난소암 세포에서 상동 재조합 수리의 표지자로서 핵 RAD51 초점을 검출하기 위한 면역형광 기반 분석법

요약

RAD51 핵 초점은 상동 재조합(HR) 활성의 지표입니다. 이 논문은 암세포 내 이러한 초점을 검출하는 간단한 면역형광 방법을 설명하여, HR 기능 평가와 DNA 손상 물질에 대한 전임상 연구를 지원합니다.

초록

RAD51은 상동 재조합(HR) 경로의 중심 단백질이며 DNA 이중 가닥 절단(DSB)의 정확한 수리에 필수적입니다. DSB 형성 후, DNA 말단 절제는 손상 부위에서 RAD51 핵단백질 필라멘트의 모집과 조립을 용이하게 하는 단일 가닥 DNA 기질을 생성합니다. 이 과정은 HR 활동의 널리 인정되는 기능적 판독 및 HR 숙련도의 대체 지표로 사용되는 이산 핵 RAD51 초점의 형성을 초래합니다. HR 결함은 특히 난소암과 유방암 등 여러 악성 종양에서 흔하기 때문에, RAD51 초점 형성 평가는 DNA 복구 능력을 평가하고 백금 화합물과 폴리(ADP-리보스) 중합효소(PARP) 억제제 등 DNA 손상 치료제에 대한 반응을 예측하는 중요한 접근법으로 부상하고 있습니다. 이 원고는 배양된 난소암 세포에서 RAD51 핵 초점을 검출하고 정량하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 면역형광 기반 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 이온화 방사선(IR)을 이용한 DNA 손상 유도, 이어서 고정, RAD51 및 γH2AX에 대한 항체로 면역염색, 공초점 현미경, 그리고 RAD51/γH2AX 공동초점의 수동 정량 분석을 포함합니다. 이 프로토콜은 기초 조건 또는 유전적·약리학적 교란 이후에 적용하여 HR 기능에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다. 대표적인 결과는 DNA 손상 후 HR 숙련 난소암 세포에서 RAD51 초점이 강력하게 유도되는 반면, RAD51 감소는 DSBs가 비슷한 수준임에도 초점 형성을 현저히 감소시켜 분석법 특이성을 확인시켜 줍니다. 전반적으로 이 프로토콜은 HR 역량 평가를 위한 견고하고 재현 가능한 기능적 검사법을 제공하며, 전임상 및 잠재적 중개 암 연구에 폭넓게 적용됩니다.

서론

DNA 이중 가닥 절단(DSB)은 부정확한 수리가 유전체 안정성을 저해하고 종양 발생이나 세포 사멸에 기여할 수 있기 때문에 DNA 손상 중 가장 심각한 형태 중 하나입니다. 이러한 위협에 대응하기 위해 세포는 상동 재조합(HR)을 포함한 여러 DNA 수리 경로를 사용하며, HR은^{DSBs 2,4,5} 수리에 가장 정확한 메커니즘으로 간주됩니다. 오류가 발생하기 쉬운 복구 경로와 달리, HR은 상동 DNA 서열을 템플릿으로 사용하여 손상된 부위의 유전 정보를 복원합니다. 따라서 HR은 주로 세포 주기의 S기와 G2기에서 기능하며, 이 시기에는 자매 염색분체가 수리 템플릿으로 사용될 수 있다 ^2,5. 특히 HR은 복제 스트레스와 같은 내인성 원인에서 발생하는 DSBs의 정확한 수리에 필수적이며, 이온화 방사선(IR) 및 DNA 손상성 화학요법제와 같은 외부 손상에도 해당됩니다^2,5.

