인간과 설치류가 분리한 췌장 섬을 자동으로 이미지 기반 정량화하는 웹 플랫폼

요약

이 프로토콜은 딥러닝 보조 이미지 분석과 시각적 품질 관리를 활용하여 분리된 인간 및 설치류 췌장 섬의 표준화된 샘플링, 염색, 이미지 획득 및 자동 웹 기반 정량화를 설명합니다.

초록

이 출판물의 목적은 IsletNet이라는 웹 기반 플랫폼의 표준 사용을 위한 서면 및 실사 영상 단계별 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이는 샘플링과 이미지 수집, 이미지 업로드, 시각적 검증, 자동 보고서 생성에 이르기까지 이미지 내 고립된 췌장 섬의 자동 정량화를 위한 웹 기반 플랫폼입니다. 이 플랫폼은 임상적 및 실험적 섬 분리 워크플로우를 지원하기 위해 분리된 췌장 섬의 2차원 현미경 이미지를 표준화되고 자동화하여 평가하기 위해 개발되었습니다. 딥러닝 기반 이미지 분할은 이미지 분석을 위해 윤곽선을 추출하는 섬과 외분비 조직을 식별하는 데 사용됩니다. 계산 알고리즘은 이후 섬 개수, 부피, 순도를 정량화합니다. 시각적 품질 관리 도구는 사용자가 부적절한 이미지를 수락, 수동으로 수정하거나 제외할 수 있도록 하여 자동 이미지 분석의 전문가 검증을 지원합니다. 임상 섬 분리 모듈은 순도 분획 배치 분석을 지원하며, 자동 PDF 보고서와 함께 다운로드 가능한 이미지 및 표 형식 데이터 파일을 생성하여 기록 보관 및 분석을 지원합니다. Simple Comparison 모듈은 자동화된 추정치와 해당 샘플 이미지가 포함된 현지 참조 결과와 비교하여 지역 표준화된 이미지의 자동 분석 적합성을 평가합니다. 프로토콜은 또한 필요할 경우 국내에서 생성된 표준화된 이미지를 사용해 재학습할 수 있는 권고사항도 제시합니다. 설치류 및 인간 섬 분리에서 나온 대표적인 데이터, 특히 도전적인 사례들은 적절한 훈련 후 자동화 분석 성능이 향상되었음을 보여줍니다.

서론

당뇨병 환자에게 분리된 췌장 섬을 이식하면 외부 인슐린 투여의 필요성을 줄이거나 없애줍니다^. 시체 기증자나 생체 기증자로부터 섬을 분리하는 과정은 생물학적 및 절차적 이질성에 영향을 받으며, 이는 수확량과 품질의 차이로 반영됩니다. 총 섬 부피는 이식 적합성과 관련된 선량 결정 및 임상 의사결정에 주요 입력 자료입니다². 섬 크기 히스토그램과 섬 지수 숫자는 크기 관련 효과의 차이를 설명합니다³. 따라서 현재 베타 세포 함량의 대체 지표로 사용되는 전체 부피 외에도 개별 섬에도 주의를 기울입니다. 고립된 인간 섬은 설치류 섬보다 밀도가 낮으며, 외분비 조직과 잘 분리되지 않은 경우가 많습니다. 따라서 얼룩이 없으면 구별하기 더 어렵습니다. 디티존을 이용한 빠르고 간단한 아연 염색 방법이 채택되었으며, 이 방법은 아연 강화된 인슐린 과립에서 강한 적색광을 반사하는 방식^입니다. 조직의 불투명성 때문에 표면에서 반사된 빛만 수집하여, 광원과 카메라가 장착된 간단한 입체 현미경 또는 역현미경 기기를 사용할 수 있습니다.

디지털 이미지 분석 도구 5,6,7,8,9,10,11,12를 사용하여 실험실 간 변동을 줄이려는 수많은 시도가 있었으나, 이러한 접근법에는 여러 한계가 있습니다. 이 방법들에서 섬과 외분비 조직의 분할은 수동 임계값 측정에 의존하는데, 이는 주관적 오차 5,6,7,8,9,10에 취약하며, 완전 자동화된 분할 접근법 ^11,12를 사용합니다. 또한, 로컬 소프트웨어 설치는 종종 5,6,7,8,9,10,11 이 요구되며, 특정 하드웨어 ^10,11에만 제한되어 일반적인 접근성과 표준화가 제한됩니다.

본 출판물의 전반적인 목표는 웹 기반 딥러닝 플랫폼을 통해 인간 전문가의 감독 하에 이미지 내 고립된 췌장 섬을 자동으로 정량화하는 표준화된 워크플로우를 제공하는 것입니다. IsletNet 은 Islet 이미지 분석의 가용성과 신뢰성 모두에 관련된 한계를 해결합니다. 이 글에서는 섬 이식편 샘플링, 적합한 현미경 이미지 생성, 그리고 IsletNet 도구를 올바르게 사용하는 권장 지침을 제시합니다. 프로토콜은 자동 생성된 결과에 대한 인간의 감독 개념을 도입하고, 잠재 및 기존 사용자를 위한 워크플로우를 제시합니다(그림 1). Simple Comparison 도구는 예비 사용자가 IsletNet 결과를 현지에서 얻은 참조 방법과 직접 비교할 수 있게 합니다(그림 1A). 지역에서 생성된 표준화된 이미지가 센터마다 크게 다를 수 있기 때문에, IsletNet 은 신뢰할 수 있는 분석을 달성하기 전에 재학습이 필요할 수 있습니다(그림 1B). 이 과정을 원활하게 하기 위해 표준화된 염색 및 이미지 획득에 대한 권고안이 제공됩니다. 기존 사용자들을 위해 임상 섬 격리 도구는 인간 섬 분리 워크플로우를 지원하도록 설계되었습니다(그림 1C). 다운로드 가능한 보고서와 IsletNet 이 생성한 추가 표 및 시각화는 표 1에 설명되어 있으며, 주요 계산 매개변수는 표 2에 요약되어 있습니다.

