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방법 논문

사회적 상호작용 중 개별 쥐에게 초음파 발음을 감지하고 할당하기

200 조회수

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DOI:

10.3791/71121

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2026년 7월 7일

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1Department of Psychological and Brain Sciences, University of Delaware, 2Interdisciplinary Neuroscience Graduate Program, University of Delaware, 3Center for Bioinformatics and Computational Biology, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 다중 마우스 사회적 상호작용 중 동기화된 비디오 및 오디오 데이터를 기록하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 마이크 배열과 음원 위치 지정을 사용하여 개별 쥐에게 초음파 발성(USV)을 할당하여, 동물과 사회적 맥락 전반에 걸친 발성 행동을 정량적으로 분석할 수 있게 합니다.

초록

쥐(Mus musculus)는 사회적 상호작용 중에 초음파 발성(USV)을 통해 의사소통합니다. 하지만 마우스 USV는 명확한 시각적 지표와 연관되어 있지 않고 인간의 청각 범위 밖에서 발생하기 때문에, 그룹 내에서 개별 발음하는 쥐를 식별하는 것은 여전히 어렵습니다. 이 프로토콜은 다동물 사회적 상호작용 중 동기화된 비디오 및 초음파 오디오 데이터를 기록하는 방법을 설명하며, 행동과 음성 활동을 동시에 포착할 수 있게 합니다. 다중 동물 추적, 발성 감지, 음원 위치 지정, 개별 동물에 대한 발성 할당을 통합한 계산 파이프라인이 개략적으로 제시됩니다. 각 파이프라인 단계에서 추적 정확도, 음성 추출, 위치 정확도, 할당 신뢰도를 평가하는 검증 절차도 추가로 설명됩니다. 이 프로토콜을 4마리 동물 시연 데이터셋에 적용하면 개별 해석된 발성 추적, 공간적으로 정밀한 음원 추정, 그리고 음성 출력 및 음향 특성의 정량적 측정이 가능합니다. 이 방법들은 음성 의사소통과 개별 행동을 연결하는 견고한 틀을 제공하며, 자유롭게 상호작용하는 쥐에서 성차, 개체 변이, 사회적 의사소통에 대한 후속 분석을 가능하게 합니다.

서론

동물계 전반의 사회적 의사소통은 생존과 번식과 같은 과정을 돕는 행동 역학의 필수 요소입니다. 포유류 사이에서는 쥐가 35kHz에서 110kHz까지 다양한 주파수를 사용하는 USV를 통해 음향적으로 소통합니다. USV는 행동 맥락에 따라 정보를 전달하는 복잡한 특징을 보입니다. 4. 암컷 쥐는 수컷 마우스 USVs를 선호하는 경향이 있으며, 구애 행동중 수컷과 암컷 마우스는 7에서 음성 상호작용을 하여, USV가 주요 사회적 신호로 기능함을 나타냅니다. 특정 USV 특징이 서로 다른 쥐의 행동 상태와 연관되어있기 때문에, 개인에게 정확한 음성 신호를 부여하는 것은 사회적 상호작용을 이해하는 데 필수적입니다.

USV의 기능과 사회적 행동과의 관계를 밝히기 위한 광범위한 노력에도 불구하고, 현장에서 지속적인 도전 과제는 집단 상호작용 중 개별 쥐에게 USV를 할당하는 것입니다. USV제작 중 입 움직임이 눈에 띄지 않고, USV의 주파수 범위가 인간의 귀에 들리지 않는 점에서 어려움이발생합니다. 그 결과, USV와 사회적 행동 간의 관계에 대한 이전 연구들은 관찰 가능한 집단 행동의 범위를 제한하는 단순화된 실험이나 제한된 환경에서만 이루어져있었으며, 자유롭게 상호작용하는 동물에서 음성 행동이 어떻게 전개되는지에 대한 통찰은 부분적으로만 제공되었다.

청각 의사소통과 사회적 행동 간의 관계를 정제하기 위해서는 쥐의 행동 범위를 모두 포착하고 집단 내 개체에게 발성을 할당해야 합니다. 발성 식별 식별은 개인별 성별 및 맥락 의존적 음성 범위를 결정하는 데 필수적입니다8, 특정 음성 특징이 동종 행동을 어떻게 유발하는지에 대한 인과 가설 검증10, 11, 12, 그리고 해당되는 경우 음성 출력과 동시에 측정된 뇌 신호(예: 전기생리학)를 상관관계 분석하는 것입니다13. 역사적으로 수컷 쥐만이 유일한 발음자라고 여겨졌으나; 그러나 음원 위치 확인 결과, 암컷 쥐도 그룹 환경에서 USV를 생성하는 것으로 밝혀졌다7 또는 수컷과 짝을 이룰 경우14. 어떤 동물이 USV를 방출했는지 밝혀내지 못하면, 자유롭게 상호작용하는 집단에서 발소리 특징과 개별 행동 및 사회적 결과를 연결하는 것은 제한적입니다. 따라서 개별 동물에게 발성을 할당하면서도 자연스러운 상호작용 역학을 유지하는 위치 기반 시스템을 활용하는 것이 필수적입니다.