RAD51은 HR 경로의 중심 효과자이며, HR 매개^{DSBs 2,5} 수리 과정에서 상동 탐색과 가닥 침입에 중요한 역할을 합니다. DSB 형성 후, DNA 말단은 MRE11–RAD50–NBS1(MRN) 복합체와 관련 인자에 의해 시작되어 3′ 단일 가닥 DNA 돌출부를 생성하는 절단 과정을 겪습니다. 이 단일 가닥 영역들은 처음에 복제 단백질 A(RPA)로 코팅되어 2차 구조 형성을 방지하고 수리 중간체 ^4,5,6을 안정화합니다. HR은 BRCA1, PALB2, BRCA2의 협력 작용을 통해 시작되며, 이들은 절단된 DNA에 RAD51이 모집되고 적재되어 RPA를 대체하고 RAD51 함유 핵단백질 필라멘트 ^4,5,6의 형성을 촉진합니다. 조립된 필라멘트는 자매 염색분체 내에서 상동 DNA 서열을 탐색하고 촉매 가닥 교환을 촉진하여 손상된 DNA ^4,5,6의 충실한 복원을 돕습니다. DSB 부위에 RAD51이 축적되는 현미경적으로는 면역형광 7,8,9,10으로 검출할 수 있는 점상 핵 중심체로 나타납니다. 이러한 초점의 형성은 HR 기구의 성공적인 참여를 반영하기 때문에, RAD51 초점 분석은 세포 7,8,9,10에서 HR 용량과 DNA 수리 숙련도를 평가하는 데 널리 사용되는 기능적 접근법이 되었습니다. 중요한 점은, 이 검사법이 DNA 손상 후 HR 반응을 수행하는 세포의 능력을 측정하며, HR 관련 유전자 또는 단백질의 발현 수준에만 의존하지 않는다는 것입니다.

HR 결함은 암에서 자주 관찰되며, 특히 BRCA1, BRCA2, RAD51 파로그(RAD51) 파로그(paralogs) 또는 HR에 관여하는 기타 유전자에 변이가 있는 종양에서 특히 난소암과 유방암에서 두드러집니다 4,11,12,13,14. HR 결핍은 합성 치명성 원리를 통해 백금 치료와 같은 DNA 손상 물질과 폴리(ADP-리보스) 중합효소(PARP) 억제제에 대한 민감도를 높여 중요한 치료적 함의를 가진다 4,11,12,13,14,15 . 따라서 HR 활동을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 기능적 검사는 기전 연구와 중개 연구 모두에서 매우 중요합니다.

이 프로토콜은 난소암 세포에서 DNA 손상 후 핵 RAD51 초점을 검출하고 정량하기 위한 면역형광 기반 분석법을 설명합니다. 작업 과정은 IR을 이용한 DNA DSB를 유도한 후, RAD51과 γH2AX의 면역형광 검출, 공초점 현미경을 통한 공소 핵 초점의 정량을 포함합니다. 이 프로토콜은 HR 숙련 OVCAR-8 세포와 획득한 PARP 억제제 내성 ABT^R2 세포를 사용하여 입증되었으며, DSB 형성 후 HR 활성을 평가하는 재현 가능한 기능적 접근법을 제공합니다. RAD51 초점 분석은 HR 활동의 기능적 측정으로 널리 사용되지만, 기존 방법은 종종 특정 실험 환경에 집중하며, 통제된 DNA 손상 유도, DNA DBS 형성 확인, 분석 검증 통제, 표준화된 이미지 기반 정량 통합에 대한 상세한 지침이 부족한 경우가 많습니다. 또한, 유전체 흉터 분석, 돌연변이 서명, 유전자 또는 단백질 발현 분석 등 HR 기능을 평가하는 대체 접근법들은 HR 상태를 간접적으로 측정할 수 있으며, DNA 손상 부위로 RAD51을 모집하는 세포 능력을 직접 평가하지는 않습니다. DR-GFP와 같은 리포터 기반 검사법은 심박 활성의 직접적인 측정을 제공하지만 안정적인 유전공학이 필요하며 많은 실험 모델에 쉽게 적용하기 어렵습니다. 따라서 여기서 설명한 워크플로우는 IR 유도 DNA 손상과 이중 RAD51/γH2AX 면역형광 염색을 결합하여 DSB 형성을 동시에 검증하고 손상된 염색질에 대한 RAD51 모집을 정량합니다. 이 접근법은 배양된 암세포에서 HR 역량을 직접적으로 기능적으로 평가할 수 있는 실용적이고 생물학적으로 관련성 있으며 광범위하게 적용 가능한 방법을 제공하며, 분석법 대조, 검증 단계, 표준화된 초점 정량화 절차를 포함합니다.