그림 1: 플랫폼의 예비 및 기존 사용자를 위한 워크플로우. (A) Simple Comparison 모듈을 이용한 로컬 검증 워크플로우. (B) 재훈련은 국소적으로 표준화된 이미지를 나타내는 집합을 필요로 합니다. (C) 임상 섬 격리 모듈을 이용한 일상 사용 워크플로우. 이미지 업로드, 분석, 시각적 품질 관리(vQC), 보고서 생성에 대한 주요 워크플로우 단계가 요약되어 있습니다. 스케일 바는 적용되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1: 플랫폼에서 생성한 다운로드 가능한 결과 파일. Clinical Islet Isolation 및 Simple Comparison 도구로 생성된 다운로드 가능한 출력 파일 목록으로, 파일 형식과 출력 카테고리별로 그룹화되어 있습니다. 표에는 보고서 파일, 분할된 이미지 출력, 시각화 파일, 그리고 아슬렛 수, 부피, 순도, 히스토그램 분석을 위한 스프레드시트 내보내기가 포함되어 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2: 다운로드 가능한 보고서 및 스프레드시트 출력에 포함된 주요 매개변수. 임상 Islet Isolation 및 Simple Comparison 도구에서 생성된 다운로드 가능한 XLSX 및 CSV 파일에 포함된 메타데이터, 사용자 정의 설정, 정량적 분석 매개변수의 상세 목록. 매개변수에는 세션 메타데이터, 이미지 획득 설정, 이미지 및 개별 섬의 아슬렛 정량화 지표가 포함됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

프로토콜

동물 시술은 체코 보건부(승인번호 49/2023)에서 유럽공동체 이사회 지침 86/609/EEC에 따라 승인되었습니다. 인간 섬 분리 및 사용 절차는 미국 약물 통제 연구소(State Institute for Drug Control)에서 승인되었습니다(승인 번호 sukls111286/2023). 쥐 및 인간 섬 준비물의 표준화된 현미경 이미지를 Simple Comparison 및 Clinical Islet Isolation 도구를 사용해 자동 분석과 수동 계수 분석을 비교하였습니다. 표준(짧은) 변환표¹³ 은 수동 및 자동 섬 상당 계산에 모두 사용되었습니다.

1. 인간 감독

1. 예비선거 결과의 초기 시각 (그림 2)
   1. 자동 생성된 아슬렛 수, 부피, 순도 값과 해당 자동 주석(예: 윤곽선 또는 세그멘테이션)의 그래픽 시각화가 배치 결과 창에 나타나기를 기다립니다.
   2. 왼쪽 정보 패널(그림 2A)에서 현재 샘플 이미지의 요약 결과를 확인할 수 있습니다.
   3. 오른쪽 표에서 복제 값(그림 2B)과 배치 평균(그림 2C)을 볼 수 있습니다.
   4. 이미지 미리보기(그림 2D,E)를 참고하여 링크(그림 2F)를 탐색하세요. 이미지 미리보기를 우클릭하고 팝업 메뉴를 따라 필요하면 한 장의 이미지를 다운로드할 수 있습니다.
   5. 탐색 화살표(그림 2G)를 사용해 샘플 이미지를 탐색하거나 표에서 직접 선택할 수 있습니다.
   6. 현재 이미지 미리보기(그림 2D) 안에서 검사 창을 열어 자동으로 생성된 윤곽선의 품질을 평가하고 결과를 검증하세요.
2. 시각적 품질 관리
   1. 이미지 주변을 움직여 확대(그림 3A)를 확대하여 윤곽선에 오류가 있는지 점검하세요.
   2. 등고선(집계된 섬에만 포함됨), 원본 이미지, 추가 시각화 뷰 사이를 전환하세요.
      참고: 사용 가능한 뷰는 창 오른쪽의 범례(그림 3B)에 나열되어 있으며, 키보드 단축키나 상단 내비게이션 바의 링크를 통해 접근할 수 있습니다(그림 3C; 표 3).
   3. 윤곽이 적절하면 아래쪽 화살표 키를 눌러 다음 이미지로 넘어가세요(표 3).
   4. 가능하면 수작업으로 윤곽 오류를 수정하세요. 감지되지 않거나 부분적으로 감지되었거나 가짜 섬이 남아 있으면 이미지를 무효로 분류하고 분석에서 제외합니다.
      참고: 제외된 이미지는 배치 결과 창(그림 2J)과 다운로드된 모든 파일에 표시되어 있습니다.
3. 수정 가능한 오류: 분리되지 않은 인접 섬들
   1. 필요 시 인접한 섬을 수동으로 분리하세요.
   2. 섬 밖에서 왼쪽 클릭으로 분리선을 시작하세요(그림 3D).
   3. 인접한 섬들 사이의 분리선을 안내하는 중간 왼쪽 클릭을 추가하세요(그림 3E).
   4. 섬 밖에서 우클릭하여 분리선을 완성하세요(그림 3F).
   5. 결과를 업데이트하기 위해 분리선을 제출하세요(그림 3G).
      참고: 필요에 따라 추가된 분리선 시각화를 켜거나 끌 수 있습니다(그림 3H).
4. 수정 가능한 오류: 허위 섬
   1. 분리 도구를 사용해 가짜 섬을 섬 크기 임계값보다 작은 여러 물체로 나누세요.
   2. 미리 정의된 최소 섬 크기 임계값(관례상 50 μm)을 설정하여 작은 섬 조각을 세는 것을 피하세요. 필요하다면 지역 실험실 관행에 따라 임계값을 조정하세요.
   3. 선상의 어느 지점이든 우클릭한 후, 팝업 메뉴에서 수동으로 추가된 분리선 하나 또는 전부를 제거하는 적절한 옵션을 선택하세요(그림 3I).
5. 수정 불가능한 오류: 누락, 부분 분절, 또는 가짜 섬
   1. 분할 뷰를 전환하여 섬들이 감지되었는지 확인하세요.
   2. 배치 평균 계산에서 탐지되지 않았거나 부분적으로 검출되었거나 여러 개의 허위 섬을 포함하는 무효 이미지는 제외합니다(그림 3J).
6. 수정 불가능한 오류: 잘못 분류된 객체
   1. 외분비 조직, 배경 인공물 또는 기포가 잘못 분류된 섬(islet)으로 분류되면 이미지를 평가에서 제외하세요(그림 3J).