여기서 설명된 마이크 배열 음원 위치 추적 시스템은 이전에 7,15호에서 발표되었으며, 경기장 내 USV의 공간적 기원을 추정하고, 발성 시 존재하는 모든 동물의 위치를 추적하여 발성기를 발신자에게 할당할 수 있게 합니다. 음원 추정과 추적된 동물 위치를 확률 기반 지표를 사용하여 개별 동물에게 USV를 할당하는 것을 지원합니다. 발성 할당은 이전에 모호했던 집단 음성 녹음을 라벨링된 동물음성 데이터로 변환하여 발성 유형과 타이밍을 행동 및 이후 종 간 행동과 연결하는 정량적 분석을 가능하게 합니다. 본 연구의 목적은 이전에 정량화되고 검증된 이 방법을 구현하기 위한 상세한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 다음 프로토콜은 이 시스템의 설정, 보정 및 구현을 개략적으로 설명하며, 마이크 배열 기하학, 오디오-비디오 동기화, 자동 음향 감지 및 확률적 출처 추정, 다중 동물 위치 추적, 그리고 방출 동물에게 USV를 귀속시키는 데 사용되는 할당 절차를 포함합니다 7,15.

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프로토콜

동물이 관련된 모든 프로토콜은 델라웨어 대학교 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호: 1275)의 승인을 받았으며, 국립보건원(NIH) 지침에 따라 수행되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 음원 위치 추적 장비 구축

  1. 기록실 준비해.
    1. 녹음 공간 역할을 하는 직육면체 프레임(76.2 cm × 76.2 cm × 61 cm; 너비 × 길이 × 높이)를 조립하여 음향 차단 공간에 넣습니다.
    2. 벽을 만들 때는 나일론 메시를 사용하고, 외벽에는 음향 폼을 깔아 소리 반사를 줄이세요.
    3. 녹음실 외부, 하지만 근처에 온도계를 놓아 녹음 시 주변 온도를 모니터링하세요.
    4. 모든 녹음은 어두운 환경에서 수행하세요.
      참고: 녹음 세션 전반에 걸쳐 안정적인 환경 조건을 유지하고 환경 매개변수를 기록하세요.
  2. 비디오 및 오디오 녹화 시스템을 설정하세요.
    1. 경기장 위에 적외선 조명을 설치해 어둠 속에서도 비디오 녹화를 가능하게 하세요.
    2. 경기장 위에 비디오 카메라를 설치하고 30Hz로 연속 녹화하도록 설정하세요.
    3. 오디오 획득 시스템을 구성하여 8채널 마이크 배열에서 250 kHz의 샘플링 속도로 초음파 신호를 녹음하도록 설정하세요.
      참고: 이 시스템에는 8개의 마이크가 사용되었으나, 실험적 필요에 따라 마이크 수를 조절할 수 있습니다.
    4. 공유 외부 트리거를 사용해 영상과 오디오 녹화를 동기화하여 시간적 정렬을 보장합니다.
    5. 비디오와 오디오 데이터가 동시에 녹화되고 각 세션마다 저장되는지 확인하세요.
      참고: 하드웨어와 획득 소프트웨어는 각각 재료표 와 표 1에 나열되어 있습니다.
  3. 마이크와 경기장을 배치하세요.
    1. 경기장 벽을 따라 마이크를 고르게 배치하세요(벽당 두 개).
    2. 마이크 센터는 각 모서리에서 38.1cm, 각 모서리에서 19.05cm, 경기장 바닥에서 10.8cm 높이에 위치하세요.
    3. 마이크 위치를 시각적으로 표시하여 나중에 보정 및 검증을 쉽게 할 수 있습니다.
      참고: LED는 마이크 위치를 표시하는 데 사용될 수 있습니다.

