전이성 난소암과 마우스의 치료 반응 연구를 위한 임상적으로 적합한 이식 종양 모델

요약

여기서는 난소암의 암 진행, 전이 및 치료 반응을 연구하기 위한 복강내 및 점액내 종양 모델을 구축하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 또한, 이 모델들에서 루시퍼레이스 기반 비침습적 생체 내 영상을 사용하여 마우스의 종양 진행을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

초록

전이성 난소암은 효과적인 치료 옵션이 없는 매우 치명적인 부인과 악성 종양입니다. 난소암 환자를 위한 임상적으로 번역 가능한 치료법 개발은 난소암 전이를 촉진하는 요인 이해에 달려 있습니다. 대부분의 고형 종양은 혈성 전이를 보이지만, 난소암 세포는 주로 복막 내 경로를 통해 전이됩니다. 이 과정은 원발 종양에서 암세포가 분리되어 복막강으로 분리되어 제거되며, 암세포는 아노이키스에 저항하고 다세포 집합체를 형성할 수 있는 특성을 갖게 됩니다. 이 세포 응집체들은 복막의 중피 내막에 부착하여 침범하여 전이성 병변을 형성합니다. 임상적으로 관련된 생체 내 모델은 세포 요인과 종양 미세환경이 전이 과정의 다양한 단계에 어떻게 영향을 미치는지, 그리고 새로운 치료 전략을 검증하는 데 필수적입니다. 난소암 전이와 치료 반응을 연구하는 데 널리 사용되는 두 가지 이식 가능한 마우스 종양 모델은 복강내 모델과 점액낭 내 모델입니다. 본 보고서에서는 이러한 모델을 구축하는 단계별 방법론을 설명하고, 그 장점과 한계점을 강조합니다. 또한, 이러한 모델을 활용해 비침습적으로 종양 진행을 모니터링하기 위해 생물발광 영상을 사용하는 방법을 설명합니다.

서론

난소암 진행을 촉진하는 요인에 대한 이해가 크게 진전되었음에도 불구하고, 난소암은 미국에서 두 번째로 치명적인 부인암으로 남아 있습니다^. 명확한 증상이 없고 신뢰할 만한 초기 진단 지표가 부재하기 때문에, 난소암 환자의 70% 이상이 진단 시 진행성 전이병을 가지고 ^{있습니다.} 현재의 치료법은 전이성 난소암 치료에 효과적이지 않아 말기 질환 환자의 5년 생존율은 30% 미만으로 남아^{있습니다.} 치료 성공 부족의 주요 원인 중 하나는 항암내성⁵의 출현입니다. 따라서 난소암 전이와 화학요법 내성을 촉진하는 요인을 규명하는 것이 시급합니다. 이 지식 격차를 해소하는 것은 이 질병을 표적으로 삼는 보다 효과적인 치료 전략을 개발하는 데 매우 중요할 것입니다. 이러한 목표를 달성하기 위해서는 난소암 진행의 주요 단계를 정확히 모방하는 생체 내 모델이 필요합니다.

난소암 세포주와 3차원 시험관 내 모델이 전이와 치료 반응에 영향을 미치는 요인 이해에 크게 기여했지만, 이 모델들은 몇 가지 한계가 있습니다 ^6,7,8. 예를 들어, 이 모델들은 종양 미세환경에 속하는 다양한 비암성 세포를 고려하지 않으며^, 종양 미세환경^내에서 일어나는 복잡한 상호작용을 포착하지 못합니다. 또한, 시험관 내 모델 ^6,7,8을 사용하여 전신 요인과 그것이 종양 진행 및 약물 반응에 미치는 영향을 연구하는 것은 매우 어렵습니다. 이러한 시험관 내 모델의 한계는 난소암 전이의 다양한 단계를 정확히 모방하는 생체 내 모델의 필요성을 강조하며, 여기에는 다른 세포 유형 및 미세환경 내 요인과의 복잡한 상호작용도 포함됩니다.

유전자 조작 마우스 모델(GEMMs)은^{면역 체계가} 온전한 자연 미세환경에서 종양이 자발적으로 발생하는 생체 내 플랫폼을 제공합니다. 하지만¹⁰개를 생성하고 유지하는 데 시간이 많이 걸리고 도전적이며 비용이 많이 듭니다. 대부분의 난소암 GEMM은 종양 발달에 긴 잠복기가 있어, 생성 후에도 치료가 시간과 비용이 많이 듭^니다. 이식 가능한 모델, 예를 들어 이종이식 및 동종이식 모델은 생물학적 관련성과 실험적 용이성 사이의 균형을 잘 제공하며, GEMM¹¹보다 생성 비용이 훨씬 저렴한 경우가 많습니다. GEMM보다 잠복 시간이 낮을 뿐만 아니라, 종양 세포를 시험관 내에서 유전적으로 변형할 수 있어 이러한 모델은 다양한 유전 요인이 종양 진행에 미치는 영향을 연구하는 데 편리하고 적합하다¹⁰. 이러한 이점 덕분에 이식 가능한 종양 모델은 난소암의 기초 및 중개 연구 모두에 귀중한 도구로 부상했습니다.