그림 2. 배치 결과 창. (A) 현재 샘플 결과 요약. (B) 샘플 이미지 복제 결과. (C) 수락된 이미지에서만 배치 평균값 산출. (D, E, F) 링크가 포함된 그래픽 결과 미리보기. (G) 샘플 항법 화살표. (H, I, J) 수정, 수락 및 제외한 이미지들. (K) IsletNet 상단 내비게이션 바. (L, M) 배치 결과 창 헤더와 푸터. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3. vQC 검사 창과 수동 윤곽 보정. (A) 이미지 줌 디스플레이. (B) 전설과 항해 힌트. (C) 검사 창의 상단 내비게이션 바. (D–G) 인접 섬에 대한 수동 분리선 건설 및 제출. (H) 수동 분리선을 표시하거나 숨기기 위한 토글. (I) 수동 분리선 제거. (J) 통계에서 이미지를 제외하기 위해 토글. 이 인터페이스 뷰에서는 스케일 바가 표시되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 3: 검사 창에서 이용 가능한 보기 모드, 키보드 단축키, 내비게이션 제어. vQC 중 제공되는 이미지 시각화 모드, 키보드 단축키, 내비게이션 기능 요약과 세분화 수작업 검토는 검사 창에서 확인할 수 있습니다. 표에는 윤곽 오버레이, 분할 표시, 히스토그램 시각화, 임상 섬 격리 및 단순 비교 도구에서 사용되는 이미지 내비게이션 제어가 포함되어 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

2. 플랫폼 내비게이션

1. 시청 버전 및 기술 정보
   1. 현재 소프트웨어 버전과 상단 내비게이션 바에 표시된 최신 교육 날짜(그림 2K)를 검토하세요.
   2. 기술 설명과 관련 참고 정보를 보려면 홈 섹션을 열어라.
2. 지역 이미지 예비 평가
   1. 1.2.4 및 1.5.2 단계에서 설명된 오류 기준에 근거해 플랫폼이 이미 로컬 생성 표준화 이미지를 올바르게 분석할 수 있는지, 아니면 지역 표준화 이미지에 대해 재학습이 필요한지 판단합니다(그림 1A 및 1B).

3. 로컬 이미지를 이용한 단순 비교 및 외부 학습

1. 간단한 비교
   참고: Simple Comparison 도구를 사용하여 자동화된 분석 결과를 현지에서 확립된 참조 방법(일반적으로 수동 계산¹³, 대체 표 ^7,11,18 또는 모델 ^5,6)과 비교하세요. 해당 참조 값 및 참조 방법 유형과 함께 현지에서 생성된 표준화된 이미지를 업로드하세요. 결과물에는 다운로드 가능한 표, 이미지, PDF 보고서가 포함되어 있습니다(표 1).
   1. 상단 내비게이션 바에서 Simple Comparison 대시보드를 열어보세요(그림 4A 와 4B).
   2. 필요한 이미지 속성에 대한 힌트 섹션을 검토하세요(그림 4C).
   3. form.xlsx 템플릿(그림 4D)을 다운로드하세요.
   4. 국소에서 확립된 기준 방법을 사용하여 여러 샘플의 섬을 세는 것입니다.
   5. 집계된 샘플에 대응하는 표준화된 현미경 이미지를 획득합니다.
   6. 모든 집계된 섬들이 이미지 프레임 내에 완전히 포함되도록 하세요.
   7. 정확한 이미지 파일명과 해당 매개변수 값을 영어 소수점(그림 4E)을 사용해 form.xlsx 템플릿에 입력하세요.
   8. 완성된 스프레드시트와 해당 이미지 파일을 드래그 앤 드롭 또는 업로드 버튼을 사용해 업로드할 수 있습니다(그림 4F).
   9. 섬 부피 추정에 사용되는 변환표 또는 모델을 선택하세요(그림 4G).
   10. 배치 제출 을 클릭하여 나란히 비교 결과를 생성합니다.
   11. 분석 결과가 나올 때까지 기다려.
   12. 검사 창을 열어 윤곽선을 시각적으로 확인하세요.
   13. 윤곽선이 틀렸다면 이미지를 분석에서 제외하세요(그림 3J).
       참고: 간단한 비교 도구에서는 수동 윤곽 편집이 불가능합니다.
   14. 결과를 표, 이미지, PDF 보고서로 다운로드하세요 (표 1).
2. IsletNet 로컬 표준화 이미지 훈련
   1. info@isletnet.com 실험의학연구소(IKEM) 개발팀에 연락하세요.
   2. 현재 지역에서 얻은 다양한 이미지 품질을 대표하는 이미지를 공유하세요.
   3. 개발팀과 이미지 품질 요구사항에 대해 논의하세요.
      참고: 주요 이미지 품질 기준에는 충분한 명암비, 이미지 프레임 내에 섬이 완전히 포함되어야 함, 인접한 섬들 간의 중첩이 최소화되어야 한다는 점이 포함됩니다. 섬의 색깔은 외분비 조직과의 구분이 명확해야 한다면 빨간색에서 분홍색, 보라색까지 다양할 수 있습니다.
   4. 예상되는 섬 순도, 배율, 색상 변화 범위를 포함하는 훈련 이미지 세트를 만드세요.

그림 4. 간단한 비교 도구, 대시보드 및 워크플로우. (A) 상단 내비게이션 바. (B) 간단한 비교 대시보드. (C) 힌트와 지시사항을 업로드합니다. (D, E) form.xlsx 템플릿 다운로드 및 매개변수 시각화 업로드. (F) 이미지 및 스프레드시트를 드래그 앤 드롭 업로드 영역. (G) 섬 크기에서 부피 변환 선택 중. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. 샘플링

참고: 섬들은 크기와 형태에 따라 빠르고 차별적으로 퇴적되어 샘플링 결과에 편향될 수 있습니다.

