쥐 간 및 골격근에서 글리코겐 정량을 위한 안트로네 색도 측정법

요약

이 프로토콜은 쥐 간과 골격근에서 다양한 대사 상태에서 글리코겐을 정량화하는 안트론 색도 측정법을 설명합니다.

초록

글리코겐은 간과 골격근에서 주요 세포내 포도당 저장고이며, 탄수화물 대사에 근본적인 역할을 합니다. 간글리코겐은 전신 혈당 항상성 유지에 필수적이며, 골격근 글리코겐은 신체 활동과 운동 수행을 지원합니다. 따라서 글리코겐의 정확한 정량화는 글리코겐 대사가 동적으로 조절되거나 병리적으로 변화하는 연구에서 매우 중요합니다. 여기서는 쥐 간과 골격근에서 글리코겐 함량을 정량화하는 신뢰할 수 있고 민감한 안트론 색도 측정법을 설명합니다. 프로토콜은 알칼리성 소화, 탈단백, 글리코겐 침전, 알코올 세척, 안론 시약을 이용한 색채 현상 등 순차적인 단계로 구성되어 있습니다. 이 방법의 적용 가능성은 세 가지 생리학적으로 관련된 조건인 자발 적 급식, 야간 단식, 단기 재급식 상태의 쥐에서 입증되었습니다. 이러한 실험 패러다임은 글리코겐 저장, 고갈, 재합성과 관련된 주요 대사 상태를 포착합니다. 주요 효소인 글리코겐 합성효소와 글리코겐 포스포릴라제의 직교 서부 블롯 분석은 관찰된 대사 변화에 대한 기전적 지지를 제공합니다. 이 방법의 적용 가능성은 에피네프린으로 처리된 동물에서 급성 스트레스 유발 글리코겐 분해를 모델링하기 위해 더욱 입증되었습니다. 이 방법은 넓은 동적 범위와 충분한 감도를 제공하여 현저히 다른 생리학적 상태에서 조직 글리코겐을 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 생체 내 글리코겐 대사를 조사하는 신뢰할 수 있는 도구를 제공하며, 시험관 내 세포 배양 모델에도 적용할 수 있습니다.

서론

글리코겐은 포유류의 골격근과 간에서 주요 에너지 저장소 역할을 하는 고분지된 다당류이며, 뇌, 신장, 심장,^{지방 조직 등} 다른 장기에서도 다소 적게 작용합니다. 섭식 중에 잉여 포도당은 중합 또는 de novo 지방생성을 겪으며, 글리코겐 또는 지질로 저장됩니다. 하지만 금식이나 신체적 운동 중에는 글리코겐이 효소 분해를 겪어 에너지 수요를 충족시키기 위해 지속적이고 빠른 포도당 공급을 보장합니다. 이 글리코겐의 완충 능력은 생리적 단속 재급식 주기 동안 혈당 항상성을 유지하는 데 필수적^이다.

글리코겐 합성은 두 가지 포유류 아이소폼인 GYS1과 GYS2에 존재하는 글리코겐 합성효소(GYS)에 의해 촉매됩니다. GYS1은 주로 골격근에서 발현되며, GYS2는 간 아이소폼입니다. GYS의 촉매 활성은 단식 조건에서 Ser641을 포함한 여러 부위에서 인산화에 의해 억제되지만, 먹이 조건에서는 탈인산화 시 활성이 자극됩니다. 글리코겐 분해는 글리코겐 인산화효소에 의해 촉매됩니다. 간 아이소폼은 PYGL이고, 근육 아이소폼은 PYGM입니다. GYS와 달리, 이들의 촉매 활성은 금식 중 Ser15의 인산화 시 자극되고,^{먹인 후} 탈인산화 시 억제됩니다.

글리코겐 대사의 적절한 조절은 수많은 생물학적 과정에 근본적이며, 글리코겐 대사 조절 이상은 많은 질병의 원인으로 확인되었습니다. 구체적으로, 간 글리코겐 대사 변화는 글리코겐 저장 질환⁴, 제2형 당뇨병⁵, 대사 기능 장애 관련 고성성 간 질환 ^6,7, 저혈당에 대한 역조절 반응 장애⁸ 등 다양한 대사 장애와 관련이 있습니다. 또한, 뇌 글리코겐은 장기 기억 형성에 필수적^{이며, 골}격근 글리코겐은 지구력 조절의 핵심 인자^입니다. 따라서 글리코겐의 정확한 정량화는 글리코겐 대사가 동적으로 조절되거나 병리학적으로 변화하는 연구에서 매우 중요하며, 이는 질병 기전 조사와 글리코겐 조절 중재 평가를 가능하게 합니다.

안트론 방법^11,12, 아밀로그루코시다제 방법¹³, 페놀황산 방법¹⁴, 비침습적 핵자기공명분광법(MRS)^{방법 15} 등 여러 글리코겐 정량 방법이 보고되었으며, 각 방법마다 장단점이 있습니다. 여기서는 쥐 간과 골격근에서 글리코겐을 정량화하기 위한 안트로네 색도 측정법의 상세한 프로토콜을 설명합니다(그림 1). 이 프로토콜에는 알칼리성 소화, 탈단백화, 글리코겐 침전, 알코올 세척, 안트론 시약을 이용한 색채 현상의 순차적 단계가 포함됩니다. 이 방법은 간단하고 경제적이며 최소한의 전문 계측 장비가 필요합니다. 민감도와 재현성을 입증하기 위해, 우리는 일련의 글리코겐 표준을 사용하여 검출 한계(LOD), 정량 한계(LOQ), 그리고 분석 내 및 분석 간 변동 계수(CV%)를 계산했습니다. 적용 가능성을 입증하기 위해, 간과 골격근의 글리코겐 수치를 세 가지 생리적으로 관련 있는 조건(자발적 급식, 16시간 야간 단식, 단기 재급식)에서 평가하였다. 또한, 이 방법은 에피네프린 처리된 동물을 사용하여 급성 스트레스로 인한 글리코겐 붕괴를 모델링하는 데 시연되었습니다. 글리코겐 대사에 관여하는 주요 효소에 대한 직교 서부 블롯 분석을 수행하여 관찰된 대사 변화를 확인하였습니다.

