방법 논문

유리 커버슬립 상의 부착성 2차원 세포 배양에서 단일 및 다중 면역형광 염색을 위한 비용 효율적인 워크플로우

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DOI:

10.3791/71114

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2026년 9월 1일

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1Laboratório de Vetores Virais (LVV), Centro de Investigação Translacional em Oncologia (CTO)/LIM24, Centro de Estudos e Tecnologias Convergentes para Oncologia de Precisão (C2PO), Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP), Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo (FMUSP)

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 부착성 2차원 세포 배양의 단일 및 다중 면역형광(IF) 염색을 위한 비용 효율적인 워크플로우를 설명합니다. 저렴한 유리 커버슬립, 표준 24-웰 플레이트 및 항체 소모를 최소화하는 저용량 염색 조건을 통해 실험 비용을 절감하는 동시에, 표준 형광 현미경을 사용하여 단백질 위치를 파악할 수 있는 대표적인 접근 방식을 제공합니다.

초록

면역형광(IF) 현미경 검사는 세포의 형태와 세포 내 구조를 유지하면서 단일 세포 해상도로 단백질의 위치와 공동 분포를 시각화하는 데 널리 사용되는 기술입니다. 본 프로토콜의 목적은 표준 실험실 재료를 사용하여 부착성 2D 세포 배양의 단일 및 다중 면역형광 염색을 위한 실용적이고 비용 효율적인 워크플로우를 제시하는 것입니다. 이 방법은 일반적인 24-웰 플레이트에 배치된 저렴한 유리 커버슬립 위에서 세포를 배양하는 방식이며, 1차 항체의 숙주 종 분리, 스펙트럼적으로 구별되는 형광체, 그리고 다중 IF의 해석 가능성을 보장하기 위한 1차 항체 미처리, 항체 미처리, 단일 염색 및 크로스톡 대조군을 포함한 강력한 대조 조건을 통해 다중 염색을 구현합니다. 신호 품질을 저하시키지 않으면서 시약과 항체의 소비를 줄이기 위해 소량의 염색 단계가 사용됩니다. 이 워크플로우는 특수 이미지 플레이트나 챔버의 필요성을 배제하며, 일반적인 광시야 또는 공초점 형광 현미경과 호환됩니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 부착성 세포 배양에서 단백질의 위치와 공동 분포를 대표적으로 평가하기 위한 접근 가능하고 실용적인 면역형광 워크플로우를 제공합니다. 다른 세포 유형이나 항체 패널에 적용하려면 항체 검증, 고정 및 투과화 조건, 형광체 선택, 현미경 및 필터 세트와의 호환성을 포함하여 표적 특이적인 최적화가 필요합니다.

서론

면역형광(IF) 현미경 검사는 고정된 세포 내 단백질의 세포 내 소기관 위치, 상대적 풍부도 및 공국소화를 시각화하는 데 널리 사용되며, 이를 통해 분자 마커를 세포 형태 및 세포 내 소기관 맥락과 연결합니다1,2. 벌크 리드아웃(예: 면역블로팅)이나 해리성 단일 세포 분석(예: 유세포 분석)과 달리, IF는 세포의 공간적 조직을 보존하므로 단일 세포 해상도에서 세포 간 표현형의 이질성과 세포 내 단백질 분포의 변화를 평가하는 데 특히 유용합니다3,4,5. 실험적 요구사항이 점점 더 여러 마커의 동시 평가를 필요로 함에 따라, 멀티플렉스 IF는 일반적으로 서로 다른 숙주 종에서 생성된 일차 항체를 스펙트럼이 서로 다른 형광체와 결합하여 동일한 시료 내에서 두 개 이상의 표적을 동시에 검출할 수 있게 하며6 (그림 1), 직접 및/또는 간접 검출 전략을 사용합니다 (그림 2). 그러나 멀티플렉싱은 특히 항체 교차 반응성과 스펙트럼 혼선(crosstalk)과 같은 주요 기술적 과제를 야기하며, 이는 세심한 패널 설계와 엄격한 대조 조건으로 해결하지 않으면 해석 가능성을 저해할 수 있습니다7,8.

이 방법의 전반적인 목표는 면역형광법으로 검증된 항체에 광범위하게 적용 가능하며, 부착성 2D 배양의 일상적인 이미징에 최적화된 실용적이고 저렴한 워크플로우를 제공하는 것입니다. 멀티플렉싱은 숙주 종 분리, 스펙트럼상 뚜렷이 구분되는 형광체, 그리고 배경 수준과 염색 성능을 검증하는 대조군을 통해 구현됩니다9,10. 특수 챔버 슬라이드 대신 표준 24-웰 플레이트에 12 mm 유리 커버슬립을 사용함으로써, 이 워크플로우는 고가의 전용 소모품 사용을 피하고 대부분의 세포 배양 실험실에서 표준 재고로 보유하고 있는 재료를 활용합니다. 또한, 이 워크플로우는 단위 성장 면적당 염색 용액(≈1.13 cm2에 150 µL, 즉 ≈133 µL/cm2)을 통상적으로 300–500 µL/cm2가 필요한 유사한 챔버 커버슬립 형식11,12보다 훨씬 적게 사용하여, 면적당 항체 및 시약 소모량을 약 2~4배 감소시킵니다. 이에 따라, 본 프로토콜은 세포골격 및 핵 대조 염색과 함께 표준 광시야 또는 공초점 현미경을 사용하여 마커의 국소화 및 공동 분포에 대한 정성적인 다중 타겟 평가를 지원합니다. 이 워크플로우는 숙주 종 분리와 스펙트럼 구분에 기반한 전통적인 고정 세포 멀티플렉스 IF를 위한 것이며, 반복적 또는 고차원적 멀티플렉스 접근법을 위해 설계된 것은 아닙니다.

프로토콜

본 연구는 인간 참여자나 동물 피험자를 포함하지 않았습니다. 모든 실험은 공공 세포 은행(Banco de Células do Rio de Janeiro, Cat. No. 0276)에서 분양받은 기성 세포주인 D17 canine osteosarcoma 세포주를 사용하여 수행되었습니다. 따라서 윤리적 승인은 필요하지 않았습니다.

1. 세포주 유지 관리

  1. 사용하는 세포주에 적합한 완전 배지를 사용하여 표준 배양 조건(37 °C, 5% CO₂, 습윤 배양기)에서 부착 세포를 유지한다.
    참고: 대표적인 예로, D17 canine osteosarcoma 세포(Banco de Células do Rio Janeiro [BCRJ], Cat. No. 0276)는 10% fetal bovine serum (FBS) 및 1% antibiotic-antimycotic가 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)에서 유지하며, trypsin-EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 사용하여 70–80% confluence에서 계代 배양하고, 검증된 계대 범위(예: passage 5–20) 내에서 사용한다.
  2. 검증된 마이코플라스마 검출 분석법을 사용하여 실험 전 마이코플라스마 음성 상태를 확인한다.

2. 24-웰 플레이트 및 유리 커버슬립 준비

참고: 커버슬립 표면은 70% 에탄올에 담가 세척해야 합니다(5분간, 3회 반복).×아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나로 멸균하기 전에 처리하십시오. 멸균 후 커버슬립은 사용 전까지 밀폐 용기에 담아 실온에서 보관해야 합니다.

