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방법 논문

수막 림프관 평가를 위한 통합 프로토콜: 흉부 주사, 림프절 영상, 수막 박리, 전면 착색

412 조회수

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DOI:

10.3791/71140

⸱

2026년 5월 29일

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1School of Medicine, School of Life Sciences, Shanghai University, 2Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University, 3Children's Hospital of Fudan University, National Children's Medical Center, 4First Clinical College, Fujian Medical University; Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian Key Laboratory of Laboratory Medicine

이 논문에서

요약

여기서는 여러 신경학적 질환에서 중요한 역할을 하는 마우스 수막 림프관(MLVs)을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 목표는 추적자 배수의 기능적 평가와 등쪽 MLVs 네트워크의 상세한 형태학적 특성화를 모두 가능하게 하는 통합 방법을 제공하는 것입니다.

초록

수막 림프관(MLVs)은 중추신경계(CNS) 항상성의 중요한 조절자로 부상했으며, MLVs의 기능 장애는 다양한 신경학적 질환과 관련이 있습니다. 따라서 MLV의 형태와 기능에 대한 포괄적인 평가는 중추신경계 생리와 질병에서 이들의 역할을 이해하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 네 가지 주요 기법을 사용하여 마우스에서 MLV를 평가하는 통합 방법을 설명합니다: 형광 추적자 주입(i.c.m.), 자궁경부 림프절(CLN) 생체 영상, 수막 박리, 그리고 전체 염색. 먼저, 30G 바늘은 폴리에틸렌(PE) 튜브를 통해 주사기와 주입 펌프에 연결됩니다. 마취 후 경막을 경막 부위에 둔탁한 박리로 노출시키고, 주사 바늘을 대뇌수조(CM)에 삽입하여 정밀한 제어로 뇌척수액(CSF)에 추적자를 전달합니다. CLNs로의 추적 배출은 실시간으로 시각화할 수 있으며, 이후 수막 박리 및 전면 염색을 통해 등쪽 MLV의 상세한 형태학적 분석이 가능합니다. 전체 시술은 3시간 이내에 완료할 수 있으며, ICM 주입, 조직 관류, 두개골 격리, 고정액에 삽입하는 과정이 포함됩니다. 이 프로토콜은 뇌내 약물 전달용으로도 조정되거나 분자 분석과 결합할 수 있는데, 수막 박리 절차는 RNA 및 단백질 추출에 적합한 신선하고 고정되지 않은 조직과 호환됩니다.

서론

MLV는 경막동 내에 위치하며 중추신경계에서 CLNs로 CSF 성분과 면역 세포를 운반할 수 있습니다 1,2. MLVs의 발견은 전통적인 중추신경계 '면역 특권' 개념에 도전했으며,최근 몇 년간 연구 중심지로 떠올랐습니다. 연구에 따르면 손상된 MLV의 기능은 알츠하이머병, 연령 관련 인지 저하, 뇌종양, 중추신경계 감염 등 다양한 질병과 밀접한 관련이있습니다. 이 분야의 연구가 발전함에 따라 통합되고 재현 가능하며 잘 표준화된 실험 방법에 대한 수요가 커지고 있습니다.

대부분의 기존 림프관 연구 프로토콜은 말초 림프관 중심에 초점을 맞추고 있습니다 8,9,10. MLVs와 관련된 연구에서, 한 연구에서는 두개골이나 뇌 실질을 손상시키지 않고 뇌척수액에 직접 접근할 수 있는 간단한 CM 캐닐레이션 절차를 설명했습니다. 영상 기법과 결합하면 이 방법은 교감계 기능과 뇌척수액 역학을 효과적으로 평가할 수 있습니다. 그러나 MLV의 기능과 형태를 연구하기 위한 상세한 실험 프로토콜은 잘 문서화되지 않았습니다.

