방법 논문

대장균 세포 침범의 정량화 및 시각화를 위한 아미카신 보호 분석

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DOI:

10.3791/71108

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2026년 7월 3일

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1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Howard Hughes Medical Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

이 논문에서

요약

침착성 대 장균 균주에서의 항생제 내성은 전통적인 겐타미신 보호 검사법을 이용한 세균 침입 평가에 도전 과제를 제기합니다. 군락 형성 단위를 열거하여 정량적으로, 그리고 감염된 세포를 면역형광 공초점 현미경으로 시각화하여 정성적으로 평가하는 개선된 방법을 기술한다.

초록

상피 세포 침범은 살모넬라, 시겔라, 비브리오 등 많은 장내 병원체의 주요 표현형입니다. 신흥 침습성 병원체로는 염증성 장질환(IBD)의 발병 기전과 관련된 부착성 침습성 대장균(Escherichia coli , AIEC)이 있습니다. AIEC 균주는 다른 침입성 병원체와 흔히 연관된 병원성 인자가 부족해 유전적 식별이 어렵습니다. 따라서 AIEC 균주는 현장 표준 겐타마이신 보호 분석법을 사용하여 상피세포 침투 능력을 바탕으로 표현형적으로 분류됩니다. 그러나 AIEC 균주는 치료 과정에서 다양한 항생제를 투여받는 IBD 환자로부터 분리되는 경우가 많아, 겐타마이신 내성 분리균의 증가로 인해 이 검사는 AIEC 분류에 있어 신뢰도가 떨어졌습니다. 이 문제를 우회하기 위해 AIEC 세포 침범을 정량하고 시각화하기 위한 대체 아미카신 기반 보호 분석법이 개발되었습니다. 이 분석법은 광범위 반합성 아미노글리코사이드를 활용하여 다른 아미노글리코사이드에 내성을 가진 균주를 효과적으로 표적으로 삼으면서도 진핵 숙주 세포에 남아 있습니다. 따라서 감염 중에 세포외 박테리아는 죽는 반면, 세포 내 박테리아는 '보호'됩니다. 이는 감염 후 집락형성 단위(CFU)를 사용한 침습 점수의 백분율로 측정되는 균주 침습성을 비교하는 정량적 분석의 기초가 됩니다. 이 분석은 감염된 상피 세포를 면역염색하고 공초점 현미경으로 세포를 시각화하여 침투의 정성적 측정으로도 사용할 수 있습니다. 이 방법은 IBD 환자를 AIEC에 대해 선별하는 진단 도구로, 다른 다제제 내성 병원체에도 적용하여 세포 침범을 평가할 수 있으며, 이는 병원성 및 병원성의 대리 지표입니다.

서론

염증성 장질환(IBD)은 크론병(CD)과 궤양성 대장염을 포함하며, 전 세계 수백만 명에게 영향을 미치는 만성 위장 염증 질환입니다. IBD의 전 세계적 발생률이 증가하고 있음에도 불구하고, 유전적, 환경적, 미생물적, 면역학적 요인들이 복잡하게 상호작용하여 정확한 원인은 여전히 불분명합니다 2,3. IBD의 대표적인 특징 중 하나는 장내 미생물 구성 변화로, 이는 종종 고당·고지방 식단 등 산업화된 국가에서 흔한 환경적 요인에 의해 촉진됩니다 4,5. IBD 환자의 미생물군집은 종종 미생물 다양성 감소, 병원성 감마프로테오박테리아 풍부화, 보호하는 Firmicutes 6,7의 감소로 특징지어집니다. CD 환자에서 대장균(대장균)은 장내 미생물군에 풍부하게 작용하여 장 점막과 결합하고 침범하며, 활동성 질환과 중증 질환과 양의 상관관계를 보입니다8,9. 이 새롭게 나타나는 대장균 병리형은 침착성 대장균(AIEC)이라고 불립니다.

AIEC는 그람 음성 기회성 병원체로, 건강한 대조군보다 회장 점막에 더 높은 경향으로 정착합니다10. CD 환자로부터 분리된 AIEC 균주는 유전적으로 다양하며, 공생 및 병원성 대장균을 포함하는 모든 대장균 계통군에 걸쳐 있습니다. 시겔라나 살모넬라와 같은 병원체가 3형 분비 시스템을 이용해 숙주 세포 침입을 촉진하는 것과 달리, AIEC는 이러한 보존된 병원성 시스템이 없습니다. 따라서 AIEC 병원성에 대한 우리의 이해는 주로 상피세포에 부착하고 침투하며 대식세포 내에서 생존하는 능력이 특징인 시험관 내 표현형에 의존한다10.

AIEC에 의한 상피세포 침범은 제1형 파일루스와 긴 극성 섬유를 포함한 여러 병원성 인자에 의해 매개됩니다. 1형 모낭 끝에 위치한 FimH는 13번 당당화된 숙주 수용CEACAM6체의 만노스 잔기와의 부착을 매개합니다. 이 결합은 AIEC가 장세포에 진입하도록 촉진하고 세포 내 복제를 지원합니다14. AIEC는 또한 마이크로폴드(M) 세포에 부착하는데, 이는 긴 극성 섬유낭과 M 세포 표면 단백질인 당단백질 2 사이의 상호작용을 통해 페이어 반점 위에 위치한 특수 상피세포입니다. 이 부착은 AIEC가 M 세포를 가로질러 전위하여 대식세포에 도달하고, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 촉진하여 염증을 촉진할 뿐만 아니라 대식세포 내 박테리아 복제를 지원하도록 합니다17,18. 이러한 병원성 기전은 CD에서 관찰된 바와 같이 숙주 내 만성 염증을 지속시키는 것으로 추정됩니다.