프로토콜

이 프로토콜에서 사용된 모든 재료 및 시약은 제조사 정보, 카탈로그 번호, 항체 희석 수를 포함하여 재료표에 나열되어 있습니다. 프로토콜의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

참고: 난소암 세포주 OVCAR-8과 ABT^R2가 이 프로토콜에 사용되었으며, 이전에 15,16,17,18,19,20에 대해 기술된 바 있습니다. OVCAR-8 세포는 원래 국립암연구소(NIH)의 도미닉 스쿠디에로 박사로부터 받은 메이요 클리닉의 래리 카니츠 박사가 친절히 제공했습니다. ABT^R2 세포는 Dr. Scott Kaufmann(메이요 클리닉)에 의해 친절히 제공되었습니다²⁰. ABT^R2는 BRCA2의 PARPi 내성 유도체입니다.- BRCA2 발현 복원으로 내성을 획득한 난소암 세포주 PEO1 변이. BRCA2 복원이 RAD51 부하와 HR 활성을 재확립했기 때문에, ABT^R2 세포는 HR 숙련도를 대표하는 모델로 기능합니다. 세포주 정체는 출처와 문헌에서 보고된 특성^{15, 16, 17, 18, 19, 20}을 기반으로 검증되었습니다. 실험은 해동 후 1개월 이상 배양 내에 유지된 저통시 세포(3–12 패시지)를 사용하여 수행되었습니다. 세포주는 마이코플라즈마 검출 키트를 사용해 6개월마다 마이코플라즈마 오염 여부를 정기적으로 검사했으며, 이 연구에 사용된 모든 배양은 마이코플라즈마가 없는 것으로 확인되었습니다.

주의: 파라포름알데히드는 독성이 있으므로 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 인증된 화학 연기 후드에서 준비 및 취급해야 합니다. 인간 유래 세포주는 적절한 격리 관행을 사용하여 기관의 생물안전 절차에 따라 취급되어야 합니다. Triton X-100, 장착 매체, 매니큐어는 제조사의 안전 권고사항에 따라 취급해야 합니다. IR은 훈련된 인력에 의해서만 관리되어야 하며, 기관의 방사선 안전 정책에 따라야 합니다. 화학, 생물학, 방사선 관련 폐기물은 지역 기관 및 규제 요건에 따라 처리합니다.

