방법 논문

마우스 유선에서 유전자 결색 및 활성화의 병행 생체 내 스크리닝

DOI:

10.3791/71115

⸱

2026년 7월 24일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 마우스 유선에서 유전자 노크아웃 및 활성화 연구를 병행할 수 있는 확장 가능한 관내 CRISPR 스크리닝 접근법을 설명합니다.

초록

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전방향 유전학 스크리닝은 수천 개의 유전 요소를 통합적으로 교란하여 대규모 유전자형-표현형 지도를 생성하는 데 일상적으로 사용됩니다. 비록 세포 배양 시스템에서 자주 수행되지만, 누적된 증거는 생 체 내 스크리닝이 시험 관 내에서 재현할 수 없는 새로운 생물학을 드러낼 수 있는 힘을 가진다는 것을 뒷받침합니다. 그러나 이 접근법의 광범위한 적용은 두 가지 주요 도전 과제로 제한되어 왔습니다: 유전자 활성화보다는 기능 상실성 교란에 대한 주된 집중과, 생체 내에서 특정 조직에 복잡한 유전자 라이브러리를 전달하는 데 있어 상당한 기술적 장애물이 있었습니다. 이러한 도전을 극복하기 위해, 수만 개의 개별 상피 클론을 생성하여 마우스 유선에서 효율적이고 신속한 기능적 유전체 스크리닝을 가능하게 하는 간단하고 다재다능한 관내 주입 전략을 설명합니다. 더 나아가, 우리는 라이브러리 생성, 관내 주입, 스크린 디컨볼루션, 그리고 포괄적인 생체 내 스크리닝을 위한 CRISPR-녹아웃 및 활성화 라이브러리 분석에 필요한 모든 세부 정보를 제공합니다. 이 도구들을 CRISPR-KOALA(녹아웃 및 활성화 연관 분석)라고 명명하여, 우리는 46개의 유전체에서 5분의 1에 이르는 유전체 라이브러리에서 코딩 및 비암호화 게놈 내에서 새로운 종양 억제자와 종양유전자를 확인했습니다. 중요한 점은, 이러한 접근법과 분석이 항상성이나 질병 동안 어떤 유전자의 생물학적 기능을 연구하는 데 다른 장기에도 적용될 수 있다는 것입니다.

서론

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기능 유전체학 스크리닝은 스케일1에서 유전자 기능을 검증할 수 있는 강력한 틀을 제공합니다. CRISPR-Cas 유전자 편집 기술의 개발은 수백에서 수천 개의 유전자를 병렬로 체계적으로 교란할 수 있게 했으며, 포유류 세포주에서 CRISPR 기반 스크리닝을 통합하는 것은 현대 암 생물학 연구의 초석이 되었습니다. 이러한 시험관 내 접근법은 다양한 암 맥락에서 필수 유전자3, 종양 억제자4, 합성 치명적 상호작용5를 확인했습니다. 그러나 한 가지 핵심적인 한계는 면역계와 기질과의 상호작용, 영양 구배, 미세환경 내 조직 구조 등 종양의 복잡한 생물학적 특징을 생체 내에서 포착할 수 없다는 점입니다. 이러한 한계와 일치하게, 최근 연구들은 많은 진정한 암 유발 유전자가 특히 세포 배양에서 결여된 미세환경 신호에 의존하는 경우 시험관 내에서 측정 가능한 효과를 발휘하지 못한다는 것을 보여주었다 6,7,8,9,10.

마우스 유선은 생체 내 기능적 유전체 스크리닝에 독특하고 유리한 조직 환경을 제공합니다. 유선 상피 세포는 매우 재생성이 뛰어나며, 발정기 주기 동안 클론 확장이 반복되고, 쉽게 접근하고 유전적으로 조작할 수 있는 가지화된 관망으로 조직되어 있습니다 11,12,13. 이러한 특징들은 수십 년간의 모자이크 유전학 분석과 계통 추적 실험을 뒷받침했으며, 유선을 조직 항상성과 질병 중 세포 내재적 및 미세환경 의존적 유전자 기능을 조사하는 다루기 쉬운 시스템임을 확립했습니다. 14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. 중요한 점은 유전적 교란이 상피 구획 내에서 제한될 수 있어, 온전한 조직 환경에서 형질전환, 세포 경쟁, 계통 충실도, 종양 진행의 상피 특이적 동인을 직접 연구할 수 있다는 점입니다.

성인 유선에 직접 유전적 교란을 전달하기 위한 여러 전략이 개발되었지만, 고처리량 응용에는 여전히 상당한 기술적 장애물이 남아 있습니다. 아데노바이러스 매개 Cre 재조합효소 전달은 성체 유선(34,35,36,37)에서 조건부 대립유전자의 체세포 재조합을 유도하는 데 널리 사용되어 왔으며, 이는 전통적인 유전자 조작 마우스 모델(GEMM)에서 필요한 복잡한 생식선 육종 없이도 유전자 기능을 효율적으로 조작할 수 있는 수단을 제공합니다. 고역가 아데노바이러스는 CRISPR-Cas9 성분을 조직 내 세포에 전달할 수 있지만, 이 벡터들은 숙주 게놈 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49에 통합되지 않습니다. 이로 인해 스크리닝 범위가 ~10–55개로 크게 제한되며, 각 gRNA 표적 부위는 분자 역 전 프로브 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47을 사용해 개별적으로 시퀀싱해야 합니다. 또한, 현재의 관내 전달 방법은 유선관계에 직접 접근할 수 있지만, 유선을 침습적으로 수술로 노출시키거나 다루기 힘든 해밀턴 주사기51을 사용해야 합니다. 바이러스의 국소적 전달에는 효과적이지만, 이러한 접근법은 비교적 침습적이고 기술적으로 도전적이며, 풀링된 렌티바이러스 라이브러리의 확장 가능한 전달에 최적화되어 있지 않습니다. 이 연구들은 종합적으로 현장 바이러스 교란이 가능함을 보여주지만, 현재 도구들은 고처리량 in vivo CRISPR 스크리닝에 필요한 안정적이고 통합된, 서열 검색 가능한 교란을 지원하지 못합니다.

