, 정상산소 대조군은 20% O₂ 및 5% CO₂ 환경에서 유지하였다16. 모든 세포 배양 과정은 무균 조작법을 사용하여 Class II 생물안전작업대 내에서 수행해야 한다. 배양 배지, 형질전환 시약 및 세포 폐기물은 기관의 생물안전 지침에 따라 폐기해야 한다.

세포 형질전환

sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 및 OE-NC를 포함하는 플라스미드를 합성하였다. HTR-8/SVneo 세포를 6-well 플레이트에 웰당 5 × 105 cells 밀도로 분주하였다. 이어서 제조사의 지침에 따라 transfection 시약을 사용하여 웰당 2 µg의 sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 또는 OE-NC 플라스미드를 세포에 transfection하였다. 간단히 설명하면, 플라스미드 DNA와 P3000 Reagent를 Opti-MEM에 희석하고, 이를 별도로 Opti-MEM에 희석한 Lipofectamine 3000과 혼합한 후 실온에서 15 min 동안 배양하여 70–80% confluency 상태의 세포에 첨가하였다. transfection 48시간 후, RT-qPCR과 Western blot을 통해 SASH1 발현을 평가하였다. SASH1 knockdown에 사용된 shRNA 표적 서열은 Supplementary Table 1에 나열되어 있다.

실시간 정량 PCR

HTR-8/SVneo 세포에서 총 RNA를 추출하고, 역전사 키트를 사용하여 42 °C에서 30분, 이어서 85 °C에서 5분 동안 cDNA로 역전사하였다. 실시간 정량 PCR (qPCR)은 SYBR Green master mix를 사용하여 다음과 같은 사이클 조건으로 수행하였다: 95 °C에서 10분, 이어서 95 °C에서 15초와 60 °C에서 1분을 40회 반복하였다. 상대적 mRNA 발현량은 β-actin을 내부 표준 물질로 하여 ΔΔCt 방법으로 계산하였다. 본 실험에 사용된 프라이머 서열은 부록 표 2(Supplementary Table 2)에 나열되어 있다.

웨스턴 블롯 분석

라이시스 버퍼(lysis buffer)를 사용하여 HTR-8/SVneo 세포로부터 총 단백질을 추출하였습니다. 세포 용해물을 수집하여 얼음 위에서 배양한 후, 4 °C에서 12,000 × g로 30분 동안 원심 분리하여 불용성 찌꺼기를 제거하였습니다. 단백질 농도는 분광광도계를 사용하여 측정하였습니다. 동일한 양의 단백질(50 µg)을 SDS-PAGE로 분리한 후 PVDF 막으로 전이시켰습니다. 막을 5% 무지방 우유로 블로킹하고 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하였습니다. 세척 후, 막을 해당 2차 항체와 함께 배양하였으며, 단백질 밴드는 강화 화학 발광(enhanced chemiluminescence) 검출 시스템을 사용하여 시각화하였습니다.

단백질 검출을 위해 anti-SASH1 및 β-actin을 1차 항체로 사용하였다. 이에 적합한 HRP(horseradish peroxidase) 접합 2차 항체인 goat anti-rabbit 및 goat anti-mouse를 이용하였다. 단백질 로딩 양이 동일함을 보장하기 위해 β-actin을 내부 로딩 대조군으로 사용하였다. 단백질 밴드의 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하고 정량화하였다.

P-EXOS의 분리

P-EXOS는 선택적 제왕절개술을 받는 건강한 여성의 만삭 태반에서 얻은 태반 융모 조직으로부터 분리하였다. 태반 융모 조직을 멸균 PBS로 충분히 세척한 후, 약 1 mm3 크기의 조각으로 잘게 자르고, 10% exosome-depleted FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 조건화 배지를 다음과 같이 차등 원심분리하였다: 모든 과정은 4 °C에서 진행하였으며, 세포 및 조직 파편을 제거하기 위해 300 × g에서 10분간, 세포 파편을 제거하기 위해 2,000 × g에서 20분간, 그리고 미세소포를 제거하기 위해 10,000 × g에서 30분간 원심분리하였다. 얻어진 상층액을 4 °C에서 120,000 × g로 70분간 초원심분리하여 엑소좀 펠릿을 형성시켰다. 펠릿을 PBS로 한 번 세척한 후, 4 °C에서 120,000 × g로 70분간 다시 초원심분리하였다. 최종 펠릿을 PBS에 재현탁하였다. 분리된 엑소좀은 엑소좀 마커(PLAP, CD63, TSG101 및 음성 대조군인 GM130)에 대한 Western blot 분석을 통해 특성을 확인하였으며, 형태학적 관찰을 위해 투과전자현미경으로 추가 분석하였다.

P-EXOS 세포 섭취 실험

P-EXOS의 세포 내 유입을 확인하기 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 친유성 막 염색약인 PKH67로 엑소좀을 형광 표지하였다. 간단히 설명하면, P-EXOS를 Diluent C에 희석된 PKH67 (4 µM)와 함께 실온에서 5분 동안 반응시킨 후, 동일한 부피의 1% bovine serum albumin (BSA)를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 결합되지 않은 염색약을 제거하기 위해 표지된 엑소좀을 초원심분리(120,000 × g, 70 min, 4 °C)하여 재분리하였다. 그 후 PKH67로 표지된 P-EXOS (50 µg/mL)를 HTR-8/SVneo 세포에 첨가하고 정상 산소 또는 저산소 (1% O₂) 조건에서 24시간 동안 공동 배양하였다. 이후 세포를 PBS로 3회 세척하고 4% paraformaldehyde로 15분 동안 고정한 뒤, DAPI (1 µg/mL)로 핵을 대조 염색하였다. PKH67로 표지된 엑소좀의 세포 내 유입은 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM; excitation 490 nm, emission 502 nm)으로 관찰하였다. 기능적 공동 배양 실험을 위해, HTR-8/SVneo 세포를 10% exosome-depleted FBS가 첨가된 완전 RPMI-1640 배지에서 50 µg/mL (단백질 등량) 농도의 P-EXOS와 함께 저산소 조건 (1% O₂)에서 24시간 동안 처리하였다.