주의: 모든 아슬렛 취급 절차는 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 층류 후드 내에서 수행하십시오.

1. 섬 현탁액에는 50 mL 또는 250 mL 튜브를 사용하세요.
2. 관찰된 펠릿 부피와 순도에 따라 현지 표준 운영 절차를 사용하여 필요한 샘플링 분율을 결정합니다.
3. 샘플 채취 직전에 튜브를 부드럽게 다섯 번 뒤집어 섬렛 현탁액을 완전히 섞으세요.
4. 외부 조직에 의한 막힘을 방지하고 섬체 손상을 최소화하기 위해 대구경 피펫 팁을 즉시 채취하세요.

5. 아슬렛 이미지 획득 최적화

1. 디티존 제제
   참고: 섬과 외분비 조직 간의 충분한 대비를 보장하기 위해 일관된 디티존 염색이 필요합니다. 아래에는 두 가지 일반적으로 사용되는 조제 방법이 설명되어 있습니다.
   주의: 디티존은 생식 독소로 의심됩니다. 디메틸 설폭화(DMSO)는 독성이 있고 피부에 침투성이 있습니다. 수산화나트륨은 매우 부식성이 강해 심각한 화학적 화상을 일으킬 수 있습니다. 모든 화학물질은 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 다루고, 피부 접촉을 피하며, 기관의 유해 폐기물 절차에 따라 폐기물을 처리하세요.
   1. DMSO¹³에서의 재정지
      1. 디티존 가루 50mg 무게입니다.
      2. 디티존을 5mL DMSO에 녹입니다.
      3. 용액을 37°C에서 배양한 후 5분마다 1분씩 격렬하게 소용돌이를 돌려 완전히 용해됩니다.
      4. 정액 1mL를 2% 태아 소 혈청이 포함된 행크스 밸런스 소금 용액 20mL에 희석하여 작업 용액을 준비합니다.
      5. 용액을 0.22 μm 주사기 필터로 걸러냅니다.
      6. 용액을 빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감싸세요.
         참고: 작동 용액은 약 12시간 이내에 사용하세요.
   2. 알칼리성 알코올 용액에서의 재현탁 (참고문헌 8의 대안)
      1. 디티존 가루 50mg 무게입니다.
         참고: 원한다면 미리 알리쿼트를 준비하세요.
      2. 디티존에 70% 에탄올 800 μL을 첨가합니다.
      3. 1 M 수산화나트륨 용액 400 μL 첨가 후 완전히 용해될 때까지 완전히 소용돌이를 돌립니다.
      4. 0.2 mg/mL 인간 알부민이 포함된 인산 완충 식염수로 용액을 희석하여 최종 부피 20 mL로 만듭니다.
      5. 용액을 0.22 μm 주사기 필터로 걸러냅니다.
      6. 용액을 빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감싸세요.
         참고: 작동 용액은 약 12시간 이내에 사용하세요.
2. 섬 착색
   1. 35mm 접시 중앙에 25 μL 디티존 작업 용액을 추가합니다.
   2. 알부민, 완전 배양 배양지, 이식 배지를 포함한 Hank의 균형 소금 용액에 50 μL 섬을 부유 첨가합니다.
      참고: 실제 샘플 부피는 순도 분획 펠릿에 따라 20-50 μL 사이이며, 최종 디티존 농도는 0.85 mg/mL에서 1.37 mg/mL 사이입니다.
   3. 첫 번째 스톱을 사용해 천천히 세 번 피펫으로 현탁액을 넣었다 빼내며 용액을 부드럽게 섞으면서도 기포가 생기지 않도록 하세요.
   4. 샘플을 20°C–25°C에서 1–2분간 배양하면서 현미경으로 착색 상태를 육안으로 관찰하여 섬이 선명한 빨간색으로 변할 때까지 관찰합니다. 일부 제제에는 얼룩이 잘 안 된 섬이 포함될 수 있는데, IsletNet 도 이에 대해 훈련받았습니다.
   5. 10 mL 주사기를 사용해 인산 완충 식염수 4mL를 0.2 mg/mL 알부민 보충 상태로 착색된 샘플에 빠르게 주입하며, 기포와 튀김을 피하세요.
   6. 즉시 접시를 격렬하게 원을 그리며 용액을 섞고, 섬을 중앙 쪽으로 옮긴 후 안정시킵니다.
      옵션 1: 주변에 조심스럽게 4mL의 PBS/알부민을 첨가하고, 디티존 내 섬들은 그대로 두세요. 그런 다음 접시를 부드럽게 원을 그리며 용액을 섞어 중앙에 머무르게 하세요. 디티존이 접시 안에서 퍼질 때까지 기다려 보세요.
      옵션 2 (입체 현미경 적합): 섬을 희석하는 대신 희석 대신 피펫 팁이나 바늘을 사용해 디티존-섬 방울을 얇게 펴 반사를 줄이도록 합니다.
   7. 현미경으로 샘플을 검사한 후 즉시 피펫 팁으로 주변 용액을 부드럽게 휘저어 디스플레이에 돌려놓으세요.
   8. 세포독성과 섬 부피 변화를 최소화하기 위해 즉시 영상 촬영을 시작하세요.
3. 이미지 획득
   참고: 저배율 대물렌즈와 안정적인 광원이 장착된 스테레오 또는 역현미경을 사용하세요. 방 조명과 같은 추가 광원으로부터 접시를 차단하세요.
   1. 조명을 켜고 할로겐 전구를 5분간 데워주세요.
   2. 눈부심과 노출 부족을 피하기 위해 표준화된 빛 강도를 설정하세요. 정확한 범위는 사용되는 영상 장비에 따라 다릅니다.
      참고: 최적의 빛 강도는 배율과 샘플 순도에 따라 달라질 수 있습니다.
   3. 모든 아슬렛이 카메라 시야 내에 머무를 수 있도록 대물렌즈와 줌 설정을 선택하세요.
   4. 배치 내 모든 샘플과 가능하면 모든 순도 배치에 대해 동일한 배율을 유지하세요.
   5. 필요하다면 노멀라이즈된 화이트 슬라이드를 사용해 화이트 밸런스를 보정하세요. 만약 아슬렛 준비의 고유한 특성 때문에 이미지 품질이 만족스럽지 않으면, RGB 값 및/또는 감마 설정을 조정하세요.
   6. 노출 시간과 필요 시 컬러 히스토그램을 사용해 조명 강도 또는 게인을 조절하여 과노출을 피하세요.
      참고: 풍부한 외분비 조직을 포함하는 샘플은 비섬 조직에서 반사된 빛 때문에 다른 카메라 또는 조명 설정이 필요할 수 있습니다. 재현성을 보장하기 위해 이 매개변수들을 별도의 구성 파일로 저장하여 향후 참고하세요.
   7. 이미지를 캡처하여 JPG, PNG, TIFF, BMP 등 지원되는 형식으로 저장하세요.
      참고: 파일 이름에는 날짜, 순도 비율, 배율 또는 픽셀 크기, 희석 등을 포함하여 향후 재분석(예: iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg)을 용이하게 하십시오.
   8. 샘플 이미징에 사용되는 동일한 배율 및 줌 설정을 사용하여 스테이지 마이크로미터의 이미지를 획득합니다.