이러한 한계를 해결하기 위해 저희와 다른 이들은 안정적이고 유전 가능한 유전적 변형을 가능하게 하는 렌티바이러스 벡터 통합에 주목했습니다. 세포 배양 시스템과 달리, 생체 내 조직은 단일 기관 내에서 생성될 수 있는 교란된 세포 수에 엄격한 제약을 가하여 전체 유전체 스크리닝을 실용적으로 불가능하게 만듭니다. 따라서 생체 내 CRISPR 스크리닝은 적용 범위와 실현 가능성을 균형 있게 고려하는 생물학적 정보에 기반한 표적 라이브러리 설계가 필요합니다. 더욱이, 여기서 검토한 대부분의 생체 내 CRISPR 스크리닝은 유전자 활성화가 상호 보완적이고 중복되지 않는 생물학적 통찰을 드러낼 수 있다는 증거가 증가함에 따라 거의 전적으로 렌티바이러스 기능 상실에 초점을 맞추고 있습니다 52,53,54,55. 저희와 다른 연구자들은 이전에 렌티바이러스 CRISPR 교란을 성인 유선상피에 통합함으로써 안정적이고 유전 가능한 유전적 변형이 현장에서 이루어지며, 유전체 DNA 36,55,56,57,58에서 회수 및 정량화할 수 있음을 입증했습니다. 이 접근법을 사용하여 우리는 통합 생체 내 CRISPR 스크리닝을 수행하여 종양 전환의 새로운 동인을 확인하고, 렌티바이러스 전달과 CRISPR 스크리닝의 실현 가능성과 생물학적 관련성을 입증하였습니다. 그러나 이 연구들은 동일 분비선 내에서 기능 상실과 획득 선별 모델을 모두 포함하도록 널리 채택되고 확장될 수 있는 간단하고 표준화되며 확장 가능한 프로토콜의 필요성도 강조했습니다.

여기서는 성체 마우스 유선55 내에서 CRISPR 녹아웃 및 활성화 라이브러리를 생체 내 선별할 수 있는 간단하고 다재다능한 관내 주입 전략인 CRISPR-KOALA를 설명합니다. CRISPR-KOALA는 CRISPR-KO 기능을 위해 기존 20-21 bp '단일 가이드'(sg)RNA 또는 CRISPR-A를 위해 14 bp '데드 가이드'(dg)RNA를 사용합니다. dgRNA는 Cas9를 표적 부위로 효율적으로 유도하지만, Cas9 엔도뉴클레아제 활성 59,60,61을 억제하여 활성 Cas9를 발현하는 단일 마우스가 녹아웃 및 활성화 방식을 모두 수행할 수 있게 합니다. dgRNA trcr에 두 개의 PP7 헤어핀을 도입하면 PP7 코트 단백질:P65:HSF1 트랜스액티베이터62의 모집이 가능해지고, 생체 내 유전자 과발현이 매우 효과적입니다(그림 1). 표적 gRNA 라이브러리 설계와 고역가 렌티바이러스 생산 및 유리 미세모세혈관을 이용한 비수술적 관내 전달을 결합함으로써, 이 접근법은 조직 구조와 미세 환경 상호작용을 보존하면서 수만 개의 공간적으로 이산적인 상피 클론을 생성합니다. 중요한 점은, 렌티바이러스가 숙주 게놈에 통합되면 고처리량 시퀀싱을 통해 gRNA를 회수하고 정량할 수 있게 되어, 생체 내에서 통합 기능성 게놈 스크리닝이 가능해집니다. 이 모든 것이 Cas9 발현 마우스의 같은 유방선 내에서 CRISPR-KO와 CRISPR-A 교란을 병행하거나 동시(동일 세포 내)로 허용합니다.

우리는 gRNA 라이브러리 설계, 렌티바이러스 생산 및 농도, 도내 전달, 라이브러리 디컨볼루션, 데이터 분석을 포함한 상세한 단계별 프로토콜을 제시합니다(그림 1). 이 방법은 생 체 내 CRISPR 노크아웃 및/또는 활성화 스크리닝을 위한 실용적이고 확장 가능한 틀을 제공하며, 조직 항상성, 다양한 질병 상황, 기타 조직, 쥐 등 다른 종의 유전자 기능 연구에 적응할 수 있습니다.

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프로토콜

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모든 동물 시술은 캐나다 동물 관리 위원회의 지침에 따라 수행되었으며, 표현유전체학 센터 동물 관리 위원회(프로토콜 26-0272H)의 승인을 받았습니다.

1. CRISPR 라이브러리 클로닝

참고: 이 절에서는 배열 합성 올리고뉴클레오타이드에서 렌티바이러스 골격으로 CRISPR 녹아웃 및 CRISPR 활성화 라이브러리를 풀링 클로닝하는 과정을 설명합니다. 우리는 최대 4,000개의 gRNA를 포함하는 라이브러리를 정기적으로 생성하며, 이를 8-20마리의 마우스에서 400X-1,000X 범위로 스크리닝할 수 있습니다. gRNA의 수와 커버리지는 필요에 따라 조정할 수 있으며, 이는 통계적 검정력을 유지하는 데 필요한 쥐 수에 영향을 미칩니다. 우리는 400배 이상의 최소 커버리지를 유지할 것을 권장하며, 이는 강한 기능 향상 표현형에 충분할 수 있습니다.