2. 사회적 행동 기록을 위한 준비

  1. 실험 동물을 준비하세요.
    1. 녹화할 마우스를 선택하세요. 여기서는 기록 당시 8주에서 12주 사이의 수컷 2마리와 암컷 2마리의 C57BL/6J 마우스 그룹을 사용했습니다.
      참고: 현재 실험 패러다임에서 생쥐의 균주, 성비, 연령대, 기록일수는 다양한 실험 목표에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 방법의 시연을 위해 실험용 쥐 일부를 이틀 동안 기록하는 동안 재사용했다. 12주 이상 된 C57BL/6J 쥐는 고주파 소리에 대한 민감도가 감소할 수 있습니다.16.
  2. 동물들을 집에 두세요.
    1. 녹화 전 14일 동안 각 쥐를 개별적으로 보관하세요.
      참고: 개인 주택은 이전 사회적 경험이 집단 상호작용에 미치는 영향을 최소화합니다.
    2. 각 우리마다 침구, 풍부한 환경, 그리고 자유롭게 먹이와 물을 제공하세요.
  3. 동물을 시각적으로 식별할 수 있도록 표시하세요.
    1. 녹화 이틀 전, 밀폐된 챔버에서 정밀 증기기를 사용해 산소에 2.5% 이소플루란을 분당 1L/분의 유량으로 마취시킵니다. 각 쥐가 마취된 후에는 챔버 밖으로 옮겨 등을 닿게 한 채 누워 마취를 마치 코 콘으로 마취합니다.
      참고: 현재 실험 패러다임에서 설명된 마취 프로토콜은 우리 동물 프로토콜에서 승인되었으며 각 마우스에 연속적으로 적용되었으나, 동물이나 실험 목표에 따라 조절 가능합니다.
    2. 각 쥐가 마취 상태일 때, 무독성 염색약을 사용해 등에 고유한 패턴을 발라주어 추적 시 시각적 식별을 가능하게 하세요.
    3. 조염료가 굳는 동안 각 동물을 지속적으로 관찰하며 약 15분간 마취를 유지하고, 마취 지속 시간을 기록하세요.
    4. 각 쥐를 헹구고 데운 회복 케이지에 넣어 완전히 움직일 때까지 보관하세요.
    5. 각 쥐를 깔개, 풍부한 환경, 먹이와 물을 제공하는 깨끗한 개별 우리에 다시 넣으세요.
      참고: 수컷 마우스보다 먼저 암컷 마우스에게 표시를 적용해 수컷 후각 신호가 전달되어 이후 행동에 영향을 줄 수 있습니다.
  4. 이성 노출을 수행하세요.
    1. 녹음 하루 전에는 깔개 없이 깨끗한 우리를 준비하세요.
    2. 각 실험용 쥐마다 동물을 우리에 넣고, 그 뒤에 새로운 성별의 쥐를 넣습니다.
    3. 동물들이 10분간 상호작용할 수 있도록 하세요.
    4. 상호작용을 관찰하고 행동 이벤트를 수동으로 기록하세요.
    5. 노출 후에는 실험 동물을 개별 사육지로 돌려보내세요.
      참고: 이성 노출은 현재 실험 패러다임에 특수하며, 이후 그룹 녹음 중 음성 행동 가능성을 높인다17; 하지만 기술에 반드시 필요한 요소는 아닙니다. 교미 행동이 관찰되면 동물을 분리하세요.
  5. 암컷 쥐의 발정 상태를 파악하세요.
    1. 녹화 약 2시간 전, 암컷 쥐의 발정 상태를 평가하세요(암컷 피험자를 사용한 경우).
    2. 30 μL 인산염 완충 식염수를 사용하여 질 세척을 시행합니다.
    3. 세척 샘플을 깨끗한 현미경 슬라이드에 옮기고 고르게 펴 바르세요.
    4. 슬라이드가 완전히 마를 때까지 기다려 주세요.
    5. 각 슬라이드에 크리스탈 바이올렛 스테인을 바르고, 피펫으로 물로 부드럽게 씻어내세요.
    6. 광미경으로 슬라이드를 검사하세요.
    7. 발정 상태를 핵화된 상피세포, 각질 상피세포, 백혈구의 상대적 비율을 기준으로 분류한다18.
    8. 각 여성의 발정 상태를 기록하세요.
      참고: USV가 발정기19, 20 동안 여성의 수용성에 영향을 줄 수 있으므로, 발정 상태를 판단하는 것은 현재 실험 패러다임에 따라 다릅니다. 하지만 기술에 반드시 필요한 요소는 아닙니다.