AIEC는 시험관 내 표현형에 의해 정의되므로, 겐타마이신 보호 분석법은 균주 분류와 병원성 인자 발견에 필수적입니다8. 이 접근법은 겐타미신 내성 분리주로 인해 복잡해질 수 있는데, 이로 인해 침입성11로 잘못 분류될 수 있습니다. 이 문제를 우회하기 위해, 겐타미신 내성 분리주를 숙주 세포막을 관통하지 않고 효과적으로 죽이는 대체 항생제가 시험되었습니다. 이 접근법을 통해 아미카신은 겐타미신의 적합한 대체제로 확인되었으며, 기존 연구에서 트리판 블루 염색으로 입증된 것과 여기서도 락테이트 탈수소효소 방출 검사로 추가 검증된 것과 유사한 효능과 호환성, 그리고 최소한의 세포독성을 제공했습니다(보충 그림 1)11. 아미카신은 카나마이신에서 유래한 반합성 아미노글리코사이드로, 단백질 합성을 방해하여 박테리아 성장을 억제합니다. 아미카신은 특히 Pseudomonas, Acinetobacter, Escherichia 종19 등 다약물 내성 그람 음성 박테리아에 효과적입니다. 특히, 카나마이신 골격의 구조적 변형으로 인해 아미카신은 박테리아 내 아미노글리코사이드 불활성화 효소에 덜 감수성이 생깁니다19. 그 결과, 아미카신은 침윤 분석에서 다중 약물 내성 박테리아를 표적으로 삼는 데 겐타미신의 강력한 대안이 됩니다. 다음 프로토콜은 참조 균주 NRG857c와 임상 분리주를 이용한 아미카신 보호 분석법을 사용하여 대장균 의 침입 표현형을 평가하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜은 AIEC 균주가 Caco-2 상피 세포에 침투할 수 있는 능력을 평가하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서 사용된 아미카신 농도(240 μg/mL)는 염증성장질환 환자 13명의 대표 AIEC 임상 분리株 패널에서 아미카신 MIC 테스트 스트립을 사용해 측정한 최소 억제 농도(MIC)의 10×에 해당합니다. 연구자는 검사를 수행하기 전에 자신의 AIEC 분리주에 대한 MIC를 결정해야 하며(재료 표 참조), 항생제 감수성은 분리주마다 다를 수 있습니다. 1장은 침입 비율 정량화를 위한 아미카신 보호 분석법을 상세히 설명하며, 2장은 공초점 현미경을 위한 아미카신 보호 분석법을 설명합니다.

1. 침입률 정량을 위한 아미카신 보호 분석

  1. 24웰 플레이트의 콜라겐 코팅
    1. 무균 빙하 아세트산 35.29 μL(재료표 참조)를 1× PBS 30mL에 희석하여 50mL 원뿔관 안에 넣습니다.
    2. 300 μL 콜라겐( 재료표 참조)을 1× PBS에 아세트산 용액과 함께 피펫팅합니다.
    3. 10초 동안 보텍스 용액을 사용해 잘 섞으세요.
    4. 희석된 콜라겐 용액 250 μL을 멸균 24웰 조직 배양 처리판의 각 웰에 분사합니다.
      참고: 30mL 콜라겐 용액은 약 5개의 24웰 플레이트를 코팅할 수 있습니다.
    5. 각 웰 바닥에 용액이 고르게 덮이도록 판을 모든 방향으로 기울이세요.
    6. 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양하여 콜라겐이 플라스틱 표면에 달라붙도록 하세요.
    7. 배양이 완료된 후에는 각 웰에서 콜라겐 용액을 흡입합니다.
    8. 각 웰에 1× PBS 1mL를 피펫팅하여 잔여 콜라겐을 씻어내고 각 웰을 흡입합니다. 이 과정을 2번 더 반복하세요(총 3번 세척).
    9. 생물학적 안전 캐비닛 안에 건조판을 설치하여 모든 눈에 보이는 습기가 증발했는지 확인합니다.
      참고: 플레이트는 즉시 세포 시딩에 사용할 수도 있고, 실온에서 보관할 수도 있습니다. 접시를 보관할 때는 외곽을 멸균 파라필름으로 밀봉하거나 멸균 지퍼백에 넣으세요.

