연구 논문

Lycopus lucidus 추출물이 장내 미생물군집 및 대사체 재구성 및 실험적 다낭성 난소 증후군 개선에 미치는 영향

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DOI:

10.3791/71084

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2026년 8월 28일

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1Department of Gynecology, Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hebei Province, 2Department of Gynecology, Heilongjiang Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine Science

이 논문에서

요약

ZeLan 추출물은 DHEA로 유도된 PCOS 쥐의 내분비 및 대사 표현형을 개선했다. 16S rRNA 시퀀싱과 혈청 대사체학의 통합 분석 결과, 장내 미생물 알파 다양성의 부분적인 회복, 미생물 조성의 변화, 그리고 스테로이드 호르몬, 담즙산 및 단쇄 지방산을 포함한 대사체 변화가 나타났다.

초록

본 연구에서는 다낭성 난소 증후군(PCOS)에 대한 ZeLan 추출물의 치료 효과를 조사하고, 장내 미생물 군집-대사체 재구성과 그 연관성을 평가하였다. 24마리의 암컷 Sprague-Dawley 랫드를 대조군, dehydroepiandrosterone(DHEA)으로 유도된 PCOS 모델군, ZeLan 처리군으로 무작위 배정하였다(각 군 n = 8). 28일간의 중재 후, ELISA를 통해 혈청 호르몬 수치를 측정하였으며, 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 이용하여 장내 미생물 군집 조성을 분석하고, UHPLC-Q-TOF-MS를 통해 혈청 대사 프로파일의 특성을 분석하였다. 미생물 군집-대사체 간의 연관성을 탐색하기 위해 다중 검정 보정을 적용한 Spearman 상관 분석을 수행하였다. ZeLan은 체중과 테스토스테론 수치(0.92 vs. 1.85 ng/mL, P < 0.05)를 감소시켜 PCOS 관련 표현형을 유의미하게 개선하였다. < 모델군과 비교했을 때, LH/FSH 비율과 인슐린 수치가 유의하게 낮았습니다(p < 0.05). 시퀀싱 결과, ZeLan은 미생물 알파 다양성을 부분적으로 회복시켰으며(Shannon 지수: 5.79 대 4.19), Firmicutes 대 Bacteroidetes 비율을 감소시켰습니다. ZeLan은 Lactobacillus 및 Ruminococcus의 풍부도 증가와 Bacteroides, Prevotella, Escherichia의 풍부도 감소와 연관이 있었습니다. 대사체학 분석을 통해 52개의 변화된 대사체 특성이 확인되었으며, 주요 변화는 스테로이드 호르몬, 리토콜산과 같은 담즙산, 그리고 낙산과 같은 단쇄 지방산을 포함했습니다. 이러한 결과는 ZeLan이 PCOS 관련 내분비 및 대사 장애를 개선하며, 장내 미생물 및 혈청 대사 프로필의 재구성(remodeling)과 연관이 있음을 시사합니다.

서론

다낭성 난소 증후군(PCOS)은 가임기 여성에게 발생하는 가장 흔한 내분비 질환 중 하나로, 사용된 진단 기준에 따라 전 세계 유병률이 6%에서 20% 사이로 추정됩니다1. 이 복잡한 대사 및 생식 장애는 고안드로겐혈증, 배란 장애, 다낭성 난소 형태를 포함하는 일련의 임상적 징후를 특징으로 하며, 이는 종합적으로 심각한 생식적, 대사적, 심리적 결과를 초래합니다2. 가임력에 미치는 직접적인 영향 외에도, PCOS는 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 자궁내막암을 포함한 장기적인 건강 합병증과 연관된 전신 질환으로 점점 더 인식되고 있으며, 이에 따라 전 세계의 개별 환자와 의료 시스템 모두에 상당한 부담을 주고 있습니다3. PCOS의 병태생리는 아직 완전히 이해되지 않았으나, 일반적으로 유전적 소인, 환경적 요인 및 생활 방식 결정 요인 사이의 복잡한 상호작용이 결합되어 환자에게서 관찰되는 특징적인 호르몬 및 대사 장애가 발생하는 것으로 알려져 있습니다4.

PCOS에 대한 현대적 치료 접근법은 주로 약물적 중재를 통한 증상 관리에 집중하고 있으며, 여기에는 생리 조절을 위한 경구 피임약, 인슐린 민감성 개선을 위한 metformin, 그리고 다모증 조절을 위한 항안드로겐 제제가 포함됩니다5. 하지만 이러한 전통적인 치료법은 증상 완화가 불완전한 경우가 많으며, 특히 임신을 희망하는 여성들에게는 장기적인 적용을 제한하는 부작용이 빈번하게 동반됩니다6. 이에 따라 보완 및 대체 의학적 접근법, 특히 총체적인 조절 메커니즘을 통해 부인과 질환 치료에 수세기에 걸친 경험적 근거를 축적해 온 전통 중의학(TCM)에 대한 관심이 높아지고 있습니다7. PCOS 관리를 위해 연구된 수많은 식물성 의약품 중에서, 혈액 순환 촉진, 어혈 제거 및 생리 조절에 전통적으로 사용되어 온 Lycopus lucidus Turcz. (중의학에서는 제란(ZeLan)으로 알려짐)이 상당한 주목을 받고 있습니다8. 발표된 화학성분 연구에 따르면, L. lucidus는 항산화 및 항염증 활성을 가진 폴리페놀과 플라보노이드가 풍부한 분획물을 함유하고 있습니다8,9. 따라서 본 연구에서는 표준화된 총 플라보노이드 함량을 추출물의 화학적 품질 관리 지표로 사용하였으나, 마이크로바이오타 및 대사 조절을 담당하는 특정 활성 단량체의 확인을 위해서는 향후 표적 화학성분 분석이 필요합니다.

장내 미생물군은 숙주의 대사 및 내분비 기능의 핵심 조절자로 부상했으며, PCOS를 포함한 다양한 대사 장애의 발병 기전에 관여한다는 증거가 점점 더 많아지고 있습니다10. 장내 미생물과 난소 기능 사이의 양방향 소통을 설명하기 위해 장-난소 축(gut-ovary axis)이라는 개념이 제안되었으며, 이는 미생물 대사산물, 면역 신호 전달 및 신경 내분비 경로에 의해 매개됩니다11. PCOS 환자 여성은 미생물 다양성 감소, Firmicutes 대 Bacteroidetes 비율의 변화, 그리고 Lactobacillus 및 Bifidobacterium 종과 같은 유익균의 풍부도 감소로 특징지어지는 장내 미생물 불균형(dysbiosis)을 일관되게 보이는 것으로 나타났습니다12. 이러한 미생물 군집의 교란은 장 투과성 증가, 전신적 저강도 염증, 그리고 담즙산 및 단쇄 지방산(SCFA) 대사의 변화를 포함한 여러 메커니즘을 통해 PCOS의 병태생리에 기여하며, 결과적으로 인슐린 민감성과 안드로겐 생합성에 영향을 미치는 것으로 생각됩니다13. 특히 프로바이오틱스, 프리바이오틱스 및 식이 조절을 포함하여 장내 미생물군을 표적으로 하는 중재법들이 PCOS 증상을 완화하는 데 유망한 결과를 보여주었으며, 이는 장-난소 축이 치료 표적이 될 수 있음을 뒷받침합니다14.