3. 사회적 상호작용 녹음

  1. 녹음 구역 준비해.
    1. 경기장 바닥에 흰 종이 기반 침구를 약 1.25cm 깊이로 균일하게 추가하세요.
    2. 침구가 모든 모서리를 고르게 덮도록 하세요.
    3. 모든 마이크가 정렬되어 있고, 방해받지 않으며, 경기장 쪽으로 향하는지 확인하세요.
    4. 실험 녹화 전에 자와 고대비 물체를 경기장 중앙에 놓아 카메라 초점을 확인하고 공간적 스케일링을 확립합니다.
    5. 행동 기록을 시작하기 전에 보정 객체를 제거하세요.
      참고: 흰 종이 기반 깔구는 어두운 털을 가진 동물에게 대비를 제공하여 추적을 용이하게 합니다. 털이 더 밝은 동물을 사용할 경우, 검은색 종이 깔개가 추적에 도움이 될 것입니다. 녹화 시간이 길어지면 경기장에 음식과 물을 추가하세요. 자에 북/남 및 동/서 방향 표시를 추가하면 8개의 마이크를 식별하기 쉽습니다.
  2. 사전 동작 시스템 녹화를 수행하세요.
    1. 행동 기록 직전에 적외선을 켜고 배경 소음을 15초씩 녹음하세요.
    2. 적외선 조명을 끄고 마이크 표시등을 켜고 마이크 위치 측정 테스트를 15초간 녹화하세요.
    3. 모든 사전 동작 기록은 시스템 성능 검증을 위해 저장하세요.
      참고: 이 녹음들은 마이크 기능과 기본 잡음 수준을 검증하는 데 사용됩니다. 녹음에 사용되는 스크립트는 관련 코드 저장소에서 확인할 수 있습니다.
  3. 집단의 사회적 행동을 기록하세요.
    1. 데이터 수집 전에 동물과의 상호작용을 최소화하기 위해 모든 기록 설정을 미리 준비하세요.
    2. 암컷 쥐들을 경기장에 배치하세요.
    3. 수컷 쥐들을 경기장에 배치하세요.
      참고: 같은 성별 동물을 여러 마리 녹화할 때는 두 동물을 동시에 배치하세요.
    4. 우리를 닫고 녹음을 시작하세요.
    5. 10분 동안 집단 사회적 행동을 연속적으로 기록하세요.
      참고: 녹화 시간은 조절 가능합니다.
    6. 비디오 및 오디오 파일이 읽을 수 있고 손상되지 않았는지 사전 처리를 반드시 확인하세요.
    7. 녹화가 끝나면 한 마리를 제외한 모든 동물을 제거하세요.
  4. 개별 동물을 기록하세요.
    1. 남은 쥐를 경기장에 혼자 10분간 녹화하세요.
    2. 남은 쥐 각각에 대해 개별 녹음을 반복하세요.
    3. 개별 녹음 후 즉시 각 마우스의 무게를 재세요.
      참고: 개별 녹음은 다중 동물 추적 훈련과 검증에 사용됩니다. 각 녹음 세션 전에 장비 내부의 온도를 기록하세요. 온도는 소리 전파에 영향을 미치기 때문입니다. 영상이나 오디오 파일이 손상되거나 불완전하면 녹화 세션을 반복하세요.

4. 비디오 전처리

  1. 영상 파일을 준비하세요.
    1. 모든 비디오 녹화물이 실험과 연관된 단일 디렉터리에 저장되어 있는지 확인하세요.
  2. 트래킹을 위해 영상 강도를 조절하세요.
    1. 필요하다면 각 픽셀에 일정한 값(brightness_adjustment x 255)을 추가하여 모든 비디오 프레임에 균일한 밝기 조정을 적용할 수 있으며, 여기서 brightness_adjustment 스칼라는 조명 조건에 따라 일반적으로 0.1에서 0.6 사이입니다.
    2. 필요하다면 정의된 입력 범위(예: [0.2, 0.8])에 대해 강도 리매핑(예: MATLAB의 imadjust 함수)을 사용하여 전역 대비 조정을 적용하여, 최대 픽셀 강도의 20%를 검은색으로, 최대 강도의 80%를 흰색으로 매핑하고 선형 중간 값을 스케일링합니다. 이 단계는 밝은 색 식별 표시와 배경 사이의 분리를 높이기 위해 수행됩니다.
    3. 클립 픽셀 세기를 비디오 비트 깊이의 유효 범위(예: 8비트 비디오의 경우 0부터 255까지)로 맞추세요.
      참고: 일관성을 보장하기 위해 녹화 내 모든 프레임과 녹화 간에 동일한 전처리 매개변수를 적용해야 합니다. 이러한 조정은 선택 사항이며 녹화 조건에 따라 달라집니다. 여기 제시된 대표 데이터에는 밝기나 대비 조정이 적용되지 않았습니다. 조정이 필요할 때는 전체 영상을 처리하기 전에 동물과 경기장 간의 적절한 대비를 확인하기 위해 처리된 첫 프레임을 미리 검토해야 합니다.
  3. 사전 처리된 영상을 내보내세요.
    1. 원본 녹화와 동일한 프레임 속도와 시간 정렬을 사용하여 사전 처리된 비디오 파일을 저장하세요.
    2. 원본 영상 파일을 참고 및 검증을 위해 보관하세요.
      참고: 비디오 전처리에 사용되는 스크립트와 적용된 특정 매개변수 값은 관련 코드 저장소에서 확인할 수 있습니다.