  1. 깨끗한 12mm 원형 유리 커버슬립을 유리 페트리 접시(또는 커버슬립 홀더)에 넣고 오토클레이브 멸균합니다. 끝이 뾰족한 금속 핀셋 한 쌍도 함께 오토클레이브 멸균합니다.
  2. 대안: 사용 전 커버슬립과 핀셋을 70% 에탄올로 세척하고 공기 중에 건조시킨 후, 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 자외선(UV) 노출(30분)을 통해 표면을 멸균한다. 멸균된 커버슬립은 사용 전까지 밀폐 용기에 넣어 실온에서 보관한다.
  3. 생물안전작업대 내에서 멸균 핀셋을 사용하여 24-웰 조직 배양 플레이트의 실험군으로 지정된 각 웰에 멸균 커버슬립을 하나씩 옮겨 넣으십시오.
  4. 선택 사항: 사용하는 세포 유형에 따라 필요한 경우, 제조사의 지침이나 확립된 실험실 가이드라인에 따라 커버슬립을 접착 촉진 코팅제로 코팅하십시오.
    참고: 코팅 옵션(poly-L-lysine, collagen I 또는 fibronectin)과 해당 작동 농도는 다음의 표에 기재되어 있습니다. 재료 목록유리 위에서 배양되는 대부분의 부착성 세포주의 경우, 코팅되지 않은 멸균 커버슬립으로도 충분합니다. 코팅 성분이 항원성으로 작용할 수 있으므로, 선택한 코팅제는 패널 내의 어떤 항체와도 교차 반응하지 않아야 합니다.
  5. 커버슬립을 코팅한 경우, 과량의 코팅액을 흡입하여 제거하고 멸균 인산완충생리식염수(PBS)로 한 번 헹군 뒤, 세포 파종 전 생물안전작업대 내에서 커버슬립을 자연 건조시킵니다.

3. 실험군

  1. 멀티플렉스 설계에 적합한 대조군 패널을 포함하십시오.
    참고: 항체 미첨가 대조군(1차 및 2차 항체 모두 제외)은 내재적 자가형광을 나타내며, 1차 항체 미첨가 대조군(1차 항체 없이 2차 항체 칵테일만 사용)은 모든 채널에서의 비특이적 2차 결합 및 배경값을 동시에 평가합니다. 본 프로토콜은 스펙트럼상으로 엄격히 구분되는 2차 항체를 사용하므로, 이 단일 대조군을 통해 각 2차 항체를 해당 채널 내에서 독립적으로 평가할 수 있으며, 이는 각 형광체별 2차 항체 전용 대조군과 동일한 목적을 수행합니다. 각 1차-2차 항체 쌍을 개별적으로 적용하는 단일 염색 대조군은 멀티플렉스 조합 전 각 항체의 성능을 검증하며, 멀티플렉스 조건과 비교함으로써 각 형광체 쌍의 스펙트럼 크로스토크를 평가할 수 있게 합니다. 가능한 경우, 표적 항원을 발현하는 양성 대조군을 사용하여 분석 성능을 확인합니다.

4. 커버슬립 상의 세포 파종(플레이팅)

  1. 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 trypsin(또는 다른 적절한 해리 방법)을 사용하여 세포를 떼어내고, 중화시킨 후 완전 배지에 재현탁합니다.
  2. 자동 세포 계수기 또는 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.
  3. 세포 농도를 6 × 104–1 × 105 cells/mL로 희석합니다.
  4. 웰당 0.5 mL의 세포 현탁액을 첨가합니다(최종 농도: 3 × 104–5 × 104 cells/well).
    참고: 필요한 경우, 멸균된 피펫 팁을 사용하여 긁힘이 생기지 않도록 주의하며 커버슬립이 웰 바닥에 평평하게 놓였는지 부드럽게 확인합니다.
  5. 세포가 부착되어 원하는 밀도(confluence)에 도달하거나 실험 시점이 될 때까지 표준 조건(37 °C, 5% CO₂)에서 배양합니다.

5. 세포 처리 (선택 사항)

  1. 실험 설계에 따라 처리 시점을 선택합니다. 처리는 해당되는 경우 약물 치료, 사이토카인 자극, 표적 유전자 발현 유도 또는 넉다운을 위한 유전적 조작 또는 기타 실험적 개입을 포함할 수 있습니다.
  2. 대조군과 처리군을 식별할 수 있도록 웰에 라벨을 붙입니다.
  3. 필요한 시간 동안 배양합니다. 과성장은 배경 신호를 증가시키고 형태학적 구조를 손상시키므로 과밀집되지 않도록 주의하십시오.
    참고: 설계상 파종 직후 고정이 필요한 경우가 아니라면, 고정 전 세포가 커버슬립에 부착되어 있어야 합니다.
  4. 빠르게 분비되는 표적(예: 사이토카인)의 경우, 고정 전 배양 배지에 최종 농도 1–10 µg/mL(일반적으로 5 µg/mL)의 brefeldin A (BFA)를 첨가하고 37 °C, 5% CO₂에서 4–6 h 동안 배양합니다.
  5. BFA가 포함된 배지를 제거하고 즉시 고정 단계로 진행합니다.

6. 면역형광 염색

참고: 고정 단계부터는 멸균 기술이 필요하지 않습니다. 염색 과정은 벤치 위에서 진행할 수 있으며, 주의(CAUTION) 시약물을 다룰 때는 항상 화학 흄 후드를 사용하십시오. 샘플이 어느 단계에서도 마르지 않도록 해야 합니다. 흡입(aspirating) 시 얇은 버퍼 막을 남기고, 즉시 다음 용액을 첨가하십시오.