생물학적 시스템 내의 저분자 대사체에 대한 포괄적인 분석인 대사체학(Metabolomics)은 질병 상태와 관련된 대사 교란을 특성화하고 치료적 개입의 생화학적 효과를 평가하는 강력한 방법을 제공합니다15. 마이크로바이옴 프로파일링을 위한 16S rRNA 유전자 시퀀싱과 비표적 대사체학을 통합하면 장내 미생물 군집과 숙주 대사 사이의 관계를 체계적으로 조사할 수 있으며, 이를 통해 질병의 병인 및 치료 반응 모두에 수반될 수 있는 마이크로바이오타-대사체 상호작용에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. PCOS 관리를 위해 장-난소 축을 표적으로 하는 이론적 근거와 부인과 질환에 대한 ZeLan의 전통적인 적응증에도 불구하고, 현재까지 ZeLan 추출물이 PCOS에서 장내 마이크로바이오타-대사체 인터페이스를 조절하는지 체계적으로 조사한 연구는 없었습니다. 이러한 지식의 공백은 ZeLan과 관련된 생물학적 반응에 대한 이해를 제한하며, PCOS 치료를 위한 이 식물성 개입의 합리적인 최적화를 저해합니다.

본 연구는 DHEA로 유도된 PCOS 쥐 모델에서 ZeLan 추출물의 치료 효능을 조사하고, 통합된 16S rRNA 시퀀싱 및 비표적 대사체학 분석을 통해 관련 장내 미생물군-대사체 변화를 평가하기 위해 설계되었습니다. 구체적으로, 체중, 혈청 테스토스테론, 황체 형성 호르몬 대 난포 자극 호르몬(LH/FSH) 비율 및 인슐린 수치를 포함한 PCOS 관련 표현형에 ZeLan 추출물이 미치는 영향을 평가하였으며, ZeLan 처리 후 장내 미생물군 조성 및 알파 다양성의 변화를 특성화하였습니다. 또한 ZeLan 중재와 관련된 차등 혈청 대사체 특성 및 농축된 대사 경로를 확인하였으며, 특정 장내 미생물 분류군과 주요 대사체 간의 상관관계를 탐색하였습니다. 이러한 목적을 통해 PCOS에서 ZeLan과 관련된 장-난소 축 조절에 대한 연합 멀티오믹스 근거를 제공하고자 하였습니다.

프로토콜

본 연구의 모든 실험 절차는 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며, 기관동물관리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(승인 번호 IACUC-2023-0156).

동물

암컷 Sprague-Dawley 쥐(n = 24, 6주령, 체중 180–200 g)를 소속 기관의 실험동물센터에서 분양받아 통제된 환경 조건(온도 22 ± 2°C, 습도 50 ± 10%, 12시간 명/암 주기)에서 사육하였으며, 표준 설치류 사료와 정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 1주일간의 적응 기간 후, 동물을 세 개의 실험군(군당 n = 8)인 대조군, PCOS 모델군, ZeLan 투여군으로 무작위 배정하였다. 표본 크기는 PCOS 모델의 장내 미생물 군집 변화를 조사한 이전 연구들을 기반으로 결정하였으며, 검정력 분석 결과 군당 8마리의 동물을 사용했을 때 α = 0.05에서 알파 다양성 지수의 1.5배 차이를 검출하기 위한 검정력이 80%인 것으로 나타났다.

PCOS 모델 구축 및 치료 프로토콜

PCOS 모델은 참깨 오일에 용해된 dehydroepiandrosterone (DHEA; Sigma-Aldrich, USA)을 체중 100 g당 6 mg의 용량으로 21일 연속으로 목 등 부위에 피하 주사하는 잘 검증된 프로토콜을 사용하여 구축되었습니다. 대조군 동물에게는 동일한 부피의 참깨 오일 용매를 투여하였습니다. 전체 실험 일정은 7일간의 적응 기간, 21일간의 모델 유도 기간, 28일간의 중재 기간으로 구성되었으며, 적응 기간을 포함하여 프로토콜 56일 차에 최종 샘플링을 수행하였습니다 (Figure 1). ZeLan 추출물은 인증된 Lycopus lucidus Turcz.의 지상부를 수성 추출하여 제조하였으며, 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 총 플라보노이드 함량이 2.5% 이상이 되도록 표준화하였으며, 이를 식물 추출물의 화학적 품질 관리 기준으로 삼았습니다. DHEA 유도 모델 구축이 완료된 후, ZeLan 군의 쥐에게는 ZeLan 추출물을 체중 kg당 200 mg의 용량으로 28일 연속으로 매일 경구 투여하였고, 대조군과 모델군에는 동일한 부피의 증류수를 투여하였습니다. 200 mg/kg 용량은 식물 추출물을 사용한 이전의 동물 실험 경험과 예비 내약성 고려 사항을 바탕으로 탐색적 약리학적 용량으로 선정되었으며, 정식 용량-반응 평가는 이번 설계에 포함되지 않았습니다. 실험 기간 동안 체중을 매주 기록하였습니다. 본 실험 설계에서 PCOS 모델 구축의 성공 여부는 DHEA 유도 프로토콜과 더불어 체중, 혈청 testosterone, LH/FSH 비율, 공복 insulin을 포함한 최종 내분비 및 대사 표현형을 사용하여 평가되었습니다. 난소 조직병리학적 검사, 난포 수 측정, 황체 정량 분석 및 연속적인 발정 주기 모니터링은 모델 확인 지표에 포함되지 않았으며, 따라서 난소 기능 장애에 대한 해석은 직접적인 조직 수준의 평가보다는 내분비 및 대사 측정값에 근거하였습니다.

시료 수집 및 처리

이후의 생화학, 마이크로바이오타 및 대사체 분석을 위해 세 그룹 모두에서 샘플(혈청 및 분변)을 수집하였습니다(그룹당 n = 8). 일주기 리듬 및 식이 관련 변동성을 줄이기 위해, 하룻밤 금식 후 오전 중에 최종 수집을 수행하였습니다. 마취 하에 복부 대동맥에서 혈액 샘플을 수집하고, 4°C에서 3,000 × g로 15분 동안 원심분리하여 혈청을 얻었으며, 이를 분주하여 호르몬 및 대사체 분석 시까지 -80°C에 보관하였습니다. 신선한 분변 샘플은 무균 조건 하에 맹장에서 멸균 크라이오튜브로 직접 수집하였으며, 운반 중에는 드라이아이스에 보관하고, 수집 후 10분 이내에 액체 질소로 급속 냉동시킨 뒤 16S rRNA 유전자 시퀀싱 시까지 -80°C에 보관하였습니다.

혈청 호르몬 측정

테스토스테론, 황체 형성 호르몬(LH), 여포 자극 호르몬(FSH) 및 인슐린의 혈청 농도는 제조사의 지침에 따라 상용 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA) 키트(Cusabio Biotech, Wuhan, China)를 사용하여 정량하였습니다. LH/FSH 비율은 PCOS의 특징인 성선 자극 호르몬 불균형의 복합 지표로 계산되었습니다. 모든 시료는 두 번씩 반복 분석하였으며, 반복 측정값의 변동 계수가 15%를 초과하는 경우 재측정하였습니다. 분석 내(intra-assay) 및 분석 간(inter-assay) 변동 계수는 각각 10%와 15% 미만으로 유지되어야 했습니다. 잠재적 이상치는 원본 기록 및 분석 성능 정보와 대조하여 선별하였으며, 문서화된 기술적 이유 없이 통계적 근거만으로 값을 제외하지 않았습니다.

16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 생물정보학 분석

제조사의 프로토콜에 따라 QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 맹장 내용물에서 총 세균 게놈 DNA를 추출하였습니다. DNA의 질과 양은 NanoDrop 분광광도법 및 아가로스 겔 전기영동을 통해 평가하였으며, DNA 추출물은 라이브러리 구축 전까지 -80°C에 보관하였습니다. 16S rRNA 유전자의 V3-V4 가변 영역은 Illumina 어댑터 서열이 포함된 유니버설 프라이머 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') 및 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')를 사용하여 증폭하였습니다. 앰플리콘 라이브러리를 구축, 정제, 정량한 후 동일 몰 농도로 풀링하였으며, Illumina NovaSeq 6000 플랫폼 (Novogene, Beijing, China)을 사용하여 paired-end 250 bp 리드로 시퀀싱하였습니다.