6. 임상 섬 격리 도구

참고: 주요 워크플로우 단계는 그림 1C에 요약되어 있습니다. 샘플이 확보될 때마다 순도 분획 배치로 이미지를 분석하세요.

1. 픽셀 크기 설정
   참고: 계산된 픽셀 크기는 분석된 샘플과 동일한 배율 및 확대 설정을 사용해 스테이지 마이크로미터 이미지를 획득할 때만 유효합니다.
   1. 임상 섬 격리 대시보드를 열어보세요.
   2. 단계 마이크로미터 업로드 를 클릭하고 단계 마이크로미터 이미지를 선택하세요.
   3. 디지털 자에 알려진 거리를 가로지르는 빨간 측정선의 끝점을 그립니다.
      참고: 측정 정확도를 높이기 위해 가능하면 더 긴 보정 거리를 사용하세요.
   4. 알려진 거리를 마이크로미터(μm) 단위로 입력합니다.
   5. 계산된 픽셀 크기를 제출하세요.
      참고: 플랫폼은 수동으로 수정될 때까지 계산된 픽셀 크기를 유지합니다.
2. 순도 분획 이미지 배치 업로드
   참고: 배치 평균 및 표준편차 값을 신뢰성 있게 계산하기 위해 3–4개의 복제 샘플을 사용하세요. 배치 내 모든 샘플에 동일한 희석도를 사용하세요.
   1. 동일한 순도 분율의 복제 샘플을 나타내는 이미지를 드래그 앤 드롭하여 업로드 영역에 배치합니다.
      참고: 이 플랫폼은 파일 이름 인식을 기반으로 동일한 이미지를 반복 사용하는 것을 방지합니다.
   2. 필요하다면 픽셀 크기를 수정하세요.
   3. 최소 섬 크기 임계값을 입력하세요.
   4. 샘플 희석값(예: 1000)을 입력합니다.
   5. 원래 플라스크에서 측정된 펠릿 부피(밀리리터 단위)를 입력합니다.
   6. 여기서 운영자 이니셜이 등장합니다.
      참고: 생성된 보고서에는 운영자 이니셜이 나타납니다.
   7. 현재 격리 절차를 나타내는 세션 ID를 입력하세요.
   8. 배치 식별자(예: 1 High Purity)를 입력하세요.
      참고: 플랫폼은 배치 ID에 따라 분수를 영숫자 순서로 주문합니다.
   9. 분석을 시작하려면 배치 제출 을 클릭하세요.
3. 배치 결과 검토 및 최종 확정
   참고: 필요하다면 헤더를 클릭하여 이전 배치 결과 창을 닫으세요(그림 2L).
   1. 배치 결과 창에 수치 및 그래픽 결과가 나타날 때까지 기다려야 합니다.
   2. 배치 결과 창에서 이미지 미리보기를 더블 클릭하여 검사 창을 열어보세요.
   3. 1단계에서 설명한 윤곽을 검토하고 필요 시 교정하세요.
   4. 윤곽이 괜찮다면 아래쪽 화살표 키를 눌러 다음 이미지로 진행하세요.
   5. 다른 배치를 추가하거나 창 하단에 있는 버튼을 이용해 세션 요약으로 이동하세요(그림 2M).
4. 배치 편집
   참고: 플랫폼은 동일한 이미지가 의도치 않게 반복되는 것을 방지하기 위해 세션 내내 이미지 파일명을 저장합니다. 여기에는 삭제된 이미지도 포함됩니다. 필요하다면 이미지 이름을 다시 설정해 재사용 시 가능합니다.
   1. 이미지를 추가하거나 제거하거나, 샘플 사양을 수정하거나, 배치 이름을 변경하려면 ' 배치 편집' 을 클릭하세요(그림 2L).
      참고: 이미지 재사용이 예상되면 배치를 수정하기 전에 이미지 파일 이름을 기록하세요.
   2. 배치 제거 를 클릭하면 배치를 완전히 삭제할 수 있습니다(그림 2L).
5. 요약 보기 및 보고서 생성
   1. 세션 개요를 보여주려면 요약 보기 를 클릭하세요(그림 2M).
      참고: 이전 배치로 돌아가 필요시 수정하세요.
   2. 세션의 총 아슬렛 수, 부피, 펠릿 부피 값과 해당 평균 배치 값을 확인하세요.
6. 보고서를 다운로드하세요.
   참고: 이 짧은 보고서에는 총 섬 수, 부피, 순도, 펠릿 값, 히스토그램, 순도 분율 요약이 포함되어 있습니다. 전체 보고서에는 각 샘플 이미지에 대한 그래픽 정보도 포함되어 있으며, 허용된 값은 빨간색으로, 제외된 값은 검은색으로 표시됩니다.