1. 세포 배양 및 유지

1. 로즈웰 파크 메모리얼 연구소(RPMI)-1640 배양지를 8% 태아 소 혈청을 보충한 채, 37°C에서 5% CO₂ 함유의 가습 인큐베이터에서 배양 세포.
   참고: 이러한 배양 조건은 이전 OVCAR-8 및 ABT^R2 세포^{15, 16, 17, 18, 19} 연구에서 사용된 것과 일치합니다. 이러한 조건에서 두 세포주 모두 견고한 성장과 DNA 손상 반응 재현 가능한 표현형을 보인다.
2. 원한다면, 최적화된 실험 조건 ^15,17에 따라 교란(예: 유전자 녹다운/녹아웃)을 수행하라.
   참고: 이 프로토콜에서는 면역형광 분석 전 유전자 교란의 대표적인 예로 siRNA 매개 RAD51의 녹다운을 제시합니다.
   1. 180 μL RPMI-1640 배지에 6^{개의 6 세포} 5개 × 준비하고 8% 태아 소 혈청을 보충합니다.
   2. 20 μM siRNA 용액 20 μL (형질전환 시 2 μM siRNA)를 넣고 부드럽게 섞습니다.
      참고: 다음 siRNA를 사용: 비표적 대조 루시페라제 siRNA(siLUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′; RAD51 siRNA (siRAD51.): 5′-GGGAUUGUGUGAAGCCAA-3′. 모든 siRNA는 Horizon Discovery에서 구매했습니다.
   3. 셀 현탁액을 4mm 전기공공 쿠벳으로 옮기세요.
   4. BTX ECM 830 전기공공기를 사용하여 280 V에서 10ms 펄스 두 개를 사용하는 전기공공 셀.
   5. 세포를 완전한 배양지로 옮기고 표준 배양 조건에서 10cm 접시에서 24시간 배양합니다.
   6. 1.2.1–1.2.4 단계에 설명된 동일한 조건으로 siRNA 전기천공을 반복합니다.
   7. 표준 배양 조건에서 15cm 접시에서 추가로 48시간 배양합니다.
   8. 2단계에서 설명한 면역형광 분석법을 위해 세포 일부를 씨앗 주었습니다. 남은 세포는 면역블롯팅을 통해 RAD51 녹다운 검증을 위해 보존합니다.
   9. 면역블롯팅으로 RAD51 녹다운 검증
      1. 얼음 냉각 용해 버퍼 내 용해세포에 50 mM HEPES(pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM 피로인산나트륨, 1 mM Na₃VO₄, 10 mM β-글리세로인산, 그리고 프로테아제 억제제 칵테일(10 mL 용해 완충제당 1정)을 포함합니다.
      2. 용해액은 18,800 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리하여 정액합니다. 상원액을 신선한 마이크로 원심분리관으로 옮기고 적절한 단백질 분석법으로 단백질 농도를 측정합니다.
      3. 적절한 양의 단백질 용해액과 4× Laemmli 샘플 버퍼를 혼합하여 최종 1× 농도를 얻습니다.
      4. 최종 농도는 20%에 β-머캅토에탄올을 첨가하고, SDS-PAGE 전에 샘플을 95 °C에서 12분간 가열합니다.
      5. SDS-PAGE로 같은 양의 단백질을 분리하여 적절한 막으로 전달하여 면역블롯 분석을 수행합니다.
      6. 멤브레인을 5% 우유에 넣어 실온에서 30분간 흔들면서 막을 막으세요.
      7. 멤브레인을 3번(각 5분씩) 실온에서 1× tris-완충 식염수와 tween 20(TBST)을 사용해 상온에서 흔들며 세척하세요.
      8. 토끼 다클론 항-RAD51 항체(1:1,000 희석)나 항-ACTIN 항체(1:1000 희석)와 함께 4°C에서 16–18시간 동안 진동시키며 막을 배양합니다.
      9. 멤브레인을 실온에서 1× TBST(각각 5분씩)로 흔들면서 세척하세요.
      10. 고추냉이 과산화효소(HRP) 결합된 항토끼 또는 항생쥐 IgG 2차 항체(1:10,000 희석)를 실온에서 1시간 동안 진동시키며 양측막을 배양합니다.
      11. 1× TBST(각각 5분씩)로 멤브레인을 상온에서 흔들고 세척한 후, 적절한 화학발광 검출법으로 면역반응 밴드를 검출하고, 비표적 대조군 siRNA로 형질화된 세포에 비해 RAD51 감소를 확인한다.