그림 1: 글리코겐 정량 작업 흐름 개요. 간 및 골격근에서 글리코겐 정량을 위한 실험적 워크플로우의 도식적 표현. 이 절차에는 조직 채취, 알칼리성 소화, 단백질 침전, 글리코겐 분리, 그리고 안트론 기반 색도 검출이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

프로토콜

모든 동물 프로토콜은 난징 의과대학의 기관 동물 관리 및 이용 위원회(IACUC; #1905019)에서 승인되었습니다.

1. 시약 준비

1. 이 연구에 사용된 모든 시약에 대해서는 재료표 를 참조하십시오.
2. 실험 시작 전에 모든 용액을 준비하세요.
3. 필요에 따라 용액 부피를 조절하세요.
4. 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액을 준비합니다
   1. NaOH 펠릿 40g 무게입니다.
   2. NaOH 펠릿을 800mL 증류수에 넣으세요.
   3. 용액을 유리봉으로 저어 용기 바닥에 녹지 않은 입자가 남지 않을 때까지 합니다.
   4. 용액을 1리터 부피 플라스크에 옮깁니다.
   5. 증류수를 넣으면 부피를 정확히 1L로 맞추세요.
   6. 용액은 실온(RT; 18°C–23°C)에서 밀폐된 병에 보관합니다.
      주의: NaOH는 부식성이 있습니다. 안전 고글, 장갑, 실험복을 착용하세요. 상업용 NaOH 펠릿은 100% 순수하지 않고 물을 흡수합니다. 펠릿을 장기간 공기에 노출시키는 것을 피하세요.
5. 20% 염화리튬(LiCl) 정액을 준비합니다
   1. 무수 LiCl 분말 20g 무게입니다.
   2. LiCl 분말을 80mL 증류수에 넣으세요.
   3. 용액을 저어 용기 바닥에 녹지 않은 입자가 남지 않을 때까지 합니다.
   4. 용액을 100mL 부피 플라스크에 옮깁니다.
   5. 증류수를 넣어 정확히 100mL까지 부피를 만듭니다.
   6. 용액은 RT에서 꽉 닫힌 병에 보관하세요.
      참고: LiCl은 피부, 눈, 호흡기를 자극할 수 있습니다. 안전 고글, 장갑, 실험복을 착용하세요. LiCl은 매우 흡습성이 강합니다. 물 흡수를 막기 위해 공기 노출을 최소화하세요.
6. 안트론 반응액을 준비합니다
   1. 1리터 비커에 28mL 증류수를 넣으세요.
   2. 물에 72mL의 고순도 농축(98%) 황산(H₂SO₄)을 첨가합니다.
   3. 혼합물이 RT로 식도록 하세요.
   4. 용액에 50mg 안론을 넣으세요.
   5. 안스트론이 녹을 때까지 저어줍니다.
   6. 용액에 티오레아 3g을 넣으세요.
   7. 티오레아가 녹을 때까지 저어줍니다.
   8. 용액을 호박색이나 호일로 감싼 유리병에 옮기세요.
   9. 용액은 최대 일주일간 냉장고(2°C–8°C)에 보관합니다.
      주의: 황산은 매우 부식성이 강하며 심각한 화학 화상을 일으키고 물과 격렬하게 반응합니다. 실험복, 화학물질 저항 장갑, 그리고 얼굴 보호대를 착용하세요. 인증된 화학 훈기 후드에서 모든 과정을 수행하세요. 희석은 강한 열을 발생시킵니다. 항상 물에 산을 넣으세요.
7. 0.1% LiCl을 포함한 95% 에탄올을 준비합니다
   1. 유리병에 95mL 절대 에탄올을 추가하세요.
   2. 증류수 4.5mL를 추가하세요.
   3. 20% LiCl 정액 0.5mL를 추가하세요.
   4. 충분히 섞으세요.
8. 0.1% LiCl을 함유한 80% 메탄올을 준비합니다
   1. 유리병에 절대 메탄올 80mL를 넣으세요.
   2. 증류수 19.5mL를 추가하세요.
   3. 20% LiCl 정액 0.5mL를 추가하세요.
   4. 충분히 섞으세요.
9. 100% (w/v) 트리클로로아세트산(TCA) 용액을 준비하세요
   1. 무게는 100g TCA 분말입니다.
   2. TCA 파우더를 80mL 증류수에 넣으세요.
   3. 녹을 때까지 저어줍니다.
   4. 용액을 100mL 부피 플라스크에 옮깁니다.
   5. 증류수를 넣어 정확히 100mL까지 부피를 만듭니다.
   6. 용액은 RT에서 밀집된 유리병에 보관하세요.
10. 포화 벤조산을 준비하세요
    1. 250mL 유리 비커에 100mL 증류수에 0.5g 벤조산을 첨가합니다.
    2. 혼합물을 뜨거운 판에서 90°C까지 가열하고 연속 자기 교반을 합니다.
    3. 용기 바닥에 녹지 않은 입자가 남지 않을 때까지 계속 가열하세요.
    4. 용액을 RT로 식히세요.
    5. 눈에 보이는 입자가 없는 투명한 상정액을 흡인하세요.
    6. 용액은 RT에서 밀폐된 유리병에 보관하세요.
11. 혈당 기준을 준비하세요
    1. 50 mg 포화 벤조산에 50 mg 포도당 분말을 녹여 1 mg/mL 스톡 용액을 만듭니다.
    2. 포화 벤조산을 연속 희석하여 1.5 mL 마이크로 원심분리관에서 포화 벤조산을 연속 희석하여 포도당 표준 물질(0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 mg/mL)을 제조합니다.
       1. 1 mg/mL 정액 500 μL을 튜브 1에 첨가하여 1 mg/mL 표준액을 준비합니다.
       2. 튜브 2에 250 μL 스톡 용액과 250 μL 포화 벤조산을 추가하여 0.5 mg/mL 표준액을 준비합니다.
       3. 튜브 3에 튜브 2 용액 200 μL와 포화 벤조산 300 μL 첨가하여 0.2 mg/mL 표준값을 준비합니다.
       4. 튜브 4에 튜브 3 용액 250 μL과 포화 벤조산 250 μL 첨가하여 0.1 mg/mL 표준액을 준비합니다.
       5. 튜브 5에 튜브 4 용액 250 μL과 포화 벤조산 250 μL를 추가하여 0.05 mg/mL 표준 액을 준비합니다.
       6. 튜브 6에 튜브 5 용액 200 μL과 포화 벤조산 300 μL 첨가하여 0.02 mg/mL 표준액을 준비합니다.
       7. 튜브 7에 튜브 6 용액 250 μL과 포화 벤조산 250 μL를 추가하여 0.01 mg/mL 표준값을 준비합니다.
       8. 500 μL 포화 벤조산을 별도의 튜브에 첨가하여 블랭크(0 mg/mL)를 준비합니다.
    3. 각 튜브와 소용돌이를 잠시 막아 10초간 충분히 섞으세요.