본 프로토콜은 기능 영상과 형태학적 분석을 통합하여 동일한 동물에서 배수 기능과 구조 형태 데이터를 동시에 획득할 수 있게 하여 사용되는 동물 수를 줄이고 데이터 비교 가능성과 일관성을 향상시킵니다. 전반적으로 이 프로토콜은 다양한 질병 모델에서 MLV의 구조적·기능적 변화를 연구하고, 약리학적 또는 유전적 개입이 MLVs에 미치는 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 운영 단계, 주요 주의사항, 문제 해결 지침에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 또한, 이 프로토콜에서 설명된 i.c.m. 주사 기법은 두개내 약물 전달에 독립적으로 적용할 수 있으며, 수막 박리 절차는 신선 조직과 호환되어 이후 RNA 또는 단백질 추출에 적합하여 상당한 유연성과 확장성을 제공합니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 기술된 쥐 시술은 상하이 대학교 기관동물관리 및 사용 위원회(IACUC)가 승인한 프로토콜(승인 번호 ECSHU 2023-099).

1. 수술 기구 및 완충제 준비

주의: PFA를 다룰 때는 화학 연기 후드에서 작업하고 장갑을 착용하여 중등도 독성 및 발암 물질인 PFA를 사용할 때 잠재적 위험을 최소화하세요. 아이소아밀 알코올이 관련된 모든 작업은 노출 위험을 줄이기 위해 점화원에서 떨어진 화학 연기호에서 장갑과 마스크를 착용한 채 반드시 수행되어야 합니다.

  1. 직선 가위 한 쌍, 곡선 미세 겸자 두 쌍, 둔끝 겸자 두 쌍, 마이크로 가위 한 쌍, 매끄러운(톱니가 없는) 끝이 있는 직선 마이크로 겸자 한 쌍과 같은 외과 기구를 준비하세요.
    참고: 수술 기구는 75% 에탄올로 닦고, 실험 전후로 건조하게 유지하세요.
  2. 완충 준비해.
    1. 1x PBS.
    2. 4% 파라포름알데히드 고정액(4% PFA).
    3. 차단 용액(3% 소 혈청 알부민(BSA), 0.5% 트라이톤 X-100, 2% 태아 소 혈청 포함 1x PBS).
    4. 항체 희석 버퍼(3% BSA와 0.5% Triton X-100 포함 1x PBS).
    5. 안티페이드 마운팅 매체.
      참고: 준비된 시약은 4°C에서 한 달간 보관할 수 있습니다.
  3. 2,2,2-트리브로모에탄올 마취액 (아베르틴, 1.25%, 50 mL) 조제
    1. 0.625g 트리브로모에탄올을 2mL 튜브에 무게를 젬고, 1.25 mL 이소아밀 알코올을 추가한 후 완전히 녹입니다(37°C 셰이커).
    2. 완전히 용해된 트리브로모에탄올-아이소아밀 알코올 용액을 50mL 원뿔형 튜브에 옮기고, 총 부피를 50mL로 만들기 위해 PBS 1배를 추가한 후 완전히 혼합합니다.
    3. 용액을 생물학적 안전 캐비닛 내 0.22 μm 필터로 필터링합니다.
  4. 오브알부민, Alexa Fluor 647 켤합체(OVA-647) 용액(2 mg/mL)을 준비합니다. OVA-647 2mg을 인공 뇌척수액(aCSF) 1mL에 녹입니다.

2. 주입 바늘 조립과 마이크로인젝션 펌프 연결

  1. 둔한 겸자로 30G 바늘을 부러뜨리고 끝11 (외경 0.30mm, 내경 0.15mm, 길이 8mm)을 유지하세요.
  2. 30cm 길이의 PE-10 튜브(외경 0.64mm, 내경 0.28mm)를 사용해 부러진 30G 바늘을 30G 바늘이 포함된 미세주입 바늘에 연결합니다(그림 1).
  3. 마이크로인젝션 바늘과 튜브, 30G 바늘이 연결된 상태로 마이크로인젝션 펌프에 장착하세요.