2. 세포 시딩

1. 세포가 로그 성장 단계(약 70–80% 합류)에 도달하면 배양지를 흡인하여 멸균 인산염 완충식염수(PBS)로 부드럽게 한 번 세척하여 잔여 혈청을 제거합니다.
2. 세포 단층을 덮을 만큼 충분한 0.25% 트립신-EDTA 용액(예: T175 플라스크당 1–2 mL)을 추가하고, 37°C에서 2–5분간 배양하며 현미경으로 세포 박리를 관찰합니다.
3. 세포가 분리되면, FBS가 포함된 완전한 배양지를 같은 양의 양으로 즉시 중화시킵니다.
4. 세포 현탁액을 15mL 원뿔관에 모으세요
5. 시드 전에 트리판 블루 배제법과 혈구세포계 또는 자동 세포 계수를 사용하여 세포 생존성과 농도를 결정합니다.
6. 4 ×^{10 4} cells/mL 농도로 완전 배양 배지에 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
7. 8웰 유리 챔버 슬라이드의 각 웰에 200 μL의 셀 현탁액을 주입하여 최종 웰당 8,000 셀의 밀도를 달성합니다.
8. 37°C에서 5% CO₂를 넣은 채 24시간 동안 배양하여 세포 부착을 가능하게 합니다.
   참고: 씨앗을 뿌릴 세포 수는 세포 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 피펫팅 변동성을 고려할 수 있도록 최소 한 개의 추가 웰에 충분한 과잉 셀 현탁액을 준비하세요. 각 조건을 중복 또는 여러 번 시딩하여 재현성을 보장하세요. 심박수의 약리학적 조절이 필요하다면, 종착 후 12–16시간 동안 하룻밤 부착 후 세포를 처리해야 합니다. 시딩 밀도는 필요에 따라 조절하여 치료 및 후속 분석 시점에 세포가 적절한 합류점에 도달하도록 해야 하며, 약리학적 작용제가 세포 증식이나 생존력에 미치는 예상 효과를 고려해야 합니다. HR은 주로 세포 주기의 S기와 G2기에서 발생하므로, 배양물을 로그 성장으로 유지하고 과도한 수합을 피해야 합니다. 세포 주기 진행을 변화시킬 수 있는 치료법의 경우, EdU 삽입, DNA 성분 분석 또는 기타 세포 주기 측정이 RAD51 초점 결과 해석을 용이하게 할 수 있습니다. 각 실험에 미처리(–IR) 및 방사선(+IR) 대조군을 포함하여 각각 기저 및 DNA 손상 유도 RAD51 초점 형성을 확립합니다. siRNA 매개 교란을 수행할 때는 비표적 대조 siRNA(예: siLUC)와 표적 특이적 siRNA 조건(예: siRAD51)을 포함합니다. 항체 최적화 시에는 비특이적 염색과 배경 형광을 평가하기 위해 1차 항체 및 2차 항체 무 대조군을 권장합니다.

3. 적외선에 의한 DNA 손상 유도

1. 챔버 내 세포를 노출시키고, 6 Gy²¹ 의 IR 용량으로 DNA DSB를 유도합니다.
2. 즉시 슬라이드를 37°C, 5% CO₂ 가습 인큐베이터에 다시 넣으세요.
3. IR 후 6시간 동안 세포를 부양하세요.
   참고: IR은 160 kV, 25.0 mA(선반 위치 5)에서 작동하는 RS-2000 생물학적 조사기를 사용해 전달되었습니다. 세포는 상온에서 단일 6Gy 방사선(약 분당 4.8 Gy)으로 방사선을 받고 즉시 37°C 인큐베이터에 5% CO₂를 넣어 회수했습니다. 조사기는 제조사 권고에 따라 정기적으로 보정되었으며, 모든 절차는 기관 방사선 안전 지침에 따라 수행되었습니다. IR 이후 6시간 잠복 기간은 이전에^{15, 17, 22}로 설정되었습니다. 최적의 시기는 세포 유형에 따라 다를 수 있으므로 각 세포주에 맞게 최적화되어야 합니다.