효소결합 면역흡착 분석법 (ELISA)

세포 배양 상층액을 수집하고, 제조사의 지침에 따라 IL-6 ELISA 키트, IL-1β ELISA 키트 및 TNF-α ELISA 키트를 사용하여 각각 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 수치를 측정하였다. 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 측정하였으며, 표준 곡선을 통해 실제 농도를 산출하였다.

TdT 매개 dUTP 닉-엔드 라벨링 (TUNEL)

제조사의 지침에 따라 TUNEL assay kit를 사용하여 세포 사멸 세포를 검출하였다. 간단히 설명하면, 세포를 4% paraformaldehyde로 실온에서 15분 동안 고정하고, PBS에 희석한 0.1% Triton X-100로 얼음 위에서 5분 동안 투과화한 후, TUNEL 반응 혼합물과 함께 37 °C의 암소에서 60분 동안 배양하였다. 핵은 DAPI로 대조 염색하였으며, TUNEL 양성 세포는 형광 현미경을 통해 시각화하고 샘플당 무작위로 선택한 최소 5개 시야에서 TUNEL 양성 세포의 비율을 계산하여 정량화하였다.

통계 분석

모든 데이터는 R 및 GraphPad Prism을 사용하여 분석되었습니다. 연속 변수는 평균 ±SD로 나타냈습니다. 두 집단 간 비교는 Student’s t-test를 사용하여 수행하였으며, 여러 집단 간 비교는 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey의 사후 검정을 실시하였습니다. 범주형 변수의 통계적 유의성은 카이제곱 검정(Chi-square test) 또는 Fisher의 정확 검정(Fisher’s exact test)으로 평가하였습니다. 별도로 명시되지 않는 한, 분자 간 상관관계는 Spearman 상관 분석을 사용하여 계산하였습니다. 엑소좀 특성 분석 실험은 세 명의 독립적인 태반 기증자로부터 분리한 P-EXOS를 사용하여 수행되었습니다. 세포 기반 실험은 서로 다른 계대의 HTR-8/SVneo 세포를 사용하여 별도의 시점에 수행된 독립적인 실험을 나타내는 세 번의 독립적인 생물학적 반복 실험으로 진행되었으며, 각 반복 실험에는 서로 다른 태반 기증자로부터 분리한 P-EXOS를 사용하였습니다. p < 0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였습니다.

결과

건강한 환자 및 PE 환자의 전사체 분석

정상(Normal) 그룹과 PE 환자 간의 유전자 발현 차이를 확인하기 위해, 병합된 데이터셋에서 R 패키지 limma를 사용하여 차등 발현 분석을 수행하였습니다. GSE75010의 경우 총 89개의 DEG(p < 0.05 및 |log2FC| > 0.5)가 식별되었으며, 이 중 69개 유전자는 발현이 증가하였고 20개 유전자는 발현이 감소하였습니다(그림 1A). 또한 2,097개의 차등 발현 유전자가 있었으며, 그 중 1,121개는 발현이 증가하고 976개는 발현이 감소하였습니다(그림 1B). GSE60438 데이터셋에서는 3,371개의 발현 증가 유전자와 4,262개의 발현 감소 유전자를 포함하여 총 7,633개의 DEG가 나타났습니다(그림 1C). 세 데이터셋 간의 DEG 수에서 나타나는 상당한 차이는 표본 크기, 조직 기원(태반 융모 vs. 기저 탈락막) 및 PE 중증도 분류의 차이를 반영하는 것으로 보이며, 이는 강건한 공통 DEG를 식별하기 위해 데이터셋 간의 교집합을 구하는 것이 가치 있음을 더욱 강조합니다.

DEG의 기능적 풍부도 분석

PE와 관련된 주요 DEG를 체계적으로 식별하기 위해 GSE75010, GSE10588 및 GSE60438 PE 데이터셋의 DEG에 대해 벤 다이어그램 분석을 수행하였으며, 최종적으로 56개의 공통 DEG를 식별하였습니다(그림 2A). 온라인 플랫폼인 STRING(상호작용 점수 ≥0.15)을 사용하여 이 56개의 공통 DEG에 대한 PPI 네트워크를 구축하였으며, Cytoscape 소프트웨어를 사용하여 네트워크 내 연결 정도에 따라 순위를 매겨 상위 20개의 허브 유전자를 추가로 식별하였습니다(그림 2B). 이러한 유전자들을 바탕으로 BP, CC 및 MF에서의 잠재적 기능을 탐색하기 위해 GO 농축 분석을 수행하였습니다(그림 2C). DEG는 호르몬 분비 및 transmembrane receptor serine/threonine kinase 신호 전달 조절에서 가장 많이 농축되었습니다. 세포 측면에서 이 유전자들은 주로 초점 부착, 세포-기질 접합, 그리고 다양한 소포 및 리소좀 관련 유전자에 위치하였습니다. 분자 기능에서는 prolyl hydroxylase 활성, 호르몬 활성 및 지질 관련 분자의 transmembrane 수송이 농축된 항목이었습니다. 이러한 결과는 DEG가 태반 세포 신호 전달, 세포-기질 상호작용 및 내분비 관련 기능 유지에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 동시에 KEGG 경로 농축 분석 결과, DEG는 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용, 세포 접착 분자 상호작용, 그리고 TGF-β 및 HIF-1 신호 전달 경로에서 가장 많이 농축되는 것으로 나타났습니다(그림 2D). 특정 바이러스 관련 항목(예: Hepatitis viruses, Ebolavirus)의 농축은 PE와의 직접적인 생물학적 연관성보다는 공유된 면역 조절 유전자와의 비특이적 중복을 반영할 가능성이 높으므로, 해석의 초점은 염증, 접착 및 저산소증 관련 경로에 둡니다. 이러한 경로들은 염증 반응, 세포 접착 매개 및 저산소증 관련 신호 전달과 관련이 있으며, 태반 미세환경의 면역 염증 상태와 세포 간 소통을 변화시킴으로써 PE 진행에 영향을 미칠 수 있습니다.