  1. 가이드 RNA 라이브러리 설계
    1. 단일 실험에서 스크리닝할 모든 마우스 유전자 목록을 작성하여 CRISPR 라이브러리 설계를 위해 후속 CRISPR 라이브러리 설계에 사용하며, CRISPR 녹아웃(CRISPR-KO)과 CRISPR 활성화(CRISPR-A) 라이브러리에 대해 별도의 표적 목록을 유지합니다.
      참고: CRISPR-KO와 CRISPR-A 라이브러리는 별도로 생성되며, 렌티바이러스 전도 단계에서 병행하여 동시에 스크리닝할 수 있습니다.
    2. CRISPR-KO 라이브러리의 경우, CRISPick62, 63, CHOPCHOP64, VBC Score65와 같은 고점수 예측 알고리즘을 사용해 유전자당 4개에서 5개의 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 선택합니다.
      참고: VBC 점수는 매우 높은 효능과 표적 활성66을 나타냅니다. 어떤 도구든, 예측 가능한 온타겟 활성, 최소 오프타겟 잠재력, 그리고 표적 코딩 엑손을 가진 가이드를 우선시하세요.
    3. CRISPR-A 라이브러리의 경우, CRISPick62,63 또는 CHOPCHOP64를 사용하여 유전자당 8개에서 10개의 가이드를 선택하세요. 사용자가 지정한 가이드 길이를 허용하는 도구(예: CHOPCHOP)의 경우, 가이드 생성 전에 가이드 길이를 14 bp로 설정하세요. 20 bp 가이드만 생성하는 도구를 사용할 경우, 프로토스페이서 인접 모티프 5' 지점에 14 bp 서열을 유지하여 이 서열을 죽은 가이드 RNA(dgRNA)로 전환할 수 있습니다. 이 서열은 유전자의 프로모터 영역을 표적으로 합니다.
      참고: dgRNA는 절단된 가이드 서열로, DNA 절단 59,60,61 없이 전체 길이 sgRNAs의 약 50-85% 수준의 전사 활성화를 가능하게 합니다.
    4. 단일 실험에 해당하는 모든 sgRNA 또는 dgRNA를 별도의 리스트로 통합하여 균일한 클로닝, 바이러스 생산, 생체 내 스크리닝을 가능하게 합니다.
      참고: 함께 스크리닝할 sgRNA와 dgRNA는 바이러스 생성 후 함께 통합됩니다.
    5. CRISPR-KO 및 CRISPR-A 스크리닝을 위한 음성 대조군 라이브러리를 생성하며, 비표적55,67 및 비유전자 gRNA서열 68을 포함하여 유전자 교란이나 활성화와 무관한 배경 효과를 조절합니다.
      참고: 필요하다면 비표적 및 비유전자 gRNA의 별도 라이브러리를 만들어 두 개의 독립적인 음성 대조 라이브러리를 만들 수 있습니다.
  2. 올리고뉴클레오타이드 풀 설계 및 증폭
    1. 각 gRNA가 표적 서열, 목적지 렌티바이러스 골격과 호환되는 제한효소 오버행, 그리고 복잡한 올리고뉴클레오타이드 풀에서 선택적 증폭을 가능하게 하는 라이브러리 특이적 프라이머 서열을 포함하는 풀링 올리고뉴클레오타이드를 설계합니다(그림 1, 표 1).
    2. 각 gRNA 라이브러리에 고유한 프라이머 쌍을 할당하여 공유된 올리고뉴클레오타이드 풀에서 개별 라이브러리를 독립적으로 증폭할 수 있도록 합니다. 고유 프라이머 쌍은 표 1에 나열되어 있습니다.
    3. 상업용 배열 합성 플랫폼에서 올리고뉴클레오타이드 라이브러리를 순서 풀하여 각 풀 내 모든 gRNA의 등몰 표현을 보장합니다.
    4. 다음 반응 혼합물에서 라이브러리 특이적 프라이머를 사용하여 집합된 올리고뉴클레오타이드 템플릿에서 개별 gRNA 라이브러리를 증폭합니다. 반응은 특정 중합효소의 권장 조성에 맞게 조절할 수 있습니다. 올리고뉴클레오타이드 템플릿을 풀한 반응 3개와 무템플릿 음성 대조 반응 1개를 준비합니다.
      4 ng 풀드 올리고뉴클레오타이드 템플릿
      2.5 μL 10 μM 포워드 라이브러리 특화 프라이머
      2.5 μL 10 μM 역방향 라이브러리 전용 프라이머
      10 μL 5배 반응 버퍼
      0.5 μL 고충실도 DNA 중합효소
      X μL 무핵효소 무첨가물
      총 50 μL 총 부피
    5. 다음 사이클링 조건을 사용하여 PCR 증폭을 수행하며, 라이브러리별 프라이머 용융 온도에 따라 어닐링 온도를 조절합니다:
      98 °C의 1주기, 30초 동안
      18주기 동안 98 °C에서 10초, 62–65 °C에서 20초, 72 °C에서 3초간 18주기
      72°C에서 5분간 1주기
      참고: 라이브러리 내에서 균등한 gRNA 표현을 유지하기 위해 증폭 주기는 18–19을 초과하지 마십시오.
    6. 2.5% 아가로스 겔에서 120 V에서 약 45분간 PCR 산물을 분리하고, 예상되는 gRNA 삽입물 크기(프라이머 설계에 따라 약 100 bp)에 해당하는 밴드를 절제합니다; 그림 2A).
    7. 젤 추출 키트를 사용해 PCR 제품을 정제하고, 최종 용출 단계에서 20 μL의 초순수수에서 용출합니다.
      참고: (멈춤 지점) 정제된 gRNA 삽입물은 클로닝 전에 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
  3. 렌티바이러스 골격의 준비 및 소화
    1. gRNA 삽입물을 클로닝하기 위해 탈착 가능한 스터퍼 서열을 포함한 렌티바이러스 골격 플라스미드를 준비합니다. 생체 내 CRISPR-KO와 CRISPR-A 라이브러리는 각각 pLKO-Cre(Addgene 플라스미드 #158032 또는 256774)와 pXPR502-PPH-Cre(Addgene 플라스미드 #256776)를 사용합니다.
    2. 적절한 제한효소와 완충제를 사용하여 총 반응량 200 μL의 렌티바이러스 골격 DNA 5–10 μg을 소화합니다. pLKO-Cre CRISPR-KO 백본에는 Esp3I를, pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A 백본에는 SapI를 사용하세요.
      5–10 μg 백본 플라스미드
      20 μL 10배 효소 버퍼
      5 μL 제한효소