5. 다중 동물 추적

  1. 추적 소프트웨어와 데이터를 준비하세요.
    1. 다동물 추적 소프트웨어와 필요한 모든 의존성을 설치하세요. 이 연구는 MOuse TRacker(MoTR; 표 1) 출력 형식이 사운드 소스 위치 계산에 사용되는 또 다른 파이프라인 소프트웨어인 Muse(표 1)와 호환되기 때문입니다21.
      참고: Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP)22 또는 DeepLabCut23과 같은 다른 자동 추적 소프트웨어도 동물의 위치, 방향, 코 위치를 생성하는 한 동물을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.
    2. 사전 처리된 비디오 파일을 정리하여 단일 동물 녹화와 다중 동물 녹화가 명확히 구분되도록 하세요.
    3. 모든 비디오 파일이 일정한 프레임 레이트와 공간 해상도를 갖추는지 확인하세요.
      참고: 소프트웨어 설치 지침과 의존성 요구사항은 관련 코드 저장소에 제공됩니다.
  2. 단일 동물 모델을 훈련시키세요.
    1. 각 실험 대상에 해당하는 단일 동물 기록을 선택하세요.
    2. 각 동물의 단일 동물 기록에서 추출한 특징을 사용해 별도의 정체성 분류기를 학습시킵니다. 그룹 기록 중에는 동물별 분류기 출력과 프레임 간 궤적 정보가 결합되어 동물 정체성을 유지합니다.
    3. 교육이 성공적으로 완료되었는지 확인한 후 진행하세요.
      참고: 단일 동물 기록은 다중 동물 세션에서 정체성 특화 추적을 초기화하는 데 사용됩니다.
  3. 다동물 기록을 녹음하세요.
    1. 훈련된 추적 모델을 다동물 사회적 상호작용 기록에 적용하세요.
    2. 각 피실험체별로 동물의 위치, 방향, 체형을 프레임별로 추정해 보세요.
    3. 추적 결과는 후속 분석용으로 저장하세요.

6. 음향 세분화

  1. 오디오 데이터를 준비하세요.
    1. 각 마이크 채널의 모든 오디오 녹음이 존재하고 접근 가능한지 확인하세요.
  2. 발음 감지.
    1. 각 녹음에 대해 음향 분할 소프트웨어인 Ax(표 1)를 실행하여 USV를 감지합니다.
    2. Ax가 고려하는 입력 파일에 정의된 시간-주파수 매개변수를 구성합니다. 마이크 샘플링 주파수는 250 kHz로 설정되었습니다.
      참고: 비균일 고속 푸리에 변환을 위한 윈도우 크기는 64, 128, 256 샘플 중 세 가지였습니다. 5개의 테이퍼를 가진 다중 테이퍼 시간-대역폭 곱 3과 유의의 임계값 0.05가 적용되었습니다. 최소 지속 시간은 0 샘플을 사용했으며, 저주파 컷오프는 30 kHz, 고주파 컷오프는 110 kHz였습니다. 합성곱 크기는 1001 Hz 0.001초를 포함하도록 설정되었습니다. 조화와 관련된 신호를 통합하기 위해 깃발이 포함되었습니다. 구체적인 내용은 Neunuebel 외 7을 참조하세요.
    3. 이러한 시간-주파수 특징을 바탕으로 후보 USV를 추출합니다.
    4. 세분화 출력을 각 녹화마다 스프레드시트로 저장하세요.
      참고: 소프트웨어 설치 지침, 스크립트 및 매개변수 설정은 관련 코드 저장소7에 제공됩니다.
  3. 세분화 출력을 컴파일하세요.
    1. 발현 시간, 오프셋 시간, 빈도 경계를 포함한 감지된 발성 사건의 통합 목록을 생성합니다.
    2. 통합 음성 파일을 저장하여 하위 위치 분석에 활용하세요.