머신러닝을 통해 PE의 핵심 유전자로 SASH1을 식별함

주요 예후 유전자를 식별하기 위해, 특징 선택(feature selection)을 위한 네 가지 머신러닝 방법이 적용되었습니다. 교차 검증을 통한 LASSO 회귀 분석 결과, log(λ.min) = -3.8075일 때 모델이 최소 교차 검증 오차를 달성하는 것으로 나타났습니다. 이 λ 값에서 0이 아닌 계수를 가진 유전자들이 LASSO에 의해 식별된 핵심 특징으로 선택되었습니다(그림 3A–B). Boruta 알고리즘은 섀도 특징(shadow features)과의 비교를 통해 특징 중요도를 평가합니다. 중요도 값이 shadowMax보다 높은 유전자는 'Confirmed'로 표시되어 핵심 후보 유전자로 간주되었으며, 중요도 값이 shadowMin보다 낮은 유전자는 'Rejected'로 표시되어 유의미한 기여도가 없는 것으로 간주되었습니다. 이 두 임계값 사이의 유전자는 'Tentative'로 표시되어 잠재적이지만 불확실한 중요성을 가짐을 나타냈습니다(그림 3C). SVM-RFE 분석에서는 40–50개의 특징이 유지되었을 때 교차 검증 정확도가 최고 또는 최고에 근접한 수준에 도달하여, 해당 특징 규모에서 최적의 예측 성능을 보임을 시사했습니다(그림 3D). 보통 수준의 교차 검증 정확도(~0.6)는 이 데이터셋에 대해 단일 알고리즘만으로는 최적으로 작동하지 않았음을 나타내며, 이에 따라 특징 선택의 강건성을 높이기 위해 다중 알고리즘 교집합 전략이 채택되었습니다. XGBoost는 Gain 값을 사용하여 유전자의 상대적 중요도를 정량화함으로써 모델 예측에 더 많이 기여하는 특징들을 식별하였습니다(그림 3E). 네 가지 방법의 결과를 벤 다이어그램 교집합 분석으로 확인한 결과, SASH1이 유일하게 중복되는 유전자로 식별되었습니다. SASH1은 Boruta 알고리즘에서는 'Tentative'로 분류되었으나, 나머지 세 가지 알고리즘 모두에서 일관되게 선택되었으므로 합의된 후보 유전자로 지정하는 근거가 되었습니다(그림 3F).

단일 세포 분석

자간전증(PE) 태반 조직의 세포 이질성과 분자적 과정을 조사하였다. 검출된 유전자 수, RNA 카운트 수 및 미토콘드리아 유전자 발현 비율을 기준으로 세포 품질 필터링을 수행하였다. 후속 분석을 위한 고품질 단일 세포 샘플을 확보하기 위해 저품질 세포(검출된 유전자가 200개 미만이거나 미토콘드리아 유전자 함량이 20% 초과인 세포)를 제거하였다. 품질 관리 지표 및 고변동성 유전자의 식별 결과는 다음에서 확인할 수 있다. 부록 그림 1A–B정규화 및 고변동성 유전자 식별 후, 상위 2,000개의 고변동성 유전자를 사용하여 주성분 분석(PCA)을 수행하였으며, JackStraw 분석과 ElbowPlot 분석을 통해 유의미한 주성분을 선정하였다.부록 그림 2A–B).

주성분 분석을 바탕으로, 차원 축소 및 비지도 클러스터링을 수행하기 위해 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP)을 사용하였으며, 모든 세포를 22개의 클러스터로 분류하여 태반 조직의 높은 세포 이질성을 확인하였습니다(Figure 4A). 클러스터 특이적 마커 유전자 발현을 분석하고 히트맵에 DEG를 시각화하여(Figure 4B), 각 클러스터를 표준 마커 기반으로 주석 처리한 후 UMAP 임베딩에 다시 투영하였습니다(Figure 4C). 이를 통해 B 세포/형질 세포, 혈관 내피 세포, 섬유아세포/기질 세포, 대식세포/수지상 세포, 자연 살해 세포, T 세포 및 영양막 세포를 포함하는 주요 태반 세포 집단을 식별하였습니다. 대조군과 PE 군을 비교한 결과, 여러 유형의 세포가 PE 태반에서 상당한 상대적 분포 변화를 보였으며, 이는 태반 미세환경의 리모델링이 일어났음을 시사합니다(Figure 4D).

조직 기원과 질병 상태를 사용하여 조직 소스(탈락막 vs. 융모) 및 질병 그룹(대조군 vs. PE)에 따른 동일한 UMAP 임베딩 내의 세포를 추적하였습니다(그림 4E). 세포 수 분포는 조직 기원에 따라 일부 분리되었으나, 서로 다른 질병 그룹의 세포들은 매우 밀접하게 연결되어 있었습니다. 이는 PE가 전체 전사체 구조를 실질적으로 재구성하지는 않지만, 개별 세포 집단이나 특정 분자적 특성에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 태반 세포 집단 간의 분포를 탐색하기 위해 SASH1 발현을 UMAP에 매핑하였습니다(그림 4F–G). SASH1은 강한 세포 유형 특이적 발현을 보였으며, 탈락막 세포 집단과 융모 세포 집단 사이에 뚜렷한 차이가 있었습니다. 여러 세포 유형에 걸쳐 PE 그룹과 대조군 간의 SASH1 발현을 통계적으로 비교한 결과(Wilcoxon 순위합 검정), 다수의 태반 세포 집단에서 유의미한 차이가 나타났으며, 특히 PE 샘플의 영양막 세포에서 가장 두드러진 증가가 관찰되었습니다(그림 4H). 이러한 결과는 SASH1의 조절 장애가 특히 영양막 구획에서 두드러진다는 단일 세포 수준의 근거를 제공하며, 후속 기능 실험을 위해 HTR-8/SVneo 영양막 세포주를 사용하는 것을 뒷받침합니다.