  1. 고정 (하나를 선택하십시오):
    참고: 고정제는 표적의 위치 및 에피토프 민감도에 따라 선택합니다(토론 섹션 참조). 파라포름알데히드(PFA)(파라포름알데히드로 조제한 포름알데히드)는 대부분의 표적에 적합하며 팔로이딘(phalloidin)과 호환됩니다. 메탄올은 특정 핵/인산화 에피토프 검출에 도움이 될 수 있으나, F-액틴 염색을 저해합니다.
    1. PFA 고정 (대부분의 타겟에 권장됨):
      1. 배지를 흡입하여 제거하고 Tris 완충 식염수(TBS) (웰당 0.5 mL)로 한 번 부드럽게 헹굽니다.
      2. PBS(인산완충식염수)에 희석한 4% PFA(0.5 mL/well)를 첨가하고 실온에서 10분간 배양한다(≈25 °C).
      3. PFA를 흡입 제거하고 3회 세척하십시오.× TBS로 세척합니다(즉시 흡입하여 웰이 마르지 않도록 하십시오).
        주의: PFA는 독성이 있으며 잠재적인 발암 물질입니다. 적절한 개인 보호 장구(실험복, 장갑 및 보안경)를 착용하고 인증된 화학 흄 후드 내에서 PFA 용액을 취급하십시오. 흡입 및 피부 접촉을 피하고, 기관의 화학 안전 가이드라인에 따라 폐기물을 처리하십시오.
  2. 또는, 메탄올 고정법(일부 핵 항원 및 특정 인산화 에피토프에 유용함):
    1. 100% 메탄올을 −까지 미리 냉각하십시오.20 °C.
    2. 얼음처럼 차가운 메탄올을 세포에 직접 첨가하고(웰당 0.5 mL), −에서 5분 동안 배양한다.20 °C.
    3. 세척 3× TBS로 세척합니다(즉시 흡입하여 웰이 마르지 않도록 하십시오).
      참고: 메탄올 고정 후에는 추가적인 투과화 과정이 필요하지 않을 수 있으며, 이는 항체/에피토프에 따라 최적화해야 합니다. 메탄올 고정은 막 에피토프를 손상시키고 형광 표지 phalloidin/F-actin 염색을 방해할 수 있습니다. 주의: 메탄올은 독성이 있고 휘발성이 강하며 인화성이 매우 높습니다. 환기가 잘 되는 곳이나 화학 흄 후드 내에서 취급하고, 적절한 개인 보호 장구를 착용하며, 개방된 화염 및 열원 근처에 두지 마십시오. 선택적 중단 지점: 고정 후 샘플을 다음 조건에서 보관하십시오. 4 °C 저농도의 고정액이 포함된 PBS(예: PBS + 0.1% PFA)에서 최대 1주일 동안 보관하십시오. 각 항원에 대해 보관 시간을 검증하십시오.
  3. 알데히드 퀀칭 (선택 사항)
    1. TBS에 희석된 50 mM 글리신(well당 0.5 mL)을 넣고 실온에서 5분 동안 배양한다.≈25 °C).
    2. 세척 3× TBS + 0.05% polysorbate 20로.
      참고: 글리신(Glycine)은 PFA 고정 후 남아있는 유리 알데히드기를 중화하여, 고정으로 인한 자가형광을 줄이고 항체 염색의 특이성을 향상시킵니다.
  4. 투과성 증진
    1. 막 단백질을 표적으로 하는 경우에는 투과화 단계를 생략하고 6.5.1단계로 진행하십시오.
    2. 세포 내 또는 핵 단백질을 표적으로 하는 경우, TBS에 희석된 0.1–0.3% 비이온성 계면활성제(웰당 0.5 mL)를 사용하여 실온에서 5–10분 동안 투과화합니다(≈25 °C).
    3. 세척 3× TBS + 0.05% polysorbate 20 (TBST)로.
      참고: Octylphenol ethoxylate 비이온성 세제의 농도와 처리 시간은 표적에 맞게 최적화해야 하며, 적절성 여부는 정확한 구획 신호, 보존된 형태, 뚜렷한 F-actin 및 낮은 배경 신호로 판단합니다(고찰 섹션 참조). Saponin을 사용하는 경우, 이후의 모든 항체 및 세척 버퍼에서도 이를 유지합니다. 주의: Octylphenol ethoxylate 비이온성 세제는 흡입하거나 피부에 접촉할 경우 유해하며 눈에 자극을 일으킬 수 있습니다. 장갑을 착용하여 취급하고 에어로졸 형성을 방지하십시오.
  5. 블로킹
    1. 웰당 0.5 mL의 블로킹 용액(5% 소 혈청 알부민(BSA))을 추가합니다. (TBS 내에서) 30분 동안 실온에서 배양합니다.≈25 °C).
    2. 블로킹 버퍼를 흡입하여 제거합니다.
    3. 세척 과정 없이 즉시 1차 항체 배양 단계로 진행하십시오.
  6. 1차 항체 배양
    참고: 1차 및 2차 항체 희석 배수는 적정법을 통해 경험적으로 설정합니다(토론 섹션 참조).
    1. 0.05% polysorbate 20 및 1% BSA가 포함된 Tris 완충 식염수(TBST-BSA)에서 단일 또는 다중 1차 항체 패널을 준비하십시오. 1%), 각 표적에 대해 사전 최적화된 항체 농도를 사용하여.
    2. 다중 면역형광 염색을 위해, 서로 다른 숙주 종에서 유래하여 서로 다른 항원을 표적으로 하는 모든 비접합 일차 항체(예: 마우스 항-인터페론-)를 혼합합니다.β (IFN-β) + rabbit anti-p14ARF + goat anti-actin)을 하나의 항체 칵테일로 혼합합니다.
    3. 추가하십시오 150 µL 웰당, 커버슬립 전체가 항체 용액으로 완전히 덮이도록 합니다.
      참고: 소량의 시료가 증발하는 것을 방지하기 위해, 플레이트를 가습 챔버(예: 젖은 티슈가 들어 있는 밀폐 상자) 내에서 배양합니다.
    4. 실온에서 1.5시간 동안 배양합니다(≈25 °C) 또는 12~16시간 동안 다음 온도에서 4 °C.
    5. 세척 3× 실온에서 TBST로 각각 3분 동안 (≈25 °C), 각 세척 단계 직후에 즉시 흡입 제거하십시오.
  7. 2차 항체 반응(및 해당되는 경우, 직접 접합된 1차 항체 반응)
    참고: 이 단계부터는 광퇴색을 방지하기 위해 샘플을 차광 상태로 유지합니다. 크로스토크를 최소화하기 위해 2차 항체 및 직접 접합된 1차 항체 전반에 걸쳐 스펙트럼적으로 구별되는 형광체를 사용하며, 비인식 1차 항체에 대한 결합을 최소화하기 위해 종 특이적인 고교차 흡착 2차 항체를 사용합니다. 핵 및 세포골격 마커를 포함한 형광체 패널 설계와 현미경의 들뜸/방출 파장 호환성에 대해서는 고찰(Discussion) 섹션에서 다룹니다.
    1. 사전 최적화된 농도를 사용하여 TBST-BSA 1% 용액에 2차 항체를 희석하십시오. 다중 검출(multiplex detection)의 경우, 사용된 1차 항체의 호스트 종에 해당하는 모든 2차 항체(호스트 종당 하나의 2차 항체)를 하나의 칵테일로 혼합하십시오.
    2. 추가하세요 150 µL 웰당, 커버슬립 전체가 완전히 덮이도록 합니다.
    3. 실온에서 1시간 동안 배양한다(≈25 °C).
      참고: 패널에 하나 이상의 직접 접합된 1차 항체가 포함된 경우, 이를 2차 항체 칵테일과 함께 추가하고 상온에서 배양 시간을 1.5시간으로 연장하십시오(약 25 °C).
    4. 세척 3× 실온에서 각각 3분 동안 TBST로 (≈25 °C), 각 세척 단계 직후 즉시 흡인합니다.

7. 핵 대조 염색 및 f-actin 염색

  1. TBS에 희석한 핵 대조염색제 Hoechst 33342 (1:5000)를 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양한다(≈25 °C), 빛이 차단된 상태로 보관하십시오. F-actin을 anti-actin 항체 대신 phalloidin으로 염색하려면, 동일한 용액에 phalloidin(1:400)을 포함시키십시오.
  2. 세척 3× TBST로 세척하고, 각 세척 단계 직후에 즉시 흡입하십시오(웰이 마르지 않게 하십시오).
  3. 커버슬립을 회수 또는 마운팅할 때까지 침전 상태로 유지하기 위해 각 웰에 TBS 0.5 mL를 추가하십시오.