본 보고서에서는 전이성 난소암 연구에 널리 사용되는 두 가지 이식 가능한 마우스 종양 모델을 구축하는 프로토콜을 설명합니다: (1) 복강내 모델, (2) 정변성 또는 점액내(점액내) 모델입니다. 두 모델 모두 외계이식 또는 동종이식 모델로 설정할 수 있습니다. 복강내 모델에서는 암세포를 쥐의 복막강에 주입합니다. 난소암 세포를 복강 내 공간에 도입하는 것은 난소암 전이의 단계와 일치하는데, 이는 전이성 난소암 세포가 원발 종양에서 복강으로 배출되는 과정입니다. 인간의 전이 과정과 유사하게, 이식된 난소암 세포들은 적대적인 복막 미세환경에 적응하고, 복막강을 감싸는 중피층에 부착 및 침범하며, 대막, 장간간막, 간, 횡격막 등 복막 내 장기와 조직에 전이 병변을 형성해야 합니다. 복강내 모델을 생성하는 데 사용되는 암세포주에 따라, 전이 종양은 인간의 말기 질환에서 관찰되는 복수와 함께 나타날 수 있습니다. 따라서 복강내 모델은 난소암 전이와 그로 인한^{후기 질환 진행}을 촉진하는 요인을 이해하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이 모델들은 전이성 난소암에 대한 새로운 치료 전략의 효능을 판단하는 데에도 유용하다¹². 점액내(점액내) 또는 정형위소 모델에서는 암세포가 쥐 난소를 둘러싼 막성 구조인 점액낭에 이식됩니다. 이 모델은 난소 종양 발생 및 전이의 초기 단계를 모방합니다. 이 단계에서 암세포는 여전히 난관과 난소에 국한되어 있습니다. 이 부위에서 암세포가 복막강으로 배출되어 결국 다른 장기로 전이됩니다. 따라서 점액낭 내 모델은 난소 종양 발생의 초기 단계와 복막강을 통한 이후 경경전이로 이어지는 사건들을 연구하는 데^{유용합니다.}

따라서 복강내 모델과 탈액내(점액수액 내) 모델은 난소암 전이와 치료 반응을 연구하는 데 훌륭한 도구이지만, 모방하는 전이 과정의 구체적인 단계에서는 차이가 있습니다. 점액 내 모델은 난소암이 전이 과정에서 초기 단계에서 후기 단계로 진행되는 과정을 모방할 수 있지만, 이 과정에 수반된 잠복기 때문에 일반적으로 난소암 전이의 초기 사건을 연구하는 데 사용됩니다. 난소암 전이의 후기 단계에 초점을 맞춘 연구에는 복강내 모델이 더 적합합니다. 더불어, 점액내(intrabursal) 모델은 복강 내 모델에 비해 기술적으로 더 어려운 점액수¹². 점액내 모델을 구축하려면 난소 점액낭에 암세포를 정밀하게 주입할 수 있는 미세수술 장비가 갖춰진 수술실에 접근할 수 있어야 합니다. 암세포가 종양을 형성하는 능력("이식률" 또는 "착착률")도 복막 내 모델에 비해 점액내 모델에서 보통 낮습니다. 또한, 정전소 주사나 복막 내 주사 후에는 종양을 쉽게 관찰할 수 없기 때문에, 비침습적 생물발광 영상 기법이 종양 진행을 모니터링하는 데 일반적으로 사용됩니다. 따라서 복강내 및 점액내 모델 모두 종양의 비침습적 영상 촬영을 가능하게 하는 추가 장비가^{필요합니다.} 궁극적으로 실험 목표, 자원 가용성, 기술적 역량이 각 연구의 모델 선택을 결정합니다.

이 보고서는 인간 난소암 세포주를 이용한 복막 내 및 점액내 마우스 이종이식 모델을 단계별로 구축하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델들은 NSG(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ)나 Foxn1 누드 (B6)와 같은 면역저하 마우스 균주에 세포를 이식함으로써 구축할 수 있습니다. CG-Foxn1 nu/J). 동일한 방법은 동종이식(동생) 모델 생성에도 적용될 수 있습니다. 동종이식 모델을 구축하는 과정에서 마우스 난소암 세포를 동일한 유전적 배경을 가진 면역 능력이 있는 마우스에 이식합니다. 면역 능력이 있는 마우스를 이용한 동종 이식 모델이 개발되면서, 난소 종양 미세환경을 조절하는 다양한 요인, 난소암 진행에서 면역 체계의 역할, 면역치료의 효과를 연구하는 데 유용합니다. 복막 내 및 점액내 이종이식 마우스 모델을 구축하는 것 외에도, 이 보고서는 이러한 모델에서 종양 진행을 비침습적으로 모니터링하기 위해 생물발광 영상을 사용하는 방법도 설명합니다.

프로토콜

이 프로토콜에 기술된 모든 동물 시술은 메릴랜드 대학교 볼티모어 카운티 캠퍼스의 기관동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(책임 연구자 - 아추스 파드마나반; 프로토콜 번호 - 1947).  이 프로토콜에서 사용된 재료 및 장비의 전체 목록과 그 카탈로그 번호는 재료표에 제공되어 있습니다.

