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방법 논문

대장균의 막 결합 프로테아제 FtsH와 어댑터 LapB에 의한 LpxC 분해를 위한 시험관 내 분석법

173 조회수

⸱

DOI:

10.3791/71092

⸱

2026년 6월 22일

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

이 논문에서

요약

대장균은 LPS 합성의 첫 단계를 촉매하는 탈아세틸화효소인 LpxC의 분해를 조절함으로써 지다당류(LPS) 생합성을 조절합니다. 이 프로토콜의 목표는 프로테올리포좀에서 재구성된 AAA+ 프로테아제 FtsH와 어댑터 LapB를 사용하여 LpxC에 대한 민감하고 정량적인 시험관 내 분해 검사를 확립하는 것입니다.

초록

이 프로토콜은 프로테올리포좀 내에서 재구성된 AAA+(다양한 세포 활동과 관련된 ATPase) 프로테아제 FtsH와 어댑터 LapB를 사용하여 LpxC의 민감하고 정 량적인 시험 관 내 분해 분석법을 제시합니다. AAA+ 프로테아제는 ATP 의존적 분자 기계로, 단백질 항상성을 유지하고 세포질 내 다양한 세포 과정을 조절합니다. 세포질 내 유사체와 비교할 때, 막에 결합된 AAA+ 프로테아제는 시험 관 내 재구성 및 활성 측정에 기술적 어려움으로 인해 특성 규명이 부족하다. 여기서는 FtsH–LapB–LpxC 시스템을 모델로 사용하여 프로테올리포좀에서 형광 기반 분해 분석법을 개발합니다. FtsH와 LapB는 원래의 막 환경을 모방하기 위해 프로테올리포솜으로 재구성되며, LpxC는 형광 염료 Atto488과 공유 공유 표지됩니다. 분해는 프로테올리포좀과 표지된 LpxC 및 ATP를 결합하여 시작하며, 트리클로로아세트산(TCA)으로 종료됩니다. 성공적인 분석은 TCA 침전 후 용해성 상원액 분획의 형광이 시간에 따라 증가하는 것으로 정의되며, 이는 LpxC 단백질분해에 의해 생성된 형광 펩타이드 조각의 방출과 일치합니다. 이 신호는 정의된 조건 하에서 초기 열화율을 직접 정량화할 수 있게 해줍니다. 기존의 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 기반 분석법과 비교할 때, 이 방법은 감도가 크게 향상되고 정량적 동역학적 분석을 가능하게 합니다. 더불어, 프로테올리포좀 시스템은 어댑터와 항어댑터 같은 단백질 구성 요소와 지질 조성이 LpxC 분해에 어떻게 영향을 미치는지 체계적으로 조사할 수 있게 합니다. FtsH–LapB–LpxC 시스템을 위해 개발되었지만, 이 분석법은 다른 막 결합 AAA+ 프로테아제 및 기질에도 쉽게 적응할 수 있어, 시험관 내 막 관련 단백질분해 연구를 위한 일반적인 플랫폼을 제공합니다.

서론

AAA+ 프로테아제는 보존된 ATP 의존적 분자 기계로, 단백질 품질 관리와 조절 단백질분해에 중심적인 역할을 합니다 1,2. 이 기계들은 AAA+ ATPases 도메인의 헥사머 고리를 포함하고 있으며, ATP를 가수분해하고 인식하며 펼쳐진 후 기질을 구획 프로테아제 도메인으로 전사하여 분해합니다. ClpXP3 및 Lon4와 같은 세포질 AAA+ 프로테아제는 잘 확립된 시험관 내 분석법을 통해 광범위하게 특성화되었으나, 막 결합형 AAA+ 프로테아제는 비교적 잘 알려져 있지 않습니다. 이 격차는 주로 막 단백질을 정의된 지질 환경으로 재구성하고 시험관 내에서 단백질분해 활성을 정량적으로 측정하는 데 관련된 기술적 어려움을 반영합니다. 이 방법의 궁극적인 목표는 막에 결합된 프로테아제의 단백질분해 활성을 조사하기 위한 민감하고 정량적인 분석법을 확립하는 것입니다.