      X μL 무뉴클레아제 물
      총 부피 200 μL
    3. 37°C에서 2–3시간 동안 소화 반응을 배양합니다.
    4. 각 소화 반응마다 2μL 재조합 알칼리성 인산효소를 첨가하고 37°C에서 1시간 배양하여 소화된 척추를 탈인산화합니다.
    5. 1% 아가로스 겔에 분해된 산물을 분해하고 선형화된 골격에 해당하는 밴드를 절제합니다(그림 2B,C)
      참고: 두 척추 모두에서 스터퍼 조각은 벡터에 따라 약 2000-2500 bp 지점에서 뚜렷한 띠로 관찰됩니다.
    6. 절제된 골격 DNA를 젤 추출 키트로 정제한 후, 최소한의 초순수수에 용출하여 높은 DNA 농도(일반적으로 20 μL)를 유지합니다.
      참고: (멈춤 지점) 정제된 소화 골격은 결찰 전에 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.
  4. gRNA 라이브러리의 분해 및 연결
    1. 정제된 렌티바이러스 골격 DNA 750 ng, gRNA 라이브러리 삽입 DNA 43 ng, 제한효소 3 μL, T4 DNA 리가제 7.5 μL, 10 mM ATP 15 μL, 적절한 반응 완충제와 멸균 증류수를 사용하여 올인원 소화-연결 반응을 설정하여 총 반응 부피 150 μL에 도달합니다.
      참고: 플라스미드 골격 소화 단계에서 처음 사용된 동일한 제한효소를 사용하세요. 정제된 렌티바이러스 골격 750 ng와 라이브러리 삽입물 DNA 43 ng의 비율을 기준으로 권장 척추를 사용할 경우 벡터 대 삽입물 모금 비율은 대략 1:7입니다.
    2. 각 연결 혼합물을 세 개의 동일한 알리코트로 나누어 변환 효율과 라이브러리 복잡성을 높이세요.
    3. 배경 연결(배경 연결)을 평가하기 위해 골격 DNA를 포함한 단일 음성 대조 반응을 준비합니다.
    4. 30°C에서 하룻밤 동안 소화-연결 반응을 배큐합니다.
    5. 다음 날 아침, 각 반응 알리코트에 적절한 제한효소 1μL을 첨가하고 37°C에서 1시간 배양하여 골격 소화를 완료시킵니다.
    6. 각 반응에 10 mM ATP 2 μL과 T4 DNA 리가제 2 μL을 첨가하고 25 °C에서 2–3시간 배양하여 완성 연결합니다.
    7. 각 라이브러리별로 세 개의 개별 소화-연결 반응을 모아 컬럼 기반 올리고뉴클레오타이드 정화 방법으로 정제한 후, 각각 21 μL 초순도 멸균 증류수에 용출합니다. 단일 정제된 음성 대조군 반응을 7 μL의 초순도 멸균 증류수에서 용출합니다.
      참고: 염이나 EDTA가 포함된 완충제에서는 연결 생성물을 용출하지 마세요. 이들은 박테리아의 전기천공 효율을 크게 저하시킵니다. (잠시 멈춤) 정제 연결 생성물은 전기천공 전에 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.
  5. 라이브러리 전기천공 및 증폭
    1. 0.1cm 전기천공 쿠벳, 정제 연결 생성물 2μL 알리코트가 담긴 마이크로 원심분리관, 그리고 전기천공 최소 20분 전 얼음 위에 14mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 배양관을 미리 냉각합니다.
    2. 전기적능 박테리아 세포를 얼음 위에서 해동하고, 25 μL 세포와 2 μL 정제 연결 산물을 미리 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브에서 피펫으로 부드럽게 섞습니다.
    3. 세포-DNA 혼합물을 미리 냉각된 0.1cm 전기천공 큐벳으로 옮겨 1.8 kV, 25 μF, 200–600 Ω에서 전기공공합니다.
      참고: 성공적인 전기천공은 일반적으로 4.6ms에서 4.9ms 사이의 시간 상수를 제공합니다.
    4. 즉시 전기적으로 적합한 세포가 포함된 37 °C 회수 배지 1mL를 쿠벳에 추가하고, 세포를 부드럽게 재현용한 후 현탁액을 14mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
    5. 회수된 세포를 30°C에서 180rpm으로 진동시키며 90분간 배양합니다.
    6. 회수된 세포 10 μL 플레이트를 90 μL LB 육수에 희석하여 암피실린이 포함된 LB-한천 플레이트에 부착하고, 30°C에서 하룻밤 배양하여 형질전환 효율과 배경 연결을 평가합니다.
      참고: 성공적인 클로닝은 삽입 플레이트에 수백 개의 콜로니가 생성되고, 골격만 있는 음성 대조판에는 소수(> 30개)의 콜로니가 생성되어야 합니다(그림 3).
    7. U6 프로모터에서 miniprep 및 Sanger 시퀀싱 포워드를 위해 ~10개의 콜로니를 선택해 라이브러리를 추가로 검증합니다. 성공적으로 복제된 라이브러리는 10개의 미니프렙 전반에 걸쳐 반복 가이드 없이 gRNA의 명확한 시퀀싱을 포함하고 < 있습니다. 또한, 제한효소는 미니프렙과 풀링된 플라스미드 라이브러리를 소화하고(단계 1.5.10), 아가로스 겔에서 검사하여 밴드 크기를 확인하고 렌티바이러스 구조체가 이상 재조합을 겪지 않았는지 확인합니다.
      참고: 라이브러리 표현은 희석판의 콜로니 수와 라이브러리 내 총 gRNA 수를 비교하여 1,000배 커버리지를 목표로 평가할 수 있습니다. 이 계산을 돕기 위해 여러 차례 연속 희석이 사용될 수 있습니다.
    8. 형질전환 효율이 충분하면, 남은 회수 세포를 적절한 항생제가 들어 있는 15cm LB-한천 플레이트에 판을 올리고, 30°C에서 하룻밤 배양하여 밀집한 군락 잔디밭을 만듭니다.
      참고: 회수한 세포 100 μL을 15cm LB 한천 플레이트 10개 각각에 플레이트 부착하여 충분한 콜로니를 회수하세요.
    9. 다음 날, 세포 스크레이퍼를 사용해 500mL의 LB 육수에 박테리아 집락을 긁어내어 클로네 gRNA 라이브러리를 나타내는 단일 박테리아 배양을 생성합니다.
    10. 30°C에서 약 3시간 흔들며 모인 박테리아 배양물을 확장하고, maxiprep 키트를 사용해 플라스미드 DNA를 분리합니다.