원시 시퀀싱 리드(Raw sequencing reads)는 QIIME2 (version 2022.2) 파이프라인을 사용하여 처리되었습니다. 페어드엔드(Paired-end) 리드는 디멀티플렉싱 및 병합 과정을 거쳤으며, Phred 점수 임계값 20 이상으로 품질 필터링을 수행한 후 DADA2로 처리하여 키메라 서열을 제거하고 앰플리콘 서열 변이(ASVs)를 생성하였습니다. 분류학적 분류는 naive Bayes 분류기를 사용하여 SILVA 138 참조 데이터베이스를 기반으로 수행되었습니다. 샘플 내 다양성과 풍부도를 평가하기 위해 Shannon 지수, Simpson 지수 및 Chao1 추정치를 포함한 알파 다양성 지표를 산출하였습니다. 리드 요약, ASV 풍부도 표, Good's coverage 및 희박화 곡선(rarefaction-curve) 파일을 포함한 시퀀싱 깊이 출력물은 데이터 가용성 섹션에 설명된 마이크로바이옴 데이터셋의 일부로 처리되었습니다. LDA 점수 임계값 2.0 초과 및 P < 0.05를 기준으로 Linear discriminant analysis effect size (LEfSe)를 사용하여 대조군(Control)과 모델군(Model) 비교에서 질환 관련 분류군을 식별하였습니다. ZeLan 관련 회복 효과는 모델군 대비 ZeLan 군에서 나타나는 분류학적 풍부도 변화의 방향을 비교하여 평가하였습니다.

비표적 대사체학 분석

혈청 대사체 프로파일링은 사중극자 비행시간 질량분석기가 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 혈청 시료(100 μL)를 내부 표준물질이 포함된 차가운 methanol:acetonitrile (1:1, v/v) 400 μL와 혼합하고, 볼텍싱한 후 -20°C에서 1시간 동안 배양하여 단백질을 침전시켰습니다. 14,000 × g에서 15분 동안 원심분리한 후, 상층액을 질소 기류 하에서 건조시키고 분석을 위해 100 μL의 acetonitrile:water (1:1, v/v)로 재구성하였습니다. 크로마토그래피 분리는 40°C로 유지된 ACQUITY UPLC HSS T3 컬럼(2.1 × 100 mm, 1.8 μm)에서 수행되었으며, 0.1% formic acid가 포함된 water를 이동상 A로, 0.1% formic acid가 포함된 acetonitrile을 이동상 B로 하여 0.30 mL/min의 유속으로 사용하였습니다. 대사체 분리를 위해 유기상의 비율을 5%에서 95%까지 증가시킨 후, 컬럼 세척 및 재평형화를 진행하는 기울기 프로그램(gradient program)을 사용하였습니다. 질량분석 데이터는 m/z 50–1200의 스캔 범위에서 양이온 및 음이온 전기분무 이온화 모드 모두에서 획득하였으며, 소스 파라미터는 모세관 전압 3.5 kV, 건조 가스 유량 10 L/min, 건조 가스 온도 325°C, 네뷸라이저 압력 35 psi, 프래그멘터 전압 120 V로 설정하였습니다.

원시 데이터 파일은 mzXML 형식으로 변환되었으며, 피크 검출, 머무름 시간 정렬 및 피크 면적 적분을 위해 R의 XCMS 패키지를 사용하여 처리되었습니다. 모든 혈청 추출물의 동일한 분취량을 혼합하여 준비한 품질 관리 샘플을 분석 시퀀스 전반에 삽입하여 기기 안정성을 모니터링했습니다. 결측치가 과도하거나 품질 관리 재현성이 불안정한 특징들은 통계 모델링 전에 제거되었습니다. 대사체 식별은 정확한 질량, 머무름 시간 및 MS/MS 파편화 패턴을 Human Metabolome Database (HMDB), METLIN 및 자체 스펙트럼 라이브러리와 대조하여 수행되었습니다. 다변량 통계 분석은 MetaboAnalyst 5.0을 사용하여 수행되었습니다. 후속 보고를 위해 유지된 대사체 특징들은 다변량 판별 기여도, 배수 변화 방향 및 통계적 근거를 통합한 복합 기준을 사용하여 우선순위를 정했으며, P 값은 다중 테스트를 고려하여 Benjamini-Hochberg 방법으로 보정되었습니다. 52개의 대사체 특징이 포함된 전체 주석 보고 표는 Supplementary Table 1로 제공됩니다. 경로 풍부성 분석은 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 데이터베이스를 사용하여 수행되었습니다.

통계 분석

모든 통계 분석은 SPSS 버전 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) 및 R 소프트웨어 (버전 4.2.1)를 사용하여 수행되었습니다. 연속형 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표기하였으며, 추론 통계 분석 전 Shapiro-Wilk 검정을 통해 정규성을 평가하였습니다. 정규 분포를 따르는 데이터의 경우, 다중 그룹 비교를 위해 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey의 사후 검정을 실시하였으며, 비정규 분포 데이터의 경우 Kruskal-Wallis 검정과 Dunn의 사후 검정을 사용하였습니다. 장내 미생물 분류군과 혈청 대사체 간의 상관관계는 Spearman 서열 상관계수를 사용하여 평가하고 계층적 군집 분석 히트맵으로 시각화하였습니다. 상관관계 P-값은 Benjamini-Hochberg 위양성 발견률(false-discovery rate) 방법을 사용하여 다중 검정 보정을 거쳤으며, 방향성이 일관되고 통계적으로 유의미한 상관관계만을 해석하였습니다. 조정된 P-값 임계값이 별도로 지정되지 않는 한, 양측 P-값 < 0.05를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였습니다.

결과

ZeLan 추출물이 PCOS 임상 표현형에 미치는 영향

DHEA 투여는 대조군(Control group)과 비교하여 체중, 혈청 테스토스테론 농도, LH/FSH 비율 및 공복 인슐린 수치의 유의미한 상승을 통해 입증된 바와 같이 쥐에서 PCOS 유사 내분비 및 대사 표현형을 유도하였습니다(모두 P < 0.05). Shapiro-Wilk 검사를 이용한 분포 평가 결과, Table 1에 요약된 주요 체중 및 호르몬 평가 지표에 대해 모수 분석이 가능하다는 것이 확인되었습니다. 28일간의 ZeLan 추출물 처리는 이러한 대사 및 호르몬 이상을 유의하게 개선했습니다. 체중은 7일간의 적응 기간을 포함하여 프로토콜 56일째인 처리 기간 종료 시점에 기록되었습니다. Table 1에 제시된 바와 같이, 모델군(Model group)의 체중(291.12 ± 15.35 g)은 대조군(227.45 ± 10.12 g, P < 0.05)보다 상당히 높았으며, ZeLan 처리는 체중을 245.25 ± 10.21 g으로 유의하게 감소시켰습니다(모델군 대비 P < 0.05). 혈청 테스토스테론 수치는 대조군(0.51 ± 0.05 ng/mL)에 비해 PCOS 모델 쥐(1.85 ± 0.21 ng/mL)에서 현저히 상승했으며, ZeLan 중재는 테스토스테론 수치를 0.92 ± 0.12 ng/mL로 낮추었습니다. LH/FSH 비율은 대조군(1.25 ± 0.11)에 비해 모델군(3.28 ± 0.25)에서 유의하게 증가했으며, ZeLan 처리에 의해 부분적으로 정상화되었습니다(1.85 ± 0.15). 공복 인슐린 수치는 모델 동물에서 상승했으며(대조군 12.55 ± 1.12 mIU/L 대비 28.95 ± 2.35 mIU/L), ZeLan 투여 후 유의하게 감소하였습니다(18.82 ± 1.55 mIU/L) (Figure 2). 이러한 결과는 내분비-대사성 PCOS 유사 표현형이 성공적으로 구축되었음을 확인시켜 주었으나, 본 연구에서는 난소 조직병리, 난포 수 측정, 황체 분석 및 발정 주기 모니터링은 수행되지 않았습니다.