FtsH는 대장균에서 유일한 필수 AAA+ 프로테아제이며, 원형적인 막 결합 AAA+ 프로테아제 5,6,7 역할을 합니다. N-말단 막관통 나선에 의해 내막에 고정된 FtsH는 다양한 세포질 및 막 관련 기질을 분해하여 막 단백질 품질 관리, 스트레스 반응, 지질 항상성 8,9,10,11을 조절합니다. 이 기질 중 가장 잘 알려진 기질 중 하나는 용해성 탈아세틸화효소인 LpxC로, 지지다당류(LPS) 생합성의 첫 단계를 촉매합니다12,13. FtsH에 의한 LpxC의 효율적인 분해는 LpxC를 특이적으로 인식하고 프로테아제 14,15,16,17,18에 전달하는 어댑터 역할을 하는 막 단백질 LapB가 필요합니다.

생리학적 중요성에도 불구하고, FtsH 매개 단백질분해의 시험관 내 정량 분석은 특히 LpxC와 같은 세포질 기질에 대해 제한적이다. 전통적인 시험관 분해 분석은 세제 미셀13,19에서 정제된 FtsH를 사용하는데, 이 미셀은 막에 고정된 프로테아제를 위한 막 환경을 제공하지 않는다. 또한, 분해 분석은 종종 SDS–PAGE 기반기판 소실 검출에 의존하는데, 이는 노동 집약적이고 처리량이 적으며 동역학적 분석에 민감하지 않을 수 있습니다. 최근에는 FtsH를 비셀로 재구성하여 막 기질의 분해를 연구하는 데 사용되었으며, 이는 홍희덕(Heedeok Hong)의 그룹20이 선구한 바와 같이; 그러나 세포질 기질을 분석하는 유사한 시스템은 여전히 부족하다. 여기서는 홍희덕의 비세포 재구성을 프로테올리포솜 재구성으로 적응시켜 막 환경을 모방합니다. 이와 더불어, 수용성 기질 LpxC는 형광 표지되어 있어 시험관 내에서 FtsH/LapB 의존적 LpxC 분해의 동역학을 민감하고 정량적으로 측정할 수 있습니다.

이 방법은 연구자들이 수용성 기질의 FtsH 매개 단백질분해를 정량적으로 측정해야 할 때 사용해야 합니다. 기존 접근법에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 첫째, 기질 소멸 대신 형광 기반 단백질분해 생성물 검출이 감도와 동적 범위를 크게 향상시켜 단백질 분해 활성의 정량적 비교를 용이하게 합니다. 둘째, 프로테올리포좀의 사용은 FtsH 기능에 필요한 막 맥락을 보존하면서도 단백질과 지질 조성을 정밀하게 조절할 수 있게 합니다18. 마지막으로, FtsH–LapB–LpxC 시스템을 사용해 개발되었음에도 불구하고, 이 프로토콜은 막 관련 분해 기구가 필요한 다른 막 결합 AAA+ 프로테아제와 그 세포질 기질에도 쉽게 적응할 수 있습니다.