8. 커버슬립 회수 및 슬라이드 마운팅

  1. 커버슬립이 TBS에 잠겨 있는 상태에서, 미세 바늘이나 메스 팁을 커버슬립 가장자리 아래로 밀어 넣어 한쪽 면이 부분적으로 들릴 때까지 조심스럽게 들어 올립니다. 미세 핀셋을 사용하여 커버슬립을 잡고 웰에서 제거합니다.
    참고: 커버슬립이 잠겨 있지 않은 상태에서 제거하면 표면 장력으로 인해 웰 바닥에 단단히 달라붙어 파손 위험이 증가할 수 있습니다.
  2. 핀셋으로 커버슬립을 잡은 채, 진공 흡입기나 흡수지를 사용하여 가장자리의 과잉 TBS를 조심스럽게 닦아냅니다. 세포가 덮인 표면을 건드리지 않도록 주의하십시오.
    참고: 잔류 액체가 많으면 마운팅 용액이 희석되어 이미지의 선명도와 대조도가 저하될 수 있으므로 주의해야 합니다.
  3. 마운팅 용액 소량(≈3 µL)이 묻어 있는 깨끗한 유리 슬라이드 위에 커버슬립의 세포 면이 아래로 향하도록 놓습니다.
    참고: 상용 자가 경화 항퇴색 용액(self-curing antifade medium) 또는 80% glycerol/Phosphate-buffered saline (PBS) 기반의 자체 제작 용액을 사용할 수 있습니다. glycerol 기반 마운트는 투명 매니큐어로 밀봉하며, 핵 염색이 없는 용액은 대조 염색 후 선택합니다. 보관 제한 및 형광단백질 안정성 가이드는 Discussion 섹션에 제공됩니다.
  4. 이미지 획득 전, 슬라이드를 빛이 차단된 상태에서 수평으로 ≈24 h 동안 경화시킵니다.

결과

본 프로토콜은 유리 커버슬립에서 배양된 부착성 canine 종양 세포의 단일 및 다중 면역형광 염색 방법을 제공하며, 세포 형태를 보존하면서 핵, 세포질 및 세포골격 마커를 동시에 시각화할 수 있게 합니다. 대표적인 결과는 그림 3.에 예시되어 있습니다.

성공적인 실험에서, 유전자 조작(섹션 5.1)을 통해 canine p14ARF 및 canine IFN-β를 발현하도록 설계된 D17 canine osteosarcoma 세포는 배경 신호가 낮고 비특이적 염색이 최소화된 상태에서 공간적으로 적절하고 강한 형광 신호를 나타냈습니다. p14ARF 발현 세포(그림 3A)의 경우, 면역형광 염색 결과 p14ARF의 알려진 세포 내 분포와 일치하게 주로 핵 내에 국한되어 나타났습니다. 0.3% octylphenol ethoxylate 비이온성 세제 투과화 공정을 사용하여 핵 형태와 세포골격의 무결성을 유지하면서 핵 에피토프에 항체가 효율적으로 접근할 수 있도록 하였으며, 이는 명확한 핵 대조 염색과 항-actin 항체(오렌지색 방출 형광체)로 시각화된 actin 구조를 통해 확인되었습니다.

IFN-β 발현 세포(그림 3A)의 경우, 단백질 분비를 차단하기 위해 BFA와 함께 배양하여 가용성 사이토카인이 세포 내에 축적되어 검출될 수 있도록 함으로써 세포질 신호가 관찰되었습니다. 이러한 조건 하에서는 약한 투과화만으로도 세포질 내용물의 과도한 추출 없이 항체 침투가 가능했습니다. 성공적인 염색은 점상에서 확산형으로 나타나는 세포질 형광, 최소한의 핵 교차 반응, 그리고 보존된 액틴 구조로 특징지어집니다.

주요 파라미터가 적절히 최적화되지 않았을 때 최적이지 않은 결과가 관찰되었습니다. 투과화가 불충분할 경우, 투과화되지 않은 조건(비이온성 계면활성제 octylphenol ethoxylate 0%)에서 나타난 바와 같이 핵 내 p14ARF 신호가 약하거나 나타나지 않았습니다. 그림 3B 및 부록 그림 1). 반대로, 과도한 투과화(0.5% 이상의 octylphenol ethoxylate 비이온성 세제 사용 또는 배양 시간 연장)는 세포골격 염색의 부분적 손실, 배경 형광 증가 및 세포 형태의 훼손을 초래할 수 있습니다. 빠르게 분비되는 단백질(예: IFN-β), BFA를 생략하면 세포 내 신호가 약하게 나타나는 경우가 많았는데, 이는 프로토콜의 실패가 아니라 신속한 분비를 반영하는 결과였다.

단일 염색 대조군(Supplementary Figure 2)에서는 각 표적에 해당하는 채널에서만 신호가 나타나, 관찰된 면역형광 염색의 특이성을 입증하였다. 1차 항체 미처리 및 항체 미처리 대조군을 포함한 음성 대조군 조건(Supplementary Figure 2)에서는 예상된 핵 염색이 나타났으며, 항체 의존적 채널에서는 신호가 무시할 수 있는 수준으로 나타나 자가형광이 낮고 2차 항체의 비특이적 결합이 최소화되었음을 보여주었다.

종합적으로, 이러한 대표적인 결과들은 고정, 투과화 강도 및 특정 표적 의존적 전략(예: 분비 차단)을 표적 생물학적 특성에 맞게 조정했을 때, 서로 다른 세포 내 국소화를 가진 단백질의 검출이 가능함을 보여줍니다. 적절한 최적화를 거치면 배경 신호가 낮고 세포 형태가 보존된 강하고 특이적인 형광을 얻을 수 있는 반면, 최적화되지 않은 조건에서는 신호가 약해지거나 노이즈가 심해지며 세포 구조가 변형될 수 있습니다.

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그림 1: 단일 및 다중 면역형광 워크플로우의 개요 순서도.세포 배양 유지부터 이미지 획득까지의 주요 단계이며, 표적에 따른 선택이 필요한 두 가지 결정 지점인 고정 방법(PFA 대 메탄올)과 투과화(표적 세포 내 국소화 기반)가 포함되어 있습니다. 빠르게 분비되는 표적을 위한 brefeldin A (BFA) 전처리를 포함하여 선택적인 실험적 처리는 고정 전 분기점으로 표시되어 있습니다. 명확성을 위해 표시되지 않은 선택적 단계(예: 알데히드 퀜칭)는 전체 프로토콜에 기술되어 있습니다. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

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그림 2: 항체 기반 형광 검출 전략의 모식도. 직접 검출은 형광체-접합 일차 항체를 사용하며, 간접 검출은 비접합 일차 항체와 형광체-접합 이차 항체를 짝지어 사용하는데, 본 프로토콜 전반에서 이 전략을 채택하였다. 다중 분석 응용을 위해 간접 검출에서는 서로 다른 숙주 종에서 생성된 비접합 일차 항체가 필요하며, 이를 통해 각 이차 항체가 교차 반응 없이 해당 일차 항체를 선택적으로 인식할 수 있게 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3

그림 3: D17 canine osteosarcoma 세포의 다중 면역형광 염색.D17 세포(5 × 104)를 24-well 플레이트의 유리 커버슬립에 분주하고 4% 파라포름알데히드(PFA)로 25 °C에서 10분 동안 고정하였다. anti-p14ARF(1:200; 녹색 형광체), anti-actin(1:200; 오렌지색 형광체), anti-interferon-β(IFN-β)(1:200; 원적색 형광체) 일차 항체와 이에 대응하는 1:500 희석의 이차 항체를 사용하여 다중 면역형광 염색을 수행하였다. 핵은 대조 염색하였다. IFN-β 검출 전, 단백질 분비를 차단하기 위해 BFA(5 µg/mL, 4 h)로 세포를 처리하였다. (A) 0.3% 비이온성 세제로 25 °C에서 10분 동안 세포를 투과화하였다. (B) 투과화 과정 없이 처리한 세포(0% 비이온성 세제). 각각 2회의 기술적 반복 실험을 수행한 2개의 독립적인 생물학적 반복 실험의 대표 이미지이다. 본 그림에서는 병합된 채널만 표시하였으며, 개별 채널은 부록 그림 1에 제공되었다. 조건 간 라벨링의 차이가 관찰되며, 특히 핵 내 표적인 p14ARF(A; 화살표)의 경우 비투과화 그룹(B)에서는 신호가 나타나지 않았다. 패널 A와 B는 동일한 설정(부록 표 1)으로 획득 및 처리되었다. 이 패널에 해당하는 음성 및 단일 염색 대조군은 부록 그림 2에 표시되어 있다. 스케일 바: 100 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

