HEK-293 세포 기반 시스템에서 STING 분류 연구를 위한 세포 없는 COPII 소포 재구성 프로토콜 개발

요약

이 프로토콜은 COPII 소포에 STING 통합을 재구성하는 최적화된 세포 자유 시스템을 설명하며, ER 수출 중 화물 분류의 통제된 생화학적 분석을 가능하게 합니다.

초록

cGAS–STING 경로는 선천면역의 핵심 구성 요소입니다. 활성화 시, 소포체(ER) 내에 거주하는 단백질 STING은 COPII 소포에 포장되어 골지체 기관으로 운반되어 하위 신호 전달을 시작합니다. 이 과정의 중요성에도 불구하고, STING이 COPII 소포로 분류되는 분자 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 여기서는 COPII 소포의 시험 관 내 재구성을 위한 최적화된 워크플로우를 제시하여 화물 선택의 통제된 분석을 용이하게 합니다. HEK-293F 현탁 세포에서 고농도 세포질(30–40 mg/mL)을 제조하는 확장 가능한 방법이 설명되었으며, 반투과성 HEK-293T 세포를 정의된 막원으로 생성하는 간단한 절차를 결합하였습니다. 기존의 부착 셀 기반 시스템과 비교할 때, 이 접근법은 확장성을 높이고 비용을 절감하며 재현성을 향상시킵니다. STING을 모델 화물로 사용하여 COPII 소포 출아와 화물 통합을 Western blot 분석으로 검증하며, 정의된 조건에서 기저 포장 효율은 약 20%입니다. 이 시스템은 뉴클레오타이드 자극을 포함한 생화학적 매개변수를 제어하여 화물 통합에 미치는 영향을 평가할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 COPII 매개 화물 분류를 연구하기 위한 견고하고 유연한 플랫폼을 제공하며, ER 수출에 관여하는 추가 막관통 단백질과 조절 인자 연구로 확장할 수 있습니다.

서론

cGAS-STING 신호 경로는 선천 면역계의 근본적인 메커니즘으로서 세포질 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 감지하여 항바이러스 반응을 시작합니다. dsDNA를 검출하면, 효소 cGAS는 고리형 디뉴클레오타이드 cGAMP를 생성하며, 이는 STING ^1,2에 결합하는 두 번째 메신저 역할을 합니다. 중요한 점은, STING이^{정상 상태 조건}에서 소포체(ER)에 비활성 이머로 존재한다는 점입니다. 활성화는 소포체에서 골지체로의 빠르고 고도로 조절된 전위를 필요로 합니다. 골지체에서 STING은 하류 키나제 TBK1과 IRF3를 모집하고 활성화하여 Type I 인터페론과 염증성 사이토카인⁴를 생성합니다.

STING의 운반은 ER⁵에서 단백질을 배출하는 보편적 매개체인 COPII 코팅 소포에 의해 매개됩니다. COPII 코트의 조립은 작은 GTPase Sar1, 내코트 Sec23/24 복합체, 외피 Sec13/31 복합체로 구성되며, ER 막을 소포로 변형시키고 화물 ^6,7을 선택적으로 모집하는 역할을 합니다. Sec22b는 COPII⁸의 Sec23/24 복합체가 인식하는 구조적 에피토프를 통해 COPII 소포로 분류됩니다. 다른 화물으로는 p24 계열과 ERGIC 마커 ERGIC-53이 있으며, 이들 모두⁹를 분류하는 데 C-말단 소수성 φC 모티프에 의존합니다. 반면, 리보포린 I(RPN1)과 같은 특정 ER 고정 단백질은 소포체 내에 국한되어 있으며, COPII 소포를 통해 운반되지 않아 온전한 소포체 구조의 표지 역할을^합니다. 따라서 세포 자유 COPII 소포 재구성 실험에서 Sec22b와 p24는 종종 COPII 화물로 간주되며, 리보포린은 소포 제제 내 소포체 오염을 모니터링하는 마커 역할을 합니다. COPII 수송의 일반적인 메커니즘은 잘 규명되었지만, 활성화된 STING을 이 소포로 선택적으로 격리시키는 구체적인 분자 신호는 여전히 밝혀지지 않았습니다. 이러한 분류 메커니즘을 이해하는 것은 매우 중요한데, STING 수송 조절 장애는 STING 관련 혈관병증(SAVI) 및 COPA 증후군¹¹과 같은 다양한 자가면역 및 자가염증 질환과 연관되어 있기 때문입니다. 그러나 온전한 세포에서 이러한 일시적이고 매우 역동적인 사건을 연구하는 것은 기술적으로 여전히 도전적입니다.