SASH1 넉다운은 저산소증으로 유도된 영양막 세포의 세포사멸 및 염증 반응을 억제한다

생물정보학적 예측을 검증하기 위해 저산소 조건(1% O2)에서 PE 관련 영양막 세포 모델을 구축하였습니다. SASH1 발현을 평가하기 위해 qPCR 및 Western blot 분석을 수행하였습니다(Figure 5A–B). 정상 산소 조건의 HTR-8/SVneo 세포와 비교했을 때, 저산소 처리된 세포에서는 SASH1 mRNA 및 단백질 발현 수준이 유의하게 증가하여 생물정보학적 결과에 대한 예비 실험적 검증을 제공하였습니다. SASH1 넉다운이 PE 관련 병리 과정에 미치는 영향을 평가하기 위해, 저산소 처리된 HTR-8/SVneo 세포에서 SASH1을 침묵시켰습니다. Quantitative PCR 및 Western blot 분석(Figure 5C–D) 결과, 모든 sh-SASH1 군에서 sh-NC 군에 비해 SASH1 발현이 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다. 그 중 sh-SASH1#3가 가장 높은 넉다운 효율을 보여 이후 실험에 선정되었습니다. TUNEL 염색 및 ELISA는 정상 산소 대조군(Normal), 음성 대조군 shRNA가 포함된 저산소군(Hypoxia + sh-NC), SASH1 넉다운이 포함된 저산소군(Hypoxia + sh-SASH1)의 세 가지 조건에서 수행되었습니다. Normal 군과 비교하여 Hypoxia + sh-NC 군은 세포 사멸이 유의하게 증가하고 전염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 분비가 증가하여, 저산소로 유도된 영양막 손상을 확인하였습니다. SASH1 넉다운은 이러한 효과를 현저히 완화하여 세포 사멸(Figure 5E)과 사이토카인 수치(Figure 5F)를 Normal 군에 근접한 수준으로 감소시켰으며, 이는 SASH1 넉다운이 저산소로 유도된 영양막 세포 사멸 및 염증 반응을 상당 부분 회복시킬 수 있음을 시사합니다. SASH1의 인과적 역할을 추가로 규명하기 위해 기능 획득(gain-of-function) 실험을 수행하였습니다. qPCR 및 Western blot을 통해 HTR-8/SVneo 세포에서 SASH1 과발현이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였습니다(Figure 5G–H). 정상 산소 조건에서 SASH1 과발현(OE-SASH1)은 OE-NC 군에 비해 영양막 세포 사멸과 전염증성 사이토카인 분비를 유의하게 증가시켜 저산소 유도 표현형을 재현하였습니다(Figure 5I–J). 종합적으로, 기능 상실 및 기능 획득 데이터는 SASH1이 영양막 세포 사멸과 염증 반응을 유도하는 데 필요하고 충분함을 입증하며, PE 관련 병리에서의 인과적 역할을 확인해 줍니다.

P-EXOS는 SASH1을 조절함으로써 저산소증으로 유도된 영양막 세포의 세포 사멸 및 염증 반응을 억제한다

P-EXOS는 PE에서 잠재적인 치료 가치가 있는 것으로 간주됩니다. 본 연구의 생정보학 분석 결과, SASH1이 엑소좀 관련 신호 전달 경로와 연관되어 있음이 시사되었으며(GO 및 KEGG 풍부도 분석 결과, 그림 2C–D), 이를 통해 P-EXOS가 SASH1을 조절함으로써 PE에서 보호 효과를 나타낼 수 있다는 가설을 세웠습니다. 기능 연구에 앞서, 분리된 P-EXOS의 특성을 먼저 분석하였습니다. 웨스턴 블롯 분석 결과, 엑소좀 마커 단백질인 PLAP, CD63, TSG101의 존재가 확인된 반면, 골지 마커인 GM130은 발현되지 않아 분리된 소포체의 순도가 높음을 나타냈습니다. 투과 전자 현미경 분석을 통해 전형적인 컵 모양의 소포체 구조를 추가로 확인하였습니다(그림 6A–B). P-EXOS가 표적 세포 내로 효율적으로 내입되는지 확인하기 위해, 면역형광 염색을 수행하여 P-EXOS의 세포 내 흡수를 평가하였습니다. 대조군과 비교하여 P-EXOS 처리된 HTR-8/SVneo 세포는 병합 이미지에서 뚜렷한 공동 국소화 신호를 보였으며, 이는 P-EXOS가 HTR-8/SVneo 세포 내로 효과적으로 내입되었음을 나타냅니다(그림 6C).

이어서, 저산소 조건 하에서 HTR-8/SVneo 세포를 P-EXOS와 공동 배양하였다. quantitative PCR 및 Western blot 분석 결과, 대조군에 비해 P-EXOS 처리군에서 SASH1 mRNA 및 단백질 수준이 뚜렷하게 감소한 것이 확인되었으며(Figure 6D–E), 이는 P-EXOS와 SASH1 사이의 조절 상호작용에 대한 기초적인 근거를 제공한다. 이러한 분자적 변화와 일치하게, TUNEL 염색 결과 P-EXOS 처리 후 HTR-8/SVneo 세포에서 저산소 유도 세포사멸이 상당히 완화되었음을 보여주었다(Figure 6F). 동시에, ELISA 분석을 통해 IL-6, IL-1β 및 TNF-α를 포함한 염증성 사이토카인의 분비가 현저히 감소했음을 입증하였다(Figure 6G).