1. 난소암 세포주 이식을 위해 마우스 준비

참고: 이 프로토콜에 기술된 모든 생체 내 모델에 대해, 난소암 세포는 마우스 이식을 위해 준비되어야 합니다. 난소암 세포는 아래에 설명된 층류 조직 배양 후드에서 상온에서 준비되어야 하며, 별도 명시가 없는 한:

1. 문헌에서 권장하는 표준 배지를 사용하여 37^°C에서 5%_CO2로 유지된 워터 재킷_CO2 인큐베이터에서 난소암 세포를 배양합니다. 종양의 비침습적 생체 내 영상 촬영을 원한다면, 난소암 세포가 이식 전에 루시퍼라제를 안정적으로 발현하도록 설계되어야 합니다.
2. 세포가 약 80%–85% 합류에 도달하면 아래에 설명된 무균 조건에서 수확합니다:
   1. 조직 배양 플레이트에서 배지를 흡입합니다.
   2. 칼슘과 마그네슘이 없는 멸균된 1X 인산염 완충 식염수(PBS)로 부착 세포를 두 번 세척합니다. PBS에 칼슘과 마그네슘이 존재하면 트립신 활성을 방해하고 세포 접착을 촉진할 수 있습니다. 조직 배양 플레이트에서 PBS를 흡인하세요.
   3. 조직 배양 플레이트에 0.05% 트립신-EDTA를 첨가합니다. 사용될 트립신의 양은 조직 배양판의 크기와 작업하는 세포주에 따라 달라집니다. 100mm 배지에서 성장하는 대부분의 세포주에는 0.05% 트립신-EDTA 1mL를 사용하세요. OVCA420과 같이 강하게 부착된 난소암 세포주에는 0.25% 트립신-EDTA 1mL를 권장합니다.
   4. 세포가 담긴 플레이트를 다시 37 ^°C 워터 재킷_CO2 인큐베이터로 옮겨 조직 배양에 사용하며 1–5분간 배양합니다. 정확한 배양 시간은 세포주에 따라 다릅니다. TYK-Nu와 HEYA8과 같은 일부 세포주는 매우 빠르게 분리되는 반면(1–2분), OVCA420 같은 세포주는 4–5분으로 더 오래 걸립니다.
   5. 세포가 분리되면 FBS가 포함된 배지를 추가하여 트립신 작용을 멈춥니다. 트립신 1mL당 FBS 함유 배지 6mL를 추가하세요. 조직 배양판에서 세포를 부드럽게 위아래로 움직여 세포를 분리하여 단일 세포 현탁액으로 분리시킵니다.
      참고: 밝은 시야 역현미경으로 관찰할 때, 분리된 세포는 평평하거나 길게 뻗은 것이 아니라 둥글게 보이며, 플레이트 바닥에 붙어 있지 않고 자유롭게 떠다닙니다.
   6. 세포를 원뿔형 튜브에 모아 400 x g 원심분리기에서 실온에서 5분간 보관하세요.
   7. 트립신 함유 상정액을 제거하고 세포 펠릿을 신선한 FBS 함유 세포 배양 배지에 재현탁합니다.
3. 트리판 블루와 같은 세포 생존성 염료와 혈구계를 사용하여 세포를 세는 것입니다. 또는 자동 셀 카운터를 사용해 셀 수를 세는 방법도 있습니다.
4. 단위 부피당 원하는 농도에 도달하도록 멸균 1X PBS(pH 7.4)의 정해진 부피로 세포를 재구성합니다. 일반적으로 사용되는 인간 난소암 세포주에 권장되는 주입 세포 수는 표 1, ¹³에 나와 있습니다.
   참고: 마우스에 안전하게 주입할 수 있는 최대 용량은 모델에 따라 다릅니다. 복막 내 모델의 최대 권장 용량은 500 μL입니다(2.1절 참조). 점포 내 모델에서는 최대 권장 용량이 5 μL입니다(2.2절 참조).
5. 세포 현탁액을 쥐에 주입할 때까지 얼음 위에 보관하세요. 세포를 쥐에게 가능한 한 빨리, 가능하면 세포 준비 후 30–45분 이내에 주입하세요.