이러한 도전을 해결하기 위해 COPII 매개 화물 분류의 분자 요구사항을 검증하는 최적화된 무세포 재구성 시스템이 개발되었습니다. 시험관 내 발아 분석법은 오랫동안 세포^생물학의 필수 기술이었지만, 고품질 부품을 준비하는 데 드는 높은 비용과 복잡성 때문에 널리 채택되는 데 제한이 많습니다. 본 연구에서는 HEK-293F 현탁 세포를 경제적인 활성 세포질 공급원으로, 반투과성 HEK-293T 세포를 견고한 막 공여체로 활용하는 간소화된 작업 흐름을 도입하였습니다. 세포 없는 COPII 소포 재구성 시스템의 전체 작업 흐름은 그림 1에 나와 있습니다. 이 시스템에서 Sec22b는 소포에 화물 통합을 확인하는 양성 대조군으로, RPN1은 소포막 오염을 모니터링하고 배제하기 위한 음성 대조군으로 사용되었습니다. STING을 개념 증명 화물로 사용하여 이 연구는 시스템이 STING 분류의 필수 생화학적 측면을 효과적으로 모델링함을 입증했습니다. 이 플랫폼은 STING 분류를 조절하는 세포질 인자와 막 신호를 식별할 수 있는 다목적이고 확장 가능한 도구를 제공했으며, 다양한 다른 소포 수송 경로 연구에 잠재적 응용을 지니고 있습니다.

프로토콜

HEK-293F (RRID: CVCL_6642) 및 HEK-293T (RRID: CVCL_0063) 세포주는 베이징 연합 의과대학 세포 자원 센터에서 획득하였습니다. 두 세포주 모두 단거리 연속 반복(STR) 프로파일링을 통해 인증되었으며, 마이코플라즈마 오염이 없음이 확인되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

이 연구에는 인간 참가자나 척추동물이 참여하지 않았습니다. 따라서 윤리적 승인은 필요하지 않았습니다. 모든 실험 절차는 기관 생물안전 지침에 따라 수행되었습니다.

1. HEK-293F 세포 세포질 제제

1. 100mL 정의된 포유류 배양 배지에 1×⁶ 세포/mL 밀도의 HEK-293F 세포를 종식시키고, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충합니다. 세포를 500mL 원뿔형 플라스크에서 배양하세요.
2. 현탁 배양물을 37°C에서 5% CO₂와 함께 흔들기 인큐베이터에서 60시간 배양합니다.
3. 세포를 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리하여 수확합니다. 자동 셀 카운터를 사용해 총 셀 번호를 결정하세요.
4. 세포 펠릿을 50mL의 얼음 차갑고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하세요. 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기.
5. 세포 펠릿을 같은 부피의 얼음처럼 차가운 B88 완충제(20 mM HEPES, pH 7.3; 250 mM 소르비톨; 150 mM 아세트산 칼륨; 5 mM 마그네슘 아세테이트)에 재현탁합니다.
6. 5mL 주사기에 22게이지 바늘이 장착된 주사기로 100회 이상 투여하여 얼음 위에 세포를 용해합니다.
7. 광학 현미경으로 세포 용해를 관찰하세요. 세포 잔해는 4°C에서 20,000 × g 에서 10분간 원심분리하여 제거합니다.
8. 상정액을 초원심분리관으로 옮기세요. 원심분리기 100,000 g × 4 °C에서 1시간 동안 진행.
   주의: 장비 손상과 안전 위험을 방지하기 위해 울트라원심분리관이 적절히 균형을 이루도록 하세요.
9. 정화된 상정액을 채취하세요. 샘플을 4,000 × g , 4 °C에서 3 kDa 분자량 차단(MWCO) 초여과 장치를 사용해 농축합니다.
10. 단백질 농도를 비신코닌산(BCA) 분석법으로 측정합니다. 농도를 30–40 mg/mL로 조절하세요.
    주의: 액체 질소는 적절한 보호 장비를 착용하여 극저온 손상을 방지하세요.
11. 세포질을 알리코트하세요. 알리코트를 액체 질소에 급동하여 −80 °C에서 보관합니다 (그림 2A)
    주의: 두 번 이상의 냉동 해동 사이클을 피하세요. 알리코트는 −80°C에서 최대 6개월간 보관합니다.

