혈장 miR-362-3p와 도플러 초음파 병용 유방암 진단 효능

요약

유방암 진단률은 상대적으로 낮습니다. 4복면 표 방법을 사용하여 miR-362-3p의 유방암 진단 가치를 도플러 초음파와 함께 분석하였습니다. 도플러 초음파와 miR-362-3p의 조합은 진단 효능을 효과적으로 향상시켜 유방암 진단에 유망한 방법을 제시했습니다.

초록

유방암은 세계에서 두 번째로 흔한 악성 종양으로, 여성의 생명을 심각하게 위협하고 막대한 경제적 부담을 안겨줍니다. 본 연구는 miR-362-3p와 도플러 초음파를 결합하여 유방암 진단에 미치는 가치를 탐구하는 것을 목표로 합니다. 총 182명의 유방암 환자와 147명의 양성 유방 질환 환자가 이 연구에 포함되었습니다. 환자의 혈장 miR-362-3p 수치는 실시간 형광 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)을 사용하여 측정하였습니다. 카이제곱 검정은 두 환자 그룹 간 도플러 초음파 매개변수 차이를 분석하는 데 사용되었습니다. 수신자 특성(ROC) 곡선을 사용하여 miR-362-3p, 저항 지수(RI), 펄서틸리 지수(PI)의 진단 효과를 평가하였습니다. 유방암에서 도플러 초음파와 혈장 miR-362-3p의 진단 효율은 4중 표 방법을 통해 분석되었습니다. 유방암 환자에서 miR-362-3p 수치는 현저히 감소했습니다. 2차원 초음파 파라미터에서는 유의한 차이가 있었습니다. miR-362-3p, RI, PI는 유방암 진단 가치가 있습니다. 세 요인의 합산 진단 값이 더 높았습니다. 초음파와 miR-362-3p의 병용 치료는 유방암 진단에서 민감도, 정확성 및 음성 예측 가치를 유의하게 향상시켰습니다. 도플러 초음파와 miR-362-3p를 병용하면 유방암 진단 효율성을 높일 수 있으며, 이는 비침습적이고 잠재적인 보조 진단 도구가 될 수 있습니다.

서론

국제암연구소(IAEC) 통계에 따르면, 2020년 유방암 발생률이 폐암을 능가했습니다. 유방암은 전 세계적으로 흔히 발생하는 악성 종양으로, 전 세계 여성의 암 관련 사망 원인 중 주요 원인^입니다. 유방암의 적시한 진단은 환자의 예후에 유익합니다. 조직 생검은 유방암 진단의 금본위입니다. 하지만 이는 침습적 진단의 한 종류이며, 초기 유^{방암 환자}에게는 적용되지 않습니다.

도플러 초음파는 유방암 검진 및 보조 진단에 일반적으로 사용되는 영상 기법입니다. 도플러 초음파는 결절의 크기, 혈류 신호, 림프절 전이 상태를 정확히 평가할 수 있습니다^. 유방 도플러 초음파는 이온화 방사선이 없고, 안전성과 비침습성, 그리고 반복 가능한 검사 능력 등 장점 덕분에 유방암 선별 및 진단에서 가장 널리 사용되는 영상 기법 중 하나가^{되었습니다.} 그러나 도플러 초음파는 밀도가 낮거나 부피가 적은 유방암을 발견할 때 조직 배경에 의해 간질이 발생하기 쉬워 진단 민감도가 크게 저하되고 조기 진단의 임상적 요구를 충족하기 어렵게 만듭니다^. 따라서 도플러 초음파 기술의 한계를 극복할 수 있는 혈장 바이오마커를 개발해야 합니다. 두 방법을 결합해 유방암 진단의 민감도를 높일 수 있다면, 임상적으로나 실질적으로도 상당한 가치를 가질 것입니다.