ZeLan 추출물이 장내 미생물군의 알파 다양성을 회복시켰다

알파 다양성 지수 분석 결과, PCOS 및 그 치료와 관련하여 장내 미생물 군집 구조에 상당한 변화가 있음이 밝혀졌습니다. 표 2 및 그림 3에 나타난 바와 같이, Shannon 다양성 지수는 건강한 대조군(6.51 ± 0.28; P < 0.05)보다 PCOS 모델 쥐(4.19 ± 0.35)에서 유의하게 낮게 나타났으며, 이는 질병 상태에서 미생물의 알파 다양성이 감소했음을 나타냅니다. ZeLan 치료는 미생물 다양성을 부분적으로 회복시켰으며, Shannon 지수는 5.79 ± 0.26(모델군 대비 P < 0.05)으로 증가했습니다. Simpson 지수에서도 일관된 결과가 관찰되었는데, 대조군의 0.98 ± 0.01에서 모델 동물의 0.82 ± 0.03으로 감소했다가 ZeLan 처치 후 0.93 ± 0.02로 회복되었습니다. 종 풍부도를 반영하는 Chao1 추정치 또한 유사한 패턴을 보였습니다. PCOS 유도로 인해 Chao1 수치가 1215.3 ± 45.4에서 665.8 ± 52.1로 크게 감소한 반면, ZeLan 치료는 풍부도를 963.5 ± 38.6까지 증가시켰습니다. 이러한 결과들을 종합하면, PCOS는 알파 다양성과 풍부도의 감소로 특징지어지는 장내 미생물 불균형과 관련이 있으며, ZeLan 추출물이 미생물 군집 구조를 대조군 프로필에 가깝게 부분적으로 회복시킬 수 있음을 시사합니다.

장내 미생물 군집 구성의 변화

문(Phylum) 수준의 분류학적 프로파일링 결과, 실험군 간에 뚜렷한 구성 차이가 나타났다. 그림 4에 나타난 바와 같이, 모든 군에서 Firmicutes와 Bacteroidetes가 우세한 문이었으며, 전체 세균 군집의 85% 이상을 차지했다. Model군은 Control군(Firmicutes 약 40%, Bacteroidetes 약 45%)에 비해 Firmicutes의 풍부도가 상당히 높고(약 75%) Bacteroidetes의 비율은 감소하여(약 15%), 대사성 디스바이오시스의 특징인 Firmicutes-to-Bacteroidetes (F/B) 비율의 현저한 증가를 보였다. ZeLan 처리는 이러한 불균형을 조절하여 Firmicutes의 풍부도를 약 52%로 낮추고 Bacteroidetes를 약 35%로 증가시킴으로써 F/B 비율을 대조군 수준으로 부분적으로 정상화했다.

대조군과 모델군을 구별하는 박테리아 분류군을 식별하여 질병 관련 미생물 시그니처를 정의하기 위해 LEfSe 분석을 사용하였습니다. 그림 5에 나타난 바와 같이, 속 수준에서 PCOS 모델군은 일반적으로 대사 기능 장애 및 염증과 연관된 것으로 알려진 Bacteroides (LDA score > 3.5), Prevotella (LDA score > 3.0), Escherichia (LDA score > 2.5)의 풍부도가 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 반대로, 대조군에서는 장벽 무결성 유지 및 단쇄 지방산과 같은 유익한 대사산물 생성 역할로 알려진 Lactobacillus (LDA score > 3.0) 및 Ruminococcus (LDA score > 2.5)를 포함한 유익한 속들이 풍부하게 나타났습니다. 그림 5에서 ZeLan군은 별도의 LEfSe 클래스로 표시되지 않았는데, 이는 본 분석이 질병과 건강을 구별하는 분류군에 집중했기 때문입니다. ZeLan 관련 효과는 대조군 프로필로의 풍부도 변화와 마이크로바이옴-대사체 상관관계 분석을 통해 해석되었습니다.

대사체 프로파일링 및 차등 대사체 식별

비표적 대사체학 분석 결과, 다낭성 난소 증후군(PCOS) 및 ZeLan 추출물 치료와 관련된 상당한 대사 섭동이 확인되었습니다. 다음의 화산 플롯(volcano plot)에서 그림 6 모델 그룹과 대조군 그룹 간의 대사체 특성 분포를 보여주며, 배수 변화(fold-change) 방향과 통계적 유의성에 따라 상향 조절 및 하향 조절된 특성이 강조되어 있습니다. 모델 대 대조군 비교를 위한 전체 메타볼로믹스 보고 표에는 총 52개의 주석이 달린 대사체 특성이 유지되었습니다. 대사체 이름, HMDB 식별자, 생화학적 분류, log2 배수 변화, P 값 및 조절 방향을 포함한 전체 목록은 다음과 같이 제공됩니다. 부록 표 1. 표 3 다낭성 난소 증후군(PCOS)과 생물학적 연관성이 높은 대표적인 주석 처리된 대사물질들을 제시합니다.

표 3은 높은 VIP 점수와 PCOS 병태생리학적 관련성을 가진 대표적인 주요 차별 대사물질을 요약한 것입니다. testosterone (VIP = 2.56, P < 0.001) 및 androstenedione (VIP = 2.34, P < 0.001)을 포함한 스테로이드 호르몬은 PCOS 모델 동물에서 유의하게 증가했으며, 이는 이 질환의 특징인 고안드로겐 상태와 일치합니다. 지방산 대사 또한 교란되어 palmitic acid (VIP = 2.12)와 arachidonic acid (VIP = 1.89)가 유의하게 증가한 반면, 전염증성 지질 매개체인 prostaglandin E2 역시 유사하게 상향 조절되었습니다 (VIP = 2.05). 반대로, 유익한 장내 미생물 활동과 관련된 대사물질은 PCOS 동물에서 감소했습니다. 미생물 생물전환을 통해 생성되는 2차 담즙산인 lithocholic acid는 상당히 감소했으며 (VIP = 2.45), 단쇄 지방산인 butyric acid (VIP = 2.21) 또한 마찬가지였습니다. 또한, Model 군에서 succinic acid와 필수 아미노산인 L-tryptophan의 감소가 나타났으며, 이는 미생물 발효의 손상 및 아미노산 대사의 변화를 시사합니다.

KEGG 경로 농축 분석

KEGG 데이터베이스를 이용한 경로 풍부도 분석 결과, PCOS에서 유의하게 교란되고 ZeLan 처리에 의해 조절되는 여러 혈청 대사 경로가 밝혀졌습니다. 그림 7에 나타난 바와 같이, 스테로이드 호르몬 생합성 경로가 가장 유의하게 풍부한 것으로 나타났으며(Rich Factor = 0.80, P < 0.01), 이는 PCOS의 고안드로겐 혈증 표현형과 일치합니다. 난소 스테로이드 생성 경로 또한 매우 높게 풍부하게 나타나(Rich Factor = 0.75, P < 0.01), 난소 기능 장애에 안드로겐 합성 변화가 관여하고 있음을 반영했습니다. 일차 담즙산 생합성 또한 유의한 풍부도를 보였으며(Rich Factor = 0.62, P < 0.02), 이는 장내 미생물 군집의 변화와 관련이 있을 수 있는 장간 담즙산 순환의 장애를 나타냅니다. 아라키돈산 대사(Rich Factor = 0.56, P < 0.03)와 인슐린 저항성 경로(Rich Factor = 0.40, P < 0.04) 역시 유의하게 풍부하게 나타나, PCOS의 특징인 염증 및 대사 장애의 존재를 뒷받침했습니다. 지방산 생합성 경로는 완만한 풍부도를 보여(Rich Factor = 0.30), 지질 대사 조절 장애의 관여를 시사했습니다.