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프로토콜

1. Atto488로 LpxC 표지 표지

  1. LpxC 제제
    1. 이전에 보고된 LpxC 단백질을 발현 및 정제하는18. 정제된 LpxC 완충액을 Tris에서 50 mM 인산 버퍼, pH 7.6(6 mM NaH2PO4, 44 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl)로 고해상도 젤 여과 컬럼(예: Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼)으로 교환합니다.
    2. 4 °C에서 울트라프와 컬럼을 사용해 최소 5 mg/mL 농도로 LpxC를 농축합니다.
  2. Atto488로 LpxC 라벨링
    1. 50 mM 인산염 완충액에 0.5 mg의 LpxC를 희석하여 최종 부피 225 μL로 만듭니다. 1 M 중탄산나트륨 25 μL를 첨가하여 pH를 약 8.3으로 조정합니다.
    2. 0.24 mg의 Atto488 반응성 염료를 0.1 M 중탄산나트륨 완충제 20 μL에 용해하여 0.012 mg/μL 정액을 만듭니다. 2 μL 스톡 용액을 0.1 M 중탄산나트륨 완충제 18 μL에 희석하여 최종 농도가 0.0012 mg/μL로 만듭니다.
    3. 즉시 Atto488 작업 용액 4μL을 단백질 용액에 추가하는데(LpxC: Atto488의 몰 비율 3:1에 해당합니다). 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 4°C에서 2시간 동안 부드럽게 저으며 18rpm 부양합니다.
      참고: Atto488 스톡과 작동 용액 모두 액체 질소에 급속 냉동하여 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
  3. LpxC–Atto488의 자유 염료 분리
    1. PD-10 탈염 컬럼을 초순수 10mL와 평형을 맞추고, 이어서 pH 7.6의 50 mM 인산염 완충액 15 mL를 투여합니다.
    2. 표지 반응 혼합물을 컬럼에 적용하고 완전히 수지에 흡수되도록 합니다.
    3. 50 mM 인산염 완액 5mL, pH 7.6으로 유출합니다. LpxC–Atto488(첫 번째 밴드)과 자유 Atto488 염료(두 번째 밴드)에 해당하는 두 개의 뚜렷한 밴드가 보이게 됩니다. 첫 번째 밴드에서 분획을 ~0.5 mL 단위로 수집합니다.
    4. SDS-PAGE로 용출된 분획을 분석합니다. 쿠매시 브릴리언트 블루(CBB) 염색 전에 자외선 조명 하에서 형광을 시각화하세요.
    5. LpxC–Atto488을 포함한 분획을 혼합하여 표지된 단백질을 약 2 mg/mL로 농축합니다.
    6. 마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 단백질 농도와 Atto488 농도를 측정하여 표지 효율을 추정합니다.
      참고: Atto488 농도(pmol/μL 단위)와 LpxC 농도(mg/mL 단위)의 비율이 2–5 범위에 이르면 적절한 표지 수준을 나타냅니다. 이는 표지 후 Atto488과 LpxC의 몰 비율이 1:15에서 1:6 사이임을 의미합니다.
    7. LpxC–Atto488을 1.5mL 마이크로 원심분리관에 넣고, 액체 질소에 급속 냉동한 후 -80 °C에서 보관합니다. 이 시점에서 프로토콜은 최대 3개월까지 일시 중지할 수 있습니다.
      주의: 액체 질소는 매우 차갑습니다; 적절한 보호 장비(냉동 장갑, 안구 보호구)를 착용해 다루세요.