마이크로RNA(miRNA)는 약 20에서 24 뉴클레오타이드 길이를 가진 비암호화 RNA 분자 클래스입니다 ^7,8. miRNA의 특징 중 하나는 진화 과정에서 높은 보존 성격을 보인다는 점입니다. miRNA는 다양한 인간 조직 세포에서 특이적으로 발현될 뿐만 아니라 혈액과 타액 같은 여러 체액에서도 안정적으로 존재할 수 있는 넓은 조직 분포를 가지고^{있습니다.} 이러한 분포 특성은 비침습적 진단 표지자 개발에 이점을 제공합니다. 기능적으로 miRNA는 3' 비번역 영역(UTR)에 상보적으로 결합하여 mRNA를 분해^{하며, 세포} 염증 반응, 산화 스트레스, 세포자멸사, 증식 및 분화 등 일련의 주요 병리학적·생리학적 과정에 참여합니다 ¹². 많은 연구들이 miRNA 발현 프로필의 비정상적인 변화가 유방암의 발생 및 발병과 밀접한 관련이 있음을 확인했습니다^13,14. miRNA 발현의 조절 이상은 종양 유전자 또는 종양 억제 유전자의 발현 네트워크를 조절함으로써 유방 상피세포의 악성 변형을 촉진할 수 있습니다. miR-362-3p는 종양 진행을 억제하는 전형적인 인자입니다. 여러 보고서에서 miR-362-3p가 유방암 진행을 억제한다는 사실이 밝혀졌습니다^{15, 16, 17}. Assiri 등은 miR-362-3p의 저발현이 유방암 환자에서 예후가 좋지 않고 전체 생존율이 짧아진다는 사실을 보고했습니다¹⁵. 기전적으로 miR-362-3p는 DEAD-box helicase 5(DDX5)를 표적으로 하여 암세포의 증식, 침윤 및 이동을 촉진함으로써 유방암에서 항종양 효과를 발휘했다¹⁶. 또한 강 연구팀은 miR-362-3p가 유방암 조직에서 유의미하게 하향 조절되었으며, miR-362-3p 발현의 표적 조절이 유방암 관리에 있어 새로운 잠재적 치료 전략이 될 수 있음을 발견했습니다¹⁷. 하지만 miR-362-3p가 유방암의 조기 진단 지표로 작용할 수 있는지에 대한 보고는 없습니다.

이 연구는 혈장 내 miR-362-3p의 발현 수준을 측정하고, 동시에 유방암 환자의 도플러 초음파 핵심 영상 매개변수를 분석하였습니다. 연구는 혈장 miR-362-3p 발현 수준과 도플러 초음파 이미지 매개변수의 결합 적용 가치를 철저히 조사하였으며, 유방암 선별 및 양성 및 악성 유방 질환 간 감별 진단에서 이 통합 진단 접근법의 효과를 명확히 입증하였습니다.

프로토콜

이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었습니다. 승인은 산둥 제2의과대학 임상의학부 산둥 제2의과대학 산동성 제2의과대학 산동성 제2의과대학 산동성 제2의과대학 산하병원 산동성 제2의과대학 산태 부속병원 윤리위원회로부터 승인되었습니다(승인 번호: wyfy-2023-ky-124). 연구에 참여한 모든 피험자로부터 사전 동의를 받았습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 실험 대상

표본 크기 계산은 독립 표본 t-검정을 기반으로 한 G*Power 3.1 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 중간 효과 크기(코헨의 d = 0.5, 임상 관찰 연구에서 널리 사용됨), 양측 검정, α = 0.05, 검정권 (1 − β) = 0.95가 설정되었습니다. 계산 결과, 그룹당 최소 105명의 참가자가 필요하다고 나타났습니다. 마지막으로 182명의 유방암 환자와 양성 유방 병변 환자 147명이 등록되었으며, 두 그룹 모두 최소 샘플 크기를 훨씬 초과하여 연구 결론을 뒷받침할 충분한 통계적 역량을 확보하고 제2형 오류 위험을 허용 범위 내에서 통제하였습니다. 모든 참가자는 통합 포함 및 제외 기준에 따라 엄격하고 연속적으로 등록되었습니다.