2. 동물 치료

1. 일반 사육
   1. 수컷 스프래그–도울리(230–270g)를 특정 병원체가 없는 환경(VAF/Plus 건강 상태, 찰스 리버 연구소) 하에 동물 시설에서 사육하며, 센다이 바이러스, 마이코플라즈마 폐, 쥐 파보바이러스 등 흔한 설치류 병원체가 없는 것으로 인증받았습니다.
   2. 표준 차우 식단을 제공하고 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하세요.
   3. 동물들은 12시간 동안 빛과 어둠 주기를 유지하세요(08:00에 조명 켜고 20:00에 불을 끕니다).
   4. RT를 22°C–23°C로 유지하세요.
   5. 상대 습도를 30%에서 70% 사이로 유지하세요.
2. 야간 단식
   1. 쥐를 일반 우리로 옮기세요.
   2. 음식을 제거하고 물을 자유롭게 공급하세요.
   3. 다음 날 아침 16시 30분부터 8시 30분까지 16시간 동안 금식을 유지하세요.
3. 재급식
   1. 하룻밤 단식 쥐에게는 일반 차우 사료(200g)를 제공하세요.
   2. 동물들이 2시간 동안 자유롭게 먹이를 먹게 하세요.
4. 에피네프린 챌린지
   1. 에피네프린 하이드로클로라이드 용액을 준비하세요.
      1. 보정된 분석 저울을 사용해 5mg 에피네프린 하이드로클로라이드 분말을 계량하세요.
      2. 분말을 15mL 원심분리관에 옮기고 10mL 생리식염수를 추가하세요.
      3. 튜브를 뚜껑 닫고 10번 뒤집어 0.5 mg/mL 스톡 용액을 만듭니다.
   2. 비복식 쥐에게 에피네프린 염산염 용액을 체중 1 mL(체중 0.5 mg/kg ^체중)의 복강 내 주사합니다3.
      1. 복부 내용물이 두개골로 이동하도록 동물을 머리를 아래로 숙인 상태로 유지하세요.
      2. 복부 오른쪽 아래 사분면에 25게이지 바늘을 45° 각도로 삽입합니다.
      3. 주사 전에 혈액이나 장 내용물이 없는지 흡인하세요.
   3. 대조군 동물에게 1 mL/kg 용량의 식염수를 복강 내 주사하세요.
   4. 꼬리 정맥 혈액 샘플을 채취하세요.
      1. 꼬리를 드러내기 위해 쥐를 잡아.
      2. 혈류를 원활하게 하기 위해 꼬리를 10초간 압박하고 따뜻하게 해주세요.
      3. 멸균된 25게이지 바늘로 꼬리 측정맥 끝에서 3cm 떨어진 곳을 찔러 주세요.
      4. 조직액 오염을 막기 위해 첫 방울의 혈액은 깨끗한 거즈로 버리세요.
      5. 혈당 측정을 위해 두 번째 혈액 방울을 채취하세요.
   5. 혈당을 15분마다 측정해 60분 동안 측정하세요.
      1. 제조사 설명서에 따라 혈당계를 보정하세요.
      2. 통제 솔루션을 사용해 매달 혈당계 정확도를 검증하세요.
      3. 테스트 스트립은 습기 노출을 방지하기 위해 원래 용기에 보관하세요.
      4. 용기에서 꺼낸 직후 바로 테스트 스트립을 사용하세요.
      5. 혈당계에 테스트 스트립을 삽입하면 자동으로 계량기가 작동합니다.
      6. 모세혈관 작용으로 혈액 샘플이 스트립에 들어가도록 하세요.
      7. 표시된 혈당 수치를 기록하세요.