P-EXOS의 보호 효과가 기전적으로 SASH1 억제에 의존하는지 확인하기 위해, 저산소 조건에서 rescue 실험을 수행하였습니다. SASH1을 과발현시킨 세포(OE-SASH1 + P-EXOS)를 음성 대조군 세포(OE-NC + P-EXOS)와 비교하였습니다. OE-NC + P-EXOS 그룹과 비교했을 때, SASH1 과발현은 세포 사멸 증가(Figure 6H) 및 전염증성 사이토카인 분비 증가(Figure 6I)로 입증된 바와 같이 P-EXOS의 보호 효과를 유의미하게 상쇄시켰습니다. 이러한 결과는 P-EXOS의 보호 효과가 병렬 경로가 아닌 SASH1의 억제를 통해 특이적으로 매개됨을 보여주며, PE 치료에 있어 P-EXOS의 치료적 잠재력을 강조합니다.

데이터 가용성:

본 연구의 결과를 뒷받침하는 데이터 세트는 공개되어 있으며 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 액세션 번호 GSE75010, GSE10588, GSE60438 및 GSE183338로 획득하였습니다. 세포 유형 주석 작업은 Cell Classification Database(https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/)를 참고하여 수행되었습니다. 편집되지 않은 Western blot 이미지와 본 연구의 결과를 뒷받침하는 모든 기타 원시 실험 데이터는 보충 원시 데이터(Supplementary Raw Data) 폴더에 제공됩니다.

화산 플롯과 히트맵 다이어그램이 서로 다른 데이터셋에서의 유전자 발현 분석 결과를 보여준다.
그림 1: 세 개의 독립적인 데이터셋에서 PE 태반 및 탈락막 조직의 DEG 식별. (A) 통합된 GSE75010 데이터셋의 PE 태반 샘플 157개와 비-PE 태반 샘플 173개 사이의 DEG 화산 플롯. (B) GSE10588 데이터셋의 중증 PE 태반 샘플(n = 17)과 정상 태반 샘플(n = 26) 사이의 DEG 화산 플롯. (C) GSE60438 데이터셋의 PE 탈락막 샘플과 정상 혈압 대조군 탈락막 샘플 사이의 DEG 화산 플롯. DEG는 p < 0.05 및 |log2FC| > 0.5를 사용하여 식별되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

벤 다이어그램, 네트워크 그래프, 코드 다이어그램; 유전자 발현 분석, 단백질 상호작용 매핑.
그림 2: 전자간증과 관련된 공통 DEG의 기능적 풍부도 및 PPI 분석. (A) PE 관련 데이터셋 GSE75010, GSE10588, GSE60438에서 확인된 DEG의 벤 다이어그램. (B) Cytoscape 소프트웨어를 사용하여 연결 정도에 따라 순위를 매겨 56개의 공통 DEG 중에서 선정된 상위 20개 허브 유전자의 PPI 네트워크 (STRING 상호작용 점수 ≥0.15). (C) 공통 DEG의 GO 및 KEGG 풍부도 분석 결과가 막대 그래프로 제시됨. (D) 공통 DEG의 GO 및 KEGG 풍부도 분석 결과가 코드 다이어그램으로 제시됨. 여기에서 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

유전자 선택 방법; LASSO, XGBoost, SVM, Boruta 결과; 비교 데이터 분석 차트.
그림 3: 전자간증과 관련된 후보 허브 유전자의 머신러닝 기반 스크리닝. (A) 후보 유전자의 계수 프로파일을 보여주는 LASSO 회귀 분석. (B) 교차 검증을 이용한 LASSO 회귀의 최적 정규화 매개변수 (λ) 선택. (C) Boruta 알고리즘. (D) SVM-RFE 분석. (E) XGBoost 알고리즘. (F) LASSO, Boruta, SVM-RFE 및 XGBoost 알고리즘에 의해 식별된 후보 유전자의 교집합을 보여주는 벤 다이어그램. 약어: LASSO = least absolute shrinkage and selection operator; SVM-RFE = support vector machine recursive feature elimination. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

세포 유형 데이터 분석 및 분포를 보여주는 UMAP 클러스터링 다이어그램 및 유전자 발현 히트맵.
그림 4: 단일 세포 전사체 분석을 통해 밝혀진 자간전증에서의 세포 유형 특이적 SASH1 발현 패턴. (A) 단일 세포 데이터셋의 UMAP 클러스터링. (B) PE 단일 세포 전사체 데이터셋 GSE183338의 상위 5개 마커 주석 분석. (C) 세포 하위 집단의 주석 처리. (D) 대조군 및 PE 샘플에서의 세포 비율 분포를 나타내는 막대 그래프. (E) 조직 기원(탈락막 및 융모) 및 질환 상태(대조군 및 PE)별로 색상 구분된 UMAP 플롯. (F) 조직 기원(탈락막 및 융모)별로 그룹화된 태반 세포 집단의 SASH1 발현을 보여주는 UMAP 플롯. (G) 질환 상태(대조군 및 PE)별로 그룹화된 태반 세포 집단의 SASH1 발현을 보여주는 UMAP 플롯. (H) 다양한 태반 세포 유형에 따른 SASH1의 발현 분포를 보여주는 바이올린 플롯. ns p > 0.05; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. 약어: UMAP = uniform manifold approximation and projection; ns = 유의하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