2023년부터 2024년까지 모든 환자가 산둥 제2의과대학 임상의학부 산둥 제2의과대학 산동성 제2의과대학 산하 제2의과대학 산하 제2의과대학 부속병원에 등록되었습니다. 양성 병변: 비악성 병변은 병리학적으로 확인되었습니다. 유방암: 병리학적으로 악성 종양이 확인되었습니다. 모든 참가자로부터 하룻밤 금식 후 정맥 혈액 샘플을 채취하였습니다. 정맥 혈액 샘플은 항응고 및 원심분리되어 혈장을 분리했으며, 표준 절차를 엄격히 준수한 후 장기 저장을 위해 −80°C로 옮겨졌고, 이후 miRNA 추출에 사용되었습니다. 모든 혈장 샘플은 miRNA 분해를 방지하기 위해 RNA 추출 전 최대 두 번의 동결-해동 사이클로 엄격히 제한되었습니다. 모든 환자는 연구 프로토콜에 대해 충분히 알았으며, 등록 전에 자발적으로 서면 동의서를 제공하였습니다.

유방암 환자 포함 기준: (1) 병리학적으로 확진된 원발성 유방암 환자. (2) 등록 전 수술 치료가 없음. (3) 샘플 채취 전에 방사선 치료나 화학요법을 받지 않은 경우.

양성 유방 질환 환자 포함 기준: (1) 병리학적으로 양성 유방 병변이 확인됨. (2) 다른 전신 악성 종양이나 전암성 병변이 없음. (3) 임신하지 않고 젖이 없는 상태. (4) 중증 급성 감염 또는 만성 염증성 질환이 없음.

유방암 및 양성 유방 병변 환자의 제외 기준: (1) 중증 유방 감염 또는 급성 중증 질환. (2) 심각한 간 또는 신장 기능 장애, 또는 자가면역 질환. (3) 6개월 이내에 호르몬 치료를 받은 환자.

2. 도플러 초음파 검사

환자의 양측 유방은 도플러 초음파를 사용해 네 사분면에 걸쳐 철저히 검사되었습니다. 2차원 초음파 스캔을 사용하여 병변의 경계, 형태, 내부 반향, 후방 반향파, 병변의 종횡비 등을 기록하였습니다. 컬러 도플러 유동 영상을 적용하여 병변의 혈류 지표(저항 지수(RI), 맥박 지수(PI), 최대 혈류 속도(V_max)를 평가하였습니다. 혈류 신호는 이전에 보고된 분류 체계¹⁸에 따라 등급이 매겨졌습니다: 등급 0: 혈류 신호 없음; 1등급: 혈류 신호가 미미함; 2등급: 혈류 신호 길이가 병변 직경의 절반을 초과합니다; 3등급: 풍부한 혈류 신호.

3. 유방암 초음파 진단에 대한 긍정적 정의

여기에는 (1) 모호한 경계; (2) 불규칙한 형태; (3) 내부 에코가 고르지 않음; (4) 약화된 후방 에코; (5) 종횡비 >1; (6) RI > 0.70; (7) PI > 1.50; (8) 최대 혈류량(Vmax)> 18.00 cm/s; (9) 혈류 신호 ≥ 2등급. 위의 의심스러운 기준을 충족하는 병변은 초음파 양성으로 분류되고, 의심스러운 특징이 없는 병변은 초음파 음성으로 분류됩니다.

4. 실시간 형광 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)

혈장 miRNA는 특수 miRNA 추출 키트를 사용해 추출되었습니다. 성공적으로 추출된 RNA 샘플은 특수 miRNA 역전사 키트를 사용해 cDNA 합성에 사용되었습니다. miR-362-3p의 역전사 반응 조건: 이 반응의 총 부피는 20 μL이었습니다. PCR 반응 절차는 다음과 같았습니다: (1) 혼합물을 37°C에서 15분간 배양, (2) 역전사 반응을 42°C에서 50분간 수행, (3) 효소를 95°C에서 5분간 비활성화함. 제품은 4°C에서 보관되었습니다. qPCR 반응 조건: 반응 시스템 전체 부피는 20 μL였습니다. 증폭 조건은 다음과 같이 수행되었습니다: (1) cDNA를 사전 변성시키고, DNA 중합효소를 95 °C에서 2분간 활성화시켰습니다. (2) DNA 가닥이 어닐링되어 60 °C에서 30초간 확장됩니다. 위의 두 단계는 총 40주기 동안 수행되었다. 유전자 상대 발현은 2^-(ΔΔCt) 공식으로 계산되었습니다. miR-362-3p 상대 발현은 U6에 의해 보정되었습니다. 내인성 대조군으로서 U6의 안정성을 평가하기 위해 플라즈마 코호트에서 BestKeeper 알고리즘을 사용했습니다. 모든 샘플에서 U6 Ct 값의 변동 계수(CV)는 2% 미만으로 높은 발현 안정성을 나타냈다. 따라서 U6가 검증되어 본 연구에서 miR-362-3p 발현의 정규화 기준 유전자로 선정되었습니다. 프라이머의 하위 순서는 키트에서 제공되었습니다. 프라이머 시퀀스는 다음과 같다:

miR-362-3p: GCCGAGAACACCTATTCA.