  1. 아미카신 스톡 용액 제조
    1. 아미카신 이황산염 240mg을 무게로 측정하고 1.5mL 미세원심분리관에 옮깁니다.
    2. 멸균수 1mL를 피펫에 넣고 아미카신을 용해시켜 소용화하여 최종 농도는 240 mg/mL(1000× 스톡)를 만듭니다.
    3. 아미카신 용액 20 μL 알리코트를 만들어 -20 °C에서 보관합니다.
      참고: 아미카신은 6개월에서 12개월 동안 -20°C에서 안정적입니다. 반복적인 동결-해동 사이클을 최소화하기 위해 일회용 알리코트를 준비하세요.
  2. 카코-2 세포의 준비
    1. 냉동 재고에서 Caco-2 세포 해동
      1. 고포도당 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, 재료표 참조)에 10% 태아 소 혈청(FBS, 재료표 참조)과 1% 항생제-항균제액( 재료표 참조)을 보충하여 완전한 성장 배지를 준비합니다.
      2. 37°C 물욕에서 30분간 예열한 미디어를 사용하세요.
      3. 냉동 바이알에 담긴 카코-2 세포를 37°C 수조에 넣고 세포가 완전히 해동될 때까지 1–2분간 배양합니다.
      4. 바이알을 물에서 꺼내고 바이알 외부에 70% 에탄올을 뿌리세요.
      5. 생물학적 안전 캐비닛 안에서 세포를 15mL 원뿔형 튜브에 피펫팅하여 9mL의 완전한 배지를 넣습니다.
      6. 원심분리기 셀은 500 × g에서 실온에서 5 분간 보관 합니다.
      7. 상정액을 흡인하고 세포 펠릿을 5mL의 완전 배지 내에 재현탁합니다.
      8. 세포를 10mL의 따뜻한 완전 배지 배지를 담은 75cm2 조직 배양 플라스크(T75)에 옮깁니다.
      9. 플레이트를 3번 돌려 세포가 플레이트 바닥에 고르게 분포되도록 하세요.
      10. 세포를 37°C에서 5%CO2 와 함께 배양하여 세포가 ~90% 융합률(6–7일)에 도달할 때까지 유지합니다.
        참고: 수합률은 광학 현미경을 이용한 세포의 시각화 근사를 통해 추정됩니다. 세포가 회복되는 동안 매지를 3일마다 교체하세요.
    2. Caco-2 세포 시딩
      1. 37 °C 수조에서 완전 배지와 0.25% (w/v) 트립신-EDTA(재료표 참조)를 사용했습니다.
      2. Caco-2 세포가 ~90% 융합에 도달하면 세포 배양지를 흡취하고 2mL의 트립신-EDTA를 추가합니다. 플라스크를 기울여 트립신 용액이 플라스크 바닥 전체를 덮도록 하여 FBS의 모든 흔적을 비활성화합니다.
      3. 트립신-EDTA 용액을 흡입하고 3mL를 추가하세요. 세포를 37°C에서 5%CO2 와 함께 5–15분간 배양합니다. 잠복 기간 동안 다양한 시점에서 광학 현미경으로 세포를 시각화하여 세포가 둥글게 움직이는 것을 관찰하여 세포가 분리되었음을 나타냅니다.
        참고: 세포 분리를 돕기 위해 플라스크 옆면을 두드리지 마세요. 이는 세포가 뭉칠 수 있습니다.
      4. 전체 배지 6mL를 피펫으로 추출하여 트립신-EDTA 용액을 비활성화하고, 피펫을 부드럽게 위아래로 움직이며 세포를 재현탁합니다.
      5. 세포를 15mL 원뿔 튜브에 피펫 넣고 500× g에서 5 분간 원 심분리기로 세포를 알렛으로 만듭니다.
      6. 배지를 흡입하고 3mL의 완전한 배지에 세포를 재현탁합니다.
      7. 현탁된 Caco-2 세포 10 μL을 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. 1.5mL 마이크로 원심분리관에 10 μL 트라이판 블루 염료( 재료표 참조)를 추가하고, 피펫으로 여러 번 위아래로 섞어 혼합합니다.
      8. Caco-2/Trypan Blue 혼합물 10 μL 피펫을 셀 카운터 슬라이드에 투여합니다( 재료표 참조). 세포 생존 가능성을 계산하기 위해 살아있는 세포 수를 열거하세요.
        참고: 존재하는 Caco-2 세포 수를 열 때는 시딩을 위한 총 세포 수가 아니라 살아있는 세포 수만 고려하세요.
      9. 24웰 플레이트 또는 T75 플라스크에 Caco-2 세포를 씨앗합니다.
      10. 24웰 플레이트의 경우 아래 단계를 따르세요:
        1. 아래 식을 사용하여 1 x 105 cells/mL 농도로 Caco-2 세포를 씨앗 투여합니다:
          [(1 × 105 셀) (시딩 웰 수 + 2)] / [생존 가능한 셀 수 농도(셀/mL)] = 셀 (mL)
        2. 3.2.6단계에서 현탁된 Caco-2 세포에서 계산된 세포 부피를 15mL 원뿔관 안에 제거합니다. 아래 식을 사용하여 세포에 추가할 완전한 배지 부피를 계산합니다:
          (시딩 웰 수 + 2개의 웰) - 세포 수 (mL) = 배지 (mL)
          참고: 계산에 포함된 "+2 웰"은 피펫팅 오차를 고려하기 위한 것입니다.
        3. 위에서 계산한 배지 부피를 Caco-2 세포가 포함된 15mL 원뿔형 배지에 피펫으로 옮기고, 여러 번 위아래로 피펫을 사용해 혼합합니다.
        4. 완전한 배지 내 Caco-2 세포 1mL(최종 농도는 1 x 105 cells/mL)를 콜라겐 코팅 24웰 플레이트의 각 웰에 피펫 삽입합니다.
        5. 37°C에서 5%CO2 와 함께 배양하여 세포가 ~90% 합율(3–4일)에 도달할 때까지 배양합니다.
      11. T75 플라스크의 경우 아래 단계를 따르세요:
        1. 다음 식을 사용하여 7.5 x 10 5개의 생존 가능한 세포를 T75 플라스크에 옮깁니다:
          [(7.5 × 105 세포)] / [생존 세포 수 농도 (cells/mL)] = 세포 (mL)
          참고: T75 플라스크에 추가할 생존 세포 수는 Caco-2 세포 배양에 대한 ATCC 지침을 기준으로 결정되었습니다.
        2. 위에서 계산한 셀 부피를 제거하고 T75 플라스크로 옮기세요. 아래 식을 사용하여 세포에 추가할 완전한 배지 부피를 계산합니다:
          15 mL - 플라스크에 첨가된 세포 양 = 배지 (mL)
        3. 위에서 계산한 배지 부피를 피펫으로 T75 플라스크에 옮깁니다.
        4. 접시를 부드럽게 여러 번 돌려 플라스크 바닥에 세포가 고르게 흩어지게 하세요. 37°C에서 5%CO2 와 함께 배양하여 세포가 ~90% 합율(3–4일)에 도달할 때까지 보관합니다.
  3. 아미카신 보호 분석
    참고: 실험 시작 전에 모든 세포 배양 배지를 37 °C로 미리 예열해야 합니다.
    1. 박테리아 제조
      1. 멸균된 나무 막대기나 멸균 피펫 팁을 사용해 -80°C에 보관된 냉동 박테리아 글리세롤 스톡에서 박테리아를 부드럽게 긁어내고, 단일 콜로니의 경우 LB 한천 플레이트에 스트레이크를 합니다. 플레이트를 37°C에서 하룻밤 부양하세요.