마이크로바이옴-대사체 상관관계 분석

장내 미생물 군집 구성과 대사 변화 사이의 기능적 관계를 평가하기 위해, 차이 있게 발현된 박테리아 속(genera)과 주요 대사산물 간에 허위 발견율(false-discovery rate) 제어가 적용된 Spearman 상관관계 분석을 수행하였다. 계층적 군집 분석이 적용된 상관관계 히트맵은 다음과 같이 제시되었다. 그림 8 미생물-대사체 연관성의 뚜렷한 패턴이 드러났습니다. Lactobacillus 및 Ruminococcus를 포함한 유익균은 리토콜산(각각 r = 0.72 및 0.68) 및 부티르산(각각 r = 0.65 및 0.60)과 강한 양의 상관관계를 보인 반면, 테스토스테론(r = -0.75 및 -0.80) 및 안드로스텐디온(r = -0.68 및 -0.72)과는 음의 상관관계를 보였습니다. 이러한 결과는 분류학적 분석에서 확인된 유익균이 안드로겐 관련 대사체 및 단쇄지방산(SCFA) 관련 대사 활동과 연관되어 있음을 시사합니다.

반대로, PCOS와 관련된 속인 Bacteroides, Prevotella 및 Escherichia는 상반된 상관관계 패턴을 보였습니다. 이 박테리아들은 테스토스테론(r = 0.85, 0.82, 0.60), 안드로스텐디온(r = 0.78, 0.75, 0.55) 및 팔미트산(r = 0.65, 0.60, 0.45)과 양의 상관관계를 보인 반면, 리토콜산 및 부티르산을 포함한 유익한 대사산물과는 음의 상관관계를 나타냈습니다. 이러한 상관관계 패턴은 특정 장내 미생물 분류군과 PCOS의 특징적인 대사 장애 사이의 기능적 연관성을 뒷받침하지만, 직접적인 인과관계를 입증하는 것은 아닙니다.

데이터 가용성:

본 연구 과정에서 생성 및 분석된 데이터세트에는 샘플 메타데이터, 표현형 소스 데이터, 16S 알파 다양성 지수, 문(phylum) 수준의 풍부도 요약, 차별적 박테리아 분류군 결과, 대사체학 차별 분석 표, 대표 대사체 결과, KEGG 경로 풍부도 결과 및 마이크로바이옴-대사체 상관관계 행렬이 포함됩니다. 이러한 기초 소스 데이터는 동반된 Supplementary File 1로 제공됩니다. 처리된 차별 대사체 데이터세트는 Supplementary Table 1로 제공됩니다.

대조군, 모델군, ZeLan군의 DHEA 주입 및 시료 수집을 나타내는 실험 타임라인 도식
그림 1: 실험 설계 및 처리 타임라인. 7일간의 적응 기간, 21일간의 DHEA 또는 vehicle 주입 기간, 28일간의 ZeLan 추출물 또는 vehicle 처리, 그리고 프로토콜 56일째의 혈청 및 분변 시료 최종 수집을 보여주는 실험 워크플로우의 모식도입니다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

대조군, 모델군, ZeLan군 간의 혈청 테스토스테론, LH/FSH 비율, 체중의 박스 플롯 비교.
그림 2: 내분비 및 대사 매개변수에 미치는 ZeLan 추출물의 효과. 중재 기간 후 대조군, 모델군 및 ZeLan 처리군의 (A) 혈청 테스토스테론 농도, (B) LH/FSH 비율, 그리고 (C) 체중을 나타내는 박스 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Shannon 지수 비교 박스 플롯; 대조군, 모델군, ZeLan군; 다양성 분석 결과.
그림 3: 장내 미생물 알파 다양성. 대조군, 모델군 및 ZeLan 처리군 간의 Shannon 다양성 지수 비교로, 장내 미생물 알파 다양성의 차이를 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

미생물 구성 막대 그래프; Control, Model, ZeLan 그룹의 문 수준 풍부도; 마이크로바이옴 분석.
그림 4: 문 수준의 장내 미생물 군집 구성. Control, Model 및 ZeLan 처리 그룹의 장내 미생물 군집에서 주요 세균 문의 상대적 풍부도를 나타내는 누적 막대 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

마이크로바이옴 분석, 대조군과 모델군의 속 풍부도를 보여주는 LDA 점수 막대 그래프.
그림 5: LEfSe 분석을 통해 확인된 차별적 박테리아 분류군. 대조군과 모델군을 구분 짓는 박테리아 속을 식별한 선형 판별 분석 효과 크기(LEfSe). LDA 점수는 차별적으로 풍부한 분류군의 효과 크기를 나타낸다. ZeLan 관련 변화는 모델군 대비 풍부도 변화를 바탕으로 결과 섹션에 기술되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유전자 발현 분석을 나타내는 볼케이노 플롯; log2 fold change 대 -log10 p-value.
그림 6: 차등 대사체 프로파일링. 모델군과 대조군 간의 차등 대사체 특징을 보여주는 볼케이노 플롯. 빨간색과 파란색 점은 각각 fold change와 통계적 유의성에 근거하여 유의하게 상향 조절 및 하향 조절된 대사체 특징을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

경로 분석 도트 플롯; 버블 크기는 개수를 나타내며; 색상은 p-값을 표시함; 축: 풍부도 인자(Rich Factor) 대 경로(Pathway).
그림 7KEGG 경로 농축 분석. 차등 대사체로부터 식별된 유의하게 농축된 대사 경로를 나타내는 버블 플롯. 버블의 크기는 매핑된 대사체의 수를 나타내며, 버블의 색상은 경로 농축의 통계적 유의성(P-값)을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

미생물 및 대사체 상관관계 히트맵 다이어그램; 장내 미생물군집 데이터 분석.
그림 8: 장내 미생물군집과 혈청 대사체 간의 상관관계.차등적으로 풍부한 박테리아 속(genus)과 대표 혈청 대사체 간의 Spearman 상관계수를 보여주는 계층적 클러스터링 히트맵. 빨간색은 양의 상관관계를, 파란색은 음의 상관관계를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그룹N체중 (g)테스토스테론 (ng/mL)LH/FSH 비율인슐린 (mIU/L)
대조군8227.45 ± 10.120.51 ± 0.051.25 ± 0.1112.55 ± 1.12
모델군8291.12 ± 15.35a1.85 ± 0.21a 3.28 ± 0.25a28.95 ± 2.35a
ZeLan8245.25 ± 10.21b0.92 ± 0.12b1.85 ± 0.15b18.82 ± 1.55b
참고: 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시됨. a = 대조군 대비 p < 0.05; b = 모델군 대비 p < 0.05.

표 1: PCOS 쥐의 내분비 및 대사 파라미터. 대조군, 모델군 및 ZeLan 처리군에서 체중, 혈청 테스토스테론, LH/FSH 비율 및 공복 인슐린 수치를 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다.

그룹섀넌 지수심슨 지수Chao1 추정치
대조군6.51 ± 0.280.98 ± 0.011215.3 ± 45.4
모델4.19 ± 0.35a0.82 ± 0.03a665.8 ± 52.1a
제란(ZeLan)5.79 ± 0.26b0.93 ± 0.02b963.5 ± 38.6b
참고: 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시됨. a = p < 대조군과 비교하여 0.05; b = p < Model 군과 비교하여 0.05였습니다.