3. 인맥 마법 주사 및 생체 영상

주의: 바늘이 너무 깊게 삽입되어 뇌 실질을 관통할 경우, 주사액이 뇌척수액 구획이 아닌 뇌 조직에 전달되어 결과의 정확성이 떨어지고 쥐 사망 위험으로 이어질 수 있습니다. 수술 중에는 쥐에 대한 지속적인 생리학적 모니터링이 필요합니다. 마취 깊이는 15분마다 발가락 꼬집는 반사를 사용하여 동물이 통증 없이 유지되도록 평가해야 합니다. 저체온증과 그로 인한 생리 기능에 미치는 영향을 예방하기 위해 온열 패드를 사용해 37 °C ± 0.5 °C 사이로 체온을 유지해야 합니다. 또한, 호흡과 심박수는 흉부 움직임을 관찰하고 심장 꼭두리를 촉진하여 30분마다 측정해야 합니다. ICM 주사 중 바늘이 너무 깊게 삽입되어 출혈이 발생하면 주사 실패를 의미합니다. 실험을 중단하고 동물을 안락사시켜.

  1. 마우스의 무게를 재고 복막 내 주사로 200 mg/kg의 아베르틴을 투여하여 마취합니다.
    참고: 대체 마취제(예: 케타민/자일라진)도 사용할 수 있습니다.
  2. 발가락 집는 반사가 멈추고 호흡이 느리고 안정적으로 변할 때, 경추 부위에 제모 크림을 발라 림프절 위의 털을 제거하세요.
  3. 등쪽 목 부위를 면도하세요.
  4. 마우스를 입체 택시 프레임 안에 가열 패드 위에 넣고, 머리를 줄기와 120° 각도로 기울인 상태로 두세요(그림 2A).
  5. 포비돈-요오딘과 75% 에탄올로 부위를 차례로 청소하세요.
  6. 에리스로마이신 안과 연고를 바르세요.
  7. 목 피부에 중간 절개를 하고 근육층을 무딘 채로 분리하세요.
    참고: 두 쌍의 무딘 팁 겸자를 사용해 근육층을 분리하여 출혈을 최소화하세요.
  8. 가늘게 끝이 있는 겸자로 근육을 해리하여 CM 위에 덮인 반투명한 경막이 보 일 때까지 해리합니다(그림 2B, C).
    참고: 근육을 당기고 점액 부위를 일정하게 노출시키기 위해 끝이 곱고 곡선 겸자를 사용하세요.
  9. 입체 현미경 아래에서 둔탁한 겸자를 사용해 바늘을 고정하고 경막 평면에 대해 45° 각도로 약 1–2mm 깊이로 삽입합니다. 바늘 경각을 경막과 평행하게 위치시켜 경막 아래에 완전히 위치하게 하세요(그림 2D).
    참고: 바늘로 부드럽게 힘을 주어 경막을 찔러 주세요. 성공적인 천공은 저항의 뚜렷한 손실과 경막 아래 바늘 끝의 시각적 확인, 그리고 뇌척수액의 유출로 표시됩니다.
  10. 누출된 뇌척수액을 말리기 위해 흡수지로 말리세요.
  11. 마이크로인젝션 펌프를 분당 1 μL로 설정하세요. CM4 에 OVA-647 용액 5 μL(2 mg/mL)을 주입합니다 (그림 2E).
  12. 바늘을 2분간 그대로 두어 역류를 방지하세요.
  13. 수막에 생물학적 접착제 한 방울을 발라.
  14. 수술 절개 부위를 닫아.
  15. 생 체 내 영상을 수행하여 CLNs의 염료 강도를 다양한 시점(30분, 60분)에서 모니터링합니다. 다음 영상 매개변수를 사용하세요: 노출 시간: 0.5초; 여기 필터: 640 nm; 방출 필터: 680 nm.

4. 쥐 두개골의 등쪽 부분 분리

참고: 흉부 박리를 시작하기 전에 발가락 꼬임 반사가 없고 자연 호흡이 중단되었는지 확인하세요.