7. 음원 위치 추적

  1. 입력 자료를 현지화할 준비하세요.
    1. 각 녹음마다 음향 분할 출력과 다중 동물 추적 결과가 있는지 확인하세요.
    2. 현지화 입력을 정리하여 오디오 데이터, 트래킹 데이터, 경기장 지하학 정보를 로컬라이제이션 소프트웨어에 접근할 수 있도록 하세요.
      참고: 입력 파일을 배열하고, 필요한 디렉터리 구조를 정의하며, 아레나 기하학 정보를 수집하는 데 사용되는 스크립트는 관련 코드 저장소에 제공됩니다.
  2. 음원 위치를 추정하세요.
    1. 각 감지된 발성에 음원-위치 추적 알고리즘인 MUSE(표 1)를 적용합니다.
    2. 마이크 배열 녹음을 사용해 경기장 내 각 보컬의 공간적 기원을 추정합니다.
    3. 각 발성에 대해 잭나이프 리샘플링을 사용해 위치 측정 절차를 8번 반복하며, 각 추정치는 남은 7개의 마이크를 기준으로 합니다. 이로 인해 발성당 8개의 추정치가 생성됩니다.
      참고: 마이크 간 도착 시간 차이는 음원 위치를 추정하는 데 매우 중요합니다. 잭나이프 리샘플링은 위치 추적 신뢰성을 평가하고 개별 마이크 채널에 대한 민감도를 낮추는 데 사용됩니다. 사운드 소스 위치를 추정하는 데 사용되는 스크립트는 관련 코드 저장소7에 제공됩니다.
  3. 음원-위치 확률 분포를 계산합니다.
    1. 각 발성에 대해 공분산 행렬24를 계산하고, 이 행렬과 평균 잭나이프 포인트 추정치를 사용해 경기장 바닥 전역의 확률 밀도를 계산합니다.
  4. 국지화와 동물 위치를 통합하세요.
    1. 각 발성 시 모든 동물의 머리 또는 코 위치를 추적해 추출합니다.
    2. 각 발성에 대해 각 동물의 코 위치에서 위치 확률 밀도를 평가합니다.
    3. 각 발성에 대해 확률 값을 기반으로 각 동물에 대한 할당 신뢰도 지표를 계산합니다. 할당 신뢰도 지표는 각 동물의 코 밀도 값을 모든 동물의 밀도 값 합으로 나눈 값으로 계산됩니다. 이 지표를 쥐 확률 지수(MPI)라고 부릅니다.
  5. 발성(vocalization)을 할당하세요.
    1. 단일 마우스의 할당 신뢰도 지표가 0.95를 초과하면, 신호는해당 마우스에게 할당됩니다.
    2. 할당 기준에 부합하지 않는 발음은 할당되지 않은 것으로 라벨링하세요.
    3. 로컬라이제이션 및 할당 출력을 저장하여 하위 검증 및 분석을 수행하세요.
      참고: 할당 임계값, 신뢰 기준 및 코드는 관련 분석 스크립트에 제공됩니다.

8. 결과 검증

  1. 다중 동물 추적 검증.
    1. 각 녹음마다 최종 트래킹 출력을 로드하세요.
    2. 동물의 위치와 몸체 형태를 해당 영상 프레임에 오버레이하여 추적했습니다.
    3. 정확한 마우스 위치와 프레임 간 일관된 식별 할당을 확인하기 위해 추적 결과를 육안으로 점검하세요.
      참고: 추적 결과에는 각 비디오 프레임의 각 마우스에 머리 방향을 나타내는 색상 구분된 타원이 겹쳐져 있습니다. 타원 크기와 몸체 방향은 각 프레임에서 마우스 크기와 방향에 각각 일치해야 합니다. 녹음 내내 각 마우스마다 타원 색상이 일관되어야 합니다.
    4. 추적 오류를 식별하고 수정하세요.
      보정된 추적 출력은 후속 분석을 위해 저장하세요.
      참고: 일반적인 추적 오류는 가까운 사회적 상호작용이나 경기장 경계 근처에서 발생합니다. 머리-꼬리 뒤집기, 정체성 전환, 타원 점프와 드리프트 등 모든 경우를 교정하세요.
      참고: 출력 추적 및 오류 수정 프로그램은 코드 저장소에 제공됩니다.
  2. 발성 추출을 검증하세요.
    1. 각 녹음마다 음향 분할 출력을 로드하세요.
    2. 대표적인 시간 창을 위해 원시 오디오 데이터를 통해 스펙트로그램을 생성합니다.
    3. 오버레이는 개별 발성 시간과 주파수 범위를 포함한 발성 이벤트를 스펙트로그램에 감지했습니다.
    4. 검출된 사건과 스펙트로그램에서 관찰된 발성 간의 상관관계를 시각적으로 확인합니다.
    5. 체계적인 오류가 관찰된 경우, 추출 및 국소화 단계를 다시 실행하기 전에 분할 매개변수를 조정하거나, 분절 오류(예: 발성 시간이나 주파수 범위의 오식별)를 수동으로 조정하세요.
  3. 발성 할당을 검증하세요.
    1. 사운드 소스 위치 및 할당 출력을 불러와.
    2. 각 발성에 대해 위치 추정치, 공간 확률 분포, 동물 위치를 비디오 프레임 위에 시각화하세요.
    3. 위치 확률 밀도가 지정된 동물의 머리 근처에 집중되어 있으며 다른 동물과 명확히 구분되어 있음을 확인하세요.
    4. 할당 기준에 부합하지 않는 발음이 할당되지 않은 것으로 표시되어 있는지 확인하세요.
      참고: 할당 출력 검사에는 모든 예상 출력이 생성되었는지, 각 발성에 대한 확률 지도가 발성에 할당된 마우스 주변과 경기장 경계 내에 위치하는지 확인하는 것이 포함됩니다.
    5. 검증된 과제 결과를 저장하여 후속 분석을 수행하세요.
      참고: 할당 신뢰 임계값과 검증 기준은 관련 분석 스크립트에서 정의되어 있습니다.