저산소증에서의 SASH1 발현; western blot을 이용한 단백질 분석; 유전자/단백질 발현 도표.
그림 5: SASH1은 저산소증으로 유도된 영양막 세포의 세포사멸 및 염증을 조절한다. (A) 정상 및 저산소 조건 하의 HTR-8/SVneo 세포에서 SASH1 mRNA 발현의 qPCR 분석 및 SASH1 단백질 수준의 밀도 측정 정량 분석. (B) (A)에 표시된 밀도 측정 데이터에 해당하는 대표 Western blot 이미지. (C) sh-NC 또는 sh-SASH1 컨스트럭트(sh-SASH1#1, sh-SASH1#2, sh-SASH1#3)를 트랜스펙션한 저산소 처리 HTR-8/SVneo 세포에서 SASH1 mRNA 발현의 qPCR 분석 및 SASH1 단백질 수준의 밀도 측정 정량 분석. (D) (C)에 표시된 밀도 측정 데이터에 해당하는 대표 Western blot 이미지. (E) Normal, Hypoxia + sh-NC 및 Hypoxia + sh-SASH1(#3) 군의 HTR-8/SVneo 세포에 대한 TUNEL 염색. 스케일 바 = 20 µm. (F) Normal, Hypoxia + sh-NC 및 Hypoxia + sh-SASH1(#3) 군에서 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 ELISA 분석. (G) OE-NC 또는 OE-SASH1 컨스트럭트를 트랜스펙션한 HTR-8/SVneo 세포에서 SASH1 mRNA 발현의 qPCR 분석 및 SASH1 단백질 수준의 밀도 측정 정량 분석. (H) (G)에 표시된 밀도 측정 데이터에 해당하는 대표 Western blot 이미지. (I) Normal + OE-NC 및 Normal + OE-SASH1 군의 HTR-8/SVneo 세포에 대한 TUNEL 염색. 스케일 바 = 20 µm. (J) Normal + OE-NC 및 Normal + OE-SASH1 군에서 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 ELISA 분석. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. 데이터는 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험(n = 3)의 평균 ± SD로 표시되었다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

Western blot, TEM 이미지 및 형광 현미경을 통해 단백질 수준과 세포 사멸에 미치는 P-EXO의 효과를 평가함.
그림 6: P-EXOS는 SASH1 억제를 통해 저산소증으로 유도된 영양막 세포 손상을 완화한다. (A) P-EXOS 마커 단백질인 PLAP, CD63, TSG101의 Western blot 분석이며, GM130을 음성 대조군으로 사용하였다. (B) P-EXOS 형태의 투과 전자 현미경(TEM) 분석. 스케일 바 = 1.0 µm. (C) HTR-8/SVneo 세포(적색) 내 PKH67로 표지된 P-EXOS(녹색)의 섭취를 보여주는 공초점 레이저 주사 현미경 이미지. 핵은 DAPI(청색)로 대조 염색하였다. 스케일 바 = 20 µm. (D) 대조군 및 P-EXOS 투여군 HTR-8/SVneo 세포에서 SASH1 mRNA 발현의 qPCR 분석 및 SASH1 단백질 수준의 밀도 분석 정량화. (E) (D)에 표시된 밀도 분석 데이터에 해당하는 대표 Western blot 이미지. (F) 대조군 및 P-EXOS 투여군 HTR-8/SVneo 세포의 TUNEL 염색. 스케일 바 = 20 µm. (G) 대조군 및 P-EXOS 투여군의 저산소증 처리 HTR-8/SVneo 세포 내 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 ELISA 분석. (H) OE-NC + P-EXOS군 및 OE-SASH1 + P-EXOS군 HTR-8/SVneo 세포의 TUNEL 염색. 스케일 바 = 20 µm. (I) OE-NC + P-EXOS군 및 OE-SASH1 + P-EXOS군의 저산소증 처리 HTR-8/SVneo 세포 내 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 ELISA 분석. 약어: P-EXOS = placenta-derived exosomes; TEM = transmission electron microscopy; PLAP = placental alkaline phosphatase; TSG101 = tumor susceptibility gene 101. *p < 0.05; **p < 0.01. 데이터는 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험(n = 3)의 평균 ±SD로 나타냈다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 단일 세포 RNA-seq 데이터의 품질 관리. (A) 품질 관리 후의 유전자 발현 수준을 나타낸 바이올린 플롯. (B) 품질 관리 후 식별된 고변동성 유전자를 보여주는 가변 특성 플롯.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

부록 그림 2: 단일 세포 클러스터링을 위한 통계적으로 유의미한 주성분 결정. (A) 통계적으로 유의미한 주성분을 식별하는 데 사용된 JackStraw 도트 플롯. (B) 주성분에 의해 설명되는 분산을 나타내는 엘보우 도트 플롯(elbow dot plot).이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: SASH1 녹다운에 사용된 shRNA 표적 서열.유전자 억제에 사용된 음성 대조군(sh-NC) 및 세 가지 SASH1 표적 구조체(sh-SASH1#1, sh-SASH1#2, sh-SASH1#3)의 shRNA 표적 서열(5′–3′).이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: 정량적 PCR에 사용된 프라이머 서열. qPCR 분석에 사용된 SASH1 및 β-actin(내부 참조 대조군)의 정방향 및 역방향 프라이머 서열(5′–3′).이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 연구에서는 통합 전사체 분석, 단일 세포 시퀀싱 및 다중 알고리즘 머신 러닝을 통해 SASH1이 PE에서 조절 장애가 일어나는 핵심 유전자임을 확인하였으며, 이는 PE에 대한 표적 치료법이 여전히 부재한 상황에서 특히 유의미한 접근 방식입니다17. SASH1은 저산소 상태의 영양막 세포에서 유의하게 상향 조절되며, 단일 세포 해상도에서 PE 태반의 영양막 구획에서 특이적으로 증가함이 입증되었습니다. 기능 상실 및 기능 획득 실험을 통해 SASH1이 영양막 세포의 세포 사멸과 전염증성 사이토카인 분비를 유도하는 데 필요하고 충분한 조건임을 확립하였습니다. 또한, P-EXOS 처리는 저산소로 인한 영양막 세포 손상을 완화하였으며, 이러한 보호 효과는 SASH1 과발현에 의해 사라졌습니다. 이는 P-EXOS 매개 세포 보호 작용이 기전적으로 SASH1 억제에 의존함을 확인시켜 줍니다.