결과

순수 쥐 섬들

첫 번째 실험에서는 네 번의 독립적인 영상 세션을 통해 총 249개의 정제된 쥐 섬을 포함한 12개의 샘플을 대표하는 36장의 이미지를 획득했습니다. 이미지는 할로겐과 발광 다이오드(LED) 광원과 다양한 카메라 설정을 사용하여 세 가지 표준화되었지만 구분되는 조명 조건 하에서 입체현미경을 사용해 생성되었습니다. IsletNet 훈련 전문가가 세 장의 대표 이미지에 대해 수작업으로 생성한 지상 진실(GT) 분할 설정이 이루어졌습니다.

공개된 Simple Comparison 도구를 사용해 이미지를 분석했을 때, 자동 생성된 윤곽선은 시각적 품질 관리를 통과하지 못했습니다(vQC, 그림 5F). 플랫폼은 이후 대표적인 국소 이미지를 사용해 재학습되었고, 재학습된 실험 버전에서 생성된 모든 윤곽선이 vQC를 통과했습니다(그림 5C).

자동 및 수동 섬 부피 추정 비율은 재훈련 후 세 가지 영상 조건에서 일관된 성능을 보였으며, 조명 조건 A, B, C의 중앙값은 각각 1.03, 0.98, 0.94였습니다(그림 5A). 이 결과는 원래 훈련 모델에 비해 상당한 개선을 보였습니다(그림 5B).

픽셀 단위로 GT 세분화와 비교한 결과, 재학습 후 자동화와 수동 생성 윤곽 간에 밀접하게 일치하는 결과가 나타났으며(그림 5D), 대표 이미지에서 정확한 윤곽선 배치와 일치합니다(그림 5C). 반면, 원래 훈련 모델은 거짓 음성 픽셀(그림 5G)과 윤곽 위치 오류(그림 5F)의 비율이 증가하여 해당 섬 크기 히스토그램에서 더 작은 섬 범주로 이동하는 결과를 보였다(그림 5E 대 5H).

그림 5. 세 가지 영상 장비 및 쥐 섬 준비를 이용한 플랫폼 재훈련 평가. (A) 세 가지 영상 설정을 사용한 재훈련 후 IsletNet 과 수동 섬 등가(IEQ) 추정치 비교. (B) 원래 공개 학습 모델을 사용한 IsletNet 과 수동 IEQ 추정치 비교. (C, F) vQC 도구를 사용한 대표적인 윤곽선 배치, 각각 재학습 후와 재학습 전. 흰색 화살촉은 올바른 윤곽 위치를, 마젠타색 화살촉은 잘못된 윤곽 위치를 나타냅니다. (D, G) 재학습 후 지상 진실과 각각 픽셀 단위로 비교한 결과, 그리고 원래 학습 모델과 비교한 결과입니다. 진양성, 거짓 양성, 거짓 음성, 진음성 영역은 범례에 표시되어 있습니다. (E, H) 재훈련 후와 원래 훈련 모델에서의 대표성 섬 크기 히스토그램을 수작업 계수 비교. 영상 설정 1 = LED 조명; 영상 설정 2 = 할로겐 조명; 영상 장비 3 = LED 암시야 조명. 스케일 바 = 100 μm. 박스플롯은 Tukey 관례에 따라 표시됩니다; 수염은 1사분위수와 3분위수에서 1.5× 4분위 범위 내의 데이터 포인트까지 확장됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

임상 인간 섬 준비

두 번째 실험에서는 3쌍의 순도 분획 쌍을 가진 단일 인간 섬 분리 절차를 나타내는 17장의 이미지를 공개된 플랫폼 버전을 사용해 분석했습니다. 샘플 하나가 분실되었습니다. vQC 이후에는 중간 및 저순도 분획을 나타내는 모든 이미지가 가짜 섬 검출(데이터 미표기)으로 인해 제외되었습니다. 이후 이 플랫폼은 대표적인 지역 이미지를 사용해 재교육되었습니다.

재훈련 후, 세 개의 수동 분리 라인을 추가한 후 모든 이미지가 vQC를 통과했습니다. 배치별 비교와 수동 계수 비교 결과, 전체 섬 수 및 부피 추정치가 ≤5%로 과소평가되었습니다. 2,000배에서 4,000배 희석된 샘플에는 순도 분율에 따라 80개에서 4개의 섬이 포함되어 있었습니다. 개별 순도 분획의 최종 준비에 대한 상대적 기여도는 그림 6A에 나타난다. 고순도 분획 1VC2는 중간 순도 분획 2SC1에 비해 주로 더 작은 섬을 기여했다. 플랫폼이 자동으로 생성한 전체 섬 크기 히스토그램은 그림 6B에 표시되어 있습니다.

그림 6. 인간 섬 격리 샘플의 정량화 및 분석. (A) IsletNet 및 수작업 계수 방법을 이용한 완전한 이식편의 순도 분율 측정 및 섬 등가 부피 추정. (B) 배치 평균 값을 사용하여 IsletNet 이 생성한 최종 섬 크기 히스토그램. (C) IsletNet 및 17개의 개별 이미지 간 수동 추정 비교. (D) 샘플 3NC1에서 원본 이미지와 등고선 배치를 보여주는 대표적인 이미지 세부사항으로, 재학습된 IsletNet이 생성했습니다. (E) IsletNet 세분화와 수동 카운팅 전문가와 IsletNet 훈련 전문가(GT1 vs. GT2)가 생성한 실제 실체의 픽셀 단위 비교. 진양성, 거짓 양성, 거짓 음성, 진음성 영역은 범례에 표시되어 있습니다. (F) 동일 이미지에 대해 IsletNet 과 수동 결과를 비교한 대표적인 섬 크기 히스토그램. 마젠타색 화살촉은 윤곽과 섬 크기 범주 이동을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. 박스플롯은 Tukey 관례에 따라 표시됩니다; 수염은 1사분위수와 3분위수에서 1.5× 4분위 범위 내의 데이터 포인트까지 확장됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

이후 모든 개별 이미지에 대해 자동 및 수동 추정치를 비교하였다(그림 6C). 자동 추정치와 수동 추정치의 중앙값 비율은 섬 수가 1.00, 섬 부피가 0.93이었으며, 여러 이상치가 관찰되었습니다. 대표적인 저순도 샘플(3NC1)에서 플랫폼은 수동 수와 동일한 수의 섬(5개)을 확인했으나, 섬 부피는 29% 적은 것으로 추정했습니다. 이 데이터 포인트들은 그림 6C의 화살촉으로 표시됩니다.