      2. 멸균된 나무 막대기나 멸균 피펫 팁을 사용해 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 집어 3mL의 LB 육수에 접종합니다. 배양물을 37°C에서 배양하고 200rpm에서 하룻밤 동안 흔들었습니다.
      3. 1 mL LB 육수에 하룻밤 배양물을 1:10 희석한 후 분광광도계를 사용해 600 nm(외600) 배양 배양 시 광학 밀도를 측정합니다.
    2. 감염 중복도(MOI) 계산
      1. 100 μL 100 μL의 하룻밤 배양액을 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮기고, 6000 × g 원심분리기를 4 °C에서 10분간 가열합니다.
      2. 세포 펠릿을 방해하지 않도록 상청액을 조심스럽게 흡인하세요. 펠릿을 1mL 혈청과 항생제-항균제가 없는 배지에 재현탁합니다.
        참고: 이는 박테리아 하룻밤 배양액을 1:10으로 희석한 것입니다. MOI 계산에는 희석 계수를 보정한 OD600 값이 아니라 4.1.3단계에서 희석된 하룻밤 배양액에 대해 계산한 원시 OD600 값을 사용하세요.
      3. 다음 계산을 사용하여 4.2.2단계에서 Caco-2 세포를 감염시키기 위해 추가할 박테리아 부탁액을 MOI 10으로 계산합니다:
        [1 OD 단위/2.4 × 109박테리아] × [10박테리아/세포] × [1 mL × OD 1:10] × 1 ×105 ×103 = 부피 (uL)
        참고: 각 샘플의 계산 부피를 꼼꼼히 기록하시기 때문에, 이 값은 이후 접종구 CFU/mL 계산에 사용됩니다. 이 박테리아 현탁 부피는 24웰 플레이트 내 1개의 우물에 한정됩니다.
      4. 4.2.3단계에서 계산된 박테리아 현탁액을 멸균 1.5mL 미세원심분리관에 옮겨 감염 매체를 준비합니다. 혈청 1mL와 항생제-항균류 자유 배지를 추가하세요. 피펫을 위아래로 여러 번 움직여 부드럽게 섞으세요.
    3. 카코-2 세포 감염
      1. 인큐베이터에서 Caco-2 세포 단층을 포함한 24웰 플레이트를 제거하고 전체 배지를 흡인합니다.
      2. 각 웰에 1mL의 혈청과 항생제-항균류 유합체를 피펫으로 채우고, 혈청 함유 배지 흔적을 제거하기 위해 흡입합니다. 이 과정을 한 번 더 반복하세요(총 2번 세척).
        참고: 흡인 시 진공압을 낮춰 세포 단층이 손상되지 않도록 하세요.
      3. 4.2.4단계의 감염 배지를 1mL를 Caco-2 세포가 포함된 24웰 플레이트의 각 웰에 피펫 보관합니다.
      4. 24웰 플레이트를 500 × g에서 15 분간 실 온에서 원심분리하여 박테리아와 상피세포의 접촉을 동기화합니다.
      5. 24웰 플레이트를 37°C에서 5%CO2 와 함께 3시간 동안 배양하여 박테리아 침입을 허용합니다.
      6. 배양 기간 동안, 96웰 플레이트를 사용해 멸균 1× PBS에서 10배 연속 희석하여 4.2.2단계의 희석된 1야간 배양액의 CFU/mL를 결정합니다.
        1. 각 희석을 준비하기 위해, 4.2.2단계에서 판의 첫 번째 웰로 희석된 야간 배양액 200 μL을 옮깁니다.
        2. 다음 행에 180 μL 1× PBS가 포함된 배양 20 μL로 피펫을 옮깁니다. 피펫팅으로 10번 위아래로 섞으세요. 희석도가 10-6 까지 될 때까지 새 피펫 팁을 사용해 매번 이 과정을 반복합니다.
        3. 10-2에서 10-6 희석액의 3회로 10 μL 희석액을 LB 한천 판에 플레이트 부착합니다. 불꽃 아래에서 반점이 한천에 흡수되도록 두세요.
        4. 27–30°C에서 하룻밤 동안 배양하여 군집 과잉 성장을 방지하고 명확하고 분리된 개별 군집을 확보합니다.
          참고: 삼중판 스팟 플레이트는 정량 정확도를 높이고 다양한 박테리아 농도에서 검출을 가능하게 합니다. 낮은 배양 온도는 박테리아 성장을 늦추어 고농도 샘플에서 더 정확한 CFU 추정을 가능하게 합니다.
      7. 미리 가열된 혈청과 항생제-항균성 유무균 배지에 240 μg/mL 아미카신을 첨가하여 항생제 함유 배지를 준비합니다.
      8. 3시간 감염이 완료되면 Caco-2 세포 단층에서 배지를 흡인합니다. 각 웰에 1mL의 혈청과 항생제-항균류 자유 배지를 추가하세요. 이 과정을 한 번 더 반복하세요(총 2번 세척).
      9. 각 웰에 240 μg/mL 아미카신 함유 배지 1mL를 피펫팅하여 37°C에서 5%CO2 와 함께 1시간 배양하여 세포외 박테리아를 제거합니다.
      10. 각 웰에서 배지를 흡입하고 1× PBS 1mL를 추가하여 아미카신에 의해 죽은 부착 박테리아를 씻어내세요. 이 과정을 한 번 더 반복하세요(총 2번 세척).
      11. 각 웰에 1× PBS로 희석한 1% Triton-X-100 피펫 200 μL 피펫(재료 표 참조). 궤도 셰이커에서 90rpm으로 10분간 배양하여 상피세포를 용해합니다.
      12. 24웰 플레이트에서 셀을 한 웰당 약 30회 피펫팅하여 분리합니다.
        참고: 콜라겐으로 플레이트를 코팅하면 세포 부착력이 향상되므로, 단일층이 플레이트에서 분리되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 이는 용해된 우물과 비용해된 우물, 그리고 Caco-2 세포가 없는 우물을 비교하여 시각적으로 확인할 수 있으며, 이 경우 투명해 보입니다.
      13. 1× PBS를 사용하여 96웰 플레이트에서 세포 용해액을 10배 연속 희석합니다.
        참고: 10-3 희석 때까지 연속 희석을 수행하세요.
      14. 10 μL 스팟 희석액을 3회로, 희석하지 않은 것부터 10-3 희석까지 LB 한천 플레이트에 부착합니다. 불꽃 아래에서 반점이 한천에 흡수되도록 두세요. 판을 27–30°C에서 하룻밤 동안 배양하여 군체 과증식을 방지하고 명확하고 분리된 개별 군집을 확보합니다.
    4. 식민지 집계 및 침입 비율 계산
      1. 하룻밤 배양 후, 희석된 하룻밤 배양액과 회수된 용해액에서 희석된 각 지점의 군락 수를 세어보라. 각 지점에 7개 이상의 고립된 군락이 포함된 희석액을 선택하세요. 같은 희석도를 삼중산에 걸쳐 사용해 그 희석 시 회수된 박테리아 군락의 평균 수를 계산합니다.
        참고: 잘 분리된 단일 군락을 포함하는 희석 석석은 세하고, 접촉하는 군집을 포함하는 희석은 피하세요.
      2. 아래 식을 사용하여 접종구 CFU/mL, 회수 CFU/mL, 침범률 비율을 계산합니다:
        접종 CFU (CFU/mL):
        CFU접종량 = (평균 집락 수)(희석 인수)(감염 배지 부피(μL) x 100
        확인된 CFU (CFU/mL):
        회수된  CFU = (평균 콜로니 수)(희석 인수) x 100
        침입 비율(%):
        침습 (%) = [(CFU검색됨)/(CFU접종량)] × 100