또한, B 세포/형질 세포, 내피 세포, 섬유아세포/기질 세포, 대식세포/수지상 세포, NK 세포, T 세포 및 영양막 세포를 포함한 여러 태반 세포 유형의 비율 변화가 PE에서 관찰되었습니다. 이러한 결과는 PE 동안 태반 미세환경이 상당한 재구성 과정을 거친다는 것을 시사합니다. 이러한 염증성 미세환경은 영양막 세포의 기능 부전을 악화시킬 뿐만 아니라, 면역-세포외 기질 상호작용을 통해 질병 진행을 가속화할 수 있습니다18. 더욱이, 최근에는 호중구 세포외 트랩(NETs)이 PE의 태반 염증을 악화시키는 데 관여하는 것으로 밝혀졌습니다19. SASH1은 염증 신호 전달, 세포 접착 및 저산소증 관련 과정에 관여함으로써 PE 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 믿어집니다. 본 연구에서는 limma 패키지를 사용하여 PE 환자와 정상 혈압 임신부의 태반 샘플에서 유전자 발현 프로파일을 추출하였으며, 특징 선택을 위해 LASSO 회귀, SVM-RFE, XGBoost 및 Boruta와 같은 여러 머신러닝 알고리즘을 사용하였습니다. 모든 알고리즘에서 SASH1이 일관되게 합의된 후보 유전자로 나타났습니다. 단일 세포 수준에서 SASH1은 다양한 태반 세포 집단 전반에 걸쳐 세포 유형 특이적 발현을 보였으며, PE 샘플에서 높은 발현 수준을 유지하였고, 특히 영양막 세포에서 가장 뚜렷한 차이가 관찰되어, 서로 다른 태반 세포 맥락에서 고유한 기능적 효과를 나타낼 수 있음을 시사하였습니다.

SASH1은 세포 이동 및 침윤, 상피-간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition), 스트레스 반응성 신호 조절을 포함한 다양한 생물학적 과정에 참여하는 것으로 보고된 신호 어댑터 단백질입니다8,9. 자간전증(PE) 관련 병리에서 SASH1의 기능적 역할을 조사하기 위해, HTR-8/SVneo 세포를 사용하여 저산소 유도 영양막 세포 모델을 구축하였습니다. 연구 결과, 저산소 노출은 SASH1 발현을 유의하게 상향 조절한 반면, SASH1 넉다운(knockdown)은 저산소 유도 세포 사멸을 현저히 완화하고 IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함한 전염증성 사이토카인의 분비를 감소시켰습니다. 반대로, 정상 산소 조건에서 SASH1을 과발현시키는 것만으로도 저산소 유도 표현형을 재현할 수 있었으며, 이는 SASH1이 영양막 세포 손상을 유발하는 인과적 역할을 한다는 것을 입증합니다. 이러한 결과는 SASH1이 염증 반응을 조절함으로써 영양막 세포의 기능적 상태를 부정적으로 조절할 수 있음을 시사합니다. 영양막 세포가 태반 염증 매개체의 주요 공급원이라는 점을 고려할 때20, 비정상적인 SASH1 발현은 PE에서 염증 증폭의 결정적인 분자적 근거가 될 수 있습니다. 특히, 영양막 세포에서 관찰된 SASH1의 세포 사멸 촉진 및 전염증 기능은 통상적으로 EMT와 이동을 억제하는 암세포 내에서의 전형적인 종양 억제 역할과 대조적입니다8,9. 이러한 맥락 의존적인 기능적 이중성은 SASH1 상호작용 파트너 및 하위 신호 전달 네트워크의 세포 유형 특이적 차이를 반영하는 것일 수 있으며, 이에 대한 추가적인 조사가 필요합니다.

엑소좀은 세포 간 통신의 중요한 매개체로 인식되며, 자간전증(PE)의 발병 기전에 관여하는 것으로 알려져 있습니다21. 특히, P-EXOS는 모체-태아 면역 관용 유지와 같이 정상 임신 중의 면역 조절에서 중요한 역할을 수행하여 PE에 대한 보호 효과를 제공할 수 있습니다22. 본 연구에서는 생물정보학적 분석을 통해 SASH1과 엑소좀 관련 신호 전달 경로 사이의 연관성을 확인하였으며, 이를 바탕으로 영양막 세포 기능 조절에서 P-EXOS의 역할에 대해 추가 조사를 수행하였습니다. 공배양 실험 결과, P-EXOS 처리는 저산소증 처리된 영양막 세포에서 SASH1 mRNA 및 단백질 수준을 유의하게 감소시켰으며, 저산소증으로 유도된 세포 사멸과 염증 반응을 현저히 완화시켰습니다. 중요한 점은 SASH1의 과발현이 이러한 보호 효과를 없앴다는 것이며, 이는 P-EXOS 매개 세포 보호 작용이 병렬 경로가 아닌 SASH1 억제에 기전적으로 의존한다는 것을 입증합니다.

P-EXOS가 SASH1 발현을 억제하는 분자적 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. P-EXOS는 수신 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 microRNA, 단백질, 지질을 포함한 다양한 생물학적 활성 화물을 운반하는 것으로 알려져 있습니다10. 한 가지 가능성은 P-EXOS가 SASH1을 직접적 또는 간접적으로 표적하는 특정 miRNA를 전달한다는 것입니다. 또는, P-EXOS가 SASH1 전사 조절로 수렴되는 NF-κB 또는 PI3K-Akt와 같은 상위 신호 전달 경로를 조절할 수도 있습니다. 암세포에서 SASH1이 PI3K-Akt-mTOR 경로와 연관되어 있다는 점을 고려할 때8, 엑소좀 매개 조절이 영양막 세포에서 SASH1의 하향 조절에 기여할 가능성이 있습니다. P-EXOS가 SASH1 발현을 조절하는 정확한 분자적 연쇄 반응을 분석하기 위해서는 엑소좀 화물 시퀀싱 및 경로 특이적 억제제를 이용한 향후 연구가 필요할 것입니다.