이 대표적인 이미지에서 가장 큰 섬은 외부 분비 조직에 부분적으로 갇혀 있으며, 원본 이미지와 자동 생성된 윤곽 오버레이를 포함한 그림 6D에 나와 있습니다. 두 전문가가 독립적으로 생성한 GT 세분화와의 픽셀별 비교는 그림 6E에 나와 있습니다. 해당 섬 크기 히스토그램은 수동 분할과 자동 분할 간 크기 분포 변화를 보여주었습니다(그림 6F).

자동화 분석의 운영 성과

간단한 비교 및 임상 섬 격리 도구의 운영 성능은 표준 인터넷 조건에서 평균 다운로드 및 업로드 속도 50 Mbps와 30 Mbps로 평가되었습니다. 각각 12장씩 구성된 5개의 이미지 배치가 0.5MB JPEG 파일에서 20MB TIFF 파일 크기의 이미지 크기로 분석되었습니다. 전체 ZIP 결과 패키지의 다운로드 기간을 측정하였습니다.

분석 시각화 시간과 다운로드 시간은 이미지 크기에 따라 점진적으로 증가했습니다(표 4). 임상 섬 분리 도구는 동등한 이미지 세트에 대해 단순 비교 도구보다 처리 시간이 더 길어야 했습니다. 이 결과들은 이미지 해상도, 파일 형식, 분석 처리량 간의 실질적 관계를 일상적인 작업 중 보여줍니다.

표 4: 임상 섬 분리 및 단순 비교 도구의 분석 시각화 시간과 다운로드 시간. 서로 다른 파일 크기와 형식의 이미지 배치를 사용한 결과 시각화 및 파일 다운로드에 필요한 처리 시간 비교. 측정은 12장의 이미지를 포함한 배치를 사용하여 수행되었으며, 배치 제출부터 결과 시각화 또는 다운로드 완료까지의 경과 시간으로 보고됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

여기서 제시된 프로토콜은 IsletNet의 예비 및 기존 사용자를 위한 실용적인 워크플로우를 설명하며, 플랫폼의 두 가지 핵심 기능인 전문가 vQC와 신경망 재학습에 중점을 둡니다. 대표적인 결과는 정확한 자동 정량화가 이미지 분할 성능뿐만 아니라 사용자가 윤곽 배치와 이미지 적합성을 비판적으로 평가한 후 결과를 받아들이는 능력에 의존함을 보여줍니다. 추가로 두 가지 고급 도구인 픽셀 대 픽셀 비교(Pixel-to-Pixel Comparison)와 나의 분할(My Segmentations)이 선택된 검증 결과를 생성하는 데 사용되었습니다; 하지만 이 도구들은 주로 신경망 훈련 지원을 목적으로 하므로 프로토콜 워크플로우에는 포함되지 않습니다.

IsletNet은 실험실 간 표준화된 Islet 이미지 분석을 위한 협력적이고 광범위하게 접근 가능한 참고 도구로 개발되었습니다. 신경망은 분리된 인간 및 쥐 섬^{14, 15, 16}의 원본 2차원 현미경 이미지에 대한 수동 주석 GT 분할을 사용하여 학습 및 검증되었습니다. 디티존 염색 처리에 대한 두 가지 별도 모델과 염색되지 않은 쥐 섬에 대한 추가 연구 모델이 생성되었으며, 요청 시 접근 가능했습니다. 플랫폼 버전과 교육 날짜는 사용자 인터페이스에 표시됩니다. IsletNet은 섬과 외분비 조직을 자동으로 세분화하고, 사용자 정의 픽셀 크기와 최소 섬 크기 임계값을 사용하여 섬 수, 부피, 순도를 계산합니다. 섬 크기 임계값 선택은 종보다는 이미지 품질과 분석 목적(수동 수거 및 작은 섬 연구와의 나란히 비교)에 따라 달라집니다. 기존 현미경의 해상도를 고려할 때, 의미 있는 최소 섬 크기는 50 μm 7,8,9,12이지만, 적절한 기기 ¹⁰으로 얻은 이미지의 경우 최대 10 μm까지 줄일 수 있습니다. 섬 부피 추정은 표준 구형 변환표¹³과 대안 변환표^{7, 18, 19}를 사용하여 생성되며, 여기에는 적합 타원 근사 ^5,6과 등고선 기반 Spinacle 및 Sphiracle 모델¹⁷이 포함됩니다. 결과 값은 섬 환산과 나노리터 단위로 보고되며, 순도는 조직 면적이나 추정 조직 부피에서 계산됩니다. 프로토콜의 중요한 단계는 자동 분할에 적합한 표준화된 미미경 이미지를 획득하는 것입니다. IsletNet은 다양한 상보성 금속 산화물 반도체 카메라와 조명 시스템을 갖춘 스테레오 및 역현미경으로 촬영한 이미지를 사용하여 훈련되었습니다. 저배율 대물렌즈(1–2×)는 전체 샘플이 시야 내에 머물면서 작은 섬을 신뢰성 있게 탐지할 수 있는 픽셀 크기를 유지할 수 있어 유리합니다. 일관된 조명, 안정적인 화이트 밸런스, 이미지 과노출 방지는 신뢰할 수 있는 윤곽 생성에 필수적입니다. 대표 결과는 대표적인 국부 이미지를 사용한 재학습이 이기종 영상 조건에서 분할 성능을 크게 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. 실용적인 지침으로서, 경험 많은 관찰자가 섬과 외분비 조직 경계를 명확히 구분할 수 있을 때 이미지는 일반적으로 IsletNet 훈련에 적합합니다. 군집이 있거나 많이 겹치는 섬을 포함하는 이미지는 가능한 한 피해야 합니다.