부록 그림 1: 그림 3에 해당하는 개별 형광 채널로, 투과화(왼쪽 열) 및 비투과화(오른쪽 열) 상태의 마커별로 정리됨. 나란히 표시된 조건: Hoechst 33342 (A, B), p14ARF (C, D; 녹색 발광 형광체), actin (E, F; 주황색 발광 형광체), IFN-β (G, H; 원적외선 발광 형광체) 및 각각 그림 3A 및 3B와 일치하는 해당 병합 패널 (I, J). 화살표는 대표적인 p14ARF 핵 염색을 나타내며, 타원은 각각 대표적인 actin (E) 및 IFN-β (G) 염색을 나타냄. 비투과화 조건에서는 p14ARF 핵 신호의 소실과 더불어 IFN-β 및 actin의 불충분한 라벨링이 분명하게 나타남. (D; 별표)에서 관찰되는 잔류 신호는 공존하는 형광체로부터의 스펙트럼 크로스토크(spectral crosstalk)를 반영하며, 이는 해당 단일 염색 및 2차 항체 전용 대조군(부록 그림 2)에서 신호가 없음을 통해 확인됨. 스케일 바: 100 µm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 그림 3의 멀티플렉스 패널에 해당하는 결합 면역형광 대조군. 각 대조군 그룹에 대해 개별 채널(Hoechst 33342, 녹색 발광 형광체, 오렌지색 발광 형광체 및 원적색 발광 형광체)이 병합 이미지(다섯 번째 열)와 함께 표시되었습니다. (A–E) 항체 미첨가 대조군: 1차 또는 2차 항체 없이 처리된 세포. (F–J) 2차 항체 전용 대조군: 1차 항체 없이 2차 항체 칵테일로 배양된 세포. (K–O) p14ARF 단일 염색 대조군(녹색 발광 형광체). (P–T) Actin 단일 염색 대조군(오렌지색 발광 형광체). (U–Y) IFN-β 단일 염색 대조군(원적색 발광 형광체). 획득 및 처리 설정은 그림 3(보충 표 1)에 사용된 것과 동일합니다. 스케일 바: 100 µm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 형광 필터 큐브 사양 및 획득 순서. 그림 3, 보충 그림 1 및 보충 그림 2에서 촬영된 모든 시야에 대해, 아래에 나열된 필터 큐브를 사용하여 도식화된 순서대로 도립 광시야 형광 현미경(40×/0.80 대물렌즈)으로 이미지를 순차적으로 획득하였습니다. 이미지는 단일 광학 평면(z-stacking 없음)으로 획득하였습니다. 조사 강도는 표시된 수준에서 형광 강도 제어 장치를 사용하여 설정하였으며, 입사광 조리개는 모든 채널에서 위치 6으로 유지하였습니다. 카메라 설정(8비트 디지털화, 3072×2048 포맷, 감마 1.0) 및 고정된 디지털 샤프닝 설정은 보충 그림 2의 대조군 이미지를 포함한 모든 채널과 패널에서 동일하게 적용되었습니다. 디스플레이를 위해 모든 채널과 패널에 단일 선형 밝기/대비 조정이 동일하게 적용되었습니다. 이미지는 TIFF 형식으로 내보냈습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: 면역형광 워크플로우에서 발생하는 일반적인 기술적 문제에 대한 트러블슈팅 가이드. 프로토콜 전반에 걸쳐 발생하는 일반적인 문제, 예상 원인 및 해결 방법.여기를 클릭하여 파일을 다운로드하십시오.

토론

이 커버스립 기반 면역형광 워크플로우의 일관된 성능을 위해서는 몇 가지 단계가 매우 중요합니다. 모든 과정은 24-well 배양 웰이라는 제한된 환경 내에서 수행되며, 이는 핸들링을 단순화하고 시료 조작을 제한하며, 적은 양의 시약으로도 커버스립 전체를 덮을 수 있게 하여 실험당 항체 소모량을 줄여줍니다. 이러한 소량의 용액은 증발하기 쉬우므로, 배양은 습윤 챔버에서 수행하는 것이 가장 좋으며 시료가 절대 마르지 않도록 해야 합니다. 짧은 시간만 건조되어도 배경 형광이 증가하고 세포 형태가 손상됩니다. 흡입 시에는 커버스립 위에 버퍼의 얇은 막을 남겨두고, 즉시 다음 용액을 첨가합니다.

적절한 세포 파종 밀도와 고정 시의 제어된 합류도(confluency)는 배경 신호를 제한하고 형태학적 특성을 보존하는 데 필수적이며, 과성장은 배경 신호를 증가시키고 세포 구조를 훼손합니다. 배양 시간과 온도 또한 고정 효율, 항체 결합 및 배경 신호에 영향을 미치므로 전 과정에서 정밀한 제어가 필요합니다5,13. 주변 환경 조건이 변동할 때는 25 °C로 설정된 온도 조절 배양기 또는 건조 오븐을 사용하고, 반복 실험 간 배양 시간을 일정하게 유지함으로써 재현성을 높일 수 있습니다.

고정은 항원 보존과 세포 구조를 결정하는 첫 번째 결정적인 단계이므로5, 표적의 위치와 에피토프 민감도에 따라 고정액을 선택합니다. PFA는 구조를 보존하고 항원 분포를 유지하며 phalloidin 기반의 F-actin 염색과 호환되므로, 대부분의 막 결합, 세포질, 핵 및 세포골격 표적에 권장됩니다. 가교 고정 후 검출 효율이 낮은 특정 핵 항원, 특히 인산화 에피토프나 알데히드 민감성 에피토프의 경우에는 메탄올이 선호될 수 있으나, 메탄올은 막의 무결성을 파괴하고 수용성 단백질을 추출하며 phalloidin/F-actin 염색을 저해하므로 각 표적에 대한 호환성을 검증해야 합니다 13,14,15,16. 수용성 사이토카인 및 기타 빠르게 분비되는 단백질의 경우, PFA 고정과 BFA 전처리를 병행하여 고정 전 세포 내 신호를 유지합니다. BFA는 소포체에서 골지체로의 단백질 수송을 차단하여 분비 단백질의 세포 내 축적을 촉진함으로써 면역형광법을 통한 검출을 가능하게 합니다. 서로 상충하는 고정 조건이 필요한 표적들을 동시에 검출해야 할 때는 경험적인 최적화가 필요합니다. 작은 다이알데히드인 Glyoxal은 PFA의 대안으로 보고되었으며, 더 빠른 가교, 향상된 항원 보존, 그리고 면역형광법 및 초고해상도 현미경과의 호환성을 제공합니다. 본 연구팀은 glyoxal 고정을 직접 수행한 경험은 없으나, 문헌을 통해 뒷받침되는 선택지로 제시합니다17,18.