4. 고정 및 투과성

1. 세포를 방해하지 않고 웰에서 배양지를 조심스럽게 흡입하세요.
2. 세포를 1× PBS에 신선하게 준비한 3% 파라포름알데히드를 1 상온에서 12분 동안 고정합니다.
3. 고정제를 부드럽게 흡입한 후, 웰당 1× PBS 500 μL 액체로 세 번 세척합니다.
4. 0.2% Triton X-100을 투과성 세포를 1× PBS에 실온에서 12분간 투여합니다.
5. 우물을 1× PBS로 세 번 세척하세요.
   참고: 고정, 투과, 세척 단계를 부드럽게 수행하여 각 웰 벽을 따라 용액을 추가하고 제거하여 셀 박리를 최소화하세요. 별도의 언급이 없는 한, 한 번 세탁당 1× PBS 500 μL 사용을 권장합니다.

5. 블로킹

1. 5%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 1× PBS에 용해하여 차단액을 준비합니다.
2. 세포를 상온에서 60분간 차단액에 배양하여 비특이적 항체 결합을 줄이세요.

6. 1차 항체 인큐베이션

1. 차단액을 제거하고 1× PBS로 세포를 세 번 세척하세요.
2. 블로킹 용액에 적정 희석된 1차 항체를 준비합니다. 토끼 다클론 항-RAD51(1:1000)과 마우스 단클론 항인산-히스톤 H2AX(γH2AX)(1:1000) 항체가 사용되며, γH2AX는 DSB^23,24의 마커로 사용됩니다.
3. 각 웰에 희석된 1차 항체 용액 100 μL을 추가합니다.
4. 증발을 막기 위해 실온에서 16–18시간 동안 가습 챔버에서 배양하세요.
   참고: 두 가지 1차 항체를 동일한 용액에 결합하여 동시에 염색할 수 있습니다.

7. 2차 항체 배양

1. 차단액에 적정 희석된 2차 항체를 준비합니다. Alexa Fluor 488 결합된 염소 항토끼 IgG(1:350)는 RAD51을 검출하는 데 사용되며, Alexa Fluor 594 결합된 염소 항생쥐 IgG(1:350)는 γH2AX 검출에 사용됩니다.
2. 1차 항체 용액을 흡입한 후 세포를 1× PBS로 세 번 세척합니다.
3. 각 웰에 희석된 2차 항체 용액 100 μL을 추가합니다.
4. 슬라이드는 실온에서 어두운 곳에서 1시간 동안 부양하세요.
   참고: 두 2차 항체는 동시에 검출할 수 있도록 결합할 수 있습니다. 이 섹션부터는 광표백을 최소화하기 위해 모든 과정을 빛이 차단된 공간에서 수행하세요.

8. 핵 염색 및 마운팅

1. Hoechst 33342 용액을 1:1,000 희석 비율로 1× PBS에 혼합하여 핵을 염색합니다.
2. 2차 항체 용액을 흡인하고 1× PBS로 세포를 한 번 세척합니다.
3. 희석된 Hoechst 33342 용액으로 실온에서 90초간 세포를 배양합니다.
4. Hoechst 33342 용액을 흡입하고 1× PBS로 세 번 세척합니다.
5. 1× PBS를 제거하고 상부 챔버를 유리 슬라이드에서 분리한 후, 각 웰에 약 25μL의 안티페이드 마운턴트를 추가하세요.
6. 장착된 셀 위에 유리 커버를 덮어 마운트 렌즈와 고르게 접촉하도록 하세요.
7. 공기 방울을 부드럽게 제거하고 가장자리를 매니큐어로 밀봉하세요.
   참고: 핵 카운터 스텔링은 핵 기준을 제공하여 핵 RAD51과 γH2AX 초점의 정확한 위치 파악과 정량을 돕습니다.