  1. 아베르틴(600 mg/kg) 과다복용으로 쥐를 안락사시키고, 20 mL 1x PBS 또는 생리식염수로 심장 관류를 시행합니다.
  2. 쥐의 목을 잘라서 머리를 분리하세요.
  3. 두개골 중앙선을 따라 절개를 하여 두피를 열어보세요.
  4. 두 개의 곡선 항전고정기를 사용해 부드럽게 후개시켜 두피를 양쪽으로 분리하세요. 그 후 곡선 지혈기를 안와 중심에 삽입하고 비강과 구강 부위의 잔여 두피를 조심스럽게 제거하세요(그림 3A–C).
    참고: 이 방법은 두피를 빠르고 완전히 분리할 수 있게 해줍니다.
  5. 두개골은 그대로 유지하면서 하악골을 제거하세요(그림 3D).
  6. 두개골 기저부에서 뼈를 제거하여 뇌의 복측 측면을 노출시킵니다(그림 3E).
  7. 두정골의 경막과 접촉하지 않도록 둔탁한 겸자로 뇌를 조심스럽게 적출하세요(그림 3F).
  8. 등쪽 두개골을 5mL, 4% PFA에 완전히 담근 후 4°C에서 24시간 고정합니다(그림 3G).
    일시정지: 고정된 두개골은 4°C에서 일주일을 넘지 않고 보관하세요. 4 °C에서 샘플을 꺼내 실온으로 되돌린 후 뇌막 해리를 합니다.

5. 쥐 두개골에서 뇌막 해리

  1. 고정된 두개골을 5mL 1x PBS로 세척한 후 세 번(각 10분씩) 세척합니다.
  2. 두개골을 등 쪽이 아래로 향하게 하여 10cm 크기의 접시에 1개의 PBS 를 채운다(그림 4A).
  3. 고운 겸자 끝으로 고막 과막을 잡거나 눌러 두개골에서 제거하세요(그림 4B).
    참고: 고막 부를 제거하는 것은 두개골에서 분리될 때 유착으로 인한 수막 찢어짐을 방지하기 위한 중요한 단계입니다.
  4. 가위로 두개골 복면을 약 2mm 정도 가까이 다듬어 부드럽게 다루세요(그림 4C).
  5. 가늘한 겸자를 사용하는데, 이는 수막의 부비동 합류부(COS) 부위에서 남은 깨끗한 흰색 조직을 정교하게 제거한 것입니다(그림 4D).
    참고: 잔여 조직의 불완전한 제거는 면역 표지에서 비특이적 염색의 주요 원인입니다.
  6. 미세한 겸자를 사용해 두개골 가장자리에서 수막막의 한쪽 가장자리를 부드럽게 들어 올린 다음, 반대쪽 가장자리를 들어 올립니다(그림 4E, F).
  7. 수막의 그릇 모양 가장자리를 잡고 COS 부위에서 두개골에서 분리하기 위해 당기세요(그림 4G).
  8. 상악골을 가위로 제거한다(그림 4H).
  9. 다시 수막의 그릇 모양 가장자리를 잡고 전두골 부위에서 수막을 분리하도록 당기세요(그림 4I).
  10. 온전한 수막을 1mL 1x PBS가 들어 있는 24웰 플레이트에 넣어 염색 준비를 합니다.
    참고: 부검사 중 특히 상시상동과 횡동이 만나는 부위에서 수막이 파열될 경우, 샘플은 추가 분석에 적합하지 않을 수 있습니다. 비특이적 배경 염색이 높은 경우, PFA 고정 후 소결과 단계(예: 0.1M 글리신 용액과 40분12분간 인큐베이션)를 추가하여 배경 신호를 더욱 줄입니다.