2. 생체 내 스크리닝을 위한 렌티바이럴 생산

참고: 관내 전달 및 생체 내 통합 스크리닝을 위해서는 렌티바이러스 제제를 높은 역가(이상적으로는 1 x 108 pfu/mL에서 1 x 109 pfu/mL 사이)로 농축하여 유선 상피 세포의 효율적인 전달을 보장해야 합니다. 다음 프로토콜은 생체 내 사용에 최적화된 고역가 렌티바이러스 생산을 설명합니다.

  1. 렌티바이러스 생성 세포의 준비
    1. HEK293TN 세포를 10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 그리고 5%CO2가 포함된 배양 세포를 37°C에서 보충한 Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM)에 보관합니다.
    2. 세포는 로그 성장을 유지하고 세포 합류율이 90%를 넘지 않도록 2–3일마다 통과시킵니다. 최적의 바이러스 생산을 위해 <20 통로 세포를 사용하세요.
    3. 형질전환 하루 전, 15cm 조직 배양 플레이트에 폴리-L-라이신(0.02 mg/mL)을 1시간 동안 실온에서 코팅합니다. 바이러스 제제 한 배치를 위해 9개의 접시를 준비하세요.
    4. 폴리-L-라이신 용액을 제거하고 인산염 완충 식염수로 플레이트를 두 번 세척합니다.
    5. 1.1 x 107 HEK293TN 세포를 9개의 폴리-L-라이신 코팅 15cm 조직 배양판에 씨앗 투여하여 형질전환 시 세포가 ~90% 융합률을 달성하도록 보장합니다.
      참고: 최대 바이러스 역가가 필요하지 않은 응용 분야에서는 렌티바이러스 생산을 3개 또는 6개 플레이트 수로 축소하여 수율을 비례적으로 줄일 수 있습니다. 형질전환을 위해 시약(플라스미드 DNA, PEI, DMEM)을 적절히 줄이세요.
  2. PEI 기반 렌티바이러스 형질염
    1. 렌티바이러스 생산용 플라스미드 DNA를 렌티바이러스 생산을 위해 95 μg의 gRNA 라이브러리 플라스미드, 95 μg의 포장 플라스미드 psPAX2(Addgene Plasmid #12260), 65 μg의 VSV-G 외피 플라스미드 pMD2.G(Addgene Plasmid #12259)로 구성된 3-플라스미드 시스템을 사용하여 준비합니다.
    2. 세 가지 플라스미드를 10.8mL의 혈청 무첨가 DMEM에 결합하여 렌티바이러스 생산을 하고, 약 10초간 소용돌이로 완전히 혼합합니다.
    3. 희석된 DNA 용액에 1 mg/mL 폴리에틸레니민(PEI) 366 μL 각하를 점차 첨가하고, 약 10초간 소용돌이로 충분히 혼합한 후 상온에서 10–30분간 배양합니다.
    4. 복합체 형성 과정에는 HEK293TN 배지에서 배양지를 흡입하고 혈청 무첨가 DMEM 14mL를 첨가합니다.
      참고: 태아 소 혈청은 세포에 의한 플라스미드 흡수를 억제할 수 있습니다.
    5. 1.2mL의 DNA-PEI 복합체를 플레이트 전체에 점차 분포하고, 균일하게 분포하도록 돌로 돌립니다.
    6. 세포를 37°C에서 5%CO2 와 함께 6–8시간 동안 배양합니다.
    7. 각 배지의 배지를 20mL 미리 예열된 DMEM과 10% 태아 소 혈청(1% 페니실린-스트렙토마이신 제외)으로 교체하고, 세포를 37°C에서 5%CO2로 계속 배양합니다.
      참고: PEI에 장기간 노출되고 혈청 부족이 바이러스 수량을 감소시키므로, 하룻밤 형질전환은 권장되지 않습니다.
  3. 바이러스 수확과 초원심분리
    1. 자당 40g, 염화나트륨 11.7g, 1M HEPES 4 mL(pH 7.4), 0.5 M EDTA(pH 7.9) 1mL를 적절한 무균 증류수에 혼합하여 200 mL의 자당 쿠션 용액을 준비한 후, 0.45 μm 저단백 결합 폴리에테르설폰 여과 장치를 통해 여과하여 멸균합니다. 이 용액은 4°C에서 몇 달간 보관할 수 있습니다.
    2. 형질전환 후 48–72시간 내에 렌티바이러스 상청액을 수집합니다.
    3. 10mL의 DMEM과 10% 태아 소 혈청을 보충하여 0.45 μm 저단백 결합 폴리에테르설폰 여과 장치를 통과시킵니다. 흐름을 버리세요. 상청액을 필터에 주입하고 진공을 적용하세요.
      참고: 즉시 농도를 측정할 수 없는 경우, 정제된 바이러스 상청액을 4°C에서 하룻밤 보관하세요.
    4. 초원심분리관에 정제된 바이러스 상원액 30mL를 추가하세요.
    5. 정화된 바이러스 상원액 아래에 4mL의 자당 쿠션 용액을 천천히 덮습니다.
    6. 초원심분리관을 스윙잉 버킷 로터에 적합한 어댑터에 넣고 튜브 간 균형을 정확히 맞추세요.
    7. 튜브를 104,000 × g 에서 최소 2시간 동안 4°C에서 원심분리합니다.
      참고: Beckman JS24.38 로터와 같은 스윙잉 버킷 로터가 자당 쿠션을 통해 바이러스를 제대로 펠릿으로 전달하는 데 필요합니다.
    8. 바이러스 펠릿을 손상시키지 않고 조심스럽게 상청액을 옮기세요. 바이러스 펠릿은 튜브 바닥에 희미한 흰색 또는 반투명 막으로 보일 수 있습니다.
    9. 튜브를 최소 10분간 자연 건조시키고, 실험실용 물티슈로 튜브 내부의 잔여 액체를 최대한 제거하면서도 펠릿을 흔들지 마세요.
      참고: 튜브의 적절한 건조는 높은 바이러스 농도를 달성하는 데 매우 중요하며, 이는 최종 회수 부피를 줄여줍니다.
    10. 바이러스 펠릿을 20μL 차가운 인산염 완충 식염수에 재현탁한 후, 공기 방울을 피하면서 조심스럽게 위아래로 피펫팅하세요.
    11. 튜브를 얼음 위에 2시간 동안 부드럽게 교묘하게 부양하여 바이러스 펠릿을 완전히 재현지시킵니다.
    12. 농축된 바이러스를 깨끗한 마이크로퓨지 튜브로 옮기고, 4 °C에서 2,000 × g 에서 5분간 원심분리하여 용액을 정액화합니다.
      참고: 이 스핀은 수술 중 주사 바늘을 막는 이물질과 잔여 입자를 제거합니다.
    13. 반복적인 동결-해동을 피하기 위해 농축된 바이러스를 일회용 용량으로 나누어 보관하고, -80°C에서 보관하세요.
  4. LSL-tdTomato 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 이용한 렌티바이라 적정
    1. 감염 하루 전 6웰 플레이트에 100,000개의 LSL-tdTomato MEFs(Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]에서 유래)를 DMEM에 10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충한 상태로 배양하고, 세포를 37°C와 5%CO2로 배양합니다. 세포 세기를 위해 도금을 더 심어두세요.
      참고: LSL-tdTomato MEFs는 렌티바이러스 내에서 Cre의 리포터 역할을 합니다. 다른 척추의 바이러스 역가분석을 위한 적합한 리포터 시스템을 사용할 수 있습니다.
    2. 다음 날, 추가 우물에서 발견된 LSL-tdTomato MEF 수를 세어 감염 시점에 존재하는 세포 수를 정량화합니다.
    3. Cre 재조합효소를 인코딩한 농축 렌티바이러스를 2mL Dulbecco's modified Eagle 배지에 10% 태아 소 혈청을 보충하여 연속적으로 희석합니다. 일반적으로 0.4 μL, 0.1 μL, 0.025 μL 농축 바이러스는 깨끗한 동적 선형 범위를 제공합니다(그림 4A–D).
    4. 각 LSL-td토마토 MEF 웰에 2mL의 바이러스 희석물을 추가하고, 각 웰에 10 mg/mL 2 μL 폴리브렌을 추가합니다.
    5. 400 × g 에서 37 °C에서 90분 동안 회전시켜 MEF를 감염시킵니다.
    6. 바이러스 배지를 2mL DMEM에 10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하고, 37°C에서 5%CO2 와 함께 48–72시간 동안 세포를 배양합니다.
    7. 형광 현미경 또는 유동 세포분석을 통해 tdTomato 양성 세포를 정량하여 각 희석 시 감염 세포의 비율을 결정합니다.
    8. 감염된 세포의 비율과 감염 시점에 존재하는 세포 수를 바탕으로 기능 역가를 계산합니다.
      참고: CRISPR-KO와 CRISPR-A 바이러스는 별도로 생산, 농축 및 조절됩니다. LSL-td토마토 MEF를 이용해 결정된 기능적 역가는 CRISPR-KO와 CRISPR-A 바이러스를 정해진 비율로 혼합하는 데 사용되어 관내 주입 전에 투여됩니다.
  5. 플라스미드 및 렌티바이러스 라이브러리의 품질 평가
    1. gRNA 라이브러리가 충분한 깊이와 커버리지를 가지고 클로닝되고 모든 gRNA가 클로닝 및 바이러스 생산 과정에서 유지되는지 확인하기 위해, 플라스미드 풀과 형질전환된 MEF를 모두 시퀀싱하는 것이 강력히 권장됩니다.
    2. 렌티바이러스 커버리지를 평가하기 위해, 계산된 바이러스 역가를 기반으로 >1000× 커버리지로 MEF를 형질전환합니다. 이 단계에서 세포의 단일 감염을 반드시 보장할 필요는 없습니다.
    3. 48–72시간 후에는 트립신이나 세포 스크레이퍼로 세포를 분리하고 세포를 펠릿으로 제거합니다. 상업용 gDNA 추출 키트를 사용해 DNA를 추출하세요.
    4. 5절에 설명된 프로토콜을 사용하여 플라스미드 1 μg와 추출한 MEF DNA 3 μg 서열을 수행했습니다. 500만 번의 심층 시퀀싱은 < 5000 gRNA를 가진 대부분의 맞춤형 라이브러리에 충분합니다.
      참고: 플라스미드 풀 리드와 가이드 비율(1로그 10년 내 가이드의 >70%), 그리고 개별 가이드가 라이브러리 수를 지배하지 않는 경우 (R2> 0.6) 강한 상관관계가 있음은 양질을 나타냅니다(그림 4E).