3. 조직 수확

1. 안락사와 준비
   1. 이소플루란 과다복용으로 동물을 안락사시키세요. 동물을 유도 챔버에 넣고 5% 이소플루란을 100% 산소에 2L/분으로 투여해 최소 3분간 노출시킵니다.
   2. 호흡 중단을 확인해 사망을 확인하세요.
   3. 각막 반사와 발가락 집는 반사가 사라졌는지 확인하세요.
      1. 멸균된 면촉 어플리케이터로 각막을 부드럽게 만져 깜빡임 반응이 없는지 확인하세요.
      2. 둔한 겸자를 사용해 뒷발가락 사이의 거미줄을 단단히 눌러 운동 반응이 없음을 확인하세요.
   4. 쥐의 배를 위로 향하게 해부 트레이에 올려놓으세요.
   5. 스프레이 병으로 복부 피부를 75% 에탄올로 적셔주세요.
      참고: 사후 허혈로 인한 글리코겐 분해를 줄이기 위해 안락사와 조직 보존 사이의 시간을 최소화하세요.
2. 간 박리
   1. 흉골 돌기에서 약 1cm 정도 뒤쪽에 작은 절개를 합니다.
   2. 절개를 흉골 쪽으로 확장하세요.
   3. 피부를 밑 근육에서 분리하세요.
   4. 양측 횡복술 절개술을 시행하는데, 이는 접골 돌기에서 약 1cm 방향으로 수평 절개를 하고, 좌우 늑하 가장자리 쪽으로 측면으로 확장하여 복강을 완전히 노출시킵니다.
   5. 간을 확인해.
   6. 오른쪽 정중엽을 절제합니다(그림 2A).
   7. 1분 이내에 조직의 무게를 재세요.
   8. 휴지를 폴리프로필렌 플라스틱 용기에 넣으세요.
   9. 조직을 드라이아이스에 급동하세요.
3. 골격근 박리
   1. 복근을 대표 표본으로 사용하는데, 이 근육은 후지의 대사 및 수축 특성을 반영하는 빠른 근육과 느린 근육이 혼합되어 있기 때문입니다¹⁶.
   2. 쥐를 엎드려 눕히세요.
   3. 슬와와 뒤쪽을 따라 종골 결절까지 세로 피부 절개를 합니다.
   4. 피부를 분리하세요.
   5. 대퇴이두근과 반텐디노스 근육을 식별하고 반영하세요.
      1. 대퇴 이두근을 뒤쪽 허벅지 윗부분을 덮는 크고 측면에 위치한 근육으로 식별하세요.
      2. 반텐디노스는 허벅지 뒤쪽을 따라 내측을 따라 무릎 근처에 삽입되는 좁은 끈 모양의 근육으로 식별할 수 있습니다.
   6. 복근을 노출하세요.
   7. 아킬레스건이 입은 부분의 아킬레스건을 정밀 수술용 가위로 절단합니다.
   8. 자레근을 분리하세요.
   9. 대퇴골의 내측 및 외측 상과에서 복근근의 근위 부착을 해방시킵니다.
   10. 전체 복근을 제거하세요(그림 2B).
   11. 1분 이내에 조직의 무게를 재세요.
   12. 휴지를 폴리프로필렌 플라스틱 용기에 넣으세요.
   13. 조직을 드라이아이스에 급동하세요.

그림 2: 간 및 골격근의 조직 박리 절차. (A) 복강 노출 및 간 조직 채취를 위한 순차적인 단계들, 피부 절개, 절개 연장, 피부와 밑 근육 분리, 횡복강 절개 포함. (B) 비복근을 분리하기 위한 순차적인 단계, 종방향 절개, 위 근육의 반사, 해부학적 구조 확인, 근육 절제 등이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. 글리코겐 색도 분석

1. 1일차: 알칼리성 소화
   1. 50mL 원심분리관에 0.4g 조직을 추가하세요. 신속한 처리와 조직 분해를 최소화하기 위해 ± 0.1g의 허용 오차가 허용됩니다.
   2. 튜브에 10mL의 1M NaOH 용액을 추가하세요.
   3. 멸균된 칼날이나 가위를 사용해 조직 조각이 약 1–2mm 크기가 될 때까지 잘게 만듭니다.
   4. 튜브를 95°C± 5°C의 물에 넣으세요.
   5. 30분 동안 부양하세요.
   6. 인큐베이션 동안 2,500 rpm에서 10초씩 10초씩 샘플을 소용돌이로 만듭니다.
   7. 수욕에서 튜브를 빼세요.
   8. 샘플을 RT로 식히세요.
2. 단백질 분석용 용해물 준비
   1. 보정된 P1000 피페터를 사용해 1mL의 알칼리성 용해물을 마이크로 원심분리관에 옮깁니다.
   2. 원심분리기는 8,000 × g에서 10분간 돌립니다.
   3. 상정액을 채취하세요.
   4. 상청액은 BCA 단백질 분석용으로 남겨두세요.
3. TCA 매개 탈단백화
   1. 알칼리성 용해액 3mL를 15mL 원심분리관에 옮깁니다.
   2. 100% (w/v) TCA 용액 1mL를 추가하세요.
   3. 증류수를 6mL 넣으면 총 부피가 10mL가 됩니다.
   4. 2,500 rpm에서 혼합물을 10초 동안 소용돌이로 만듭니다.
   5. 튜브를 얼음 위에 올려놓으세요(0°C–4°C).
   6. 단백질을 침전시키기 위해 1시간 배양하세요.
4. 탈단백화된 상액 수집
   1. 혼합물 1mL를 마이크로 원심분리관에 옮깁니다.
   2. 원심분리기는 8,000 g × 10분 동안 RT 상태에서 사용했습니다.
   3. 상정액을 남겨두세요.
5. 글리코겐 침전
   1. 상청액 0.4mL를 새로운 미세원심분리관으로 옮깁니다.
   2. 0.1% LiCl을 함유한 95% 에탄올 0.8mL를 추가합니다.
   3. 혼합물을 철저히 소용돌이로 처리하세요.
   4. RT에서 16시간 부양하세요.
6. 2일차: 글리코겐 펠릿 투여
   1. 샘플을 1,000 × g에서 RT에서 15분간 원심분리하여 단단하고 반투명한 흰색 글리코겐 펠릿을 얻습니다(그림 3A 및 그림 3B).
   2. 상원액은 버리세요.
7. 첫 번째 글리코겐 세척
   1. 펠릿에 0.1% LiCl을 함유한 80% 메탄올 1.5mL를 첨가합니다.
   2. 2,500 rpm에서 10초 동안 샘플을 소용돌이로 만든다.
8. 세척 후 원심분리
   1. 원심분리기를 1,000g × 5분간 RT로 돌립니다.
   2. 상원액은 버리세요.
9. 두 번째 글리코겐 세척
   1. 세탁 과정을 한 번 반복하세요.
   2. 잔여액은 P200 피펫터로 조심스럽게 흡인하여 글리코겐 펠릿이 손상되지 않도록 제거하세요.
10. 글리코겐 용해
    1. 펠릿에 증류수를 0.8mL 넣으세요.
    2. 2,500rpm에서 소용돌이가 가시되는 입자 없이 투명하고 균질한 용액이 나올 때까지 유지됩니다.
11. 표준 및 샘플 준비
    1. 포도당 기준, 빈 샘플, 미확인 샘플을 3회로 준비할 1.5mL 마이크로 원심분리관을 준비합니다.
       참고: 표 1에 따라 각 튜브에 시약을 추가하세요.
    2. 각 포도당 표준액 각각 50 μL를 지정된 튜브에 추가하세요.
    3. 빈 튜브에 증류수 50 μL를 추가합니다.
    4. 각 미확인 샘플 튜브에 50 μL 글리코겐 샘플을 추가하세요.
    5. 각 튜브에 200 μL 안트론 반응액을 추가합니다.
12. 안트론 색소 현상 및 흡입도 측정
    1. 모든 관을 철저히 보텍스하세요.
    2. 튜브를 95°C± 5°C의 물에 넣으세요.
    3. 15분간 부화하세요.
    4. 튜브를 제거하고 RT로 식히세요.
    5. 각 튜브에서 96웰 플레이트로 200 μL를 전달합니다.
    6. 마이크로플레이트 리더기(엔드포인트 모드, 25°C)를 사용해 620 nm 부근에서 흡수도를 측정하며, 자동 경로 길이 보정이 1cm까지 가능합니다.
    7. 표준 곡선은 선형 회귀에 의해 결정 계수(R²)가 ≥0.995여야 하며, 이를 허용 범위로 간주합니다.
    8. 3중 측정 중 CV%가 >20%인 개별 표준 또는 샘플 복제는 신뢰할 수 없으므로 재검사해야 합니다.