2. 공초점 현미경을 위한 아미카신 보호 분석

  1. 멸균 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립 준비
    1. 생물학적 안전 캐비닛에서 멸균 겸자를 사용해 폴리-L-라이신 코팅된 커버슬립 (재료표 참조)을 70% 에탄올에 적신 종이 타월 위에 올려놓습니다.
    2. 커버슬립의 두 슬라이드에 70% 에탄올을 뿌리고, 멸균 겸자로 커버슬립을 양쪽으로 뒤집으세요.
    3. 커버슬립을 생물학적 안전 캐비닛에서 UV 조명 아래에서 완전히 말릴 때까지 기다립니다.
  2. 6웰 플레이트에 Caco-2 세포를 시딩하기
    1. 생물학적 안전 캐비닛에 6웰 플레이트의 각 웰에 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립 1장을 넣습니다.
    2. "Caco-2 세포 시딩" 섹션의 3.2.1–3.2.8 단계를 반복합니다.
    3. 아래 식을 사용하여 6웰 플레이트에서 1 x 105 cells/mL 농도로 Caco-2 세포를 씨앗합니다:
      [(1 × 105 셀) (씨앗 우물 수 + 2)] / [생존 가능한 세포 수 농도(세포/mL)] × 2 = 세포 (mL)
      참고: 이 값은 6웰 플레이트를 사용할 때 웰당 2mL의 매질을 추가하는 것을 반영하여 2를 곱한 값입니다.
    4. 위에서 계산한 세포 부피를 15mL 원뿔 튜브에 꺼내세요. 아래 식을 사용하여 세포에 추가할 완전한 배지 부피를 계산합니다:
       (시딩 웰 수 + 2웰) x 2 - 세포 (mL) = 배지(mL)
    5. 위에서 계산한 배지 부피를 Caco-2 세포가 포함된 15mL 원뿔형 배지에 피펫으로 옮기고, 여러 번 위아래로 피펫을 사용해 혼합합니다.
    6. 6웰 플레이트의 각 웰에 완전한 배지 속에 Caco-2 세포 2mL를 첨가합니다(최종 농도는 1 ×10 5 cells/mL).
    7. 5%CO2 와 함께 37 °C에서 세포가 ~90% 합율(2–3일)까지 배양합니다.
  3. 아미카신 보호 분석
    1. 1절 4.1-4.3.10에 명시된 아미카신 보호 검사를 수행하세요
  4. 면역형광 염색
    1. Caco-2 세포의 고정 및 투과화
      1. 각 웰에 1X PBS로 희석된 4% 파라포름알데히드 1mL를 첨가하여 세포를 고정합니다(재료 표 참조). 어두운 상태에서 실온에서 10분간 배양하세요.
      2. 각 웰을 흡입하고 1× PBS 1mL를 넣어 세포를 세척하세요. 이 과정을 2번 더 반복하세요(총 3번 세척).
        참고: 세포는 4°C의 1X PBS에 며칠간 보관할 수 있습니다.
      3. 각 웰에 0.1% Triton-X-100 1mL를 추가하고 상온에서 10분간 배양하여 세포를 투과시킵니다.
      4. Triton-X-100 용액을 흡입하여 각 웰에 1× PBS 1mL를 추가합니다. 1× PBS로 세포를 5분간 배양하세요. 이 과정을 2번 더 반복하세요(총 3번 세척).
    2. 차단 및 항체 염색
      1. 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 1% 소 혈청 알부민(BSA), 22.52 mg/mL 글리신을 1× PBS + 0.1% Tween20에 넣은 차단액을 준비합니다( 재료표 참조).
      2. 각 웰에 블로킹 용액 1mL를 추가하고 상온에서 1시간 배양합니다.
        참고: 블로킹 단계는 4°C에서도 16시간 동안 수행할 수 있습니다.
      3. 흡입 차단액을 흡입하고 상온에서 1시간 동안 희석한 1:500 희석 권장 1:500 희석 상태로 방충한 항체를 박살 후 세포를 배양합니다(재료표 참조).
        참고: 1차 항체와의 인큐베이션은 4°C에서 16시간간 할 수도 있습니다.
      4. 1차 항체 용액을 흡입하고 1× PBS + 0.1% Tween20 1mL를 추가합니다. 세포를 1× PBS + 0.1% Tween20에 5분간 배큐합니다. 이 과정을 2번 더 반복하세요(총 3번 세척).
      5. 염소 항토끼 알렉사 플루오르 488 2차 항체(재료 표 참조)를 실온에서 블로킹 용액에 희석(권장 1:1000 희석)하여 1시간 동안 세포를 배양합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸 형광체를 빛으로부터 보호하세요.
      6. 2차 항체 용액을 흡인하고 1× PBS + 0.1% Tween20 1mL를 추가합니다. 세포를 1× PBS + 0.1% Tween20에 5분간 배큐합니다. 이 과정을 2번 더 반복하세요(총 3번 세척).
    3. 커버슬립 카운터 스테인과 장착
      1. 숙주 및 박테리아 DNA와 숙주 액틴을 염색하기 위해, 10 mg/mL 호에스트(권장 1:2000 희석, 재료표 참조)와 로다민-팔로이딘(권장 1:1000 희석, 재료표 참조)을 1× PBS에 혼합 희석액을 준비합니다.
      2. 각 웰에 1mL의 염료 용액을 추가하고 10분간 배양합니다.
      3. 염료 용액을 제거하고 각 웰에 1× PBS 1mL를 추가하세요. 이 과정을 한 번 더 반복하세요(총 2번 세척).
      4. 1× PBS 1mL를 추가하고 세포를 용액에 담그게 합니다.
      5. 라벨이 붙은 슬라이드에 마운팅 매체 한 방울( 재료표 참조)을 놓으세요.
      6. 구부린 바늘로 6웰 플레이트에서 커버슬립을 조심스럽게 들어 올려 셀이 있는 면이 장착 매체가 들어있는 슬라이드를 향하도록 뒤집습니다.
      7. 커버슬립을 마운팅 매체 위에 올려놓으세요. 마운팅 매체가 커버슬립 전체에 고르게 퍼져 있는지 확인하세요.
      8. 마운트된 슬라이드는 어두운 밤새 실온에서 부양하세요.
      9. 커버슬립의 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉하고, 슬라이드를 슬라이드 박스에 4°C 온도에서 보관하세요.
      10. 공초점 현미경에 사용되는 염료/형광체에 대응하는 적절한 채널을 사용해 장착된 샘플을 영상화하세요.