고정 후, 적절한 투과화(permeabilization)를 통해 구조적 무결성을 유지하면서 항체가 세포 내 및 핵 에피토프에 접근할 수 있도록 합니다5. 투과화가 불충분할 경우 형태는 유지되더라도 일반적으로 신호가 약하거나 나타나지 않아 항체의 접근이 제한되었음을 나타내며, 반대로 과도한 투과화는 수용성 단백질을 추출하고 막을 파괴하며 세포골격 염색의 손실을 유발하고 배경 신호를 증가시킵니다. 따라서 계면활성제의 종류, 농도 및 배양 시간은 표적에 맞게 최적화해야 합니다. 적절한 투과화 여부는 다음 네 가지 기준으로 판단할 수 있습니다: (i) 예상되는 세포 내 구획에서 특이적 신호가 나타나는지, (ii) 각각 Hoechst 33342와 phalloidin으로 확인했을 때 핵과 세포질의 경계가 온전하게 유지되어 형태가 보존되었는지, (iii) F-actin 염색이 뚜렷하게 나타나는지(확산되거나 소실된 세포골격 신호는 과도한 투과화를 의미함), (iv) 음성 대조군에서 배경 신호가 낮은지입니다. 이 기준들이 충족되지 않을 경우, octylphenol ethoxylate 비이온성 계면활성제 농도 및/또는 배양 시간을 경험적으로 조정합니다. 막 결합 항원과 세포 내 항원을 하나의 패널에서 함께 분석할 때는 완만한 조건(낮은 계면활성제 농도, 짧은 배양 시간)을 적용하여 세포 내 접근을 허용하면서 막 에피토프를 보존하며, 5분부터 시작하여 점진적으로 시간을 늘리는 시계열 분석이 유용합니다. 대신 saponin을 사용하는 경우, 투과화 효과가 가역적이므로 이후의 모든 항체 및 세척 버퍼에 이를 계속 유지해야 합니다.

항체 농도는 일반적인 권장 사항을 따르기보다 적정법을 통해 경험적으로 설정합니다. 실용적인 접근법은 제조사가 권장한 희석 배수(예: 1:200 권장 시 1:50, 1:100, 1:200, 1:400)를 기준으로 상하 3~4단계의 농도를 포함하는 연속 희석 계열을 만들어, 동일한 조건의 반복 실험용 커버슬립에 적용하는 것입니다. 각 희석 농도는 예상되는 구획 내의 특이적 신호 강도, 염색된 시료와 해당 1차 항체 미첨가 대조군 및 2차 항체 배경 신호와 항체 미첨가 대조군을 비교한 신호 대 배경 비율, 그리고 형태학적 보존 상태를 기준으로 평가합니다. 배경 신호가 최소화되면서 강하고 특이적인 신호를 나타내는 가장 낮은 농도를 선택합니다. 지속적으로 높게 나타나는 배경 신호는 일반적으로 추가 적정, 블로킹 시간 연장 또는 세척 강도 증가를 통해 완화할 수 있습니다. 반면, 약한 신호는 과도한 고정, 부적절한 항체 농도, 1차 항체의 표적 에피토프 인식 실패, 2차 항체와 1차 항체 숙주 종 간의 불일치(예: 마우스 숙주 1차 항체에 anti-rabbit 2차 항체를 적용한 경우), 또는 유효 기간 만료나 부적절한 보관(특히 반복적인 빛 노출)으로 인한 2차 항체 분해로 인한 형광체 신호 손실을 반영할 수 있습니다. 모든 희석 농도에서 신호가 나타나지 않는 경우, 1차 항체 배양 시간을 연장하거나 다음의 조건으로 하룻밤 동안 배양하는 것을 고려할 가치가 있습니다. 4 °C, 세포주에서의 항원 발현 확인, 고정 및 투과화 조건에 대한 항체 적합성 검증, 1차 및 2차 항체의 로트, 보관 상태 및 유효기간 확인, 형광체에 적합한 여기 및 방출 필터가 현미경에 장착되어 있는지 확인, 그리고 문제가 지속될 경우 대체 클론을 테스트하십시오. 작업 용액을 준비할 때, 필요한 칵테일 부피는 웰 수에 다음을 곱한 값입니다. 150 µL 피펫팅 손실을 보전하기 위해 약 10%의 여유분을 추가합니다. 각 항체의 스톡 부피는 이 전체 합계를 해당 희석 배수로 나눈 값과 같습니다 (예: 825 µL ÷ 200 = 4.13 µL (1:200 희석의 경우), 나머지는 1% TBST-BSA로 채웁니다. 동일한 계산 방식이 2차 항체 칵테일에도 적용되며, 이때는 해당 희석 배수로 대체하여 계산합니다.

멀티플렉싱 성능은 궁극적으로 형광체 패널 설계에 달려 있습니다. 1차 타겟, 핵 대조 염색 및 세포골격 마커에 할당된 형광체는 스펙트럼 중첩이나 신호 중복을 피하기 위해 서로 조정되어야 하며, 이미징 시스템은 선택된 모든 형광체의 들뜸 및 검출을 지원해야 합니다9,10. 각 필터 큐브의 들뜸 및 방출 범위는 Supplementary Table 1에 제공되어 패널 전체의 스펙트럼 호환성을 직접 비교할 수 있습니다. 본 패널을 다른 형광체로 변경하여 적용하려는 사용자는 가능한 한 인접 채널 중첩이 최소화된 조합을 선택하고, 여기에서 수행한 것과 같이 타겟을 결합하기 전에 단일 염색 대조군에서 크로스톡(crosstalk)이 없는지 확인할 것을 권장합니다. 멀티플렉스 패널의 모든 획득 채널에서 공존하는 형광체로 인한 잔류 신호가 관찰되었으나(Supplementary Figure 1), 해당 단일 염색 및 2차 항체 전용 대조군에서는 관찰되지 않았으며(Supplementary Figure 2), 이는 광시야 획득에 사용된 광대역 필터 세트로 인한 스펙트럼 크로스톡임을 나타냅니다(이는 공초점 레이저 기반 들뜸 방식을 통해 잠재적으로 줄일 수 있습니다). p14ARF의 인(nucleolus) 국소화와 액틴 및 IFN-β의 섬유상/세포질 분포 사이의 공간적 분리를 고려할 때, 이러한 크로스톡은 멀티플렉스 패널에서 p14ARF 국소화 해석에 영향을 주지 않습니다. 이 워크플로우는 전통적인 형광체 기반 멀티플렉싱에 의존하며, 여기에서 동시에 분해 가능한 타겟의 수는 사용 가능한 항체 숙주 종과 스펙트럼적으로 구별되는 형광체의 수에 의해 제한됩니다. 고차 멀티플렉싱은 반복적인 염색/표백을 가능하게 하는 주기적 면역형광법(cyclic immunofluorescence)이나 중첩된 형광체의 선형 언믹싱(linear unmixing)을 가능하게 하는 스펙트럼 이미징을 통해 달성할 수 있으나, 이는 본 문서에서 다루지 않는 전문 장비와 소프트웨어가 필요합니다19,20.