그림 3: 다양한 영양 상태에서의 글리코겐 분리 및 정량화. (A) 간 샘플에서 침전된 글리코겐 펠릿의 대표적 이미지, 식사, 공복, 섭취 조건 하에서. (B) 골격근 샘플에서 침전된 글리코겐 펠릿의 대표적 이미지, 식사, 공복, 재회 조건 하에 제공됨. (C) 620 nm 흡광도와 포도당 농도 간의 선형 관계를 보여주는 포도당 표준에서 생성된 표준 곡선. (D) 섭식, 공복, 재건 조건 하에서의 혈당 수치. (E) 섭식, 공복, 재회 조건 하에서의 간 글리코겐 함량. (F) 섭식, 공복, 재회 조건 하에서 골격근 글리코겐 함량. 데이터는 SEM 평균± 제시됩니다(그룹당 n = 6개). 통계 분석은 일반 일방향 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었으며, 다중 비교는 벤자미니-호흐버그 방법으로 보정되었습니다. **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, ns: 중요하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

시약	0 mg/mL	0.01 mg/mL	0.02 mg/mL	0.05 mg/mL	0.1 mg/mL	0.2 mg/mL	0.5 mg/mL	1 mg/mL	공백	미상의 샘플
포도당 표준 용액	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	–	–
증류수(H₂O)	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL	–
글리코겐 샘플	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL
안트론 반응 용액	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL

표 1: 글리코겐 색도 분석의 반응 설정. 안론 색도 분석법에 사용되는 포도당 표준, 빈 및 미확인 글리코겐 샘플에 대한 반응 설정. 배양 및 흡수 측정 전에 정의된 부피의 포도당 표준, 증류수 또는 글리코겐 샘플을 안트론 반응액과 결합하였습니다.

5. 조직 글리코겐 함량 계산

참고: 측정된 글리코겐을 조직 습윤량 또는 총 단백질량으로 정규화하세요.

1. 표준 곡선과 농도 결정
   1. 8개의 혈당 표준 튜브에서 흡수도 측정값을 사용하세요.
   2. 흡수도 측정값에서 빈 값을 빼고 포도당 농도와 비교해 그래프를 그립니다.
   3. 엑셀에서 일반 최소제곱 회귀를 사용해 선형 회귀 곡선을 적합합니다(그림 3C).
   4. 각 미지의 글리코겐 샘플(C_미상)에서 포도당 농도를 5.1.3단계에서 얻은 회귀 방정식을 사용하여 블랭크 뺀 흡수도를 선형 표준 곡선에 보간하여 계산합니다.
2. 조직 습윤 중량으로의 정규화
   1. 다음 식으로 글리코겐 함량을 계산합니다:
      
   2. C_unknown을 5.1.4단계에서 결정된 미지의 글리코겐 샘플 내 포도당(mg/mL) 농도로 정의합니다.
   3. 4.10.1단계에서 용존 글리코겐 샘플(mL)의 부피로 0.8을 정의합니다.
   4. 0.9를 포도당 값을 글리코겐 값으로 변환하는 데 사용되는 계수로 정의합니다.
   5. 2.5를 4.5단계에서 글리코겐 침전 중에 도입된 희석 인자로 정의합니다.
   6. 10을 4.3.3단계에서 준비한 총 10 mL 혼합물에서 분석된 1 mL 알리코트를 설명하는 희석 인자로 정의합니다.
   7. 10/3을 4.1.2단계에서 준비된 총 10 mL 알칼리 소화에서 사용된 3 mL 알리코트를 고려한 희석 인자로 정의합니다.
3. 전체 단백질 질량으로의 정규화
   1. 다음 식으로 글리코겐 함량을 계산합니다:
      
   2. C_unknown을 5.1.4단계에서 결정된 미지의 글리코겐 샘플 내 포도당(mg/mL) 농도로 정의합니다.
   3. 4.10.1단계에서 용존 글리코겐 샘플(mL)의 부피로 0.8을 정의합니다.
   4. 0.9를 포도당 값을 글리코겐 값으로 변환하는 데 사용되는 계수로 정의합니다.
   5. 2.5를 4.5단계에서 글리코겐 침전 중에 도입된 희석 인자로 정의합니다.
   6. 10을 4.3.3단계에서 준비한 총 10 mL 혼합물에서 분석된 1 mL 알리코트를 설명하는 희석 인자로 정의합니다.
   7. 4.3.1단계에서 알칼리 분해물에서 사용된 3 mL 알리코트를 고려한 보정 계수로 1/3을 정의합니다.
   8. 단백질 농도를 BCA 분석으로 결정한 알칼리성 소화물 내 총 단백질 농도(mg/mL)로 정의합니다.