2. 마우스에서 이식 가능한 난소암 모델 구축

1. 난소암의 복강내 모델 확립
   참고: 이 과정에서 루시페라제를 안정적으로 발현하는 난소암 세포가 성체 암컷 쥐의 복강에 주입됩니다. 루시퍼레이스를 안정적으로 발현하는 세포를 사용하면 생체 영상 시스템(IVIS)을 이용한 종양 진행을 장기적이고 비침습적으로 모니터링할 수 있습니다.
   1. 1절에 설명된 대로 세포를 준비하세요. 1000 μL 마이크로피펫을 사용해 세포를 부드럽게 재현탁시키고, 세포가 해리 상태를 유지하도록 합니다.
      참고: 뭉치를 떼어내지 못하면 바늘이 막히게 됩니다.
   2. 세포 현탁액 500 μL을 1 mL 주사기에 흡입하고 21G X 1인치 바늘을 연결하세요. 주사기 안에 기포가 없는지 확인하세요.
      참고: 성체 암컷 쥐(25–30g)에 복강 내 주입할 수 있는 최대 용량은 500 μL입니다. 따라서 최대 500 μL 부피 내에 필요한 셀 수를 포함하도록 부피 내에 재현탁하세요. 일반적으로 사용되는 인간 난소암 세포주에 권장되는 주입 세포 수는 표 1, ¹³에 나와 있습니다.
      참고: 마우스 무게가 20–25g 사이라면 400 μL 미만의 작은 용량을 주입하는 것이 권장됩니다.
   3. 동물을 우리에서 꺼내 거칠거나 철사가 있는 표면 위에 올려 고정하세요.
   4. 그림 1A에 보이는 대로 비우세 손으로 목 밑의 느슨한 피부를 부드럽게 긁어 쥐를 제지하세요.
   5. 쥐를 부드럽게 들어 올려 배 쪽이 위를 향하도록 돌리세요. 그림 1B에 보이는 대로 손가락으로 꼬리를 고정하세요.
   6. 복부 중앙에 가로지르는 가상의 선을 그려보세요. 주사 부위를 찾으려면, 오른쪽 아래 사분면의 중앙선과 두 젖꼭지 사이에 삼각형이 있다고 상상해 보세요. 주사 부위가 이 가상의 삼각형 중앙에 있는지 확인하세요. 그림 1B를 참고하세요.
   7. 마우스의 머리를 약간 땅 쪽으로 기울여 뒷부분보다 낮게 만드세요. 이 자세로 쥐를 묶으면 복부 내용물이 두개로 이동하는 데 도움이 됩니다. 이로 인해 주사 시 내부 장기가 찌를 위험이 줄어듭니다.
   8. 멸균 알코올 면봉으로 주사 부위를 깨끗이 청소하세요.
   9. 우세 손을 사용해 주사 부위에 바늘을 45° 이하의 각도로 삽입합니다. 0.5인치만 전진시키고, 바늘 길이의 절반을 넘지 마세요. 바늘이 안정적으로 고정되도록 하세요. 복강 내에서 움직이면 내부 장기에 손상을 줄 수 있습니다.
   10. 세포를 천천히 꾸준히 쥐의 복강에 분사합니다.
   11. 같은 각도로 바늘을 마우스에서 빼세요. 즉시 주사 부위에 멸균된 게이지를 덮어 누출을 방지하세요.
   12. 바늘과 주사기는 적절한 날카로운 용기에 버리세요.
   13. 쥐를 케이지에 넣기 전에 선호하는 방법으로 귀에 달아주세요. 귀 태그를 사용하면 나중에 주입된 쥐의 신원을 확인할 수 있습니다.
2. 난소암의 점액 내 모델 확립
   참고: 점액내(intrabursal) 모델에서는 루시페라제를 안정적으로 발현하는 난소암 세포를 성체 암컷 쥐의 난소 점액낭에 직접 주입합니다. 점액낭은 쥐 난소를 둘러싼 막막입니다. 난소암 세포에서 루시퍼라제의 안정적인 발현은 IVIS를 이용한 비침습적 종단적 종양 진행 모니터링을 가능하게 합니다.
   1. 1일차 – 점액수 내 이식 수술을 위한 장비와 마우스 준비
      1. 수술에 필요한 기구는 오토클레이브로 처리하세요. 기기 목록은 다음과 같습니다 (그림 2A):
         파인 팁 가위, 5인치 곡선 미세 핀셉, 메이요-헤거 바늘 홀더, 해부 보석용 마이크로포셉, 파인 팁, 미세 포인트로 해부용 핀셋 기구용
      2. 수술 전 진통제 시에는 24시간마다 카프로펜(15 mg/kg)을 피하 주사로 투여합니다.
         참고: 진통제 카프로펜은 수술 1일 전부터 수술 후 3일간 24시간마다 피하 투여하세요.
   2. 2일차 – 마우스 난소암 세포의 점액 내 이식
      1. 1절에 설명된 대로 난소암 세포를 주입 준비합니다. 마우스에서 점액 내 주입으로 안전하게 주입할 수 있는 최대 용량은 5 μL입니다. 따라서 세포 농도는 10⁴ cells/μL로 유지하는 것이 바람직합니다. 이로 인해 5 x 10^{4개의 세포} 이식이 가능해집니다.
         참고: 일반적으로 사용되는 인간 난소암 세포주에 권장되는 주입 세포 수는 표 1¹³에 표시되어 있습니다.
      2. 사용 전까지 셀을 얼음 위에 보관하세요. 수확 후에는 가능한 한 빨리, 가능하면 30분에서 45분 이내에 주입하는 것이 권장됩니다.
      3. 아이소플루란 유량 4%, 산소 유량 3.5 L/min의 이소플루란 챔버에 마우스를 넣어 마취를 유도합니다. 쥐가 마취되어 있는지 확인하려면 움직임이 정해져 있는지, 발가락 집는 반사가 없는지 확인하세요.
      4. 마취된 쥐를 멸균 수술용 드레이프 위에 옮기고, 설치류 온열 패드 위에 37°C로 유지됩니다. 빠르게 코 콘을 끼우고 1.5% 이소플루란과 98.5% 산소로 마취를 유지하세요. 발가락 집는 반사가 없는지 확인하여 쥐가 마취되었는지 확인하세요.