결과

아미카신 치료가 세포외 박테리아를 제거하는 효과를 평가하고 세포 내 침범을 시각화하기 위해 Caco-2 세포 단층을 이용한 감염 실험을 수행하였습니다. 그림 1에 나타난 것처럼, 대장균 NRG857c(양성 대조군) 또는 대장균 DH5α(음성 대조군) 감염 후 겐타미신 또는 아미카신 치료도 유사한 침습 양상을 보였습니다. 이 발견들은 아미카신이 겐타마이신만큼 세포외 박테리아를 제거하는 데 효과적이며, 세포 내 박테리아 부하를 정확히 반영하여 침윤 검사를 위한 대체 항생제로서의 사용을 뒷받침합니다. NRG857c의 회복 범위는 ~4-10%, 대장균 DH5α는 <1%의 회복 범위가 돌연변이 균주나 기타 임상 분리주에 대한 침입 표현형의 정확한 해석에 적합하다고 여겨지며, 이는 이전 관찰과 일치합니다11. 양성 및 음성 대조군의 침범 백분율이 이 예상 회복 범위를 벗어난 경우, 결과를 신중하게 해석하고 검사를 반복해야 합니다.

아미카신이 겐타미신 내성 임상 대장균 분리주를 효과적으로 표적으로 할 수 있음을 입증하기 위해, 겐타미신과 아미카신 보호 분석이 병행하여 수행되었고, 분리주들의 침투 프로파일을 조사하였습니다. 그림 2에 나타있듯이, 겐타마이신 내성 분리주를 겐타마이신으로 처리했을 때 회복 값이 21.52%에서 2788.50%까지 매우 변동적이었습니다. 반면, 아미카신 치료는 모든 분리주에서 회복률을 극적으로 감소시켜 효과가 강조되고 침투 측정이 더 정확하고 신뢰할 수 있게 했습니다.

마지막으로, 침범 중 AIEC의 세포내 표현형을 평가하기 위해 Caco-2 세포에 대장 균 NRG857c를 감염시켰습니다. 그림 3 은 면역형광으로 염색된 박테리아(녹색), 숙주 액틴(빨간색), DNA(파란색)가 각각 로다민-팔로이딘과 호에스트로 염색하여 시각화된 감염된 Caco-2 세포의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 감염 후 4시간 후, NRG857c는 세포질 내에서 복제되는 것이 관찰되며, 핵 근처와 액틴 경계 내에 위치하여 이 박테리아들의 세포 내 특성을 확인시켜 줍니다.