6. 글리코겐 대사 촉매 주요 효소의 웨스턴 블롯

1. 일반적인 고려사항
   1. 표준 서부 블롯 절차에 대한 앞서 설명한 프로토콜^17,18을 참고하세요.
2. 단백질 추출
   1. 스냅 프로즌 조직 75mg 무게입니다. 빠른 처리와 조직 해동 최소화를 위해 ± 25 mg의 내성이 허용됩니다.
   2. 1mL 얼음 냉각 RIPA 용해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0.5% 디옥시콜레이트 나트륨; 0.1% SDS; 1 mM EDTA)를 프로테아제와 인산효소 억제제로 보충합니다.
   3. 휴대용 로터-스테이터 균질기를 사용해 조직을 균질화합니다.
3. 용해물 준비
   1. 균질 균열을 얼음 위에 30분간 배양하세요.
   2. 인큐베이션 동안 샘플을 2,500rpm으로 10초간 10초간 보텍스로 돌립니다.
   3. 고정 각도 로터를 사용해 10,000 × g에서 4°C에서 5분간 원심분리.
4. 단백질 정량화
   1. 상정액을 총 단백질 용해액으로 채취하세요.
   2. 단백질 농도를 측정하기 위해 BCA 분석을 수행하세요.
   3. RIPA 용해 버퍼에 희석된 0, 0.025, 0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 1 mg/mL의 BSA 표준 제도를 준비합니다.
   4. 96웰 마이크로플레이트에서 각 표준 또는 미확인 샘플 20 μL을 개별 웰에 적재합니다.
   5. 각 웰에 시약 A 50부와 시약 B 1부를 혼합하여 제조한 BCA 작업 시약 200 μL를 추가합니다.
   6. 반응판을 37°C에서 30분간 배양하세요.
   7. RT(18°C–23°C)로 냉각된 후, 마이크로플레이트 리더기(엔드포인트 모드, 25°C)를 사용해 562 nm에서 흡수를 측정하며 자동 경로 길이 보정을 1cm까지 수행합니다.
5. SDS-페이지
   1. 단백질 15 μg과 SDS-PAGE 로딩 버퍼를 혼합합니다.
   2. 샘플을 95°C에서 5분간 가열합니다.
   3. 샘플을 얼음 위에 식혀.
   4. 샘플을 10% SDS-PAGE 겔에 적재하세요.
   5. 단백질은 러닝 버퍼(25 mM Tris, 192 mM 글리신, 0.1% SDS)에서 전기영동으로 분리됩니다.
   6. 젤을 일정한 100V로 돌려 브로모페놀 블루 염료 앞면이 젤 바닥에 닿을 때까지 유지하세요.
6. 단백질 전달 및 차단
   1. 단백질을 니트로셀룰로오스나 PVDF 막으로 옮깁니다.
   2. 니트로셀룰로오스 막의 경우, 10분간 전이 완충제(25 mM Tris, 192 mM 글리신, 20% 메탄올, pH 8.3)에서 막을 평형으로 유지합니다.
   3. PVDF 막의 경우, 100% 메탄올에 30초간 담근 후 10분간 전이 완충제에서 평형을 맞춰 활성화합니다.
   4. 전이사 샌드위치를 다음 순서로 조립하세요: 스펀지, 필터 페이퍼, 젤, 멤브레인, 필터 페이퍼, 스펀지.
   5. 4°C에서 200 mA의 일정 전류로 90분간 단백질 전달을 수행합니다.
   6. TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.1% Tween-20) 중 3% (w/v) BSA를 준비합니다.
   7. RT 시점에서 막을 1시간 동안 지속적으로 흔들면서 막을 막으세요.
      참고: 인산화 단백질을 감지할 때는 무지방 우유 대신 BSA를 사용하세요.
7. 1차 항체 배양
   1. 1:1,000 희석된 블로킹 버퍼에 1차 항체 용액을 준비합니다.
   2. 1차 항체와 함께 1차 항체와 함께 하룻밤 동안 지속적으로 흔들며 배양하세요.
8. 세척
   1. 멤브레인을 TBST로 세척하세요.
   2. 세 번씩 10분씩 반복하세요.
9. 2차 항체 인배큐어
   1. HRP 결합 2차 항체를 차단 버퍼에서 1:10,000 희석으로 준비합니다.
   2. 막을 RT에서 1시간 동안 꾸준히 흔들며 배큐하세요.
10. 세척
    1. 멤브레인을 TBST로 세척하세요.
    2. 세 번씩 10분씩 반복하세요.
11. 화학발광 검출
    1. 루미놀/증강제와 안정적인 과산화수소 용액을 같은 부피로 혼합하여 화학발광 기판을 준비합니다.
    2. 0.1 mL^{/cm 두께} 의 2막 표면적에 기질을 적용하고, 궤도 셰이커(100rpm) 위에서 RT 2분간 배양합니다.
    3. 화학발광 이미저를 사용해 신호를 포착합니다.
    4. 노출 시간을 10초에서 300초 범위로 테스트하고, 각 블롯마다 선형 검출 범위 내에서 노출을 선택합니다.
    5. 기기 내장 소프트웨어를 사용해 픽셀 포화가 없는지 확인하여 신호 선형성을 검증하세요.
12. 이미지 분석
    1. ImageJ 소프트웨어(버전 1.51, NIH)를 사용하여 밴드 강도를 분석하세요.
    2. 이미지를 8비트 그레이스케일로 변환하고 반경 50픽셀의 롤링 볼 배경 감산을 적용하세요.
    3. 동일한 크기의 직사각형 관심 영역을 사용하여 각 밴드를 정의하고, 인접한 빈 영역에서 국부 배경을 빼서 원시 통합 밀도 값을 얻습니다.
13. 총 단백질 염색
    1. 0.1% 인도 잉크 용액에 TBST에서 RT 상태로 1시간 동안 지속적으로 흔들며 인큐브를 배양하세요.
    2. 멤브레인을 TBST로 각각 10분씩 세 번 세척하세요.
    3. 여러 염색 밴드를 로딩 조절 변수로 정량화하여 면역 블롯 신호를 정규화합니다.
       참고: 하우스키핑 유전자(HKGs) 대신 전체 단백질 염색을 사용하세요. HKG 발현은 다양한 실험 조건에서 달라질 수 있으니까요¹⁹.