      5. 15분마다 발가락 꼬집기 반사가 없는지 확인하여 시술 내내 쥐가 마취 상태를 유지하도록 하세요. 마취 중 쥐의 호흡 속도를 모니터링하여 느리고 부드럽게 진행되도록 하세요. 호흡 속도가 변하면 이소플루란 용량을 조정하세요. 생쥐가 숨쉬기 힘들거나 헐떡임을 보인다면 용량을 줄이세요. 반대로 마우스가 호흡 속도가 증가하면 이소플루란 용량을 약간 늘려야 합니다.
         참고: 마우스를 40분 이상 마취 상태로 두지 마세요. 이를 위해서는 수술 과정에서 효율적이고 신속하게 진행하는 것이 중요합니다.
      6. 난소암 세포가 점포 내 이식될 쪽과 마우스를 위치시키고, 그림 2B에 보이는 대로 위를 향하게 합니다.
      7. 쥐의 양쪽 눈에 눈 연고를 발라서 건조(각막 건조)를 막아주세요.
      8. 쥐에게 털이 있다면, 위를 향한 쪽 하반신의 털을 밀어주세요. 면도한 부위를 제대로 청소하고 마우스를 새 멸균 패드 위에 올려놓으세요. Foxn1 누드(B6)와 작업할 때. Cg-Foxn1 nu/J) 마우스 스트레인, 이 단계는 건너뛰세요.
      9. 멸균된 수술용 드레이프를 사용해 쥐의 몸 하반부만 드러나게 감싸세요.
      10. 수술 시작 전에 비누로 손을 제대로 씻고, 새로 만든 멸균 수술용 장갑을 착용하세요. 수술용 장갑을 끼고 나서는 멸균되지 않은 부위나 물건을 만지지 마세요.
      11. 멸균 면봉 어플리케이터를 사용해 수술 부위에 안쪽에서 시계 방향으로 원을 그리며 베타딘 액체를 바르세요. 다음으로, 멸균 알코올 면봉으로 같은 부위를 비슷한 방식으로 청소하세요. 이 과정을 두 번 더 반복하세요.
          참고: 수술 중 멸균되지 않은 물건이나 부위를 만지지 마십시오. 비멸균 표면과 접촉하면 즉시 장갑을 교체하세요. 점액 주사를 시행할 때는 다른 사람이 도와주는 것이 강력히 권장됩니다. 이 사람은 수술 중 무균이 아닌 물품을 다루는 데 도움을 줄 수 있습니다.
      12. 알코올이 마를 때까지 1분을 기다려야 합니다.
      13. 그림 2B에 나타난 대로 뒷다리 위 약 1.5cm 높이, 쥐의 갈비뼈에서 5mm 떨어진 지점을 찾으세요. 이 부위의 피부를 곡선 겸자로 들어 올린 후, 가늘게 끝이 있는 가위로 5mm 수직 절개를 합니다.
          참고: 절개를 하기 전에 쥐가 완전히 마취 상태에 있는지 확인하여 발가락 집는 반사가 없는지 확인하세요.
      14. 미세한 팁 마이크로포셉으로 한쪽 피부를 잡고 같은 부위에 피하 조직에 절개를 하세요.
      15. 이 시점에서 피하 조직 아래 복막층이 보일 것입니다. 가늘고 굽은 톱니 모양의 겸자를 사용해 복막층을 고정하고, 가늘게 가위로 약 2.5mm 길이의 절개를 하세요.
      16. 톱니 모양의 겸자로 복막 절개 판 옆을 잡고 가는 겸자로 난소 지방 패드를 찾으세요. 난소는 지방 패드 아래에 위치해 있습니다.
      17. 난소 지방 패드와 난소를 절개 부위를 통해 조심스럽게 빼내세요.
      18. 해리 겸자를 사용해 지방 패드를 잡아 난소가 위를 향하게 하고 움직이지 않게 하세요.
          참고: 난소를 겸자로 잡지 마세요. 지방 패드는 미끄러우니 항상 톱니형 겸자를 사용해 지방 패드를 잡으세요.
      19. 도움을 주는 사람에게 세포 현탁액이 담긴 주사기를 준비해 달라고 요청하세요. 0.3 mL 인슐린 주사기 사용을 권장합니다.
      20. 베벨이 위를 향하게 한 바늘을 난관과 난소 교차부에 부드럽게 삽입하세요. 플런저를 누르기 전에 전체 베벨이 점액낭 안으로 들어가도록 하세요.
          참고: 삽입 부위 반대편 점액낭을 찔리지 않도록 주의하세요.
      21. 플런저를 부드럽게 밀어 주사기 내용물을 난소 점액액으로 옮기세요. 바늘을 빨리 빼세요.
      22. 난소를 둘러싼 점액낭이 부풀어 오르면 세포 접종이 성공했음을 나타냅니다.
      23. 5초 정도 기다린 후 난소를 부드럽게 복강 안으로 다시 넣으세요.
      24. 복막을 6-0 흡수성 단섬유 봉합사로 한두 개의 간단한 중단 수술용 봉합으로 봉합합니다.
      25. 6-0 흡수성 단섬유 봉합사로 피부 절개를 간단한 수술용 봉합으로 봉합하세요. 절개 부위에서 출혈이 없는지 확인하세요.
      26. 절개 부위를 닫은 후 절개 부위에 3중 항생제 연고(바시트라신, 네오마이신, 폴리믹신 B)를 바르세요.
      27. 통증 완화를 위해 카프로펜 15 mg/kg을 피하 투여합니다.
      28. 선호하는 방법으로 귀 태그를 쥐에 부착하세요. 귀 태그를 사용하면 나중에 주입된 쥐의 신원을 확인할 수 있습니다.
      29. 쥐를 새 우리로 옮기세요. 이 케이지를 반 개와 함께 최소 60분 이상 열찜질팩 위에 올려놓으세요. 마취 효과가 완전히 사라지고 쥐가 깨어 활동 중인지 확인하세요.
          참고: 쥐는 마취 상태에서 저체온증에 취약합니다. 따라서 체온 조절을 위해 외부 열을 제공하는 것이 중요합니다.
      30. 수술 후 4-5시간 후에 절개 부위에서 출혈이나 기타 불편함이 있는지 쥐를 확인하세요.
      31. 다음 3일 동안 24시간마다 15 mg/Kg을 쥐에게 피하 투여하세요.
      32. 접종된 세포가 루시퍼레이제를 안정적으로 발현하도록 유전공학적으로 조작된 경우, 3절에서 설명한 대로 주사 후 1일차부터 종양 부담을 측정할 수 있습니다.