9. 데이터 분석

  1. 음원과 위치 파악을 시각화하세요.
    1. 단일 또는 다수의 동물 녹음 세션에서는 발음이 감지되는 영상 프레임을 선택하세요.
    2. 선택된 비디오 프레임의 도식화된 표현을 생성하세요.
    3. MUSE 출력에서 모든 마이크의 위치, 개별 음원점 추정치, 추정된 음원 위치, 공간 확률 분포, 마우스 위치, 추정된 보컬라이저 식별자, 그리고 스케일 바를 표시하여 공간 회로도를 생성합니다.
    4. 각 마이크 채널에서 녹음된 해당 음성 스펙트로그램을 생성합니다.
      참고: 이 시각화들은 개인 및 집단 맥락 모두에서 현지화 성과를 정성적으로 평가하는 데 유용합니다.
  2. 위치 오류와 정밀도를 정량화하세요.
    1. 추정된 음원 위치와 기록된 동물의 위치 간 거리를 계산하여 위치 파악 오류를 정량화합니다. 이 계산에는 단일 마우스 녹화를 사용하세요. 발신기는 하나뿐이고 소스도 알려져 있기 때문입니다.
    2. 할당 정밀도를 평가하기 위해, 음원 추정치와 해당 동물 위치를 소리를 내는 동물을 중심으로 한 기준 프레임으로 변환합니다.
    3. 중심 동물 위치에 대한 음원 추정치의 공간적 분포를 시각화하세요.
  3. 스펙트로그램을 생성해 발성을 시각화하세요.
    1. 보컬라이저 정체, 발성 시작 및 오프셋 시간, 고주파 및 저주파 경계를 포함하는 음성 추출 출력을 사용하여 관심 있는 발성 구간을 식별합니다.
    2. 각 경기에서 첫 발음이 시작되기 전부터 마지막 발음 오프셋 이후까지의 시간창을 선택하세요.
    3. 선택한 시간 창에 대해 오디오 채널 파일에서 전압 트레이스를 추출하세요.
    4. 추출한 전압 트레이스를 시간 영역에서 주파수 영역으로 변환하여 스펙트로그램을 생성합니다.
    5. 스펙트로그램에 할당된 음성과 할당되지 않은 음성에 해당하는 시간 지점을 서로 다른 색상으로 표시하세요.
    6. 사회적 상호작용 세션에서는 서로 다른 개인이 만들어낸 발성 구분을 식별하고, 정체성별 색상으로 음성 식별자를 나타내는 스펙트로그램을 생성합니다.
  4. 개인별로 음성 출력을 수치화하세요.
    1. 음원 위치 코드의 출력을 사용하여 각 발성에 식별 라벨을 부여하여, 비국소화, 국소화되지만 할당되지 않은 개별 동물 정체성을 숫자로 인코딩합니다.
    2. 각 동물이 내는 소리 수를 합산하세요.
    3. 개인별 및 성별 간 발성 수를 비교하세요.
  5. 성악 특성을 분석하세요.
    1. 각 보컬에 대한 주파수 윤곽을 추출하세요.
    2. 최대 주파수, 최소 주파수, 평균 주파수, 대역폭, 음성 지속 시간과 같은 음성 매개변수를 정량화합니다.
    3. 성별 간 음성 수치를 비교하세요.
    4. 데이터의 분포 특성을 바탕으로 적절한 통계 분석을 수행하세요.
      참고: 측정된 변수의 모수적 특성에 맞는 통계 방법을 선택하세요. 여기서는 피험자 수가 너무 적어 통계적 비교가 불가능하다.