6. 차단, 1차 항체 및 2차 항체 염색

  1. 1mL 피펫을 사용해 1x PBS를 흡인하여 뇌막이 웰 플레이트 하단에 달라붙도록 하세요.
  2. 24웰 플레이트에 200 μL 블로킹 용액으로 전체 마운트 멘저를 실온에서 1시간 동안 차단합니다.
    참고: 차단액 안에 수막을 완전히 펴서 겸자를 사용해 고르게 노출되도록 하세요.
  3. 피펫을 사용해 차단액을 제거하세요.
  4. 전체 마운트 뇌정막을 희석된 항-LYVE-1(림프관 특이적표지 13) 200 μL 희석 비율(최종 농도 1 μg/mL)에 4 °C에서 하룻밤 배양합니다.
  5. 피펫을 사용해 항체 용액을 제거하세요.
  6. PBS 1개(각각 10분)로 세 번 세척하세요.
  7. 전체 마운트 뇌정막을 DAPI(최종 농도 1 μg/mL)와 Alexa Fluor 488 당나귀 항쥐 IgG(최종 농도 2 μg/mL)로 1시간 동안 상온에서 1x PBS에 배양합니다.
    참고: 항체 배양 중에는 빛으로부터 보호하세요.
  8. 피펫을 사용해 항체 용액을 제거하세요.
  9. PBS 1개(각각 10분)로 세 번 세척하세요.

7. 장착 및 영상

  1. 슬라이드 중앙에 1x PBS 100 μL 피펫을 사용하세요.
  2. 물방울 안에 전체 마운트 뇌막을 띄우고 펼치세요(그림 5A).
  3. 조직이 슬라이드에 평평하게 부착되도록 1x PBS를 흡인하세요(그림 5B).
  4. 전체 장착 뇌막에 20 μL 마운팅 매체를 바릅니다.
  5. 휴지 위에 커버슬립을 덮어주세요(그림 5C).
  6. 슬라이드는 실온에서 자연 건조하고 4°C에서 보관하세요.
    일시정지 지점: 슬라이드는 최대 한 달간 4°C에서 보관할 수 있습니다. 슬라이드를 4°C에서 분리하고 실온으로 되돌려 두세요. 흡수성 종이로 슬라이드 표면의 결로를 제거하세요.
  7. MLV 이미지를 촬영할 때는 20배 대물렌즈를 사용하세요. 채널을 FL 그린으로 설정하고, 방출 파장은 518nm, 노출 시간은 100ms입니다.

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결과

OVA-647 주입 후 생 체 내 소동물 영상 검사에서 경추 부위에 양측적으로 분포된 뚜렷한 타원형 형광 신호가 확인되었습니다(그림 6A). 성공적인 주입에서는 주사 후 CLN에서 추적자가 명확히 관찰되었으며, 형광 강도는 약 60분에 최고조에 달했습니다(그림 6B). 또한, 고립된 표재성 및 심부 경부 림프절에서도 형광 신호가 관찰되었습니다(그림 6C). 형광 신호 강도에 대한 반정량적 분석을 통해 CLNs에서 OVA-647 축적을 평가할 수 있습니다. 반면, 주사 실패(예: 뇌 실질에 관통하지 않고 뇌 실질로 침투)로 인한 주사 실패는 경추 부위에서 감지 가능한 형광 신호가 나타나지 않았습니다(그림 6D). 이러한 샘플은 추가 분석에서 제...

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토론

이 프로토콜은 i.c.m. 주입, CLNs의 생체 내 영상, 수막 박리, 전체 염색을 통합하여 MLV의 기능과 형태를 평가하는 포괄적인 방법을 제공합니다. 이 통합 접근법의 주요 장점은 동일 동물 내에서 림프 배출 기능과 혈관 형태를 동시에 평가할 수 있어 별도의 코호트가 필요 없고, 실험 변동성을 줄이며 데이터 비교 가능성을 높인다는 점입니다. 또한, 절편 절단이 필요한 기존 면역염색 기법과 달리, 전체 마운트 염색은 림프관망의 3차원 구조를 보존하여 혈관 면적, 직경, 분기 패턴을 보다 정확하게 정량화할 수 있게 합니다.