본 연구에서는 PE 환자의 태반 조직에서 발생하는 분자적 변화를 조사하기 위해 전사체 프로파일링과 단일 세포 RNA 시퀀싱을 통합하여 분석하였습니다. 분석 결과, SASH1이 저산소증으로 유도된 영양막 세포의 세포 사멸 및 염증 반응에서 핵심적인 역할을 하며, P-EXOS가 SASH1 발현을 억제함으로써 보호 효과를 나타낼 수 있음을 입증하여 PE의 기저 분자 기전에 대한 새로운 통찰을 제공하고 잠재적인 치료 전략을 제시하였습니다. 그러나 본 연구에는 몇 가지 한계점이 있습니다. 첫째, 기능적 결과가 주로 HTR-8/SVneo 불멸화 영양막 세포주에서 도출되었으므로, 일차 영양막 세포에서의 검증이 필요합니다. 둘째, 면역조직화학법을 통해 임상 PE 태반 조직에서 SASH1 단백질 발현을 검증하지 못하였으며, 이는 결과의 중개적 해석을 제한하므로 향후 연구에서 다루어져야 합니다. 셋째, SVM-RFE 분류기의 교차 검증 정확도가 중간 수준(~0.6)으로 나타났는데, 이는 데이터셋 고유의 이질성을 반영하는 것이며, 더 견고한 진단 모델을 개발하기 위해서는 더 큰 규모의 독립적인 코호트가 필요할 것입니다. 넷째, P-EXOS가 SASH1 발현을 억제하는 정확한 분자 기전은 아직 불분명합니다. 다섯째, SASH1 웨스턴 블롯 검출에서 비특이적 염색 밴드가 관찰되었으며, 이는 항체의 특이성이 최적화되지 않았기 때문일 수 있습니다. 본 실험에 사용된 항체는 다클론 항체로, 일반적으로 단클론 항체에 비해 면역 검출 시 특이성이 낮습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 비특이적 밴드는 SASH1 단백질 분석 결과나 본 연구의 결론에 영향을 미치지 않습니다. 향후 in vivo 실험, 임상 시료 분석 및 엑소좀 화물 특성 분석을 포함하는 연구를 통해 PE에서 P-EXOS-SASH1 축의 기능적 역할을 더욱 명확히 규명하고 그 중개적 잠재력을 평가해야 합니다.

공개 사항

본 연구에는 이해상충이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 중국 허베이성 건강위원회(Hebei Provincial Health Commission)의 의과학 연구 핵심 프로그램(No. 20210075)의 지원을 받아 수행되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMI-1640 배지Gibco11875085
소태아혈청 (FBS)Gibco16140071
엑소좀 제거 FBSSystem BiosciencesEXO-FBS-50A-1
페니실린/스트렙토마이신Thermo Fisher Scientific, CN15140122
Lipofectamine 3000 형질전환 시약 (P3000 시약 포함)Thermo Fisher Scientific, CNL3000150
Opti-MEM 저혈청 배지Thermo Fisher Scientific, CN31985070
SASH1 shRNA 플라스미드 (HuSH)origeneTL301836
SASH1 ORF 발현 플라스미드origeneRC218866
공벡터 대조군origenePS100001
역전사 키트Thermo Fisher Scientific, CN4368814
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific, CNA46110
SASH1 프라이머Sangon Biotech맞춤 합성된
β$\beta$-actin 프라이머Sangon Biotech맞춤 합성된
세포 용해 버퍼BeyotimeP0013B
NanoDrop 분광광도계Thermo Fisher Scientific, CNNanoDrop Ultra
PVDF 멤브레인Thermo Fisher Scientific, CN88518
Anti-SASH1 항체ABclonalA15248
항-β-액틴 항체Abcamab6276
HRP-접합 염소 항-토끼/항-마우스 2차 항체BeyotimeA0208
ImageJ 소프트웨어NIH (퍼블릭 도메인)ImageJ
PKH67 녹색 형광 세포 링커 키트 (희석액 C 포함)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CNMINI67
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 중국10711454001
DAPIBeyotimeC1002
공초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)LeicaLeica TCS SP8
Human IL-6 Quantikine ELISA 키트R&D SystemsD6050B
인간 IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISAR&Amp;D SystemsDY201
인간 TNF-α Quantikine ELISA 키트R&D SystemsDTA00D
마이크로플레이트 리더Thermo ScientificMultiskan FC
인시튜 세포 사멸 검출 키트 (TUNEL 분석 키트)Roche11684795910
Triton X-100BeyotimeP0096
파라포름알데히드 (4%)BeyotimeP0099
형광 현미경OlympusBX53
냉장 원심분리기 (12,000 × g 용량)EppendorfEppendorf 5430 R
초원심분리기 (120,000 × g 용량)Beckman CoulterOptima MAX-XP
R 소프트웨어R 재단v4.2.1
GraphPad PrismGraphPad 소프트웨어v10.0
Seurat (R 패키지)Satija Lab (오픈 소스)v4.0.4
Harmony (R 패키지, 배치 교정)오픈 소스v1.2.0
Scrublet (Python 패키지, 더블릿 검출)오픈 소스v0.2.3
clustree (R 패키지)오픈 소스v0.5.1
glmnet (R 패키지, LASSO)오픈 소스v4.1.8
e1071 (R 패키지, SVM-RFE)오픈 소스v1.7-14
xgboost (R 패키지)오픈 소스v1.7.7.1
randomForest (R 패키지, Boruta)오픈 소스v4.7-1.1
Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
STRING 데이터베이스string-db.orghttps://www.string-db.org/
Metascapemetascape.orghttps://metascape.org/
Cytoscape 소프트웨어Cytoscape 컨소시엄v3.10.4
ggplot2 (R 패키지)오픈 소스v3.5.1
limma (R 패키지)오픈 소스v3.58.1
pheatmap (R 패키지)오픈 소스v1.0.12
ClusterProfiler (R 패키지)오픈 소스v4.8.3
DOSE (R 패키지)오픈 소스v3.28.2
ggpubr (R 패키지)오픈 소스v0.6.0

참고문헌

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SASH1RNA

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