표 2: 장내 미생물 알파 다양성 지수. 대조군, 모델군 및 ZeLan 처리군 간의 Shannon 지수, Simpson 지수 및 Chao1 추정치 비교. 데이터는 평균 ± SD로 표시됨.

대사체 이름HMDB ID강의경향 (모델군 vs 대조군)p-값VIP 점수
테스토스테론HMDB0000286스테로이드위 ↑< 0.0012.56
안드로스텐디온HMDB0000055스테로이드위 ↑< 0.0012.34
팔미트산HMDB0000220지방산위 ↑< 0.0012.12
아라키돈산HMDB0001043지방산위 ↑0.0031.89
프로스타글란딘 E2HMDB0001036지질위 ↑< 0.0012.05
리토콜산HMDB0000752담즙산하향 ↓< 0.0012.45
낙산HMDB0000039단쇄지방산하향 ↓< 0.0012.21
숙신산HMDB0000254유기산하향 ↓0.0211.65
L-트립토판HMDB0000929아미노산하강 ↓0.0151.58
참고: VIP = 투영 가변 중요도 (Variable Importance in Projection) > 1을 유의미한 것으로 간주함). 

표 3: 대표적인 차등 혈청 대사체. HMDB 식별자, 대사체 클래스, 조절 경향, P-값 및 VIP 점수를 포함하여, PCOS와 관련이 있고 ZeLan 추출물에 의해 조절되는 대표적인 주석 처리된 대사체들이다. 주석 처리된 52가지 대사체 특징의 전체 목록은 부록 표 1에 제공된다.

보충 표 1: 완전한 주석 처리된 대사체 데이터 세트. 대사체 이름, HMDB 식별자, 생화학적 분류, 배수 변화(fold change), P-값 및 조절 방향을 포함하여 대사체학 보고를 위해 유지된 52개 주석 처리된 대사체 특징의 전체 목록입니다.여기에서 이 파일을 다운로드하십시오.

보충 파일 1: 실험, 마이크로바이옴 및 대사체 분석을 뒷받침하는 소스 데이터. 이 워크북에는 원고에 제시된 그림과 표를 생성하는 데 사용된 샘플 정보, 임상 표현형 측정값, 16S rRNA 시퀀싱 다양성 지수, 문(phylum) 수준의 미생물 상대 풍부도, LEfSe 차별 분류군 분석, 대사체 차별 분석, 대표 대사체, KEGG 경로 농축 분석, 상관 행렬 데이터 및 데이터 검증 요약이 포함되어 있습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 연구는 ZeLan 추출물이 DHEA 유도 쥐 모델에서 PCOS 관련 내분비 및 대사 표현형을 개선하며, 이러한 효과가 장내 미생물 군집 구성 및 혈청 대사 프로필의 긍정적인 변화와 연관되어 있다는 증거를 제공합니다. 통합 멀티오믹스 분석 결과, ZeLan 처리는 고안드로겐혈증, 상승된 LH/FSH 비율 및 인슐린 저항성을 개선하는 한편, 장내 미생물의 알파 다양성을 일부 회복시키고 미생물 구성을 재균형화하며 PCOS 병태생리에 관여하는 여러 대사 경로를 정상화하는 것으로 나타났습니다. 이러한 발견은 전통 중약 성분에 대한 생물학적 반응에 대한 현재의 이해를 확장하며, PCOS 중재를 위한 잠재적 표적으로서 장-난소 축(gut-ovary axis)에 대한 추가 연구를 뒷받침합니다.

ZeLan 처리 후 혈청 testosterone 및 LH/FSH 비율의 감소는 flavonoid와 phenolic 화합물을 함유한 식물 추출물의 항안드로겐 특성을 입증한 이전 연구들과 일치합니다16. PCOS에 대한 한약물을 사용한 임상 연구의 종합적인 검토에서는 식물성 중재를 통한 내분비 및 대사 개선 사항들이 요약되었습니다17. ZeLan이 안드로겐 생합성을 조절하는 기전은 난소 스테로이드 생성 경로에 대한 직접적인 영향, 전신적 항염증 및 인슐린 민감성 촉진 효과, 또는 장내 미생물 대사산물과 관련된 간접적인 영향이 포함될 수 있으며, 본 설계로는 이러한 가능성들을 완전히 분리하여 규명할 수 없습니다. LH/FSH 비율의 개선은 PCOS에서 흔히 조절 장애가 나타나는 시상하부-뇌하수체-성선 축 기능의 부분적인 회복을 나타냅니다18. PCOS에 대한 중의학 처방 동물 실험의 체계적 문헌고찰에서도 생식 및 내분비 지표의 개선이 보고되었습니다19. 인슐린 관련 지표의 동시 개선은 ZeLan이 내분비 조절 외에도 말초 인슐린 신호 전달 강화 또는 인슐린 수용체 기능을 저하시키는 염증 매개체 감소를 통해 대사적 이점을 제공할 수 있음을 시사합니다20.

ZeLan 처리 후 장내 미생물의 알파 다양성 회복은 마이크로바이옴 관련 반응과 일치합니다. PCOS 모델 쥐에서 관찰된 알파 다양성 감소는 실험적 PCOS 모델과 임상군 모두에서 장내 미생물 불균형(dysbiosis)을 기록한 점점 더 많은 문헌들과 일치합니다21. Insenser 등은 PCOS의 장내 미생물 프로필이 성별, 성호르몬 및 비만의 영향을 받는다고 추가로 보고했습니다22. ZeLan 처리가 Shannon 지수를 4.19에서 5.79로 부분적으로 회복시켰다는 우리의 관찰 결과는 이 식물성 추출물이 미생물 군집 구조를 지원할 수 있음을 시사합니다. 이와 유사한 다양성 회복 효과가 폴리페놀이 풍부한 다른 식물 추출물에서도 보고되었으며, 이는 잠재적인 병원성 분류군을 억제하는 동시에 유익한 박테리아 군집을 선택적으로 촉진할 수 있음을 나타냅니다23. 문 수준에서 관찰된 분류학적 변화, 특히 ZeLan 처리 후 Firmicutes 대 Bacteroidetes 비율(F/B ratio)의 감소는 높은 F/B 비율과 비만 및 인슐린 저항성을 포함한 대사 기능 장애 사이의 기성 연관성을 고려할 때 매우 중요합니다24. PCOS 청소년을 대상으로 한 Jobira 등의 연구를 포함한 추가 연구에서도 위장관 미생물의 생물 다양성 변화가 보고되었으며, 이는 미생물 구성이 숙주 대사에 갖는 생물학적 관련성을 뒷받침합니다25.

PCOS 및 ZeLan 치료와 차별적으로 연관된 특정 세균 속(genera)의 식별은 본 연구에서 관찰된 미생물군-대사체 연관성에 대한 생물학적 맥락을 제공합니다. 건강한 대조군에서 Lactobacillus와 Ruminococcus가 풍부하고 PCOS 동물에서 감소한 것은 이들 속의 보호적 역할을 강조한 이전 보고들과 일치합니다26. Lactobacillus 종은 장벽 무결성을 유지하고 병원성 세균을 억제하는 젖산 및 항균 펩타이드를 생성하는 것으로 알려져 있으며, Ruminococcus 종은 식이섬유의 발효를 통해 단쇄지방산(SCFA)을 생성하는 중요한 역할을 합니다27. ZeLan 치료 후 이러한 유익한 속들이 회복된 것은 대사체 분석에서 관찰된 낙산(butyric acid) 수준의 증가가 반영하듯, 장벽 기능을 개선하고 SCFA 관련 대사 활동을 강화했을 가능성이 있습니다. 반대로, PCOS 동물에서 Bacteroides, Prevotella 및 Escherichia의 풍부도가 높아진 것은 이러한 속들이 염증성 및 대사 장애에 관여한다는 연구들과 일치합니다28. 특히 Escherichia coli를 포함한 Escherichia 종은 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 생성할 수 있으며, 이는 Toll-like receptor 4 신호를 통해 전신 염증과 인슐린 저항성을 유발하여 장내 미생물 불균형과 PCOS 관련 대사 기능 장애 사이의 타당한 연결 고리가 될 수 있습니다29.