2. 반투과성 HEK-293T 세포 제조

1. 15mL DMEM에 15cm 접시당 3×⁶ 개의 세포 밀도로 전장 인간 STING을 발현하는 HEK-293T 세포를 15mL DMEM에 10% 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신 1%를 보충하여 배정합니다. 37°C에서 5% CO₂와 함께 48시간 부양하세요.
2. 세포를 약 60% 합류율로 채취하세요.
3. 배지를 흡인하고 10mL 얼음 차가운 PBS로 세포를 두 번 세척하세요.
4. 0.25% 트립신-EDTA 2mL를 추가합니다. 세포를 분리하기 위해 실온에서 2–3분간 배양하세요.
5. 트립신화 억제를 위해 200 μL 대두 트립신 억제제(1 mg/mL)를 추가하세요. 세포를 10 mL의 얼음 냉각 KHM 완충제(20 mM HEPES, pH 7.2; 110 mM 아세테이트 칼륨; 2 mM 마그네슘 아세테이트)에 재현탁합니다.
6. 세포를 250 × g에서 원심분리하여 3분간 제거하세요. 상원액은 버리세요.
   주의: 디지토닌은 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 연기함 안에 보관하세요.
7. 세포를 6mL 얼음 냉각 KHM 버퍼에 재현탁합니다. 6 μL 디토닌 정액(DMSO 내 40 mg/mL)을 추가합니다.
8. 부드럽게 반전(inversion)으로 섞으세요. 얼음 위에 5분간 부화시키세요.
9. 8mL KHM 버퍼를 희석한 디토닌에 추가하세요. 250 × g 에서 3분간 원심분리기로 투과성 세포를 수집합니다.
10. 14 mL 얼음 냉각 HEPES 완충제(50 mM HEPES, pH 7.3; 90 mM 아세트산 칼륨)에 재현탁합니다. 얼음 위에 10분간 부화시키세요.
11. 원심분리기 250 g × 3분간 돌립니다. 이 펠릿을 얼음처럼 차갑게 1mL KHM에 재현탁합니다. Cl 완충제(20 mM HEPES, pH 7.3; 110 mM KCl; 2 mM MgCl₂).
12. 원심분리기 10,000g × 15초 동안 상원액은 버리세요.
13. 펠릿을 50 μL KHM·에 재현탁합니다. 클랜 버퍼. BCA 분석법을 사용해 단백질 농도를 측정하고 5–7 mg/mL로 조절합니다.

3. 세포 자유 COPII 소포 재구성 실험

1. 재료표에 기재된 모든 시약을 준비하세요. 알리코트를 만들어 −80 °C에서 보관하세요.
2. 110 mM KCl, 20 mM HEPES(pH 7.2), 2 mM MgCl₂, 프로테아제 억제제 칵테일(1×), 0.2 mM GTP, 그리고 ATP 재생 시스템(40 mM 크레아틴 인산, 0.2 mg/mL 크레아틴 인산효소, 1 mM ATP)을 포함한 50 μL 반응 혼합물을 준비합니다.
3. cGAMP를 최종 농도 10 μM에 첨가합니다. 반응을 실온에서 15분간 배양합니다.
4. 50 μg 반투과성 HEK-293T 세포를 추가합니다. 부드럽게 섞으세요.
5. 80 μg HEK-293F 세포질을 추가하여 소포 형성을 시작합니다. 37°C에서 45분간 배양하세요.
6. 반응을 얼음에 올려 출아귀를 종료하세요. 원심분리기 12,000 × g , 4 °C에서 20분간 진행.
7. 소포가 포함된 상청액을 채취하세요. 소기관이 포함된 펠릿을 유지하세요.
8. 상청액을 100,000 × g 에서 4 °C에서 1시간 동안 초원심분리합니다. 소포 펠릿을 30 μL 단백질 로딩 버퍼에 재현탁합니다.
9. 95°C에서 5분간 가열 샘플을 사용하세요. 20,000 × g에서 5분간 원심분리기를 통해 침전물을 제거합니다.
10. SDS-PAGE를 수행하여 단백질을 PVDF 막으로 전달합니다. Sec22b, STING, RPN1에 대한 항체를 이용한 프로브.