프로토콜은 또한 자동 영상 분석과 관련된 여러 제한 사항과 문제 해결 사항을 강조합니다. IsletNet 은 완전 수동 집계에 비해 처리량, 객관성, 재현성을 크게 높여주지만, 여전히 이미지 품질에 민감합니다. 잘못된 등고선 배치(가짜 섬 탐지, 인접 섬 분리 실패)가 가끔 발생할 수 있으며, 이는 하류 정량화에 영향을 줄 수 있습니다. 자동 결과를 받기 전에 정기적인 vQC가 필수적입니다. IsletNet 에 즉시 현장에서 적용하는 것은 부적절한 이미지를 조정한 영상 매개변수로 재획득할 수 있어 유리합니다. 자동 등고선의 수동 보정은 검사 창 내에서 가능하며, 누락된 섬이나 여러 개의 위성 섬이 있을 경우는 예외입니다. 또한, 자동 분리 알고리즘은 등고선 기하학과 섬 크기 분포 통계에 기반하므로, 개별 전문가의 초기 해석과 다를 수 있지만 분석적으로는 수용 가능합니다.

IsletNet의 신뢰성은 종 단위만이 아니라 지역 이미지 품질과 학습 데이터셋 간의 일관성에 의해 주로 결정됩니다. 현재 훈련 세트에는 다양한 순도의 인간 섬과 고순도 쥐 섬들이 포함되어 있지만, 이미지 특성이 훈련 데이터와 일치한다면 플랫폼은 다른 종으로도 확장될 수 있습니다. 예를 들어, 배양으로 정제된 돼지 섬은 훈련 데이터셋에 포함된 인간 섬과 닮을 수 있습니다. 반면, 약한 디티존 염색을 가진 광범위하게 배양된 섬들은 훈련 중에 나타나지 않았으며, 추가 훈련이 필요할 수 있습니다. 따라서 Simple Comparison 도구는 신규 사용자나 새로운 영상 구성을 위한 중요한 검증 단계를 지원합니다. 여기 제시된 결과들은 내장된 섬에 대한 전문가의 해석 차이가 GT 생성과 하류 부피 추정에 어떻게 영향을 미치는지를 강조합니다. 향후 다기관 연구에서 광범위한 전문가 합의 부족을 해결하기 위해, 합의 기반 이미지 주석을 촉진하기 위해 IsletSwipe 애플리케이션²⁰이 개발되었습니다.

현미경 아래의 전통적인 수동 계산과 비교할 때, IsletNet 은 훨씬 높은 처리량, 영구적인 디지털 문서화, 표준화된 정량적 출력을 제공하며, 운영자에 따른 변동성을 줄입니다. 수동 계수는 경계 상태에서 조직 식별에 더 큰 신뢰를 제공할 수 있지만, 주관적인 크기 추정, 낮은 확장성, 광범위한 인력 교육 요구에 의해 제한됩니다. 웹 기반 서비스인 IsletNet 은 중앙집중적이면서도 익명성 있는 분석을 통해 실험실 간 비교를 가능하게 합니다. 분석 속도는 여전히 로컬 인터넷 대역폭, 이미지 파일 크기, 이미지 복잡도에 따라 달라집니다. 더 큰 TIFF 파일은 이미지 품질을 향상시킬 수 있지만, 압축된 JPEG 이미지에 비해 업로드 및 다운로드 시간이 더 길어집니다.

전반적으로 여기 제시된 결과는 국소 이미지 획득이 재현 가능하고 훈련 세트와 일관성 있을 때 신뢰할 수 있는 자동 정량화가 가능함을 보여줍니다. 사용자는 일상에 vQC를 포함시키고, 국소 영상 조건에 상당한 변화가 생기면 재훈련을 고려하도록 권장됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35 mm Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5481	비멸균
200 µL pipette tips, wide-bore	Sigma-Aldrich	AXYT205WBCRS	염색 전 아일렛 현탁액 분배용
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	GC 등급 또는 세포 배양 등급
Dithizone (DTZ)	Sigma-Aldrich	D5130	분말
Ethanol, 70%	Local supplier	N/A	(v/v) in H2O; DTZ 제조용
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10270106	열 불활성화, 인증
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	페놀 레드 포함 또는 미포함 (분석 기준 지정)
Human albumin	Grifols	61953-0001-2	고농도 용액(200 g/L)
Infinity 1-3C	Lumenera	3-1URC	CMOS, 3 MP
Infinity Capture	Lumenera	N/A	표준 이미지 획득 소프트웨어
Inverted microscope CKX41	Olympus	N/A	1.25x 및 2x 목적 렌즈
LED-High-Power-Spots (2-arm)	Photonics	10068	LED 광원; 이중 거즈넥 가이드
Light source Highlight 2000	Olympus	5-HL2000	할로겐 광원(14.5 V, 90 W); 수동 강도 조절; 이중 거즈넥 가이드
Laboratory essentials	Various	N/A	피펫, 튜브, 바늘, 주사기, 실험실 타이머, 표준 PPE
MicroCam software	Bresser	N/A	표준 이미지 획득 소프트웨어
MikroCam 3.0M	Bresser	86000180	CMOS, 3.1 MP 카메라
Millex-MP filter unit	MilliporeSigma	SLMP025SS	0.22 µm 구멍 크기, PES 멤브레인
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010023	pH 7.4
Promicam Pro 3-5 CP	Promicam	E61MPR937	CMOS, 5 MP, 고 다이내믹 레인지 카메라
QuickPHOTO	Promicra	N/A	표준 이미지 획득 소프트웨어
Sodium hydroxide (1 M NaOH)	Local supplier	N/A	pH 조정 및 DTZ 제조 중 용해에 사용
Stage micrometer	Thorlabs	R1L3S1P	10 mm 길이; 교정용 50 µm 구분
Stereo microscope SZH10	Olympus	N/A	1x 아포크로마트 목적 렌즈