마운팅 용액은 이미지 품질과 신호 지속성에 모두 영향을 미칩니다. 상용 자가 경화 항퇴색 용액(antifade medium)을 사용하거나, 자체 제작 대안으로 PBS에 80% glycerol을 섞어 사용할 수 있습니다(항퇴색제 및 자가 경화 성분 없음). 자체 제작한 glycerol 기반 마운팅 용액은 건조 및 커버슬립의 이동을 방지하기 위해 투명 매니큐어로 밀봉하며, 핵 대조 염색이 완료된 후에는 핵 염색제가 포함되지 않은 용액을 선택합니다. 이미지는 경화 직후에 획득하는 것이 가장 좋습니다. 즉각적인 이미징이 불가능할 경우, 경화된 슬라이드는 암실 상자 내 4 °C에서 2~4주 또는 −20 °C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 다만, 광불안정성이 높은 형광체(예: 녹색 발광 형광체)는 최적의 보관 조건에서도 시간이 지남에 따라 신호가 감소한다는 점에 유의하십시오. 상용 항퇴색 용액은 자체 제작 glycerol 기반 용액에 비해 형광체의 안정성을 상당히 연장시켜 줍니다. 자체 제작 용액을 사용하는 경우에는 24~48시간 이내에 이미지를 획득할 것을 강력히 권장합니다. 투명 매니큐어는 대부분의 형광체와 호환되며, 보관 전 최소 30분 동안 암소 경화를 거친다면 신호 보존에 큰 영향을 미치지 않습니다.

고정 단계부터는 더 이상 멸균 기술이 필요하지 않으며, 염색은 벤치 위에서 진행할 수 있고, CAUTION 표시가 된 시약에 대해서만 인증된 화학 흄 후드를 사용합니다. D17 및 기타 종양 유래 세포주는 해당되는 경우 위험 그룹 1 또는 2 물질에 대한 기관 생물 안전 지침에 따라 취급합니다. 배양된 세포, 커버슬립, 팁, 배지 및 액체 폐기물과 접촉하는 모든 재료는 폐기 전 오염 제거를 거칩니다. 액체 폐기물은 최종 농도 10%의 표백제로 최소 30분 동안 불활성화하며, 고체 폐기물은 적절한 생물학적 폐기물 용기에 버립니다. PFA, 메탄올 또는 옥틸페놀 에톡실레이트 비이온성 세제가 포함된 화학 폐기물은 분리하여 기관의 화학 안전 규정에 따라 폐기합니다.

이 워크플로우는 폭넓게 유용하도록 설계되었으나, 엄격하고 보편적인 절차라기보다 표적에 따른 최적화가 가능한 방식으로 간주하는 것이 가장 적절합니다. 성공적인 적용 여부는 각 항원의 국소화, 용해도, 에피토프 접근성, 그리고 고정 및 투과화에 대한 민감도에 대한 연구자의 이해도에 달려 있습니다. 두 가지 제한 사항을 강조해야 합니다. 첫째, 본 연구의 염색 평가는 공식적인 신호 대 배경 정량화가 아니라, 음성 대조군 및 예상되는 세포 내 국소화와의 비교를 바탕으로 한 정성적 평가입니다. 따라서 여기서 보고된 일관성은 정량적으로 검증된 성능이 아니라, 반복 실험한 커버슬립과 대조군 조건 전반에서 재현 가능한 정성적 염색 결과를 반영합니다. 일반적인 문제, 예상 원인 및 교정 조치를 요약한 통합 문제 해결 가이드가 다음에서 제공됩니다. 보충 표 2정량적 판독이 필요한 실험실에서는 평균 강도 측정, 배경 감산, 관심 영역(ROI) 기반 정량화 및 강도 프로파일링을 위해 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.21둘째, 대표 데이터는 단일 부착성 canine 종양 세포주(D17)에서 유래하였으므로, 다른 세포 유형, 종 또는 항원 조합으로 확장하려면 고정, 투과화 및 항체 조건에 대해 표적 특이적인 재최적화가 필요합니다.

요약하자면, 본 프로토콜은 표준 실험실 장비를 사용하여 낮은 시약 소모량과 일관된 염색 성능을 결합함으로써, 부착성 2D 배양에서 단일 및 다중 면역형광 염색을 수행할 수 있는 유연하고 비용 효율적인 워크플로우를 제공하며, 표적에 따른 정보 기반의 최적화된 적용이 가능하도록 합니다.

공개 사항

저자들은 상충하는 재정적 이해관계가 없음을 밝힙니다.