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결과

이 글에서 제시된 결과는 2일간 진행된 녹음에서 나온 것으로, 원래 Warren 등에 발표된 프로토콜의 결과물을 설명하기 위한 것입니다. 이 데이터는 통계적 추론이나 일반화된 결론을 뒷받침하기 위한 것이 아닙니다.

USV의 탈출 및 배치
USV는 마이크 배열 위치 추적 시스템을 사용하여 개인 및 그룹 사회적 상호작용 세션 모두에서 녹음되었습니다. 각 사회적 상호작용 세션 동안 남성 2명과 여성 2명이 기록되었습니다. 총 기록은 2일간 진행되었으며, 기록된 동물들의 신원은 표 2에 제공되어 있습니다. 사회적 세션에서 2,783마리의 USV가 추출되었으며, 이 중 2,773마리(99.6%)가 국소화되었고, 1,636마리가 개별 쥐(58.8%)에 할당되었습니다. 나머지 1,137개의 국지화 신호는 할당 기준을 충족하지...

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토론

집단 상호작용 중 개별 동물에게 USV를 신뢰성 있게 귀속시키는 것은 쥐 음성 통신 연구에서 주요 기술적 한계였습니다. 쥐는 사회적 의사소통 연구에 널리 사용되지만, 특정 개체에게 발성을 할당할 수 없기 때문에 자연주의적 사회적 환경에서 음성 행동에 대한 정량적 분석이 제한적입니다. 따라서 동물 특이적 발성 추적을 사회적 상호작용 중 가능하게 하는 방법은 자유롭게 상호작용하는 쥐의 발성 연구에 필수적입니다.

이 글은 개별 동물을 추적하고, USV를 추출하며, 자유롭게 상호작용하는 사회적 세션 중 특정 쥐에게 음성 신호를 할당하는 체계적이고 검증된 프레임워크를 제시합니다. 비디오 기반 트래킹과 음성 추출, 위치 파악, 할당을 결합함으로써 이 접근법은 행동 및 음향 데이터의 정확한 시간적 정렬을 가능하게 합니다. 결과된 데이터셋은 발성 타이밍, 음향 구조, 동물 특유 음성 출력에 대한 정량적 분석을 지원하며, 파이프라인의 ...

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

동물 관리를 위해 델라웨어 대학교 생명과학연구시설 직원들, 실험실 장비 제작을 지원해 준 짐 파머와 제이미 퀘센베리, 컴퓨팅 클러스터 유지 관리를 지원해 준 델라웨어 대학교 고성능 컴퓨팅 그룹에 감사드립니다. 데이터 수집에 도움을 준 Andre Yichong Ma에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH의 지원으로 지원받았으며, 보조금 번호는 R01MH122752과 T32GM142603입니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알파-드라이 침구셰퍼드 스페셜티 페이퍼스알파-드라이음원 위치 파악 시스템에 필요
알루미늄 압출8020녹음 경기장에 맞게 맞춤 제작음원 위치 파악 시스템에 필요
BNC-2110내셔널 인스트루먼트777643-01음원 위치 파악 시스템에 필요
투명 아크릴 패널홈 디포MC-24음원 위치 파악 시스템에 필요
CM16/CMPA40-5V아비소프트40014음원 위치 파악 시스템에 필요
컴퓨터휴렛 패커드Z620음원 위치 파악 시스템에 필요
그래스호퍼 3FLIRGS3-U3-41C6M-C음원 위치 파악 시스템에 필요
IR 조명GANZIR-LT30음원 위치 파악 시스템에 필요
NI PXIe-1073내셔널 인스트루먼트781161-01음원 위치 파악 시스템에 필요
NI PXIe-6356내셔널 인스트루먼트781053-01음원 위치 파악 시스템에 필요
나이스 앤 ‘쉬 보른 블론드 맥시클레롤2523721음원 위치 파악 시스템에 필요
케이지 벽용 나일론 메쉬맥마스터-캐러9318T25음원 위치 파악 시스템에 필요
전원 코드내셔널 인스트루먼트763000-01음원 위치 파악 시스템에 필요
SCHC68-68-EPM내셔널 인스트루먼트192061-02음원 위치 파악 시스템에 필요
소넥스 폼핀타 어쿠스틱VLW-35음원 위치 파악 시스템에 필요
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참고문헌

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