결과

HEK-293F 세포 세포질 준비 과정에서 세포질 질을 평가하기 위해 두 가지 매개변수가 평가되었습니다. HEK-293F 세포는 고밀도로 배양되어 단백질 농도가 높은 세포질 추출물을 얻었습니다. 또한, 주사기 기반 용해 후 세포 파괴 정도를 광학 현미경으로 평가하여, 적용된 조건에서 효율적인 세포 용해가 확인되었습니다(그림 2B).

반투과형 HEK-293T 세포 생성을 위해 배양액은 약 60% 합류율에서 채취되었습니다. 이 단계에서 세포 내 소기관은 현미경으로 관찰된 것처럼 잘 분포되어 있고 형태학적으로도 온전하여 소포 재구성 검사에 적합한 막원을 제공했습니다(그림 3).

이 최적화된 시스템을 사용하여 STING 신호와 소포 운송 간의 결합을 조사하였습니다. 이 워...

토론

시험관 내에서 필수 생화학 반응의 재구성은 수많은 획기적인 발견에 중요한 세포 없는 시스템의 기초를 마련했습니다. 여기에는 세포질 DNA 센서로서의 cGAS 확인(^14,15), 세포자멸사에서 사이토크롬 c의 역할 규명, 최초의 히스톤 탈메틸화효소 JHDM1^16,17의 발견이 포함됩니다. 이러한 정의된 생화학적 접근법은 STING 운송의 밀접하게 결합된 단계들을 해부하는 데 특히 강력한데, 이는 소포체(ER)에서 나오는 과정부터 골지체 기관에 도달하는 과정까지 이어집니다. 이 과정은 선천 면역 신호전달에 매우 중요합니다.