U6: CTCGCTTCGGCAGCACATATACT.

5. 수신기 작동 특성(ROC) 곡선

유덴 지수는 ROC 곡선의 민감도와 특이도를 계산하여 유방암 진단에 있어 miR-362-3p의 최적 컷오프 값을 결정하는 데 사용되었습니다. 통합 진단 모델은 SPSS의 이진 로지스틱 회귀를 사용하여 구축되었으며, miR-362-3p, RI, PI를 독립 변수로 입력하였습니다. Enter 방법에는 각 피험자의 통합 진단 예측 확률값을 생성하기 위해 변수가 포함되었습니다. 예측 확률(PRE) 공식은 다음과 같습니다. ROC 곡선은 PRE를 기반으로 그려졌습니다. 델롱 검정은 서로 다른 ROC 곡선 간 곡선면적(AUC) 값의 차이를 비교하는 데 사용되었습니다.

6. 결과 매개변수의 정의

주요 결과 기준은 유방암에 대한 혈장 miR-362-3p와 도플러 초음파 결합 모델의 전반적인 진단 효능이었으며, 병리학적 진단이 골드 스탠다드였습니다. 부차 결과 지표에는 도플러 초음파 단독 및 혈장 miR-362-3p 단독 진단 성능이 포함되었습니다.

7. 데이터 통계

miR-362-3p의 발현 수준과 두 그룹의 ROC 곡선을 통계 및 그래프 소프트웨어를 사용해 분석하였다. t-검정 은 두 그룹 간 연속 변수의 차이를 비교하는 데 사용되었습니다. 카이제곱 검정과 4접면 표 방법은 SPSS 26.0을 사용해 분석되었습니다. 카이제곱 검정은 범주별 변수들의 통계적 차이를 평가하는 데 사용되었습니다; 2지수 조합(miR-362-3P + 도플러 초음파)은 임상 실무에서 일상적인 질적 진단 결론으로 간주되었으며; 유방 영상 보고 및 데이터 시스템(BI-RADS) 분류에서 의심스러운 특징이 있을 경우, 병변은 양성으로 정의되었다; 4복합표 방법을 사용하여 도플러 초음파와 miR-362-3p의 결합 진단의 특이도, 양성, 음성 예측값, 정확도를 계산하였습니다. 도플러 초음파와 miR-362-3p 간의 진단 결과에는 진양성(a), 위양성(b), 위음성(c), 진음성(d)이 포함되었습니다. 계산 공식: 민감도 = a / (a + c); 특이성 = d / (d + b); 양성 예측값 = a / (a + b); 음성 예측값 = d / (d + c); 정확도 = (a + d) / (a + b + c + d). 세 가지 진단 방법(miR-362-3p, 초음파, 복합 진단)은 R×C 컨틴전시 테이블에 대한 Pearson χ² 검정을 사용하여 수행되었습니다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

유방암 환자에서 miR-362-3p 수치가 유의하게 감소했습니다

182명의 유방암 환자와 147명의 양성 유방 병변 환자의 임상 기초 정보와 임상 병리학적 특성을 비교하였다. 상세 데이터는 표 1에 요약되어 있다. RT-qPCR은 두 그룹의 환자에서 혈장 miR-362-3p 수치를 측정하는 데 사용되었습니다. 결과는 유방암 환자에서 순환하는 miR-362-3p 발현이 양성 유방 질환 환자보다 현저히 낮다는 것을 보여주었습니다(그림 1A). ROC 곡선 분석 결과, miR-362-3p는 유방암과 양성 유방 병변을 구분하는 데 유리한 진단 성능을 보였음을 시사하였다(그림 1B). 182명의 유방암 환자를 miR-362-3p 고발현 그룹과 miR-362-3p ...