대사체 분석 결과는 ZeLan 치료에 수반되는 장내 미생물군-숙주 간의 대사 연관성에 대한 근거를 제공합니다. lithocholic acid와 같은 2차 담즙산의 변화는 이러한 대사체들이 박테리아의 효소 활성을 통해 생성되기 때문에 생물학적으로 중요합니다30. 담즙산은 지질 흡수뿐만 아니라 farnesoid X receptor 및 Takeda G protein-coupled receptor 5를 통해 포도당 및 지질 대사를 조절하는 신호 분자로 작용하며, 이는 담즙산 프로파일의 정상화가 대사 항상성 개선에 기여할 수 있음을 시사합니다. 마찬가지로, butyric acid 수치의 회복은 장벽 기능 강화, 항염증 특성 및 인슐린 민감도 촉진을 포함한 여러 유익한 효과를 고려할 때 매우 중요합니다. 유익균과 보호 대사체 사이에서 관찰된 상관관계는 병원균과 유해 대사체 사이의 연관성과 대조를 이루며, 이는 직접적인 기전 검증의 필요성을 강조하는 동시에 장-난소 축 가설에 대한 연관적 근거를 제공합니다.

이러한 발견의 임상적 함의는 전임상 탐색적 설계의 한계 내에서 해석되어야 합니다. 본 결과는 PCOS 관리를 위한 보조적 접근법으로서 ZeLan 추출물의 추가적인 평가를 지지하며, 특히 내분비-대사 지표와 장내 미세환경 모두에 영향을 줄 수 있는 식물성 중재의 관점에서 그러합니다. 치료 반응과 관련된 미생물 및 대사 바이오마커의 식별은 향후 기전 및 중개 연구의 지침이 될 수 있습니다. 또한, 장-난소 축은 향후 ZeLan과 프로바이오틱스 또는 식이 조절을 통합한 병용 전략을 뒷받침할 수 있으나, 이러한 전략은 임상 적용 전에 대조군 검증이 필요합니다.

본 연구의 몇 가지 제한 사항에 대해 언급하고자 한다. 첫째, DHEA 유도 쥐 모델이 인간 PCOS의 여러 특징을 재현하지만, 마른 체형, 비만, 인슐린 저항성 및 염증성 아형을 포함한 인간 PCOS 표현형의 이질성을 완전히 포착하지는 못한다. 따라서 임상적 적용을 위해서는 특성이 잘 규명된 환자군에서의 검증이 필요하다. 둘째, 본 연구에서는 용량-반응 구배나 metformin과 같은 양성 약물 대조군 없이 단일 ZeLan 용량을 사용하였으므로, 유효 용량 범위, 비교 효능 및 최적 투여 주기는 향후 결정되어야 한다. 셋째, 샘플링이 종료 시점에만 수행되어 중재 기간 동안의 미생물군, 대사체 및 호르몬 프로필의 동적인 시간적 변화를 해석하는 데 한계가 있다. 넷째, 난소 조직병리학, 난포 수 측정, 황체 정량화 및 연속적인 발정 주기 모니터링이 이번 실험 설계에 포함되지 않았다. 따라서 난소 기능 회복은 조직 수준 및 주기 수준의 직접적인 평가가 아닌 내분비 및 대사 지표를 통해 추론되었다. 다섯째, 미생물 분류군과 대사체 간의 상관관계는 확인하였으나, 분변 미생물군 이식, 무균 동물 실험, 표적 대사체 보충, 염증 마커 분석 또는 CYP17A1, CYP19A1, StAR와 같은 난소 스테로이드 생성 효소 측정을 포함하지 않았다. 결과적으로 현재의 데이터만으로는 인과 기전을 확증할 수 없다. 여섯째, 비표적 대사체학은 발견 단계의 근거를 제공하므로, 향후 연구에서 lithocholic acid, butyric acid 및 testosterone와 같은 주요 대사체에 대한 표적 정량 검증이 필요하다. 일곱째, 베타 다양성 시각화, 미생물 기능 예측 및 통합 미생물군-대사체-유전자 경로 모델링이 이번 제출본에는 포함되지 않아 완전한 조절 네트워크를 구축하는 능력이 제한적이다. 마지막으로, ZeLan 추출물은 총 플라보노이드 함량으로 표준화되었으나, 활성 단량체에 대한 종합적인 정성 및 정량적 파이토케미컬 특성 분석이 여전히 필요하다.

결론적으로, ZeLan 추출물은 쥐 모델에서 PCOS 관련 내분비 및 대사 표현형을 개선하였으며, 장내 미생물 알파 다양성의 부분적 회복, 미생물 조성의 변화, 그리고 스테로이드 호르몬 생합성, 담즙산 대사 및 단쇄 지방산 관련 대사를 포함한 혈청 대사 경로의 조절과 연관이 있었습니다. 유익균과 보호성 대사산물 사이의 상관관계가 PCOS 농축균과 유해 대사산물 사이의 연관성과 대조를 이룬다는 점은 생물학적으로 타당한 장-난소 축(gut-ovary axis) 연관성을 뒷받침합니다. 이러한 발견은 PCOS 관리에서 ZeLan 추출물의 기전 및 중개 연구를 위한 기초를 제공하며, 동시에 인과 관계 검증과 더 폭넓은 식물 화학적 특성 분석의 필요성을 강조합니다.

공개 사항

저자들은 선언할 이해상충 관계가 없습니다.