3. 생체 내 영상 시스템(IVIS)을 이용한 마우스 종양의 비침습적 영상

이 보고서에서 설명한 이식 가능한 종양 모델을 사용한 여러 연구에서 중요한 목표 중 하나는 종양 진행에 대한 종단 데이터를 얻는 것입니다. 베르니어 캘리퍼로 피하 종양의 부피를 추정할 수 있지만, 복강내 및 점액골 내 모델로 형성된 종양에는 적합하지 않습니다. 이 문제를 극복하고 복강 내 종양 부하를 측정하기 위해 대부분의 실험실에서는 루시퍼라제 기반의 비침습적 생물발광 영상을 사용합니다. 이를 위해 이식된 암세포는 루시페라제를 안정적으로 발현하도록 설계되어, 기질인 D-루시페린을 투여하면 생물발광을 일으킵니다. 생물발광은 생체 내 영상 시스템(IVIS)을 사용하여 비침습적으로 검출됩니다. 이 신호는 종양 부하를 추적하고 전이 및 약물 치료 효능에 관한 정보를 밝히기 위해 정량화됩니다. 아래에서는 쥐에서 루시페라제 기반의 비침습적 생물발광 영상을 이용한 IVIS를 이용한 종양 부하 추적 프로토콜을 설명합니다.