토론

유방암은 가장 흔한 악성 종양 유형 중 하나로, 인체 건강을 위협하는 주요 공중보건 문제로 자리 잡고 있습니다^19,20. 높은 발생률과 사망률은 환자 가족에게 심각한 심리적 충격을 줄 뿐만 아니라 사회와 경제에도 큰 부담을 안겨줍니다. 대부분의 유방암 환자는 진단 시점에 이미 국소 침습이나 원거리 전이를 경험한 상태입니다^21,22. 이로 인해 치료의 난이도가 크게 높아지고 임상 실무에서 생존율이 감소합니다. 따라서 조기이자 정확한 선별과 진단이 유방암 환자의 예후를 개선하는 핵심 단계입니다.

도플러 초음파는 유방암 검진, 병변 질적 진단, 치료 후 예후 모니터링 전 과정 전반에 걸쳐 널리 적용되어 왔습니다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BD Vacutainer K2EDTA 혈액 수집 튜브(보라색 뚜껑)	미국	367861	혈액 채취 및 miRNA 분석용 혈장 준비.
CFX96 Touch 실시간 PCR 검출 시스템	Bio-Rad Laboratories	1855195	광섬유 전도 및 냉각 CCD 이미징을 사용하는 96웰 6채널 형광정량 PCR 기기로, 각 웰에서 지연 없이 동기화 형광 채집. 동적 범위는 10 차수에 이르고, 일반 qPCR 및 고해상도 용융 곡선(HRM) 분석 모두와 호환됩니다. 소프트웨어는 RDML 형식 내보내기를 지원하고 연구 및 임상 테스트 모두와 호환되며, 유전자 발현 정량, SNP 유형화 및 메틸화 분석과 같은 실험에 일반적으로 사용됩니다.
Kirgen 0.1 mL PCR 튜브(또는 8-스트립 PCR 튜브), 멸균	중국 상하이	KG0811	qPCR 반응 준비 및 수행에 사용됩니다.
Kirgen 1.5 mL 마이크로센트리퓨지 튜브, 멸균	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	miRNA 추출 및 역전사 중 샘플 저장, 시약 준비 및 원심분리에 사용됩니다.
miRcute miRNA 분리 키트(스핀 컬럼)	중국 베이징	DP501	스핀 컬럼 기반 기술을 사용하여 인간 혈장 샘플로부터 miRNA를 포함한 총 RNA를 분리 및 정제합니다.
miRcute Plus miRNA 퍼스트-스트랜드 cDNA 키트	중국 베이징	KR211	폴리(A) 테일링 방법을 통한 정제된 miRNA의 역전사를 위한 제1 스트랜드 cDNA 생성.
miRcute Plus miRNA qPCR 키트(SYBR Green)	중국 베이징	FP411	SYBR Green I 기반 화학을 사용하는 miRNA의 정량적 실시간 PCR 검출.
Roche LightCycler 480 멀티웰 플레이트 96, 화이트	독일 만하임	4729692001	Roche LightCycler 480 기기에서의 정량적 실시간 PCR 분석에 사용됩니다.
Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP 리니어 어레이 프로브	Siemens Healthineers	10041226	주파수 범위가 5–14 MHz인 고주파 리니어 어레이 프로브로, 유방 및 갑상선과 같은 표재 기관의 검사를 위해 특별히 설계되었습니다. 고해상도 및 우수한 조직 대비를 제공하며, 탄성 단면 영상 및 자동 유방 부피 스캔을 지원합니다.
Siemens Acuson S2000/S3000/S1000 초음파 시스템	Siemens Healthineers	/	색 도플러 초음파 진단 시스템은 실시간 3D/4D 이미징 및 탄성 이미징 기능을 지원하며, 복부, 심혈관, 부인과 및 산부인과, 유방 등 여러 부서에서 널리 사용됩니다.
Veriti 96-Well 열 사이클러	Thermo Fisher Scientific	4375786	96채널 기울기 PCR 기기로, 기울기 온도 최적화 지원; 높은 온도 제어 정확도를 제공; cDNA 합성 및 일반 PCR 증폭에 사용됩니다.