본 연구에서는 STING을 모델 화물로 사용하여 최적화된 세포 자유 COPII...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5mL 멸균 주사기	WEGO	V526273	기계적 세포 용해에 사용
아데노신 5&프라임;-삼인산 (ATP)	MCE	HY-B2176	수중 100 mM 재고, pH 7.3, 저장 및 마이너스; 80 & deg; C
어도비 일러스트레이터	어도비 시스템즈 주식회사	SCR_010279	개념 삽화 및 회로도 제작에 사용됩니다
ATP 재생 시스템 (10번&1회;)	—	—	크레아틴 인산, 크레아틴 키나아제, ATP를 포함한 에너지 재생 혼합물입니다
BCA 단백질 분석 키트	써모피셔	23227	색도 단백질 분석
바이오렌더	바이오렌더	SCR_018361	개념 삽화 및 회로도 제작에 사용됩니다
BSA	바이오리진	BN20815	차단 반응제
이산화탄소 흔들기 인큐베이터	지추	ZCZY-CS8	온도, CO2 유지, 현탁 배양을 위한 교반
CO2 인큐베이터	써모피셔	3110	부착 배양을 위해 온도와 CO2 유지
기존 현미경	올림포스	CX43	세포 용해 및 형태 평가에 사용됨
크레아틴 키나제	로슈	CKRO	버퍼 내 20 mg/mL 재고, 저장 및 마이너스; 80 & deg; C
크레아틴 인산염	로슈	크로포 로	ATP 재생 시스템의 구성 요소
데스크탑 원심분리기	에펜도르프	5810R	저속 원심분리에 사용
디지토닌	시그마	D5628	DMSO에 40 mg/mL 스톡을 저장하며, &-로 저장; 20 & deg; C
DMEM	코닝	10-013-CMR	HEK-293T 세포용 배양지
D-소르비톨	상곤	A100691	1M 스톡 용액을 물에 담아 4 & 도에서 보관; C
ECL 검출 시약	바이오리진	BN16009	화학발광 기판
전기영동 탱크	바이오-래드	1658001	SDS-PAGE용 장치
태아 소 혈청(FBS)	코닝	35-015-CV	혈청 보충제
고정 각도 로터 (TFT 80.2)	써모피셔	54456	초원심분리용 로터
프리스타일 293-F 셀	써모피셔	R79007	세포질 준비에 사용됨
염소 항생쥐 IgG (H+L)	인비트로젠	31430	HRP 결합 2차 항체
염소 항토끼 IgG (H+L)	인비트로젠	31460	HRP 결합 2차 항체
그래프패드 프리즘	그래프패드 소프트웨어	SCR_002798	통계 분석(일방향 ANOVA) 수행 및 그림 4D의 정량적 막대 그래프 생성에 사용됩니다.
구아노신 5&프라임;-삼인산 (GTP)	MCE	HY-113225	수중 10 mM 재고, pH 7.3, 저장 시간은 마이너스; 80 & deg; C
인간 STING을 발현하는 HEK-293T 세포	—	—	사내에서 제작; 멤브레인 소스로 사용
HEPES 완충기 (1 M, pH 7.3)	비요타임	C0215	용액 준비를 위한 완충 성분
영상 시스템	바이오-래드	12003153	신호 검출에 사용
마그네슘 아세테이트 사수화물	햄튼 리서치	HR2-561	B88 제제를 위한 완충 성분
육수화마그네슘 클로라이드	햄튼 리서치	HR2-559	버퍼 성분
마이크로 원심분리기	에펜도르프	5420R	중고속 원심분리에 사용됨
마이크로 원심분리기	에펜도르프	5420	일상적인 원심분리에 사용됩니다
나노드롭 분광광도계	써모피셔	840-317400	단백질 정량에 사용
OPM-CD Trans293 매체	OPM	P82019	HEK-293F 부탁 배양용 무혈청 배지
페니실린&대시; 스트렙토마이신 (100회 이상 )	서비스바이오	G4003	세포 배양을 위한 항생제 보충제
페닐메틸 설포닐플루오라이드 (PMSF)	상곤	A610425	프로테아제 억제제
인산효소 억제제	라블리드	C0104	단백질 탈인산화를 예방합니다
인산염 완충 식염수(PBS)	서비스바이오	G4202	세척 셀용 완충제
아세트산 칼륨	시그마	236497	1M 스톡 용액을 물에 담아 4 & 도에서 보관; C
전원 공급	바이오-래드	1645052	전기영동을 위한 전압 제공
프로테아제 억제제 칵테일, EDTA 프리	로슈	4693132001	광범위 프로테아제 억제제 혼합물
PVDF 멤브레인	밀리포어	ISEQ00010	웨스턴 블롯을 위한 멤브레인
RPN1 항체 (토끼 mAb)	앱캠	AB197888	ER 마커
SDS-PAGE 겔 (4– 20%)	—	—	단백질 분리에 사용
SDS-PAGE 로딩 버퍼 (5×)	솔라비오	P1040	단백질 샘플 준비 완충제
Sec22b 항체 (토끼 mAb)	앱캠	ab181076	COPII 화물 마커
대두 트립신 억제제(SBTI)	시그마	T9128	PBS에 1 mg/mL 스톡을 저장하며, &-로 저장; 20 & deg; C
STING 항체 (토끼 mAb)	CST	13647	1차 항체
TBST 버퍼	서비스바이오	G0004	면역블롯을 위한 세척 버퍼
열 사이클러	바이오-래드	186-1096	가열 및 부화 사용
열정식 금속 욕조	DLAB	5062102100	일정한 온도를 유지함
전이 셀	바이오-래드	1703930	단백질 전달에 사용됩니다
트립신-EDTA (0.25%)	서비스바이오	G4011	세포 분리에 사용됨
초원심분리기	써모피셔	75000100	고속 원심분리에 사용
초심분리기 튜브 (2 mL)	써모피셔	54460	초원심분리 호환 튜브
초여과 튜브 (4 mL, 10 kDa MWCO)	밀리포어	UFC8010	세포질 농도에 사용