3. 생쥐 유선에 대한 관내 렌티바이러스 주사

  1. 바늘과 바이러스 희석
    1. 마이크로피펫 바늘 풀러를 사용해 유리 미세모세관 바늘을 당겨 9–10 μL 부피의 관내 주입에 적합한 미세 모세혈관을 생성합니다. 가는 겸자를 사용해 바늘 끝을 부러뜨리세요.
      참고: 최적의 위치는 액체를 담을 수 있을 만큼 크면서도 젖꼭지 입구에 쉽게 들어갈 만큼 얇은 바늘 크기를 만듭니다.
    2. 무균 인산염 완충 식염수에 0.05% (w/v) Fast Green FCF 염료를 보충하여 최종 농도인 1 × 10pfu /mL로 희석한 렌티바이러스 제제를 투여합니다.
    3. CRISPR-KO와 CRISPR-A 바이러스를 동일한 복합 풀 내에서 스크리닝할 경우, 멸균 인산염수 생리식염수와 동일한 바이러스 역가로 두 라이브러리를 조절하고, 두 라이브러리 모두에서 gRNA의 비율이 균등하도록 혼합합니다.
  2. 관내 주사를 위한 쥐 준비
    1. 성체 암컷 쥐(8–20주)를 4% 이소플루란 농도로 1L/분의 산소와 함께 마취시키고, 양쪽 눈에 멸균 안과 윤활제를 발라하여 각막 건조를 방지합니다.
      참고: 관내 주사는 비침습적 시술이며 진통이 필요하지 않습니다. 이 실험에는 Rosa26-LSL-Cas9, H11-Cas9, 또는 Rosa-LSL-tdTomato 마우스를 사용하세요.
    2. 시술 내내 2% 이소플루란과 1L/min 산소를 노즈콘으로 투여하여 체온을 유지하고 마취를 유지하기 위해 덮개가 있는 온열 패드 위에 엎드린 상태로 고정하세요.
    3. 제모 크림을 사용해 제모 크림을 사용해 약 0.5cm 반경 반경의 원형 공간에 10–15초간 제거한다. 피부 자극을 방지하기 위해 즉시 멸균 거즈와 멸균 물로 크림을 제거하세요.
      참고: 제3, 4 번째 유선은 보통 주사가 가장 쉽습니다. 또는 두 번째와 다섯 번째 샘도 같은 방식으로 주입 준비를 할 수 있습니다.
    4. 멸균 거즈를 사용해 70% 이소프로필 알코올과 요오드로 순차적으로 면봉으로 각 유두 주변 피부를 소독하세요.
    5. 생체 안전 캐비닛 안에서 해부 현미경 아래에 쥐를 두어 유두를 명확히 볼 수 있게 합니다.
    6. 70% 에탄올로 세척한 미세한 겸자를 사용해 유두 위에 덮인 죽은 피부를 부드럽게 제거하여 유관 입구를 노출시킵니다.
      참고: 이 죽은 각화층은 느슨하게 붙어 있어 바늘 침투를 방해할 수 있습니다. 제거 시 생존 가능한 피부나 기저 조직을 손상시키지 않아야 합니다.
  3. 관내 주입
    1. 희석된 바이러스 8μL를 뽑은 유리 미세모세관에 주입합니다.
    2. 가늘한 겸자로 젖꼭지 부위를 잡고, 바늘 끝을 부드럽게 젖꼭지 구멍에 넣으세요(그림 5A). 적절히 배치된 바늘은 저항이 거의 없어 덕트 안으로 들어갑니다. 바이러스 현탁액을 5–10초 동안 천천히 유선관에 투여합니다.
      참고: 1 × 107 pfu/mL 렌티바이러스 8 μL 투여 시 하강 유선 상피세포의 감염률은 약 30%, 기저 유선 상피세포의 감염률은 5%이며, 기질36의 감염은 무시할 만한 수준(< 0.5%)입니다. 바이러스 역가는 감염성을 높이거나 낮추도록 조절할 수 있습니다.
    3. 해부 현미경을 통해 주입 중 Fast Green 염료의 확산을 모니터링하세요. 피부 아래 유관 네트워크 전체에 염료가 확산되는 것을 관찰하여 성공적인 관내 전달을 확인한다(그림 5B).
    4. 유두를 따라 유두를 따라 염료를 모으는 것이 아니라 유두 옆 유방지방 패드 내에 염료를 모아 실패한 주사를 식별합니다(그림 5C).
    5. 양쪽 모두 세 번째 흉선과 네 번째 복부 유선에 주사 과정을 반복하여 쥐당 총 네 개의 분비선을 주입합니다.
      참고: 경험상 성공적인 관내 분만은 주사의 >95%에서 이루어집니다. 지방 패드에만 국한된 실패한 주사는 부작용과 관련이 없으며, 나머지 분비샘도 계속 사용할 수 있습니다. 추가적인 주사 검증은 면역조직화학 및 유세포검사(Figure 5D,E)를 통해 수행할 수 있습니다.
    6. 마취를 중단하고 쥐를 깨끗한 회복 케이지로 옮기세요.
    7. 쥐가 완전히 움직일 때까지 모니터링하고, 정상적인 행동이 관찰되면 지정된 생물안전 보호소로 돌려보내세요.
    8. 주사 후 3일 후, 전체 케이지 교체를 시행하고, 모든 하우징과 침구를 바이러스성 폐기물로 버리고, 쥐를 깨끗한 케이지로 옮겨 표준 케이지로 복귀시킵니다.

4. 유선과 종양에서 유전체 DNA 분리

참고: 동물 관리 지침에 따라 일산화탄소 노출 또는 마취제 과다복용 후 자궁경부 탈구로 쥐를 안락사시키십시오. 규제 지침에 따라 원하는 시점 또는 인도적 종점에서 유선선 또는 유선종양을 채취합니다. 감염된 세포는 렌티바이러스 감염 후 48시간(36.55)부터 늦은 경우 주사 후 5+개월(야생형 마우스36), 또는 암성 생 생쥐(55)에서는 >24개월에 채취되었습니다. 다음 단계는 DNA 지우기로 청소된 공간과 sgRNA/dgRNA 카세트가 포함된 플라스미드가 없는 장비를 사용하여 수행해야 합니다. 플라스미드 DNA의 미량만으로도 조직 샘플 오염을 일으킬 수 있으므로, 이후 심층 시퀀싱 PCR 및 음성 대조(조직 없음) 대조를 통해 깨끗한 준비를 해야 합니다.