7. 방법의 민감도와 재현성

1. 글리코겐 표준 제제
   1. 1M NaOH에 20 mg/mL 글리코겐 스톡 용액을 준비합니다.
   2. 아래에 설명된 대로 1M NaOH로 점차 희석하여 15 mL 원심분리관 내에서 일련의 글리코겐 표준 액(0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.2, 0.5, 1 mg/mL)을 준비합니다.
      1. 500 μL 글리코겐 스톡 용액과 1 M NaOH 9.5 mL를 혼합하여 튜브 1(1 mg/mL)을 준비합니다.
      2. 250 μL 글리코겐 스톡 용액과 1 M NaOH 9.75 mL를 혼합하여 튜브 2(0.5 mg/mL)를 준비합니다.
      3. 100 μL 글리코겐 스톡 용액과 1 M NaOH 9.9 mL를 혼합하여 튜브 3(0.2 mg/mL)을 준비합니다.
      4. 50 μL 글리코겐 스톡 용액과 1 M NaOH 9.95 mL를 혼합하여 튜브 4(0.1 mg/mL)를 준비합니다.
      5. 25 μL 글리코겐 정액과 1 M NaOH 9.975 mL를 혼합하여 튜브 5(0.05 mg/mL)를 준비합니다.
      6. 10 μL 글리코겐 스톡 용액과 1 M NaOH 9.99 mL를 혼합하여 튜브 6(0.02 mg/mL)을 준비합니다.
      7. 튜브 7(0.01 mg/mL)을 튜브 1 용액 100 μL과 1 M NaOH 9.9 mL를 혼합하여 준비합니다.
      8. 튜브 8(0.005 mg/mL)을 튜브 1 용액 50 μL과 1 M NaOH 9.95 mL를 혼합하여 준비합니다.
      9. 15mL 원심분리관에 10mL 10 mL의 NaOH를 첨가하여 블랭크(0 mg/mL)를 준비합니다.
   3. 각 튜브와 소용돌이를 2,500rpm에서 10초간 혼합할 수 있도록 캡을 씌우세요.
2. 안트로네 색도 분석
   1. 글리코겐을 추출하고 4.1.4–4.12.6 단계에 따라 안트론 색도 분석을 수행합니다.
   2. 620 nm에서 흡광도 기록 (_{A 620}).
3. 글리코겐 농도 계산
   1. 5.1단계에서 명시된 각 표준 샘플(C_표준)의 포도당 농도를 계산하고 혈당 표준 곡선을 생성합니다.
   2. 각 표준 튜브 내 글리코겐 농도를 다음 식으로 계산합니다:
      
   3. C_표준 은 각 표준 샘플에서 결정된 포도당 농도(mg/mL)로 정의합니다.
   4. 0.8을 글리코겐 샘플의 부피(mL)로 정의합니다.
   5. 0.9를 포도당 값을 글리코겐 값으로 변환하는 계수로 정의하자.
   6. 2.5를 희석 인수로 정의하세요.
   7. 10을 4.3.3단계에서 준비한 총 10 mL 혼합물에서 분석된 1 mL 알리코트를 설명하는 희석 인자로 정의합니다.
   8. 4.3.1단계에서 알칼리 분해물에서 사용된 3 mL 알리코트를 고려한 보정 계수로 1/3을 정의합니다.
   9. 하루에 세 번 더 반복하여 총 네 번의 러닝을 합니다.
   10. 4일간 네 번의 반복을 통해 총 16번의 런이 됩니다.
4. LOD 및 LOQ 계산
   1. y축의 16가지 흡수도 측정값을 x축의 각 글리코겐 표준 농도에 대해 모두 그래프로 표시하세요.
   2. 선형 회귀 곡선과 R²를 계산하세요. R² 가 ≥0.995인 선형 회귀는 허용된다.
   3. LOD와 LOQ는 다음 식으로 계산합니다:
      
      
   4. σ를 반응의 표준오차(y-절개)로 정의하자.
   5. S를 선형 회귀 곡선의 기울기로 정의하자.
5. 분석 내 및 분석 간 CV% 계산
   1. 각 글리코겐 표준에 대해 1일차 4회 실행에서 계산된 값의 분석 내 CV%를 다음 식으로 계산합니다:
      
   2. s₁ 을 1일차에 네 번의 런에서 값의 표준편차로 정의합니다.
   3. 1일차에 네 번의 런을 모두 합친 평균값으로 정의 합니다.
   4. 이 계산을 2일차, 3일차, 4일차에도 반복하여 CV₂,_{CV 3},_{CV 4}를 얻습니다.
   5. 다음 식을 사용하여 최종 분석 내 CV%를 계산합니다:
      
   6. 다음 식으로 분석 간 CV%를 계산합니다:
      
   7. s_inter 를 CV₁,_{CV 2},_{CV 3}, CV₄의 표준편차로 정의합니다.
   8. CV₁,_{CV 2},_{CV 3}, CV₄의 평균값으로 정의하자.