이 프로토콜의 성공은 여러 중요한 단계에 달려 있습니다. 중요한 단계 중 하나는 정확한 ICM(뇌척수액 주입)으로, 이는 적절한 추적자 투여를 위해 필수적입니다. 수막은 뇌 실질체15 위에 얇고 투명하거나 약간 희끄는 막 조직을 형성합니다....

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공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가중점연구개발 프로그램(2023YFC2306500), 중국 국가자연과학기금(82502108), 중국박사후 과학기금(2024M760542)의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ACSF (인공 뇌척수액)Tocris  Cat# 3525
Alexa Fluor 488 당나귀 항-쥐 IgG (1:1000 희석)InvitrogenCat# A-21208
안티페이드 장착 매체BeyotimeCat# P0126
둔한 끝 힘센 집게RWD Life ScienceCat# F12011-10
BSABeyotimeCat# ST023
커버슬립CITOTESTCat# 80312-3161
곡선 날카로운 집게RWD Life ScienceCat# F11003-11
DAPISigma-AldrichCat# D9542
탈모 크림VeetN/A
Dish-10 cmThermo Fisher ScientificCat# 150464
일회용 정맥 (IV) 주입 바늘Zhejiang Kindly Medical Devices N/A
에탄올-75%Sinopharm Chemical Reagent Cat# 80176961
태아 소 혈청ExcellCat# FSD500
필터-0.22 µmMerck Millipore Cat# SLGPR33RB
유리 슬라이드CITOTESTCat# 80340-3610
이소아밀 알코올Sinopharm Chemical Reagent Cat# 10003218
IVIS SpectrumPerkinElmerN/A
마이크로 힘센 집게Shinva Medical Instrument Cat# ZD372RB 
마이크로 가위Shinva Medical Instrument Cat# ZO13056R
마이크로 주사 바늘 (25 µL)Shanghai Gaoge Industry & Trade N/A
마이크로 주사 펌프Voyage PowerCat# QHZS-001A
마우스: C57BL/6 야생형, 8주령, 남성 CavensN/A
바늘-30GZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Normal SalineBeyotimeCat# ST341
Ovalbumin, Alexa Fluor™ 647 ConjugateThermo Fisher ScientificCat# O34784
Paraformaldehyde 고정 용액-4%BeyotimeCat# P0099
PE-10 튜빙Shanghai Qiujing Biochemical Reagent and InstrumentN/A
인산염 완충 식염수 (1x PBS)BeyotimeCat# ST447
항-LYVE-1 (1:200 희석)Santa CruzCat# sc-65647
스테레오 현미경JonecCat# JSZ6
스테레오탁시 프레임RWD Life ScienceCat# 68030
곧은 가위RWD Life ScienceCat# S12007-10
주사기-1-mL Zhejiang Kindly Medical Devices N/A
조직 접착제 I3M VetbondCat# 1469SB
TribromoethanolSigma-AldrichCat# T48402
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# T8787
VS120 고처리량 형광 이미징 시스템OlympusN/A
```

참고문헌

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  7. Rustenhoven, J., et al. Age-related alterations in meningeal immunity drive impaired cns lymphatic drainage. J Exp Med. 220, (2023).
  8. Kodama, T., Hatakeyama, Y., Kato, S., Mori, S. Visualization of fluid drainage pathways in lymphatic vessels and lymph nodes using a mouse model to test a lymphatic drug delivery system. Biomed Opt Express. 6, 124-134 (2015).
  9. Banerjee, R., Knauer, L. A., Yang, Y. Protocol for in vivo and in vitro study of lymphatic valve formation driven by shear stress signaling pathway. STAR Protoc. 4, 102141 (2023).
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  15. Betsholtz, C., et al. Advances and controversies in meningeal biology. Nat Neurosci. 27, 2056-2072 (2024).
  16. Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathol. 137, 151-165 (2019).
  17. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high eeg delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Sci Adv. 5, eaav5447 (2019).
  18. Lee, H., et al. The effect of body posture on brain glymphatic transport. J Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).

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