9. DSB에서의 RAD51 초점의 영상화 및 정량화

1. 이미지는 즉시 슬라이드되거나 분석이 끝날 때까지 어두운 슬라이드 박스에 4°C에 보관됩니다.
   참고: 신호 저하와 광표백을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리, 가능하면 장착 후 1주 이내에 이미지를 촬영하세요.
2. 공초점 현미경을 사용해 적절한 레이저 라인과 필터 세트를 사용하여 이미지를 획득하세요: 핵에는 Hoechst 33342(405 nm), RAD51에는 Alexa Fluor 488(488 nm), γH2AX에는 Alexa Fluor 594(561/594 nm)를 사용합니다.
3. 세포 내 구조를 해독하는 데 적합한 고배율 대물렌즈를 사용하여 공초점 영상을 수행합니다.
4. γH2AX와 동일 위치에 있는 이산적인 핵 초점을 세어 RAD51 초점을 수동으로 정량화할 수 있습니다; γH2AX와 동일 위치하지 않은 초점은 제외합니다.
   참고: RAD51 siRNA 처리 후 대조군 세포에서 IR 유도 RAD51 및 γH2AX 핵 초점과 RAD51 신호 감소를 확인하여 정량적 분석 전에 항체 성능을 검증합니다. 형태가 온전하고 염색 패턴이 명확한 핵에서 γH2AX와 동일 위치하는 이산 핵 RAD51 초점만 정량화합니다; 확산성 또는 비핵 염색, 비공소 RAD51 신호, 겹치거나 다핵 세포, 유사분열 세포, 세포자멸사 세포는 제외합니다. 각 실험 내에서 동일한 영상 설정을 유지하고, 모든 조건에서 일관된 수동 점수 기준을 적용하세요. 각 생물학적 복제에 대해 조건당 여러 시야에서 ~50개의 핵을 분석하고, 최소 세 개의 독립적인 생물학적 복제를 수행합니다. 적절한 통계 분석을 사용하여 핵당 RAD51/γH2AX 공존 초점 수를 보고합니다.

10. 통계 분석

1. 약 50개의 핵에서 RAD51/γH2AX의 공동국소 초점을 정량화합니다.
2. 최소 세 개의 독립적인 생물학적 복제체의 평균 ± SD 데이터를 제시합니다.
3. 적절한 통계 검정(예: 쌍 없는 양측 학생 t-검정 또는 다중 그룹 비교 시 일원 ANOVA)을 사용하여 통계 비교를 수행하세요
4. p . < 0.05를 통계적으로 유의하다고 생각하세요.
5. GraphPad Prism(버전 10.6.1)을 사용하여 통계 분석 및 그래프 생성을 수행합니다.

결과

IR은 OVCAR-8 세포의 DNA DSB에서 RAD51 초점 형성을 유도합니다
HR 활성을 기능적으로 평가하기 위해, IR에 의해 DNA DSB를 유도한 HR 숙련 OVCAR-8 난소암 세포에서 RAD51 초점 형성을 조사하였다. 분석의 특이성을 확립하고 관찰된 초점이 진정한 RAD51 의존적 HR 이벤트임을 확인하기 위해, 세포는 비표적 대조군 루시페라제 siRNA(siLUC) 또는 RAD51 표적 siRNA(siRAD51)로 형질전환되었습니다.IR 이전에 ^{15, 16, 17}.