1. D-루시페린 기질 준비
   1. 멸균 조건에서 1X PBS(pH 7.4)에 15 mg/mL D-루시페린 용액을 준비합니다.
   2. 0.22 μm 필터를 사용해 용액을 필터 멸균합니다.
   3. 사용 전까지 조명으로부터 보호하기 위해 용액을 알루미늄 호일로 감싸세요.
2. IVIS 이미지 획득을 위한 초기 설정
   1. IVIS 이미저에 연결된 컴퓨터에서 "리빙 이미지" 소프트웨어를 열고 로그인하세요.
   2. 이미지 획득을 위해 이미저가 초기화되어야 합니다. 이 과정은 다음과 같습니다:
      1. 로그인 시 IVIS 제어판의 창이 그림 3A에 나타난 것처럼 열립니다.
      2. 창 오른쪽 하단에 위치한 "초기화" 버튼을 클릭하세요(그림 3A). 시스템이 초기화되는 데 몇 분이 걸릴 거예요.
         참고: 처음에 창문 하단의 온도 바가 빨간색으로 변하며, 이는 영상 카메라가 목표 온도인 -90 °C에 도달 중임을 나타냅니다(그림 3B).
      3. 영상 카메라가 목표 온도(-90 °C)에 도달하면 온도 바가 녹색으로 변하고 시스템 상태는 "사용 준비 완료"로 표시됩니다(그림 3C). 이제 이미저가 마우스 촬영 준비가 완료되었습니다.
         참고: 노출 시간, 빈잉, 조리개 조리(f/stop)은 사용자 요구에 따라 조정할 수 있습니다.
3. IVIS 영상 촬영을 위한 마우스 준비
   마우스 영상 촬영 전에 D-루시페린을 복강 내 주입해야 합니다.
   1. 쥐를 케이지에서 꺼내 거칠거나 와이어가 있는 표면 위에 올려두세요. 2.1절에 설명된 대로 쥐를 부드럽게 잡아 제대로 제압하세요.
   2. 마우스를 들어 올려 배 쪽이 위를 향하게 돌리세요.
      참고: 쥐가 제대로 제압되어 있으면 네 다리 모두 들어 올릴 때 바깥쪽으로 뻗어 나갑니다. 그림 1B에 보시다. 시술 중에는 꼬리를 손가락 사이에 끼워 고정해 추가적인 제약을 하세요.
   3. 멸균 알코올 면봉을 사용해 2.1절의 복막 내 주사 프로토콜에 따라 주사 부위를 청소하세요.
   4. 1ml 결핵 주사기와 30G 1/2인치 바늘을 사용해 기본 용액에서 적절한 용량의 D-루시페린을 복강 내 주입하여 최종 용량 150 mg/Kg의 D-루시페린을 얻으세요.
      참고: 복강내 주사 방법에 대한 지침은 2.1절의 복막 내 주사 프로토콜을 참조하십시오. C57BL/6 마우스(공동 동종 동종 모델용)를 사용할 경우, IVIS를 이용한 생물발광 영상 촬영 전에 털을 제거하는 것이 강력히 권장됩니다. 검은 털과 색소가 있는 피부는 빛을 크게 감쇠시켜 신호 강도를 감소시킵니다.
   5. 쥐를 조심스럽게 다시 우리 안에 넣으세요. 정확한 대기 시간과 노출 시간은 실증적으로 결정되어야 합니다. 이는 다음과 같이 결정할 수 있습니다.
      1. D-루시페린 주사 직후 마취를 하고 3.4절에 설명된 대로 2분마다 20분 동안 영상을 촬영하세요.
         참고: 이 실험을 처음 수행할 때는 D-루시페린 투여 후 루시퍼레이스 신호가 시간에 따라 어떻게 변하는지 확인하는 것이 권장됩니다. 이는 이후 실험에서 D-루시페린 투여 후 쥐를 촬영할 가장 적절한 시기를 결정하는 데 도움이 됩니다. 생물발광 신호는 세포주, 마우스 이종이식 모델, 루시퍼라제 발현 수준 등 여러 요인에 따라 달라질 수 있습니다.
      2. 각 간격마다 5, 10, 15초의 실험을 합니다.
      3. 이 데이터를 사용해 표준 곡선을 그려보세요. 곡선을 바탕으로 신호가 정체에 도달하는 대기와 노출 시간을 선택하면서 가장 높은 강도를 유지하세요.
         참고: 보통 이 시간은 5분에서 10분 사이이지만, 모델에 따라 다를 수 있습니다.
4. IVIS를 이용한 비침습적 마우스 종양 영상
   1. 대기 기간이 끝난 후, 쥐를 4% 이소플루란 함량과 산소 유량 3.5의 이소플루란 챔버에 넣습니다.
   2. 쥐가 마취 상태인지 확인하려면 발가락 집는 반사가 없는지 확인하세요.
   3. 영상 촬영 중 마취 유지를 위해 마우스를 IVIS 영상기 내부 스테이지에 올려놓고 코를 코 콘 안으로 밀어 넣습니다. 카메라 초점 표시선 안에 머무르고 이미저 문을 닫으세요.
      참고: 이미저 내부에는 무대에 다섯 개의 위치가 있습니다. 각 체위마다 마취용 코 콘도 있습니다. 이 기능은 5마리의 마우스를 동시에 촬영할 수 있게 해줍니다. 영상에 필요한 마우스 수에 따라 제어판 박스에서 카메라 시야각을 "D"(넓은 시야)에서 "A"(좁은 초점)로 조정하세요. 마우스는 촬영 내내 코를 마취 코 콘 안에 유지해야 무대 어디든 배치할 수 있습니다. 쥐를 순서대로 등쪽, 그 다음에 배쪽을 촬영하는 것이 권장됩니다.
   4. 노출 시간을 조정하고 제어판에서 "획득"을 클릭하세요(그림 3C).
      참고: 제어판에서 발광, 사진, 오버레이가 "켜짐" 상태인지 확인하세요.
      이미지가 촬영되면, 루시퍼레이스 신호가 있는 마우스의 이미지가 화면에 나타납니다.
   5. 이미저를 열고 마우스를 배 쪽이 위를 향하게 돌린 뒤, 이미저 문을 닫은 후 "획득"을 클릭하세요.
      참고: 영상 촬영 시 마취 유지를 위해 마우스의 코가 코 안에 있는지 확인하세요.
   6. 등쪽과 복측 이미지를 모두 획득하면 이미저 문을 열고 쥐를 다시 우리에 넣으세요.
   7. 쥐가 의식을 되찾도록 5-10분 정도 기다리세요.
5. 마우스의 종양 부담을 판단하기 위한 IVIS 영상 분석
   1. 이미지의 색상 척도 조정
      1. "file"을 클릭한 뒤 "다른 이름으로 저장"을 클릭하여 원본 이미지를 적절한 폴더에 저장하세요.
         참고: 이미저는 신호 강도에 따라 색상 척도를 자동으로 조정합니다. 실험 기간 동안 촬영된 모든 이미지에서 색상 척도를 일정하게 유지하는 것이 권장됩니다. 이 소프트웨어를 사용해 원본 이미지를 열어 색상 척도도 조정할 수 있습니다.
      2. 수동 조정을 위해 화면 오른쪽 상단에 툴 팔레트의 다른 창(그림 3D)이 뜨고, "이미지 조정"으로 가서 축척을 위해 "manual"을 선택하세요. 스케일 값에 원하는 최소 및 최대 숫자를 입력한 후 "Enter"를 클릭하세요 (그림 3E).
         참고: 이전에 획득한 이미지의 색상 척도를 조정할 때는 먼저 해당 폴더에서 저장된 RAW infoclick.txt 이미지 파일을 "file"과 "open"으로 열어야 합니다.
         3.5.1.3. 이 이미지를 원본 이미지와 별도로 적절한 폴더에 저장하세요.
   2. 쥐의 종양 부담 분석
      참고: 종양 부하의 정량적 측정을 위해서는 전체 기간 동안 촬영된 각 마우스의 신호 강도를 측정할 수 있습니다. 이 값을 엑셀이나 그래프패드 프리즈에 입력하여 통계 분석과 종양 진행 행도 그래프를 생성할 수 있습니다.
      1. 해당 폴더에서 저장된 원본 infoclick.txt 파일을 열어보세요.
      2. 도구 팔레트 창의 오른쪽 상단에 뜨는 ROI(관심 영역) 섹션으로 가세요(그림 3F).
      3. 각 마우스의 ROI 영역을 수동으로 또는 자동으로 '그리기' 기능을 사용해 본인에게 가장 적합한 도형을 사용하세요. 수동으로 하려면 비교하는 모든 마우스의 모든 이미지에서 영역을 일정하게 유지하세요.
         참고: 복강내 접종의 경우, 마우스의 복측 이미지에서 가슴과 복부 전체의 ROI를 수동으로 선택하는 것이 가장 효과적입니다. 점액 내 접종의 경우, 신호와 함께 등쪽 영상 영역의 ROI를 수동으로 선택하는 것이 가장 효과적입니다.
         참고: 자동 ROI 선택은 이미지 신호 강도가 높은 영역만 선택합니다.
      4. "ROI 측정"(그림 3F)을 클릭하세요. 이 과정에서 선택된 각 ROI의 총액과 평균 카운트 데이터가 추가로 열립니다.
      5. 이 파일을 적절한 폴더에 저장해 나중에 접근할 수 있도록 하세요. 이 데이터를 사용해 MS Excel이나 GraphPad Prism에서 그래프를 그릴 수 있습니다.