figure-results-1
그림 1: AIEC 균주 NRG857c에 감염된 Caco-2 세포에 겐타미신 또는 아미카신을 첨가하면 유사한 침입 프로파일이 나타납니다. 카코-2 세포 단층체는 AIEC 균주 NRG857c와 대장균 DH5α에 감염되어 MOI가 10이었습니다. 감염 후 3시간 후, 세포는 1시간 동안 겐타미신(100 μg/mL) 또는 아미카신(240 μg/mL)으로 세포외 박테리아를 제거했습니다. 그 후 세포는 1% Triton-X-100으로 용해되고, 동질체는 연속적으로 희석되어 LB 한천에 플레이트되어 CFU 열거를 수행했습니다. 침입은 초기 접종 수에 비해 회수된 박테리아의 비율로 표현되었습니다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험(n = 3)을 나타냅니다; 오차 막대는 평균의 표준편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-2
그림 2: 아미카신은 겐타미신 내성 대장균 을 효과적으로 표적으로 합니다. 카코-2 세포 단층체는 IBD 환자로부터 분리된 대장균 에 감염되었으며, MOI는 10이었습니다. 감염 3시간 후, 세포는 1시간 동안 겐타미신(100 μg/mL) 또는 아미카신(240 μg/mL)으로 세포외 박테리아를 제거하였습니다. 그 후 세포는 1% Triton-X-100으로 용해되고, 동질체는 연속적으로 희석되어 LB 한천에 플레이트되어 CFU 열거를 수행했습니다. 침입은 초기 접종 수에 비해 회수된 박테리아의 비율로 표현되었습니다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험(n = 3)을 나타냅니다; 오차 막대는 평균의 표준편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 3: 대장균에 의한 상피세포 침입의 시각화. 대 장균 NRG857c에 감염된 Caco-2 세포의 대표적인 공초점 현미경사진이 사용되었습니다. Caco-2 세포는 3시간 동안 감염된 후 아미카신(240 μg/mL)으로 1시간 배양하였습니다. 숙주 액틴은 로다민-팔로딘(빨간색)으로 염색되었고, 숙주 및 박테리아 DNA는 호에스트(파란색)로 염색되었습니다. 대 장균(녹색)은 토끼 대장균 1차 항체와 염소 항토끼 1차 항체인 Alexa Fluor 488 2차 항체를 사용해 검출되었습니다. 이미지는 라이카 공초점 현미경을 사용해 3× 줌으로 63× 대물렌즈로 촬영했습니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 확대판을 보시려면 여기를 클릭하세요.

figure-results-4
그림 4: 연구의 흐름도. (A) AIEC 균주는 하룻밤 동안 배양하고 세척한 후 카코-2 단일층에 MOI가 10으로 첨가되었습니다. 감염 3시간과 아미카신 처리 1시간 후, 세포 내 박테리아를 회수하여 삼중순 희석액을 연속 도금하여 정량하였다. (B) 감염된 단일층을 고정하고 항체로 염색한 후 형광 현미경으로 영상화하였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: 아미카신 치료는 상피 세포에서 세포독성을 최소화합니다. 카코-2 세포는 겐타미신(100 μg/mL) 또는 아미카신(240 μg/mL)으로 1시간 처리되었습니다. 세포독성은 배양 배지에 방출된 락테이트 탈수소효소를 측정하여 결정하였습니다. 오차 막대는 평균의 표준편차(n = 3)를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

아미카신 보호 분석법은 대장균이 상피 세포에 침입하는 것을 평가하기 위한 수정된 접근법입니다. 이 분석의 성공을 위해서는 플레이트의 콜라겐 코팅, 단일층 무결성 유지, 효율적인 세포 용해 등 여러 단계가 중요합니다. 카코-2 세포는 조직 배양 처리된 플라스틱에 부착하여 단일층을 형성할 수 있는 부착 세포주입니다20. 그러나 감염 시에는 혈청이 없는 배지 사용과 반복적인 세척이 세포 박리에 영향을 미쳐 박테리아 침입이 과소 대표될 수 있습니다21. 이를 해결하기 위해 IV 콜라겐과 같은 세포외 기질 성분을 코팅하는 플레이트는 감염 중 세포 부착과 안정적이고 합류하는 단일층 형성을 촉진할 수있습니다. 이는 AIEC 균주 LF82가 침입 시 밀접 결합을 방해하는 것으로 나타났으며, 불완전한 단일층 형성이 이 단계를 우회하여 결과를 왜곡할 수 있기 때문에 중요합니다22. 마지막으로, 효율적인 세포 용해는 박테리아 회복에 영향을 미치는 또 다른 핵심 단계로, 불완전한 용해는 침습성을 가릴 수 있어 분석법 결과를 혼란스럽게 만듭니다23. 이를 우회하기 위해서는 Triton-X-100과의 인큐베이션 후 세포 용해물을 철저히 재현탁하는 것이 중요합니다.

침입 분석의 변동성에 기여할 수 있는 기술적 어려움 외에도, AIEC 균주 LF82의 감염 후 회수된 접종 비율은 0.61%에서 17.25% 사이로 나타났습니다. 이 변동성은 담즙염, 점액, 기타 장내 대사산물과 같은 특정 환경 신호가 없기 때문에 영향을 받을 수 있으며, 이들은 AIEC 병원성에 기여하는 것으로 알려져 있습니다24,25,26. 구체적으로, 담즙염은 긴 극성 섬유낭의 발현을 유도하여 M 세포 간 AIEC 부착 및 전위를 증가시키는 것으로 나타났습니다27. 비브리오와 시겔라와 같은 다른 위장 병원체는 담즙에 반응하여 제3형 분비 시스템을 조절하여 상피세포 침범을 매개하는 것으로 알려져 있다28,29. 담즙염으로 병원성 인자 발현을 유도하는 하부 배양은 다른 병원체에 대한 겐타마이신 보호 프로토콜에서 표준이며, 이러한 환경 신호를 이용한 AIEC를 배양하면 침입을 안정시키고 보다 일관된 프로필을 얻을 수 있다 30,31.