IR이 없는 상태에서 siLUC와 siRAD51

토론

여기서 설명한 핵 RAD51 초점의 면역형광 기반 검출은 배양된 난소암 세포에서 HR 활성을 평가하는 신뢰할 수 있고 기능적인 접근법을 제공합니다. HR 상태를 간접적으로 추론하는 유전체 또는 전사체 분석과 달리, RAD51 초점 형성은 DNA DSB 부위에서 핵심 HR 기구를 모집하고 조립하는 세포 능력을 직접 반영합니다. 따라서 이 검사는 DNA 손상 후 HR 역량을 민감하게 측정하는 지표로, HR 수리 조절이나 치료 반응을 조사하는 기전적 연구에 적합합니다. 이 프로토콜에서는 IR을 사용해 DSBs의 조절되고 재현 가능한 수준을 유도하여 γH2AX 형성과 이후 RAD51 모집을 이끌었습니다. 6 Gy의 선정 용량과 6시간 회복 기간은 활성^{HR 수리 중} RAD51 초점 형성의 최고점을 포착하도록 최적화되었습니다. 이러한 매개변수는 세포 유형, 증식률 또는 기본 DNA 수리 능력에 따라 조정이 필요할 수 있으며, 프로토콜을 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10% Polyacylamide gel recipe (Lower gel buffer 20 ml,ddH2O 33.4 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 26.6 mL. 10% APS (fresh) 200 µL  TEMED 70 µL)	셈짓한	NA	SDS-PAGE용 분리 젤
10% Polyacylamide gel recipe (Upper gel buffer 10 mL, ddH2O 23.6 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 6.4 mL 10% APS (fresh) 160 µL  TEMED 40 µL)	셈짓한	NA	SDS-PAGE용 스태킹 젤
100 mL Trypsin EDTA 1X, 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA in Sodium Bicarbonate	코닝	25-053-C1	세포 증식 및 세포 접종 전 부착 세포를 분리하는 데 사용됨.
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	바이오-래드	1610780	세척, 블록킹 용액, 항체 희석, 고정, 세포막 투과성 조절에 1배로 희석하여 사용됨.
10X Running buffer (6 L) Tris 181.8 g +Glycene 864.0 g+SDS 60 g	셈짓한	NA	젤에서 단백질 샘플을 분리
10X Transfer (6 L) Tris 181.8 g+ Glycene 864 g	셈짓한	NA	젤에서 멤브레인으로 단백질 전달
10x Tris Buffered saline	바이오-래드	1706435	버퍼
30%  (w/v)Acrylamide ;0.8(w/v)/Bis-acrylamide stock solution (37.5:1)	울트라퓨어 EC-890	EC-890	SDS-PAGE용
ABTR2 세포	메이요 클리닉	NA	PARPi 저항성 난소암 세포주 획득
AKT 용해 버퍼 레시피 (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-glycerophosphate, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin, 5 μg/mL pepstatin, and 20 mM microcystin-LR.)	셈짓한	NA	세포 용해 버퍼
암모늄 퍼술페이트	바이오-래드	16107000	분자 생물학에서 젤의 중합을 위한 산화제로서 자유 라디칼 개시제로 사용됨
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	시그마-알드리치	05-636	γH2AX 포커스를 검출하는 데 사용되는 1차 항체. 1:1000 희석으로 사용됨
Anti-Rad51 (Ab-1) Rabbit pAb	시그마-알드리치	PC130	동질성 재조합 활성의 마커로 RAD51 핵 포커스를 검출하는 데 사용되는 1차 항체. 1:1000 희석으로 사용됨
보우인 혈청 알부민 Protease free	골드바이오	A-420-250	면역형광 염색 시 비특이적 항체 결합을 줄이기 위해 차단 용액(PBS에 5% BSA)을 준비하는 데 사용됨.
케미독 이미징 시스템	바이오-래드	12003154	이미징 시스템
공간 레이저 스캐닝 현미경	자이스	자이스 LSM 780	면역형광 이미징, γH2AX 포커스 분석, RAD51 포커스 정량화, 단백질 공간 공유 및 3D 이미지 획득
카운터 II FL 자동 세포 카운터	라이프 테크놀로지	AMQAF1000	자동 세포 카운터
커버 슬립	카디널 헬스	M6045-10A	염색된 세포를 보호하고 고해상도 이미징을 가능하게 하기 위해 장착된 샘플 위에 배치됨.
ECM 830 스퀘어 웨이브 전기 펄스 시스템	Hbio-BTX	45-2052	포유동물 세포에 유전자 전달 응용 프로그램에 적합한 전기 펄스 시스템
태아 소 혈청	코닝	35-010-CV	세포 성장 및 생존을 지원하기 위해 RPMI-1640(8%로)에 추가됨.
글리신	써모 피셔 과학	A13816.0C	버퍼
마우스 IgG(H+L) 고도 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor® 594	써모 피셔 과학	A-11032	γH2AX 1차 항체를 검출하는 데 사용되는 2차 항체. 1:350 희석으로 사용됨
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