감사의 글

본 연구는 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) 보조금 2023/01697-7 (JL) 및 2022/15913-0 (BES)의 지원을 받았습니다. 또한 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)로부터 보조금 401811/2024-7 (BES) 및 펠로우십 310497/2021-3 (BES)를 포함한 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
24-웰 조직 배양 플레이트Corning3524커버슬립 시딩 및 염색용
항생제-항진균제Gibco15240062세포 배양 시 박테리아 및 진균 오염 방지용으로 사용함.
항체 희석액 (TBST-BSA 1%)자체 제조—10 mL 기준: 5% BSA 블로킹 용액 2 mL + Tween-20 5 µL + 1x TBS (작업 용액) 7.995 mL를 섞어 최종 부피 10 mL로 맞춤 (최종 농도: 1% BSA, 0.05% Tween-20 in TBS; pH 7.6). 새로 제조하여 사용하며, 보관 시 오염되지 않도록 4 °C에서 보관하고 1주일 이내에 사용함.
블로킹 용액자체 제조—10 mL 기준: 0.5 g BSA를 10 mL 1x TBS (10x TBS 스톡 1 mL + 증류수 9 mL)에 용해함; pH 7.6. 25 °C에서 30분간 배양함; 새로 제조함.
(TBS 내 5% BSA)
Brefeldin ASigma-AldrichB76515 µg/mL; 사이토카인 검출 전 단백질 분비를 차단하기 위해 4시간 동안 전처리함.
BSA (소 혈청 알부민)Sigma-AldrichA7906블로킹용으로 TBS 내 5% 농도로 사용; 항체 희석액으로 TBS 내 1% + 0.05% Tween-20 농도로 사용함.
콜라겐 기반 시약 (커버슬립 코팅, 선택 사항)Corning 354231소 진피 유래 type I 콜라겐; 0.01 N HCl에 50 µg/mL로 희석하여 5–10 µg/cm² (≈100 µL/well) 농도로 도포함; 실온 (≈25°C)에서 1시간 동안 배양함; 세포 시딩 전 흡입 제거 후 PBS로 헹굼.
커버슬립, 유리, 12 mm 원형Knittel Glass100013부착성 세포 배양 및 염색용 기질.
D17 canine osteosarcoma 세포주Banco de células do Rio de Janeiro276대표 세포 모델; 10% FBS와 항생제-항진균제가 첨가된 DMEM에서 유지함; 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양함.
(BCRJ)
탈이온수/증류수자체 제조—완충액 제조용.
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco12100-046세포 배양용 완전 배지.
에탄올Supelco1.00983커버슬립/포셉 오염 제거용.
소 태아 혈청Sigma-AldrichF7524세포 배양 배지 첨가제.
(FBS)
FibronectinGibco33016015세포외 기질 당단백질; 세포 배양 배지에 0.0125 mg/mL로 희석함; 세포 시딩 전 100 µL/well 농도로 도포하고 실온 (≈25°C)에서 1시간 동안 배양함.
미세 팁 금속 포셉다양함—커버슬립 취급용.
형광 현미경Leica MicrosystemsDMi8DMi8 광시야 형광 현미경 (Leica Microsystems), HC PL FLUOTAR 40×/0.80 DRY 대물렌즈; 패널 내 형광체 (AF488, AF555, AF647, Hoechst)와 호환됨.
유리 현미경 슬라이드Bioslide—이미징을 위해 염색된 커버슬립을 마운팅하는 용도.
유리 페트리 접시 또는 커버슬립 홀더다양함—커버슬립 오토클레이브/보관용.
GlycineSigma-Aldrich8.16E+0950 mM 용액 10 mL 기준: 37.5 mg glycine을 10 mL 1x TBS에 용해함; pH 7.6. 25 °C에서 5분간 처리; 고정 후 투과화 전 선택적인 알데하이드 퀀칭 단계임; 새로 제조함.
Hoechst 33342InvitrogenH3570작업 용액 10 mL 기준: 스톡을 TBS로 1:5000으로 희석함. 핵 대조 염색용; 빛을 차단하여 배양함; 새로 제조함.
습윤 챔버다양함/자체 제조—항체 배양용; 또는 밀폐된 플라스틱 상자에 젖은 흡수성 종이를 넣어 제작함.
ImageJOpen source (NIH)—획득 후 이미지 분석에 사용함.
이미징 획득 소프트웨어Leica Microsystems LAS X 3.7.3Leica DMi8에서 이미지 획득을 위해 사용함.
메탄올Merck1.06009대체 고정액 (핵 항원/인산화 에피토프용); −20 °C로 예냉하여 5분간 배양함; phalloidin/F-actin 염색을 저해할 수 있음.
마운팅 배지Sigma-AldrichG228910 mL 기준: 8 mL 글리세롤 + 2 mL PBS, pH 7.6을 충분히 혼합함. 항퇴색 특성이 없으며 자가 경화되지 않음. 건조 및 밀림을 방지하기 위해 커버슬립 가장자리를 매니큐어로 밀봉하고, 슬라이드를 빛이 차단된 4 °C에서 보관하며, 광퇴색을 최소화하기 위해 즉시 이미징함.
(글리세롤 기반)
마운팅 배지 (ProLongTM Glass)InvitrogenP36984항퇴색 시약을 포함하며 실온에서 빛이 차단된 상태로 약 24시간 이내에 자가 경화(경화)되어 영구 마운트를 형성함 (매니큐어 밀봉 불필요). 이미징 전까지 빛이 차단된 2–8 °C에서 슬라이드를 보관함.
NaClSigma-AldrichS9888TBS 완충액의 이온 성분; 세척 및 항체 배양 단계 동안 세포 및 조직의 형태를 보존하기 위해 생리적 삼투압을 유지함.
바늘 (세경, 예: 25–27G)다양함—세포 단층을 손상시키지 않고 웰 바닥에서 커버슬립을 조심스럽게 들어 올리거나 분리하는 지렛대로 사용함.
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich15812710 mL 기준: 0.4 g paraformaldehyde 분말을 8 mL PBS에 용해하고, 1N NaOH를 몇 방울 떨어뜨려 투명해질 때까지 60–65 °C로 가열함; 냉각 후 pH를 7.4로 조정하고 PBS로 최종 부피 10 mL를 맞춤; 사용 전 0.2 µm 필터로 여과함. 새로 제조하거나 분주하여 −20 °C에서 보관하며, 반복적인 동결-해동 사이클을 피함.
Phalloidin, 형광체 접합.Invitrogen선택한 형광색에 따라 다름작업 용액 10 mL 기준: 제조사 지침에 따라 스톡을 TBS, pH 7.6로 1:400으로 희석함. 대체 세포골격/F-actin 표지제; 빛을 차단하여 새로 제조함.
인산염 완충 식염수Sigma-AldrichP4474-1L등장성 인산염 완충액 (pH 7.4); 고정 및 세척 단계 동안 세포 형태를 보존하기 위해 생리적 삼투압을 유지함.
(PBS)
Poly-L-lysine (커버슬립 코팅, 선택 사항)Sigma-AldrichP8920정전기적 세포 부착을 강화하는 합성 폴리카티온 코팅 시약; 증류수 내 0.1 mg/mL 농도로 사용하며 커버슬립 표면을 충분히 덮을 부피를 사용함; 세포 시딩 전 25 °C에서 30분간 배양함.
1차 항체, anti-actin (goat host)Santa Cruz BiotechnologySC-1615Anti-actin 항체; 다클론성, 비접합형, anti-goat 2차 항체로 검출함. 1:200 작업 희석 배율로 사용함.
1차 항체, anti-IFN-β (mouse host)Aviva Systems BiologyOAPB00536Anti-IFN-β 항체; 다클론성, 비접합형, anti-mouse 2차 항체로 검출함. 1:200 작업 희석 배율로 사용함.
1차 항체, anti-p14ARF (rabbit host)CalbiochemPC409Anti-p14ARF 항체; 다클론성, 비접합형, anti-rabbit 2차 항체로 검출함. 이 제품은 단종되었으므로, 해당 타겟에 대한 연구 계획 시 새로운 항체의 검증이 필요함. 1:200 작업 희석 배율로 사용함.
2차 항체, anti-rabbit, Alexa Fluor 488-접합Thermo Fischer ScientificA32731TRAnti-rabbit AF488-접합 항체. 1:500 작업 희석 배율로 사용함.
2차 항체, anti-goat, Alexa Fluor 555-접합Thermo Fischer Scientific A-21432Anti-goat AF555-접합 항체. 1:500 작업 희석 배율로 사용함.
2차 항체, anti-mouse, Alexa Fluor 647-접합Thermo Fischer ScientificA-21235Anti-mouse AF647-접합 항체. 1:500 작업 희석 배율로 사용함.
Tris-완충 식염수 (TBS), 10x 스톡자체 제조—100 mL 기준: 6.06 g Tris base와 8.77 g NaCl을 80 mL 증류수에 용해함; 농축 HCl로 pH를 7.6으로 조정함; 최종 부피 100 mL로 맞춤; 오토클레이브함. 작업 용액 (TBS 1x)을 위해 증류수로 1:10으로 희석함 (최종: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6); 실온 또는 4 °C에서 최대 3개월 동안 보관함.
TBST (TBS + 0.05% Tween-20)자체 제조—10 mL 기준: 1 mL TBS 10x 스톡 + 8.995 mL 증류수 + 5 µL Tween-20 (0.05% v/v); pH 7.6. 염색 단계 사이의 세척 완충액; 새로 제조하여 4 °C에서 약 1주일 이내에 사용함.
Tris BaseSigma-Aldrich252859TBS 스톡 용액 제조에 사용되는 완충제; 면역형광 세척 및 희석 완충액을 위해 생리적 범위(pH 7.6) 내에서 pH 안정성을 유지함.
Triton X-100 (옥틸페놀 에톡실레이트 비이온성 세제)Sigma-AldrichX10010 mL 기준: TX100 0.1%를 위해 9.99 mL 1x TBS에 10 µL Triton X-100를 추가함; TX100 0.3%를 위해 9.97 mL 1x TBS에 30 µL를 추가함 (타겟에 따라 다름; 핵 타겟은 더 높은 농도가 필요함).
Trypsin-EDTAGibco25200056세포 분리를 위해 사용함.
Tween-20Sigma-AldrichP9416세척 완충액 (TBST) 및 항체 희석액 (TBST-BSA 1%)을 위한 TBS에 사용함.

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