결과

면역저하 Foxn1 누드 마우스에서 루시퍼레이스 태그 OVCAR8 세포를 사용한 복강내 난소암 모델의 대표 데이터가 그림 4에 나타났다. 이 세포들에서 루시퍼라제의 안정적인 발현은 III절에서 설명한 IVIS 이미저를 이용한 비침습적 생물발광 영상을 통한 종양 진행 종단 모니터링을 가능하게 했습니다. Foxn1 누드 마우스에 500만 개의 OVCAR8-루시퍼레이스 세포를 복막 내 주입하였으니, 복막강에 100% '흡수율'을 가진 전이성 종양이 형성되었습니다(그림 4). 종양은 빠르게 진행되어 큰 종양 부담과 복수로 이어졌습니다(그림 4A,B). 생체 내 영상 검사에서 Foxn1 누드 마우스에서 500만 개의 OVCAR8-루시페라제 세포를 복막 내 접종 후 29일 이내에 높은 종양 ...

토론

종양 세포, 미세 환경, 전신 요인 간의 복잡한 상호작용을 모방하는 능력은 마우스 모델을 난소암 진행 연구에 탁월한 자원으로 만듭니다¹². 난소암 진행과 전이를 촉진하는 요인에 대한 이해를 진전시키는 것 외에도, 생체 내 마우스 모델은 전이성 난소암의 소분자 및 치료 전략의 전임상 평가에도 중요한 역할을 합니다^12,15. 이러한 장점을 바탕으로 전이성 난소암을 연구하기 위한 여러 생체 내 마우스 모델이 개발되었습니다 ^12,15. 각 모델의 장점과 한계를 이해하는 것은 특정 연구 질문에 적합한 모델을 결정하는 데 매우 중요합니다.

GEMMs는 난소암 진행 요인에 대한 이해...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 um 주사기 멸균 필터, 33mm	피셔 사이언티브	09-720-004
1ml 결핵 주사기	BD	309659
21G, 1인치 바늘	BD	305167
30G 및 frac12; 인치 바늘	BD	305106
5인치 곡선 미세 점 겸자	피셔 사이언티브	1631
6-0 흡수성 단섬유 봉합사	맥슨TM	6532-11
알코올 면봉(70% 이소프롤릴 알코올)	두칼 코퍼레이션	80003156
베타딘 (1% 요오드 용액)	퍼듀 프로덕츠	367618150085
카프로펜 INJ, 50mg/ml	레바펜	RXLEVA50-20INJ
원심분리기와 nbsp;	에펜도르프	5702
D-루시페린	시드 랩스	MB000102-R70170
보석 미세포셉 해부, 아주 좋은 팁	피셔 사이언티브	08-953E
눈 연고	메드벳	11897
가는 끝이 있는 가위	피셔 사이언티브	8940
히트 패드	선빔	731-500
미세한 끝으로 겸자를 해부하는 기구	피셔 사이언티브	S08096
인슐린 주사기 3/10ml	BD	328438
이소퓨란	플루리소	플루리소250
IVIS	퍼킨 엘머	이비슬미
메이요 - 헤거의 직선 바늘 홀더	피셔 사이언티브	08-966
칼슘과 마그네슘 없이 멸균 1X PBS	코닝	21-040-CV
멸균 면 팁 어플리케이터	맥키슨	24-106-1S
멸균 게이지	켄달	3033
멸균 패드/수건/커튼, 창문 없는 것	헨리-샤인	100-9687
트리플 항생제 연고	지구본	4006-4SL
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드	깁코	25200-056