이 분석법의 또 다른 한계는 박테리아 침입이 단일 시점에서 평가된다는 점인데, 이는 현장에서 표준이긴 하지만 침입 과정을 지나치게 단순화한 것으로 보입니다12. 박테리아 침입은 숙주 세포 내 부착, 내화, 세포 내 복제, 탈출을 포함하는 역동적인 과정입니다. AIEC 침범에 기여하는 새로운 유전자를 식별하는 것이 어려웠기 때문에, 단일 시점 분석법을 사용하면 이 과정에 기여하는 유전자 수를 과소평가할 수 있습니다12. 따라서 시간 경로 침윤 분석법은 특정 유전자가 침윤에 어떻게 기여하는지 평가하고 I-407 및 Hep-2 세포에서 AIEC 복제를 연구하는 데 사용되어 왔습니다 8,33. 시간 경로 침입 분석법의 사용은 개별 유전자의 침윤 기여도를 특성화하는 데 유용하지만, 특히 많은 임상 분리株을 선별할 때 노동 집약적이다. 이 때문에 침입 평가에는 단일 시점이 사용됩니다.

또한 AIEC의 세포내 생활 방식은 아직 명확히 규명되지 않았습니다. 대부분의 연구는 다양한 병원성 인자 결실 돌연변이체의 CFU 변화를 감지하기 위해 침범률 비율을 주요 측정 지표로 사용합니다 14,34. 감염된 숙주 세포의 시각화는 CFU 인거매션35만 사용할 때는 놓치는 AIEC 생물학에 대한 독특한 통찰을 제공할 수 있습니다. 따라서 세포 침범에서 다양한 유전자의 역할을 포괄적으로 평가하기 위해서는 감염된 세포에 대한 면역형광 현미경 검사를 CFU 열거와 병행하여 수행해야 합니다. 이는 내체체 생존과 탈출에 기능하는 유전자, 숙주의 세포골격을 표적으로 하는 유전자, 세포당 박테리아 부하 차이를 나타내는 유전자를 식별하는 데 중요하며, 이는 CFU 회복만으로는 간과될 수 있습니다. 여기서 설명한 면역형광 염색 프로토콜을 사용하여 세포 내 박테리아를 검출하는 것은 진정으로 내화된 박테리아와 세포 표면에 부착된 박테리아를 구분하지 않는다는 점을 유념하는 것이 중요합니다. 과화 전에 세포외 박테리아를 뚜렷한 2차 항체로 표지하고, 투과화 후에 세포 내 박테리아를 염색하는 차별 염색 접근법이 이 한계를 해결할 것이며, 향후 연구에서 이 집단을 보다 명확히 구분하는 데 활용될 수 있다36.

이 방법의 중요성은 다양한 항생제 치료를 받은 IBD 환자로부터 다제제 내성 대장균 분리균을 스크리닝할 수 있다는 점에 주요. 겐타미신은 조기 발병 IBD 환자 치료에 사용되며, 다른 세균 감염 치료에도 투여할 수 있습니다37. 겐타미신 내성 분리주가 등장하면 표준 분석법 사용이 불가능해지므로, 아미카신이 더 신뢰할 만한 대안이 될 수 있습니다11. 이 논문에서 제시한 프로토콜을 사용하면 AIEC 감염 생물학을 보다 철저하게 특성화할 수 있으며, 침범에 기여할 수 있는 새로운 유전자를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법들은 박테리아 병원성 및 숙주-병원체 상호작용 연구 맥락에서 중요하며, 새로운 병원성 인자 발견, 박테리아 세포 내 생활사의 특성화, 감염 중 표적 숙주 경로의 탐색을 가능하게 합니다. 또한, 시험관 내 상피세포 모델을 사용하여 다른 침입성 병원체를 연구하는 데에도 널리 적용할 수 있습니다.

공개 사항

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 하워드 휴즈 의학 연구소 신흥 병원체 이니셔티브(K.O., J.N.), 웰치 재단 보조금 1-561(K.O.), 원스 어폰 어 타임 재단(K.O.), NIH 보조금 R35 GM134945(K.O.), NIH 보조금 NIDDK K08-DK-123316(J.N.), 버로스 웰컴 기금 의학 과학자 경력상 - 1020904(J.N.), NIH T32 AI007520(샌프란시스코)의 지원을 받았습니다.

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
75 cm2 조직 배양 플라스크Fisher Scientific FB012937
Amikacin disulfate Research Products International A20540-25.0
항생제-항진균제(100배)Gibco15240062
항-E.coli 항체Abcamab137967
BioLite 마이크로웰 플레이트 - 6웰Fisher Scientific 12-556-004
우청 알부민Sigma-AldrichA7906
콜라겐 I, 쥐 꼬리, 100 mgCorning354236
Countess 세포 계수 챔버 슬라이드InvitrogenC10312
DMEM, 고당Gibco11965118
태아 우청Corning35-011-CV
갈라시아 아세트산Sigma-AldrichA6283
글리신 초순USBiologicalG8165
Goat anti-Rabbit IgG (H + L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Hoechst 33342, 삼수화 삼수산InvitrogenH3570
Liofilchem MTS amikacin [AK] 0.016-256 μg/mLFisher Scientific 22-777-704Amikacin MIC 테스트 스트립
파라포름알데히드 용액, PBS 내 4%Fisher Scientific J19943.K2
PBS, 1xCorning21-040-CV
세포 배양용 폴리-L-리신 코팅 멸균 독일 유리 커버슬립NeuvitroNC1327375
ProLong gold 안티페이드 마운탠트 InvitrogenP36934
로다민-파로이딘InvitrogenR415붉은 주황색 540/565 nm
표면 처리된 멸균 조직 배양 플레이트Fisher Scientific FB01292924웰 플레이트
트리톤 X-100 (전기영동용)Fisher Scientific BP151-100
트리판 블루InvitrogenT10282
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드Gibco25200056
Tween-20Fisher Scientific BP337-100
```

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