2. FtsH/LapB의 프로테올리포좀 재구성

  1. 리포좀 준비
    1. 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC) 100mg을 클로로포름 형태로 유리 시험관에 옮깁니다. 용매를 부드러운 N₂ 흐름 아래에서 증발시키고, 진공 상태에서 하룻밤 건조합니다.
      참고: POPC는 ~-2 °C의 상전이 온도를 가지며, 막 생물물리학, 리포좀 제형, 세포 모델 시스템에서 널리 사용됩니다.
      주의: 클로로포름은 눈, 피부, 간, 신장, 신경계에 해를 끼칠 수 있습니다. 취급 시 적절한 보호 장비(장갑, 안구 보호구, 마스크)가 필요합니다. 후드에 넣어 유리 주사기를 사용해 만져보세요.
    2. 건조된 POPC 필름에 1,315 μL 버퍼 A(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl)를 첨가합니다. 지질을 재현탁하는 방법은 1분간의 수조 초음파 검사와 최대 속도로 1분간의 소용돌이 운동을 번갈아 가며 총 ~15분 동안 또는 완전히 분산될 때까지 반복합니다. (최종 지질 농도: 100 mM).
      참고: 지질 재현탁을 개선하려면 수욕 초음파 장치의 유리 시험관의 침수 깊이를 조절하여 교반을 극대화하세요. 재부유된 지질은 -20°C에서 저장할 수 있습니다. 이 시점에서 프로토콜은 최대 1개월까지 일시정지할 수 있습니다.
    3. 리포솜 현탁액을 200 μL 단위로 분리하여 -20 °C에서 보관합니다.
  2. 리포좀 추출
    1. 200 μL 리포솜 알리코트를 상온 물에서 해동한 후 800 μL 완충제 A로 희석하여 최종 부피 1 mL로 만듭니다.
    2. 리포좀을 상온에서 액체질소와 물욕을 번갈아 사용하여 세 번의 동결-해동 사이클을 가하세요.
    3. 주사기, 두 개의 필터 지지대, 그리고 완충제가 있는 200nm 폴리카보네이트 멤브레인을 세척하세요. 미니 익스트루더를 조립하고 리포좀을 20번 압출하세요.
      참고: 지질체 현탁액은 압출 후 투명해 보여야 합니다.
    4. 1 mL 압출된 리포좀 현탁액을 세 개의 튜브(튜브당 330 μL)로 나누고, 각각 600 μL 완충제로 희석합니다.
  3. Triton X-100 부풀어 오르는 조절
    참고: Triton X-100은 저임계 미셀 농도(CMC) 세제이며, 많은 경우에 가장 효과적인 것으로 입증되었습니다21
    주의: Triton X-100은 주로 심각한 눈 손상, 피부 자극, 그리고 삼킬 경우 해로운 영향을 일으키는 유해한 화학물질입니다. 취급 시 적절한 보호 장비(장갑, 안구 보호구)가 필요합니다.
    1. 100 μL 트리톤 X-100을 900 μL 초순수수와 혼합하여 셰이커에서 배양하여 완전히 녹여 10% (v/v) 트리톤 X-100을 준비합니다.
    2. 분광광도계를 사용해 540 nm(A₅₄₀) 거리에서 리포좀의 흡광도를 측정합니다.
    3. 10% Triton X-100 5μL 알리코트를 순차적으로 첨가하고, 각 첨가 후 부드럽게 섞은 후 A₅₄₀를 측정합니다. A₅₄₀가 최대치에 도달할 때까지 Triton X-100을 계속 첨가한 후, Triton X-100을 추가로 4–5번 추가하여 흡광도가 최대 값의 약 60%까지 감소할 때까지 반복합니다.
    4. 적정 곡선을 바탕으로 10% Triton X-100 35 μL을 첨가하여 지포좀을 부풀리고, 상온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하며 배양합니다.
  4. FtsH/LapB의 리포좀으로의 재구성
    1. 앞서 설명한 대로 FtsH와 LapB 단백질을 발현 및 정제합니다.
    2. 비극성 폴리스티렌 흡착제(예: Bio-Beads SM-2)를 메탄올 10부피와 함께 한 번, 에탄올 10부피, 초순수 10부피로 10회를 세척합니다. 세척된 흡착제는 4°C의 버퍼 A에 보관합니다.
    3. Triton X-100-부풀어 오른 리포좀 각 튜브마다 500 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) 3 μL 투여, FtsH 22.5 μg, LapB 22.5 μg 추가. 완충액 A를 사용해 총 부피를 1mL로 조절하고, RT에서 1시간 동안 부드럽게 저으며 배양합니다.
      참고: 단백질 대지질 비율은 1:20에서 1:200(wt/wt)으로 프로테올리포좀 재구성 과정에서 일상적으로 사용되었습니다. 여기서는 1:100 비율이 사용됩니다.
    4. 비극성 폴리스티렌 흡착제를 사용한 순차적 배양으로 세제를 제거하세요: 40mg을 RT에서 0.5시간, 이어서 RT에서 40mg을 1시간, 40mg을 4°C에서 하룻밤, 마지막으로 40mg을 4°C에서 1시간 동안 사용합니다.
    5. 4 °C(400 × g 동안 3초)에서 비극성 폴리스티렌 흡착제를 잠시 원심분리합니다. 상정액을 초원심분리관으로 옮기세요. 비극성 폴리스티렌 흡착제를 1mL의 완충제로 세척한 후 상청액과 혼합합니다. 최종 부피 ~6 mL에 추가 버퍼 A를 추가합니다.
      참고: 안전을 위해 초원심분리관에는 최소 6mL의 액체가 포함되어야 합니다.
    6. 튜브와 초원심분리기를 고정각 로터(예: MLA-80)에서 45 분 동안 45분 동안 4×5분 동안 조절하여 프로테올리포좀을 펠릿으로 만듭니다.
    7. 상청액을 버리고 프로테올리포솜 펠릿을 70 μL 버퍼 A에 1 mM TCEP를 보충하여 재현탁합니다.
      참고: 최종 프로테올리포솜 부피는 약 100 μL입니다.
    8. 프로테올리포솜을 액체 질소에 급속 냉동하여 -80 °C에서 보관합니다.
      참고: 이 시점에서 프로토콜은 최대 1개월까지 일시정지할 수 있습니다.
  5. 프로테올리포좀의 SDS-PAGE 분석
    1. 프로테올리포좀을 충분히 혼합하여 5 μL의 샘플과 2× SDS 로딩 버퍼 5 μL(0.1 M Tris-HCl, pH 6.8, 5% SDS, 20% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루, 200 mM DTT)을 결합합니다.
    2. 프로테올리포솜 샘플을 525 ng FtsH(20 μL에서 0.06 μM FtsH 헥사머에 해당)와 함께 4–20% SDS-PAGE 겔에 적재합니다.
    3. 젤에 CBB를 염색하세요.
    4. 겔을 스캔하여 각 샘플의 FtsH 밴드 강도를 정량화하세요. 525 ng FtsH에 해당하는 프로테올리포좀 현탁액의 부피를 계산하세요.