결과

다양한 영양 상태에서의 간 및 골격근 글리코겐 수치

야간 단식은 자유 먹이를 준 쥐에서 혈당 수치(평균 ± 표준 오차 [SEM])를 7.9 ± 0.4 mM에서 5.4 ± 0.3 mM으로 유의하게 감소시켰습니다. 재급식 후 혈당 수치는 8.3 ± 0.1 mM으로 회복되었습니다(그림 3D). 이러한 변화와 일치하게, 간글리코겐 수치(SEM ± 평균)는 먹인 조건에서 3.85 mg/g 조직± 45.05였고, 밤새 공복한 후 0.13 mg/g 조직± 0.63으로 급격히 감소했으며, 재급식 2시간 후 0.73 mg/g 조직± 13.29로 증가했습니다(그림 3E). 비록 비복근 골격근에서도 유사한 경향이 관찰되었습니다. 먹일 때 글리코겐 함량은 0.38 mg/g 조직± 2.33이었으나, 금식 후 0.22 mg/g 조직± 1.08로 감소했고...

토론

이 글에서는 동물 조직에서 글리코겐을 정량하기 위한 수정된 안트론 색도 측정법을 설명합니다. 조직 수확, 알칼리 소화, 글리코겐 침전, 알코올 세척, 안트론 기반 색소 현상과 같은 기존의 순차적 단계 외에도, 배경 간섭을 줄이기 위해 탈단백화 단계를 포함시켰습니다(그림 1). 그 후 우리는 이 방법을 적용하여 간과 비복근의 글리코겐 함량 변화를 다양한 생리학적 조건에서 평가하여, 글리코겐 대사에서 생리학적으로 관련된 변화를 감지할 수 있음을 입증하였습니다. 글리코겐 합성효소와 글리코겐 포스포릴라아제를 포함한 글리코겐 대사에 관여하는 주요 효소에 대한 직교 웨스턴 블롯 분석은 글리코겐 수치 변화를 더욱 뒷받침하고 이 방법의 적용 가능성을 확인했습니다.

이 방법으로 측정된 조직 글리코겐 함량은 문헌에서 이전에 보고된 범위 내에 속합니다. 자발적으로 먹이를...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-15-M	샘플 처리 및 반응 설정에 사용
15 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-150-M-S	용액 처리 및 침전 단계에 사용
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	Western blot에서 멤브레인 세척용 버퍼
37 oC Incubator	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	BCA 분석판 배양
50 mL centrifuge tubes	LABGIC	CT-112-50A	조직 소화 및 추출에 사용
96-well plate	LABGIC	BS-MP-96W-CL	판 기반 흡광도 측정
Analytical balance	Changzhou Xingyun	FA2204N	화학 분말 무게 측정
Anthrone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	글리코겐 색상 검출용 시약
Anti-GYS1 antibody	Proteintech	10566-1-AP	글리코겐 합성효소 1 검출
Anti-GYS2 antibody	Proteintech	22371-1-AP	글리코겐 합성효소 2 검출
Anti-phospho-GYS1/2 (Ser641) antibody	Cell Signaling Technology	47043S	인산화된 GYS 검출
Anti-phospho-PYGL (Ser15) antibody	Abcam	ab227043	인산화된 글리코겐 인산분해효소 검출
Anti-PYGL antibody	Proteintech	15851-1-AP	간 글리코겐 인산분해효소 검출
Anti-PYGM antibody	Novus Biologicals	NBP2-16689	근육 글리코겐 인산분해효소 검출
BCA assay kit	Beyotime	P0012	단백질 정량
Benzoic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	표준 포화 용액 준비
Blunt forcepts	Shanghai Jinzhong	J42010	발가락 꼬집기; 조직 해부
BSA Fraction V	Beyotime	ST023	Western blot에서 차단제
Chemiluminescent imager	Tanon	Tanon 5200 Multi	Western blot 신호 검출
Chemiluminescent substrate (ECL)	Beyotime	P0018S	Western blot에서 신호 개발
Distilled water	Beyotime	ST872	시약 준비용 용매
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642	체내 글리코겐 분해 유도
Ethanol	Macklin	E809065	글리코겐 침전 및 세척
Fine surgical scissors	Shanghai Jinzhong	JA2601	조직 해부
Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	샘플 원심분리
Glucometer	i-SENS	CareSens N	혈당 측정
Glucometer	i-SENS	CareSens N	꼬리 정맥 혈당 수준 측정
Glucometer strips	i-SENS	CareSens N Strips	꼬리 정맥 혈당 수준 측정
Glucose	Macklin	G6172	표준 곡선 준비
Glycogen stock	Beyotime	D0812	일련의 글리코겐 표준 준비
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31462	일차 항체 검출
Handheld homogenizer	GreenPrima	PB100	조직 균질화
India ink	Sigma-Aldrich	198285	정상화를 위한 총 단백질 염색
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	동물 안락사
Laboratory heating block	Changzhou Guowang	GWJ300-1	분석 중 시료 가열
Lithium chloride	Macklin	767397	글리코겐 침전 증강
Methanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	글리코겐 세척 단계
Microplate reader	BioTek	ELx800	620 nm에서의 흡광도 측정
Nitrocellulose membrane	Millipore	HATF04700	단백질 전달 멤브레인
Orbital shaker	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	발광 시약 배양
P1000 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641100N	용액 이송
P200 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641080N	잔류 액체 제거
Phosphatase inhibitors (PhosSTOP)	Roche	4906845001	단백질 인산화 보존
Plastic containers (for tissue storage)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	수확한 조직 저장
Protease inhibitors cocktail	MCE	HY-K0011	단백질 분해 방지
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013B	단백질 추출
SDS-PAGE gel kit	Beyotime	P0012A	단백질 분리
SDS-PAGE loading buffer (6X)	Beyotime	P0015F	SDS-PAGE 겔 우물에 단백질 샘