감사의 글

본 연구는 허베이성 중의약관리국 과학연구 계획 프로젝트 (그랜트 번호 2021316)의 지원을 받아 수행되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세토니트릴Fisher Chemical / Thermo Fisher ScientificA955-4Optima LC-MS 등급, 4 L; 이동상 및 시료 재구성용
ACQUITY UPLC HSS T3 컬럼Waters Corporation186003539100 Å, 1.8 μm, 2.1 × 100 mm; UHPLC 분리
아가로스 겔 전기영동 시스템Bio-Rad Laboratories1704486Mini-Sub Cell GT 수평 전기영동 시스템; DNA 품질 평가
Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MSAgilent TechnologiesG7120A/G7167B/G7116B/G6550B6550 iFunnel Q-TOF MS와 결합된 1290 Infinity II UHPLC 모듈 세트; 혈청 비표적 대사체학 플랫폼
DADA2 알고리즘Bioconductor버전 1.24.0ASV 생성 및 키메라 제거; R 4.2.1/Bioconductor 3.15 워크플로와 일치하도록 추론된 버전
데히드로에피안드로스테론 (DHEA)Sigma-Aldrich / MilliporeSigmaD4000PCOS 모델 유도; 체중 100g당 6mg; CAS 53-43-0
증류수Invitrogen / Thermo Fisher Scientific10977015UltraPure DNase/RNase-Free 증류수; 대조군 및 모델군의 경구 투여용 용매
개미산Fisher Chemical / Thermo Fisher ScientificA117-50Optima LC-MS 등급, 50 mL; LC-MS 이동상용 0.1% 첨가제
인체 대사체 데이터베이스앨버타 대학교 / HMDBHMDB 5.0대사체 주석 데이터베이스
Illumina NovaSeq 6000 플랫폼Illumina20012850페어드 엔드(paired-end) 250 bp 16S rRNA 시퀀싱을 위해 시퀀싱 서비스 제공업체가 사용한 시퀀싱 시스템
Lycopus lucidus Turcz. 초본Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd.배치 ZL-20230315제란(ZeLan) 수성 추출물을 위한 인증된 식물성 원료
메탄올Fisher Chemical / Thermo Fisher ScientificA456-4Optima LC-MS 등급, 4 L; 혈청 대사체학을 위한 단백질 침전
METLIN 데이터베이스스크립스 연구소(Scripps Research)METLIN 클래식 2023대사체 질량 분석 주석 데이터베이스
NanoDrop 분광광도계Thermo Fisher ScientificND-ONE-WNanoDrop One 미세 부피 UV-Vis 분광광도계; DNA 양 및 순도 평가
QIAamp Fast DNA Stool Mini KitQiagen51604맹장 내용물로부터의 DNA 추출; 50-prep 대변 DNA 키트
QIIME2QIIME2 개발팀버전 2022.216S rRNA 서열 처리
R 소프트웨어R Foundation버전 4.2.1통계 분석 및 XCMS 처리
테스토스테론, LH, FSH 및 인슐린 측정을 위한 혈청 ELISA 키트Cusabio BiotechCSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070r혈청 호르몬 및 인슐린 정량을 위한 쥐 테스토스테론, LH, FSH 및 인슐린 ELISA 키트
참기름Sigma-Aldrich / MilliporeSigmaS3547DHEA 주입용 용매
펜토바르비탈 나트륨Sigma-Aldrich / MilliporeSigmaP3761마취; 50 mg/kg 복강 내 투여
SPSS 소프트웨어IBM Corporation버전 26.0통계 분석
범용 16S rRNA 프라이머 338F/806RSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.맞춤 합성: 338F/806RV3-V4 영역의 증폭; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT
XCMS 패키지Bioconductor / R버전 3.18.0피크 검출, 머무름 시간 정렬 및 적분
제란 추출물자체 제조 수성 추출물배치 ZLE-20230402경구 투여 처리; 표준화된 총 플라보노이드 ≥2.5%

참고문헌

  1. Joham AE, Norman RJ, Stener-Victorin E, et al. Polycystic ovary syndrome. Lancet Diabetes Endocrinol. 2022;10(9):668-680.
  2. Islam H, Masud J, Islam YN, et al. An update on polycystic ovary syndrome: a review of the current state of knowledge in diagnosis, genetic etiology, and emerging treatment options. Womens Health (Lond). 2022;18:17455057221117966.
  3. Azziz R, Carmina E, Chen Z, et al. Polycystic ovary syndrome. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16057.
  4. Fahs D, Salloum D, Nasrallah M, et al. Polycystic ovary syndrome: pathophysiology and controversies in diagnosis. Diagnostics (Basel). 2023;13(9):1559.
  5. Conway G, Dewailly D, Diamanti-Kandarakis E, et al. The polycystic ovary syndrome: a position statement from the European Society of Endocrinology. Eur J Endocrinol. 2014;171(4):P1-P29.
  6. Huddleston HG, Dokras A. Diagnosis and treatment of polycystic ovary syndrome. JAMA. 2022;327(3):274-275.
  7. Zhang J, Xin X, Zhang H, et al. The efficacy of Chinese herbal medicine in animal models of polycystic ovary syndrome: a systematic review and meta-analysis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022:4892215.
  8. Chen J, Na E, Lim SY. Effect of fractions from Lycopus lucidus Turcz. leaves on genomic DNA oxidation and matrix metalloproteinase activity. Comb Chem High Throughput Screen. 2022;25(10):1778-1784.
  9. Ślusarczyk S, Hajnos M, Skalicka-Woźniak K, et al. Antioxidant activity of polyphenols from Lycopus lucidus Turcz. Food Chem. 2009;113(1):134-138.
  10. Qi X, Yun C, Sun L, et al. Gut microbiota-bile acid-interleukin-22 axis orchestrates polycystic ovary syndrome. Nat Med. 2019;25(8):1225-1233.
  11. He FF, Li YM. Role of gut microbiota in the development of insulin resistance and the mechanism underlying polycystic ovary syndrome. J Ovarian Res. 2020;13(1):73.
  12. Chadchan SB, Singh V, Kommagani R. Female reproductive dysfunctions and the gut microbiota. J Mol Endocrinol. 2022;69(3):R81-R94.
  13. Puspitasari VD, Lestari ES, Pramono N. Testosterone induced Wistar rat model for gut microbiota dysbiosis of polycystic ovarian syndrome research. J Indones Med Assoc. 2024;74(3):132-140.
  14. Zhang J, Sun Z, Jiang S, et al. Probiotic Bifidobacterium lactis V9 regulates the secretion of sex hormones in polycystic ovary syndrome patients. mSystems. 2019;4(2):e00017-19.
  15. Xuan Y, Hong X, Zhou X, et al. The vaginal metabolomics profile with features of polycystic ovary syndrome: a pilot investigation in China. PeerJ. 2024;12:e18194.
  16. Hu M, Zhang Y, Guo X, et al. Hyperandrogenism and insulin resistance induce gravid uterine defects in association with mitochondrial dysfunction and aberrant ROS production. Endocrinology. 2019;160(9):2208-2223.
  17. Moini Jazani A, Nasimi Doost Azgomi H, Nasimi Doost Azgomi A, et al. A comprehensive review of clinical studies with herbal medicine on polycystic ovary syndrome (PCOS). DARU J Pharm Sci. 2019;27(2):863-877.
  18. McCartney CR, Marshall JC. Polycystic ovary syndrome. N Engl J Med. 2016;375(1):54-64.
  19. Cui Y, Zhang C, Li X, et al. Systematic review and meta-analysis of animal experiments on Bushen formulas for the treatment of polycystic ovary syndrome. Sci Rep. 2025;15(1):7648.
  20. Thackray VG. Sex, microbes, and polycystic ovary syndrome. Trends Endocrinol Metab. 2019;30(1):54-65.
  21. Torres PJ, Siakowska M, Banaszewska B, et al. Gut microbial diversity in women with polycystic ovary syndrome correlates with hyperandrogenism. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(4):1502-1511.
  22. Insenser M, Murri M, Del Campo R, et al. Gut microbiota and the polycystic ovary syndrome: influence of sex, sex hormones, and obesity. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(7):2552-2562.
  23. Guo Y, Qi Y, Yang X, et al. Association between polycystic ovary syndrome and gut microbiota. PLoS One. 2016;11(4):e0153196.
  24. Liu R, Zhang C, Shi Y, et al. Dysbiosis of gut microbiota associated with clinical parameters in polycystic ovary syndrome. Front Microbiol. 2017;8:324.
  25. Jobira B, Frank DN, Pyle L, et al. Obese adolescents with PCOS have altered biodiversity and relative abundance in gastrointestinal microbiota. J Clin Endocrinol Metab. 2020;105(6):e2134-e2144.
  26. Bai X, Ma J, Wu X, et al. Impact of visceral obesity on structural and functional alterations of gut microbiota in polycystic ovary syndrome (PCOS): a pilot study using metagenomic analysis. Diabetes Metab Syndr Obes. 2023;16:1-14.
  27. Rizk MG, Thackray VG. Intersection of polycystic ovary syndrome and the gut microbiome. J Endocr Soc. 2021;5(2):bvaa177.
  28. He S, Li H, Yu Z, et al. The gut microbiome and sex hormone-related diseases. Front Microbiol. 2021;12:711137.
  29. Chu W, Han Q, Xu J, et al. Metagenomic analysis identified microbiome alterations and pathological association between intestinal microbiota and polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2020;113(6):1286-1298.
  30. Yurtdaş G, Akdevelioğlu Y. A new approach to polycystic ovary syndrome: the gut microbiota. J Am Coll Nutr. 2020;39(4):371-382.

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