3. 시험 관 내 LpxC–Atto488 분해

  1. 분해 완충제(50 mM 트리스-아세테이트, pH 8.0, 10 mM 트리스-아세테이트, 10 mM 아세테이트, 5 mM ATP, 25 μM Zn-아세테이트, 80 mM NaCl, 1.4 mM β-머카프토에탄올)를 포함한 20 μL 반응에서 시험 관 분해 분석을 수행합니다.
  2. 각 기판 농도를 측정할 때는 70 μL 반응을 준비합니다.
    1. 20 μL 분획을 취해 즉시 5% 트리클로로아세트산(TCA) 48 μL과 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 혼합하여 소금합니다(0분). 두 번째와 세 번째 분열을 각각 10분과 20분에 소금하세요.
    2. 동시에 배경 감량을 위해 프로테올리포좀이 없는 대응 대조 반응을 준비합니다.
      참고: 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 세 번의 반복 측정이 권장됩니다.
      LpxC–Atto488을 다룰 때는 빛 노출을 최소화하세요.
      주의: TCA는 매우 부식성이 강한 화학물질로, 흡입 시 심각한 피부 화상, 영구적인 눈 손상, 심한 호흡기 자극을 유발합니다. 적절한 보호 장비(장갑, 안구 보호구, 마스크)를 착용해 처리하세요.
  3. 샘플을 37°C에서 30분간 배양하여 단백질을 침전시키고, 18,800 × g 에서 실온에서 20분간 원심분리합니다.
  4. 500 mM Tris-HCl, pH 8.8의 60 μL 튜브에 50 μL 상청액을 전달하여 샘플을 중화시킵니다. 잘 섞은 후 100 μL를 검은색 96웰 플레이트에 전달합니다. 플레이트 리더기를 사용해 498 nm에서 여기, 520 nm에서 방출하는 형광을 측정합니다.

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결과

시험 관 분해 분석의 감도를 높이기 위해 기질 LpxC에 형광 염료 Atto488이 표지되었습니다. Atto488의 석시니미딜 에스터기는 약한 알칼리성 조건에서 LpxC의 1차 아미노기와 효율적으로 반응합니다. Tris 버퍼에는 이 반응을 방해하는 1차 아민이 포함되어 있기 때문에, Tris 버퍼에서 정제된 LpxC는 표지 전에 겔 여과를 통해 인산 버퍼로 교환되었습니다. 표지 반응에서는 LpxC와 Atto488의 몰 비율 3:1을 사용하여 중간 정도의 표지를 달성하고 과도한 표지를 피하였습니다(논의 참조). 자유 염료를 제거한 후, LpxC–Atto488 분획을 SDS–PAGE로 분석하였고, 자외선(UV)에서 형광을 시각화하였습니다(그림 1A). 같은 젤을 CBB로 염색하여 LpxC 단백질의 존재를 확인했습니다(그림 1B). 형광 및 단백질 대대...