  1. 조직 해리
    1. 유선의 경우, 각 유선을 15mL 원뿔관 내에서 2mL의 완전한 Epicult-B 배지(마우스)에 0.2mL의 순한 콜라게나제/히알루로니다제를 보충하여 37°C에서 하룻밤 배양합니다.
    2. 450 × g 에서 실온에서 5분간 세포를 펠릿 해리시켰습니다.
    3. 소 알부민 코팅 피펫 팁을 사용해 상위 지방층을 새 15mL 원뿔 튜브로 조심스럽게 옮기고 남은 상청액은 버립니다.
      참고: 이 단계의 상부 지방층에는 분리되지 않은 잔류 상피 오가노이드가 지방 조직과 연관되어 있는 경우가 많습니다. 이 분획을 별도의 튜브에서 처리하면 상피세포 회복이 크게 증가합니다.
    4. 지방 분획과 세포 펠릿을 5mL 인산염수 5mL로 한 번 세척하고, 450 × g에서 실온에서 5 분간 원 심분리한 후 상원액을 버립니다.
    5. 세척된 지방 분획과 같은 유선에서 나온 세포 펠릿을 15mL 원뿔형 튜브에 5mL 인산염염수로 결합합니다.
    6. 450 × g 에서 5분간 혼합물을 알렛으로 넣고 상청액을 버립니다.
    7. 유선종양의 경우, 멸균 가위나 메스로 조직을 작은 조각으로 잘게 만든 후 2mL 마이크로퓨지 튜브로 직접 옮깁니다.
  2. 유전체 DNA 분리
    참고: 유전체 DNA 추출은 제조사 지침에 따라 Qiagen DNEasy 혈액 및 조직 키트 또는 다음 페놀-클로로포름 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있습니다.
    1. 1 M 트리스-HCl(pH 8.0) 5 mL, 1 mL EDTA(pH 8.0), 5 M NaCl 25 mL, 10% SDS 50 mL를 혼합하여 DNA 용해 완충제를 준비하고, 최종 부피는 멸균 증류수로 500 mL로 만듭니다.
    2. 각 샘플에 DNA 용해 완충제 1mL와 단백질분해효소 K 10 μL(20 mg/mL)을 첨가하고 역전하여 완전히 혼합합니다.
    3. 샘플을 56°C에서 하룻밤 배양하여 완전한 용해를 허용합니다.
    4. 원심분리기는 16,000 × g 에서 실온에서 5분간 용해하여 불용성 이물질을 제거합니다.
    5. 정화된 상청액을 새로운 2mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
      주의: 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올은 독성이 있고 부식성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 화학 연기 후드에서 유기 용매와 관련된 모든 과정을 수행하세요.
    6. 페놀:클로로포름:아이소아밀 알코올을 같은 양으로 추가하고 약 15초간 소용돌이 현상을 통해 격렬하게 혼합하여 균질한 혼합물이 형성됩니다.
    7. 16,000 × g 에서 4°C에서 10분간 원심분리하여 유기와 무기 상을 분리합니다.
    8. 상부 수상을 조심스럽게 새 튜브로 옮기면서 간기를 방해하지 마세요.
      참고: 단백질과 RNA 오염을 최소화하기 위해 흰색 간기에서 물질을 흡입하지 마세요.
    9. 회수된 수상에 0.7 부피의 이소프로판올을 추가하고 약 15초간 소용돌이로 격렬하게 혼합합니다.
    10. 원심분리기는 16,000 × g 에서 4°C에서 10분간 10분간 진행합니다.
    11. 상정액을 조심스럽게 버리고 70% 에탄올 500μL로 DNA 펠릿을 헹군다.
    12. 16,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리하여 에탄올을 완전히 제거하세요.
    13. DNA 펠릿을 실온에서 10분간 자연 건조하세요.
    14. DNA 펠릿을 멸균수 50 μL에 재현탁합니다.
    15. 37°C에서 1시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배큐하여 유전체 DNA의 완전한 재현탁을 촉진합니다.
    16. DNA 농도와 순도를 나노드롭 또는 형광측정 정량으로 측정하세요.

5. 차세대 CRISPR 라이브러리 시퀀싱


참고: gRNA 접힘 변화 계산을 위해 참조 샘플을 생성하세요. 감염 후 3일 이내에 채취한 전도된 MEF(섹션 2) 또는 유선선(섹션 4)과 원래의 플라스미드 maxiprep을 사용하여 시작 라이브러리와 바이러스 스톡에서 가이드 대표성을 결정할 수 있습니다.

  1. 게놈 DNA에서 gRNA 카세트의 PCR 증폭
    1. 표 2에 나열된 프라이머 쌍을 사용하여 샘플을 고유하게 인덱싱하여, 시퀀싱 후 최대 306개의 샘플을 다중화하거나 탈다중화할 수 있게 합니다.
    2. 1 μg 유전체 DNA 주형을 사용하여 총 반응 부피 50 μL, 25 μL 2x Q5 마스터 믹스, 2.5 μL 10 μM 전방 프라이머, 2.5 μL 10 μM 역방향 프라이머를 포함한 PCR 반응을 준비합니다.
    3. 오염 모니터링을 위해 무템플릿 제어 반응을 병행하여 포함하세요.
    4. 다음 사이클링 조건을 사용하여 PCR 증폭을 수행하며, 라이브러리별 프라이머 용융 온도에 따라 어닐링 온도를 조절합니다:
      98 °C의 1주기, 30초 동안
      98 °C에서 10초, 68 °C(-1 °C/사이클) 10초, 72 °C 15초 간격으로 5회 사이클
      98 °C 10초, 63 °C 30초, 72 °C 15초 20회 사이클
      72°C에서 2분간 1주기
    5. PCR 산물을 2.5% 아가로스 겔에서 분해하여 올바른 앰플리콘 크기를 검증합니다.
    6. pLKO 기반 sgRNA 라이브러리는 약 306 bp, pXPR502 기반 dgRNA 라이브러리는 약 430 bp 밴드의 존재를 확인한다(그림 6).
      참고: 명확한 무템플릿 통제는 시약의 순도를 보장하고 분석이 교차 오염이 없음을 확인합니다.
    7. 적절한 DNA 정제 방법으로 PCR 제품을 정제하고, 형광측정 정량을 이용해 DNA 농도를 정량합니다.
  2. 차세대 시퀀싱
    1. 예상되는 라이브러리 복잡도와 샘플 클로날리티를 바탕으로 필요한 시퀀싱 깊이를 결정합니다.
      참고: 클론으로 의심되는 종양의 경우, 샘플당 약 100만 개의 리드가 가이드 표현을 정량화하기에 충분합니다. 유선샘에서 시퀀싱 깊이를 계산하려면, 라이브러리의 가이드 수에 1,000배 커버리지를 곱한 뒤, 세포당 유전체 DNA/6 pg를 곱하여 PCR 증폭이 필요한 샘플당 총 유전체 DNA 질량을 계산합니다. 시퀀싱에 필요한 총 읽기 수는 도서관 내 가이드 수에 1,000을 곱한 것과 같습니다.
    2. 서로 다른 샘플에서 정제 라이브러리를 등몰 농도로 풀어냅.
    3. 단판 일루미늄 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 라이브러리를 시퀀스 풀링했습니다.
  3. 데이터 분석
    1. 샘플별 인덱스를 사용하여 원시 시퀀싱 FASTQ 파일을 디멀티플렉싱합니다.
    2. 트림은 Trimmomatic69를 사용해 gRNA 프로토스페이서 서열을 읽습니다. CRISPR-A 샘플의 경우 트림 리드는 14 bp, CRISPR-KO의 경우 트림은 전방 프라이머 끝에서 20 bp까지 읽힙니다.
    3. Bowtie70을 사용해 해당 gRNA 참조 라이브러리에 정렬 트림 리드를 배치합니다. CRISPR-KO에는 -v 2 와 -m 1 , CRISPR-A 및 혼합 풀에는 -v 2 와 -m 2 의 정렬 매개변수를 사용하세요.
      참고: 일반적으로 90% 이상의 리드가 성공적으로 정렬됩니다. 낮은 정렬은 일반적으로 트리밍 오류, 입력 파일의 잘못된 형식, 또는 PCR 중 샘플 오염으로 인해 발생합니다.
    4. MAGeCK72의 카운트 함수를 사용하여 각 gRNA의 정렬된 리드를 정량하여 최종 gRNA 카운트 테이블을 생성하여 후속 분석을 수행합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서는 마우스 유선에서 통합 생체 내 CRISPR 선별 프로토콜을 제공합니다. 이 파이프라인은 올리고뉴클레오타이드 배열에서 풀린 gRNA 라이브러리를 설계 및 증폭하는 데 종단 투 엔드를 사용할 수 있으며, gRNA 라이브러리를 렌티바이러스 골격으로 클론화하고, 고역가 렌티바이러스를 생산하며, 집합된 렌티바이러스 라이브러리를 성인 유선에 전달하고, 라이브러리 표현의 시퀀싱 기반 디컨볼루션을 위해 gRNA를 회수하는 데 사용됩니다(그림 1).