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토론

이 프로토콜의 첫 번째 중요한 단계는 LpxC의 Atto488 라벨링입니다. 시험 관 내 분해 활성을 정확히 측정하기 위해서는 적당한 표지가 매우 중요합니다. 최적화 실험에 따르면, LpxC와 Atto488의 몰 비율이 9:1에서 3:1 사이가 최적입니다. 과도한 Atto488은 과도한 라벨링을 초래하여 LpxC의 원유 상태를 교란시키는 것으로 보입니다. 이러한 조건에서 FtsH 단독과 FtsH/LapB에 의한 LpxC–Atto488의 분해 차이는 현저히 줄어든다(데이터 미공개). 반대로, 불충분한 표지는 민감한 동역학적 측정에 너무 약한 형광 신호를 생성합니다. 이 프로토콜을 다른 수용성 기판의 열화를 측정하기 위해 적용할 때, 기판과 Atto488의 몰 비율 3:1이 유용한 출발점이 됩니다.

FtsH/LapB가 프로테올리포좀으로 재구성되는 효율을 결정하는 것은 프로토콜의 두 번째 중요한 단계입니다. ...

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공개 사항

저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

모든 연구는 예일 대학교에서 수행되었습니다. W.M.은 국립 일반 의학 과학 연구소(NIPM)의 수상 번호 R01GM137068과 RM1GM149406 지원, 그리고 리처드 및 수잔 스미스 가족 재단의 오디세이 상을 통해 지원받고 있습니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA scientific1415-2500
200 nm polycarbonate membraneAvanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGE수제
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA26209
Atto 488 Protein Labeling KitSigma38371
Bio-Beads SM-2 Bio-Rad152-8920비극성 폴리스티렌 흡착제 
검은색 96-well plate Costar3915
Bromophenol blueSigma114391
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
EthanolSigma459844
Filter supportAvanti Polar Lipids610014
Glass syringeAvanti Polar Lipids610017
Glass test tubeKIMBLE45066-16150
GlycerolAvantor2136-01
Magnesium acetate tetrahydrateSigma228648
MethanolSigma179337
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75-002-436
Mini-extruderAvanti Polar Lipids610000
MLA-80 rotor Beckman367096고정각 로터 
Plate readerTecanInfinite M1000 PRO
POPC Avanti Polar Lipids850457C
Refrigerated microcentrifugeThermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
Sodium bicarbonate SigmaS6014
Sodium chlorideSigmaS9888
Sodium dihydrogen phosphateSigma38400100
Sodium phosphate dibasicSigma567547
SonicatorFisherbrandFB-11201
SpectrophotometerSCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva 28990944고해상도 겔 여과 컬럼 
탁상형 초원심분리기BeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
Trichloroacetic acid SigmaT6399
Tris BaseSigma252859
Triton X-100 SigmaT8787
초원심분리기 튜브 Beckman355647
초여과 컬럼 MilliporeUFC8030
Vortex-Genie 2 MixerScientific IndustriesSI-0236 
Zinc acetate dihydrateSigma379786
β-mercaptoethanolSigma444203
```

참고문헌

  1. Sauer, R. T., Baker, T. A. Aaa+ proteases: ATP-fueled machines of protein destruction. Annu Rev Biochem. 80 (1), 587-612 (2011).
  2. Neuwald, A. F., Aravind, L., Spouge, J. L., Koonin, E. V. AAA: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res. 9 (1), 27-43 (1999).
  3. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpxP degradation machine. Mol Cell. 5 (4), 639-648 (2000).
  4. Gur, E., Sauer, R. T. Recognition of misfolded proteins by Lon, a AAA+ protease. Genes Dev. 22 (16), 2267-2277 (2008).
  5. Ogura, T., Wilkinson, A. J. Aaa+ superfamily ATPases: Common structure-diverse function. Genes Cells. 6 (7), 575-597 (2001).
  6. Tomoyasu, T., et al. The Escherichia coli FtsH protein is a prokaryotic member of a protein family of putative ATPases involved in membrane functions, cell-cycle control, and gene expression. J Bacteriol. 175 (5), 1344-1351 (1993).
  7. Tomoyasu, T., et al. Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli. J Bacteriol. 175 (5), 1352-1357 (1993).
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FtsH 프로테아제LapB 어댑터프로테오리포좀 재구성AAA+ 프로테아제형광 분석단백질 항상성속도론적 분석

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