결합된 gRNA 라이브러리의 성공적인 증폭 및 클로닝은 먼저 아가로스 겔 전기영동으로 평가합니다. gRNA 라이브러리의 PCR 증폭은 풀린 올리고뉴클레오타이드 칩 배열에서 균일한 증폭을 나타내는 이산 밴드를 생성합니다(그림 2A). pXPR502 PPH-Cre...

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토론

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풀링 in vivo CRISPR 스크리닝에서 중요한 고려사항은 클론 해상도를 유지하기 위해 드문드문 단일 세포 전도(transduction)를 유지하면서 충분한 라이브러리 커버리지를 달성하는 것입니다. 쥐 유선에서는 상피 구획이 보존적으로 각 36개의 샘당 약 3.5개 ×10개의 5개의 세포로구성되어 있습니다. 평균 렌티바이러스 전이율 15%로 세포당 다발 감염 빈도를 최소화하며, 관내 전달은 선당 약 5× 104개의 상피세포가 전달됩니다36,55. 따라서 제3흉선과 제4복부 유선에 양측 주사를 투여하면 마우스당 ~2 × 105개의 상피세포가 전달됩니다36,55

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공개 사항

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D.S.는 ViVerita Therapeutics의 컨설턴트이자 창립자이며, 그의 연구실은 ViVerita Therapeutics와 연구 계약 및 서비스 계약을 후원했습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구와 관련된 유용한 의견과 토론을 주신 연구실 모든 구성원분들께 감사드립니다. 또한 캐나다 토론토의 루넨펠드-타넨바움 연구소(LTRI)에서 쥐 연구에 도움을 주신 표현유전체학 센터에 감사드리며, 이에 감사드립니다. 이 연구는 캐나다 보건연구소(PJT462506)의 프로젝트 보조금과 D.S.에 대한 테리 폭스 연구소 프로그램 프로젝트 보조금(TFRI Project #1107), 그리고 Nicol Family Foundation의 지원을 받았습니다. E.R.L.은 캐나다 암 학회 연구 훈련상과 프랭크 플레처 기념 기금의 지원을 받았습니다. K.N.A.는 H.L. 홈즈 박사후 연구상과 암 연구 학회의 1318698 및 26089 보조금의 지원을 받았습니다. J.N.은 캐나다 보건연구소 대학원 장학금(석사 과정)과 캐나다 보건연구소 박사 연구상(#193389)의 지원을 받았습니다. Y.L은 캐나다 보건연구소(Canadian Institute of Health Research)의 연구 우수성, 다양성, 독립성 펠로우십(#ED6-190718)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.45 마이크론 필터시그마S2HVU02RE
12k 또는 92k 올리고 칩Customarray Inc. (Genscript)
15 cm 세포 배양 플레이트코닝CLS353004
293FT인비트로겐R70007
293NT시스템 바이오사이언스LV900A-1
알칼리성 포스파타제NEBM0290L
앰플리실린피셔 사이언티픽BP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
Cutsmart 버퍼NEBB6004S
딥 시퀀싱 (Next-Seq 또는 Hi-Seq)일루미나
DNAesy 혈액 및 조직 DNA 추출 키트Qiagen69506
듈베코의 수정된 이글 배지Wisent319-015-CL
엔두라 전기전도성 세포루시겐60242-1
EpiCult-B 마우스 배지 키트스템셀 테크놀로지스05610
Esp3INEBR0734L
태아 소 혈청Wisent090-150
겔 DNA-정제 키트자이모 리서치D4008
Gene Pulser/MicroPulser 전기 충격 큐벳바이오레드1652089
젠틀 콜라겐아제/히알루로니다제스템셀 테크놀로지스7919
H11-Cas9잭슨 랩러토리JAX#028239
고속 원심분리기벡만 코우터MLS-50
김와이퍼킴벌리-클락34155
LB 아가와이센트 테크놀로지스800-011-LG
마이크로파이펫 풀러사터 인스트루먼트P97
미니-프레핑 플라즈미드 키트프로가 바이오PDH300
NE버퍼 3.1 (버퍼 포 BsmBI)NEBR0580L
올리고 클린 앤 콘센트레이터자이모 리서치D4061
올리고 클린업 키트자이모 리서치D4060
PAGE 정제된 일루미나 시퀀싱 프라이머IDT DNA
PCR 마이크로파이펫드러먼드5-000-1001-X10
PEI (폴리에틸렌이민)시그마408727-100ML
페니실린 및 스트렙토마이신와이센트450-201-EL
pLKO-Cre애드진158032
pMD2.G애드진12259
폴리-L-리신시그마P2636-100MG
psPAX2애드진12260
pXPR502-PPH-Cre애드진256776
Q5 폴리머레이즈 2x 마스터 믹스NEBM0494L
퀴빗 형광 정량인비트로겐Q33327
R26-LSL-Cas9-EGFP잭슨 랩러토리JAX#024857
R26-LSL-TdTomato 마우스잭슨 랩러토리JAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA 리가제NEBM0202L
울트라 원심분리기 튜브벡만 코우터344058
진공 필터 유닛피셔 사이언티픽SCHVU02RE

참고문헌

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